Hier presenteren we een protocol om kernen te isoleren uit de hersenen van het kortlevende gewervelde model Nothobranchius furzeri voor downstream toepassingen zoals single-nucleus RNA sequencing of single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-seq).
Het bestuderen van hersenveroudering met eencellige resolutie in gewervelde systemen blijft een uitdaging vanwege kosten, tijd en technische beperkingen. Hier demonstreren we een protocol om single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) bibliotheken te genereren uit de hersenen van de van nature kortlevende gewervelde Afrikaanse turquoise killifish Nothobranchius furzeri. De Afrikaanse turquoise killifish heeft een levensduur van 4-6 maanden en kan op een kosteneffectieve manier worden gehuisvest, waardoor kosten- en tijdsbarrières worden verminderd om gewervelde hersenveroudering te bestuderen. Er zijn echter op maat gemaakte protocollen nodig om kernen van voldoende kwaliteit voor downstream eencellige experimenten te isoleren uit de hersenen van jonge en oude vissen. Hier demonstreren we een empirisch geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van hoogwaardige kernen uit de hersenen van volwassen Afrikaanse turquoise killifish, een cruciale stap in de generatie van hoogwaardige single nuclei omic bibliotheken. Verder laten we zien dat de stappen om vervuilend achtergrond-RNA te verminderen belangrijk zijn om celtypen duidelijk te onderscheiden. Samenvattend toont dit protocol de haalbaarheid aan van het bestuderen van hersenveroudering in niet-traditionele gewervelde modelorganismen.
Het begrijpen van de mechanismen van gewervelde hersenveroudering is van cruciaal belang voor het aanpakken van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en dementie1. De Afrikaanse turquoise killifish (Nothobranchus furzeri) is het kortstlevende gewervelde dier dat in gevangenschap kan worden gefokt, en vanwege zijn korte levensduur en leeftijdsgebonden cognitieve stoornissen is het een uitstekend hersenverouderingsmodel 2,3,4,5. Onlangs heeft de komst van single-cell “omics” -technologieën, zoals single nuclei RNA-seq (snRNA-seq) en single nuclei assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (snATAC-seq), onderzoekers in staat gesteld om de ouder wordende hersenen te ondervragen met een ongekende resolutievan 6,7,8. Deze methoden zijn afhankelijk van kernisolatie, omdat het herstel van hersencellen zoals neuronen vaak te uitdagend is om 6,7,8,9,10 te isoleren. De meeste gepubliceerde kernisolatieprotocollen zijn echter geoptimaliseerd voor zoogdiermodelorganismen 11,12,13,14,15. Aangezien er momenteel dus een onvervulde behoefte is aan het isoleren van hersenkernen in de killifish als een opkomend nieuw modelorganisme op het gebied van verouderingsonderzoek2, is het doel van dit protocol om een methode vast te stellen voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit bevroren hersendodendvisweefsel.
Hier wordt een gestroomlijnde en robuuste workflow opgezet die algemeen beschikbare materialen gebruikt om hoogwaardige kernen uit killifishhersenen te isoleren. Dit protocol is aangepast van een 10x Genomics-protocol voor muizenhersenen om tegemoet te komen aan de hersenen met een lager myelinegehalte van Afrikaanse turquoise killifish, de kwetsbaarheid van bevroren weefsel en de noodzaak om het omgevingsafvalgehalte te verminderen voor sequencing-gerelateerde toepassingen16. Inderdaad, eerder geoptimaliseerde protocollen voor hersenweefsel van zoogdieren 17,18 leiden tot een slechte kernkwaliteit (d.w.z. overlyse) en / of een hoog puingehalte bij gebruik op bevroren killifishhersenen, waardoor ze ongeschikt zijn voor gebruik met snRNA-seq volgens aanbevelingen voor enkele kernen RNA-seq met behulp van microfluïdica (aanvullende figuur 1).
Naast kernisolatie laten we zien hoe we de kwaliteit en opbrengst van kernen kunnen beoordelen door middel van microscopie en flowcytometrie. Dit artikel geeft voorbeelden van zowel optimale als suboptimale resultaten en bespreekt het oplossen van problemen. Dit protocol is ontworpen en geoptimaliseerd voor bevroren killifish-hersenen, maar kan ook zonder grote wijzigingen worden gebruikt op vers ontleedde killifish-monsters. Killifish hersenkernen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn geoptimaliseerd voor gebruik in single nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als een downstream-toepassing, maar moeten ook geschikt zijn voor gebruik in snATAC-seq en bulk ATAC-seq.
Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om reproductief hoogwaardige kernen te genereren uit killifishhersenen. Dit protocol moest specifiek worden ontworpen voor de killifish-hersenen, omdat typische op zoogdieren gebaseerde hersenkernisolatieprotocollen toegepast op killifish-hersenen consequent resulteerden in een slechte kernkwaliteit in onze handen. We vermoeden dat dit te wijten is aan het lagere relatieve myelinegehalte van de killifish-hersenen in vergelijking met hun zoogdierachtige tegenhangers, die zouden lyseren en klonteren als reactie op de barre omstandigheden die nodig zijn voor hersencellysis van zoogdieren. Dit protocol is een vooruitgang in de verouderings- en killifish-velden omdat het de verkenning van hersenveroudering op eencellig niveau vergemakkelijkt in een kosten- en tijdeffectief model van gewervelde hersenveroudering.
Dit protocol is robuust voor verse of bevroren monsters, hoewel men rekening moet houden met de downstream-toepassingen bij het gebruik van vers of bevroren weefsel. Bevroren weefsel is vaak handig omdat het maandenlang kan worden verzameld en bewaard terwijl monsters worden verzameld. Dergelijke monsters kunnen veilig worden gebruikt voor toepassingen zoals snRNA-seq. Het bevriezen van monsters kan echter de nucleaire structuur verstoren en dus het vermogen om het chromatinelandschap nauwkeurig te meten door ATAC-seq21. Voor downstream-toepassingen zoals bulk ATAC-seq of snATAC-seq wordt het dus aanbevolen om vers ontleedde hersenen te gebruiken in plaats van bevroren hersenen. Bovendien, omdat alle stappen na hersenhomogenisatie parallel kunnen worden uitgevoerd, is dit protocol vatbaar voor het uitvoeren van meerdere monsters in een redelijk tijdsbestek, waardoor RNA-afbraak veroorzaakt door langdurige incubatie op ijs wordt beperkt.
Bovendien is het noodzakelijk om buffers vers (binnen enkele uren) na het uitvoeren van kernextractie te bereiden. We ontdekten dat detergentia en BSA onmiddellijk voorafgaand aan het begin van het protocol aan buffers moeten worden toegevoegd. Buffers die alleen zouten bevatten (PBS, NaCl, enz.) mogen als concentraten worden gemaakt, filter gesteriliseerd (0,22 μm) en voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. BSA-stamoplossingen kunnen binnen enkele dagen na de kernextractie (indien bereid uit een poeder) worden bereid, gesteriliseerd en bij 4 °C worden bewaard, maar moeten altijd onmiddellijk aan de in dit protocol gebruikte buffers worden toegevoegd voordat het protocol wordt uitgevoerd. We raden echter aan om BSA-oplossingen voor te bereiden op de dag van het protocol. Als u vooraf gemaakte BSA-oplossingen van een derde partij gebruikt, wordt geadviseerd om verse, ongeopende flessen te gebruiken. Het gebruik van verse BSA leidt over het algemeen tot een lager puingehalte in kernvoorbereiding.
Of verse of bevroren monsters nu als input worden gebruikt, het is belangrijk om de kwaliteit van kernen na kernisolatie te beoordelen. Hoewel dit protocol specifiek is ontworpen om overlyse te voorkomen, is dit de meest voorkomende oorzaak van kwaliteitsverlies in kernen. Overlyse kan het gevolg zijn van te veel tijd doorgebracht in de lysisbuffer, te ruwe behandeling van de kernen zoals overmatig pipetteren met een standaard boringpipetpunt, of een overmatige hoeveelheid tijd doorgebracht tussen kernisolatie en downstream-toepassingen (>1 uur). Overdreven kernen hebben vaak beschadigde nucleaire periferie, die DNA lekken en klontering veroorzaken (figuur 2B). Dit zal leiden tot een verhoogd aantal multipletten en bijdragen achtergrondnucleïnezuren die zullen interfereren met downstream-toepassingen, met name snRNA-seq. Beide kwaliteiten kunnen worden beoordeeld door microscopie na kernisolatie. Als overmatige nucleaire klontering wordt waargenomen, raden we aan om te proberen de lysisstap incubatie te verkorten om de kans op overlyse te verminderen. Als alternatieve methode voor het verhogen van singlets van kernen, kan fluorescentie-assisted cell sorting (FACS) worden gebruikt om te verrijken voor singlets stroomafwaarts van dit protocol. We merken echter op dat, bij het werken met reeds fragiele kernen uit bevroren weefsel, de schuifspanning die optreedt tijdens het sorteren kan leiden tot verhoogde nucleaire breuk en dus verhoogd omgevings-RNA / DNA. Bovendien merken we op dat de tijd die nodig is om een FACS-opbrengstsortering voor kernen uit te voeren bij het verwerken van meerdere monsters, vereist dat alle kernmonsters urenlang op ijs blijven, terwijl andere monsters worden gesorteerd. Verhoogde wachttijden bij het verwerken van meerdere monsters parallel met de FACS-aanpak kunnen dus waarschijnlijk ook leiden tot een algehele verminderde kernkwaliteit en het risico op RNA-afbraak verhogen. Dus als FACS gewenst is voor een verlaagde doubletsnelheid, raden we aan dat het puingehalte opnieuw wordt gecontroleerd na de opbrengstsortering en dat mogelijk verminderde RNA-kwaliteit in aanmerking wordt genomen voor single cell RNA-seq-toepassingen als een potentieel voorbehoud.
Een nauwkeurige schatting van het aantal kernen en de singletverhouding is essentieel voor bijna alle downstream “omics” -toepassingen en is van het grootste belang. Vanwege het vermogen om kernen gemakkelijk op grootte te sluiten en te tellen, is flowcytometrie de meest nauwkeurige methode voor het tellen van kernen die we hebben beoordeeld. Als alternatief kan men kernen kwantificeren met behulp van celtellers zoals Invitrogen’s Countess 2 FL Automated Cell Counter of de DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. Om op te merken, heeft invitrogen’s Countess 2 FL Automated Cell Counter, en in veel mindere mate de DeNovix, de neiging om kerntellingen te overschatten door puin als kernen te tellen, wat betekent dat handmatige gating van de grootte nodig kan zijn. Bovendien kan men met de flowcytometer eenvoudig de zuiverheid van de kernen beoordelen. Men kan de relatieve verhouding van singlet versus multipletkernen onderscheiden op een kwantitatieve manier die moeilijk is door microscopie. Dit is van vitaal belang voor snRNA-seq en snATAC-seq, omdat die protocollen zullen lijden onder een overschot aan multipletmonsters, die moeten worden uitgesloten van downstream-analyses. Naast multipletten kan het relatieve aandeel “puin” (gefragmenteerde kernen, cellulair puin) worden gekwantificeerd door flowcytometrie en moet relatief laag zijn, omdat dit materiaal vaak verontreinigende nucleïnezuren bevat die een achtergrondsignaal kunnen bijdragen en “omics” -gegevens met één kern kunnen beschadigen.
Net als bij eerder beschreven kernisolatieprotocollen, mogen de verhoudingen van celtypen in het oorspronkelijke weefsel niet getrouw worden samengevat in de kernvoorbereiding19 en moeten daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Om op te merken, zoals alle teleosts, hebben Afrikaanse turquoise killifish kernvormige erytrocyten, die naar verwachting ook vertegenwoordigd zullen zijn in de kernvoorbereiding. Deze kernen kunnen worden geïdentificeerd in snRNA-seq en snATAC-seq datasets door de hogere expressie / toegankelijkheid van hemoglobinegenen en kunnen indien gewenst computationeel worden uitgesloten.
The authors have nothing to disclose.
Sommige panelen werden gegenereerd met BioRender.com. Dit werk in ons laboratorium werd ondersteund door de NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., een subsidie van de Simons Foundation als onderdeel van de Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, een pilotbeurs van de Navigage Foundation en een Hanson-Thorell Family award aan B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |