Her præsenterer vi en protokol til at isolere kerner fra hjernen i den kortlivede hvirveldyrmodel Nothobranchius furzeri til downstream-applikationer såsom enkeltkerne-RNA-sekventering eller enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med sekventering (ATAC-seq).
At studere hjernens aldring ved enkeltcelleopløsning i hvirveldyrsystemer er fortsat udfordrende på grund af omkostninger, tid og tekniske begrænsninger. Her demonstrerer vi en protokol til at generere enkeltkernede RNA-sekventeringsbiblioteker (snRNA-seq) fra hjernen hos det naturligt kortlivede hvirveldyr afrikansk turkis killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanske turkise killifish har en levetid på 4-6 måneder og kan opbevares på en omkostningseffektiv måde, hvilket reducerer omkostnings- og tidsbarrierer for at studere hvirveldyrs hjerne aldring. Imidlertid er der behov for skræddersyede protokoller for at isolere kerner af tilstrækkelig kvalitet til nedstrøms enkeltcelleforsøg fra hjernen hos unge og gamle fisk. Her demonstrerer vi en empirisk optimeret protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra hjernen hos voksne afrikanske turkis killifish, et kritisk skridt i dannelsen af enkeltkerner af høj kvalitet omiske biblioteker. Desuden viser vi, at trinene til at reducere forurenende baggrunds-RNA er vigtige for klart at skelne celletyper. Sammenfattende viser denne protokol muligheden for at studere hjernens aldring i ikke-traditionelle hvirveldyrmodelorganismer.
At forstå mekanismerne for hvirveldyrs hjerne aldring er afgørende for at løse aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og demens1. Den afrikanske turkis killifish (Nothobranchus furzeri) er det kortest levede hvirveldyr, der kan opdrættes i fangenskab, og på grund af dets korte levetid og aldersrelaterede kognitive svækkelse er det en fremragende hjerne aldringsmodel 2,3,4,5. For nylig har fremkomsten af enkeltcellede “omics” -teknologier, såsom enkeltkerner RNA-seq (snRNA-seq) og enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med sekventering (snATAC-seq), gjort det muligt for forskere at forhøre den aldrende hjerne med en hidtil uset opløsning 6,7,8. Disse metoder er afhængige af kerneisolering, da genopretningen af hjerneceller såsom neuroner ofte er for udfordrende til at isolere 6,7,8,9,10. Imidlertid er de fleste offentliggjorte kerneisoleringsprotokoller optimeret til pattedyrmodelorganismer 11,12,13,14,15. Da der således i øjeblikket er et udækket behov for at isolere hjernekerner i killifish som en kommende ny modelorganisme inden for aldringsforskning2, er målet med denne protokol at etablere en metode til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosset hjernedræbervæv.
Her etableres en strømlinet og robust arbejdsgang, der bruger almindeligt tilgængelige materialer til at isolere kerner af høj kvalitet fra killifish-hjerner. Denne protokol blev ændret fra en 10x Genomics-protokol for musehjerner for at imødekomme hjerner med lavere myelinindhold i afrikansk turkis killifish, skrøbeligheden af frosset væv og behovet for at reducere indholdet af omgivende affald til sekventeringsrelaterede applikationer16. Faktisk fører tidligere optimerede protokoller for pattedyrs hjernevæv17,18 til dårlig kernekvalitet (dvs. overlysis) og / eller højt affaldsindhold, når de anvendes på frosne killifish-hjerner, hvilket gør dem uegnede til brug med snRNA-seq i henhold til anbefalinger for enkeltkerner RNA-seq ved hjælp af mikrofluidik (supplerende figur 1).
Ud over kerneisolering demonstrerer vi, hvordan man vurderer kernekvalitet og udbytte ved mikroskopi og flowcytometri. Denne artikel indeholder eksempler på både optimale og suboptimale resultater og diskuterer fejlfinding. Denne protokol blev designet og optimeret til frosne killifish hjerner, men kan også bruges uden større ændringer på frisk dissekerede killifish prøver. Killifish hjernekerner isoleret ved hjælp af denne metode er optimeret til brug i enkeltkerne RNA-seq (snRNA-seq) som en downstream-applikation, men bør også være egnet til brug i snATAC-seq og bulk ATAC-seq.
Protokollen, der præsenteres her, kan bruges til reproducerbart at generere kerner af høj kvalitet fra killifish-hjerner. Denne protokol skulle være specielt designet til killifish-hjernen, da typiske pattedyrbaserede hjernekerneisoleringsprotokoller anvendt på killifish-hjerner konsekvent resulterede i dårlig kernekvalitet i vores hænder. Vi formoder, at dette skyldes det lavere relative myelinindhold i killifish-hjernen sammenlignet med deres pattedyrs modstykker, som ville lyse og klumpe sig sammen som reaktion på de barske forhold, der kræves for pattedyrs hjernecellelysis. Denne protokol er et fremskridt inden for aldring og killifish-felterne, da det letter udforskningen af hjernens aldring på enkeltcelleniveau i en omkostnings- og tidseffektiv model af hvirveldyrs hjerneældning.
Denne protokol er robust over for friske eller frosne prøver, selvom man skal overveje downstream-applikationerne, når man bruger frisk eller frosset væv. Frosset væv er ofte praktisk, da det kan indsamles og opbevares i flere måneder, mens prøver indsamles. Sådanne prøver kan sikkert anvendes til applikationer såsom snRNA-seq. Imidlertid kan fryseprøver forstyrre den nukleare struktur og dermed evnen til nøjagtigt at måle kromatinlandskabet ved ATAC-seq21. Til downstream-applikationer såsom bulk ATAC-seq eller snATAC-seq anbefales det således at bruge frisk dissekerede hjerner i stedet for frosne hjerner. Derudover, fordi alle trin efter hjernehomogenisering kan udføres parallelt, er denne protokol egnet til at køre flere prøver inden for en rimelig tidsramme, hvilket begrænser RNA-nedbrydning forårsaget af langvarig inkubation på is.
Desuden er det bydende nødvendigt at forberede buffere friske (inden for få timer) efter udførelse af kerneekstraktion. Vi fandt ud af, at vaskemidler såvel som BSA skal tilsættes buffere umiddelbart inden protokollen påbegyndes. Buffere, der kun indeholder salte (PBS, NaCl osv.), kan fremstilles som koncentrater, filtreres steriliseres (0,22 μm) og opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur. BSA-stamopløsninger kan fremstilles, steriliseres og opbevares ved 4 °C inden for få dage efter kerneekstraktionen (hvis de er fremstillet af et pulver), men bør altid tilsættes til de buffere, der anvendes i denne protokol, umiddelbart før protokollen iværksættes. Vi anbefaler dog at forberede BSA-løsninger på protokollens dag. Hvis du bruger præfabrikerede BSA-opløsninger fra en tredjepart, anbefales det at bruge friske, uåbnede flasker. Brug af frisk BSA fører generelt til lavere snavsindhold i kerneforberedelser.
Uanset om friske eller frosne prøver anvendes som input, er det vigtigt at vurdere kernekvaliteten efter kerneisolering. Selvom denne protokol er specielt designet til at undgå overlysis, er dette den mest almindelige årsag til tab af kernekvalitet. Overlysis kan skyldes for meget tid brugt i lysisbufferen, alt for hård håndtering af kernerne, såsom overdreven pipettering med en standardborepipettespids eller en for lang tid brugt mellem kerneisolering og nedstrøms applikationer (>1 time). Overlyserede kerner vil ofte have beskadiget nukleare periferier, som lækker DNA og forårsager klumpning (figur 2B). Dette vil føre til et øget antal multipletter og bidrage med baggrundsnukleinsyrer, der vil interferere med downstream-applikationer, især snRNA-seq. Begge kvaliteter kan vurderes ved mikroskopi efter kerneisolering. Hvis der observeres overdreven nuklear klumpning, anbefaler vi at forsøge at forkorte lysistrininkubationen for at reducere risikoen for overlysis. Som en alternativ metode til at øge kernesingler kan fluorescensassisteret cellesortering (FACS) bruges til at berige for singler nedstrøms for denne protokol. Vi bemærker dog, at når man arbejder med allerede skrøbelige kerner fra frosset væv, kan forskydningsspændingen, der opstår under sortering, føre til øget nuklear brud og dermed øget omgivende RNA / DNA. Derudover bemærker vi, at den tid, der kræves for at køre en FACS-udbyttesortering for kerner, når de behandler flere prøver, vil kræve, at alle kerneprøver forbliver på is i timevis, mens andre prøver sorteres. Således kan øgede ventetider ved behandling af flere prøver parallelt med FACS-tilgangen sandsynligvis også føre til generelt reduceret kernekvalitet og øge risikoen for RNA-nedbrydning. Hvis FACS ønskes for reduceret dublethastighed, anbefaler vi således, at affaldsindholdet kontrolleres igen efter udbyttesorteringen, og at mulig reduceret RNA-kvalitet tages i betragtning for enkeltcellede RNA-seq-applikationer som en potentiel advarsel.
Et nøjagtigt skøn over kernetal og singlet-andel er afgørende for næsten alle downstream “omics” -applikationer og er af største betydning. På grund af evnen til let at gate og tælle kerner efter størrelse er flowcytometri den mest nøjagtige metode til at tælle kerner, som vi har vurderet. Alternativt kan man kvantificere kerner ved hjælp af celletællere som Invitrogens grevinde 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. For at bemærke, har Invitrogens grevinde 2 FL Automated Cell Counter, og i langt mindre grad DeNovix, en tendens til at overvurdere kernetællinger ved at tælle snavs som kerner, hvilket betyder, at manuel størrelse gating kan være påkrævet. Desuden giver flowcytometeret en mulighed for let at vurdere kernernes renhed. Man kan skelne den relative andel af singlet versus multipletkerner på en kvantitativ måde, der er vanskelig ved mikroskopi. Dette er afgørende for snRNA-seq og snATAC-seq, da disse protokoller vil lide under et overskud af multipletprøver, som skal udelukkes fra downstream-analyser. Ud over multipletter kan den relative andel af “snavs” (fragmenterede kerner, cellulære affald) kvantificeres ved flowcytometri og skal være relativt lav, da dette materiale ofte indeholder forurenende nukleinsyrer, der kan bidrage med et baggrundssignal og korrupte enkeltkerne “omics” -data.
Som med tidligere beskrevne kerneisoleringsprotokoller må proportionerne af celletyper i det oprindelige væv ikke rekapituleres trofast i kerneforberedelsen19 og bør derfor fortolkes med forsigtighed. For at bemærke, som alle teleosts, har afrikansk turkis killifish nukleerede erytrocytter, som også forventes at være repræsenteret i kerneforberedelsen. Disse kerner kan identificeres i snRNA-seq og snATAC-seq datasæt ved den højere ekspression / tilgængelighed af hæmoglobingener og kan udelukkes beregningsmæssigt, hvis det ønskes.
The authors have nothing to disclose.
Nogle paneler blev genereret med BioRender.com. Dette arbejde i vores laboratorium blev støttet af NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant til B.T., et tilskud fra Simons Foundation som en del af Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, et pilotstipendium fra Navigage Foundation og en Hanson-Thorell Family-pris til B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |