Summary
여기에서 우리는 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 시퀀싱을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 단일 핵 분석(ATAC-seq)과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 수명이 짧은 척추동물 모델 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
척추 동물 시스템에서 단일 세포 분해능으로 뇌 노화를 연구하는 것은 비용, 시간 및 기술적 제약으로 인해 여전히 어렵습니다. 여기에서는 자연적으로 수명이 짧은 척추동물 아프리카 청록색 킬리피시 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 라이브러리를 생성하는 프로토콜을 시연합니다. 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 4-6 개월의 수명을 가지고 있으며 비용 효율적인 방식으로 수용 할 수 있으므로 척추 동물의 뇌 노화를 연구하는 데 드는 비용과 시간 장벽을 줄일 수 있습니다. 그러나 젊은 물고기와 노인 물고기의 뇌에서 다운 스트림 단일 세포 실험에 충분한 품질의 핵을 분리하기 위해서는 맞춤형 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 고품질 단일 핵 오믹 라이브러리 생성의 중요한 단계인 성인 아프리카 청록색 킬리피쉬의 뇌에서 고품질 핵을 분리하기 위한 경험적으로 최적화된 프로토콜을 시연합니다. 또한, 우리는 오염 배경 RNA를 줄이는 단계가 세포 유형을 명확하게 구별하는 데 중요하다는 것을 보여줍니다. 요약하면,이 프로토콜은 비 전통적인 척추 동물 모델 유기체에서 뇌 노화를 연구 할 가능성을 보여줍니다.
Introduction
척추동물의 뇌 노화 메커니즘을 이해하는 것은 알츠하이머 및 치매와 같은 노화 관련 신경퇴행성 질환을 해결하는 데중요합니다1. 아프리카 청록색 킬리 피쉬 (Nothobranchus furzeri)는 포로 상태에서 사육 할 수있는 가장 수명이 짧은 척추 동물이며 짧은 수명과 연령 관련인지 장애로 인해 우수한 뇌 노화 모델 2,3,4,5입니다. 최근 단일 핵 RNA-seq (snRNA-seq) 및 시퀀싱을 통한 트랜스포자제 접근 가능 염색질에 대한 단일 핵 분석 (snATAC-seq)과 같은 단일 세포 "오믹스"기술의 출현으로 연구자들은 전례없는 해상도 6,7,8로 노화 된 뇌를 조사 할 수있었습니다. 이러한 방법은 뉴런과 같은 뇌 세포의 회복이 종종 6,7,8,9,10을 분리하기에는 너무 어렵 기 때문에 핵 분리에 의존합니다. 그러나, 대부분의 공개된 핵 분리 프로토콜은 포유동물 모델 유기체 11,12,13,14,15에 대해 최적화된다. 따라서, 현재 노화 연구2 분야에서 떠오르는 새로운 모델 유기체로서 킬리피쉬의 뇌핵을 분리하는 데 대한 충족되지 않은 요구가 있기 때문에, 이 프로토콜의 목표는 동결된 뇌 킬리피쉬 조직으로부터 고품질 핵을 분리하는 방법을 확립하는 것이다.
여기에서는 일반적으로 사용 가능한 재료를 사용하여 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 분리하는 능률적이고 강력한 워크플로가 설정됩니다. 이 프로토콜은 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 낮은 미엘린 함량 뇌, 냉동 조직의 취약성 및 시퀀싱 관련 응용 분야의 주변 파편 함량을 줄여야 할 필요성을 수용하기 위해 마우스 뇌에 대한 10x Genomics 프로토콜에서 수정되었습니다16. 실제로, 포유류의 뇌 조직17,18에 대해 이전에 최적화 된 프로토콜은 냉동 킬리 피쉬 뇌에 사용될 때 핵 품질 저하 (즉, 과잉 용해) 및 / 또는 높은 파편 함량을 초래하여 미세 유체 공학을 사용하는 단일 핵 RNA-seq에 대한 권장 사항에 따라 snRNA-seq와 함께 사용하기에 적합하지 않습니다 (보충 그림 1).
핵 분리 외에도 현미경 및 유세포 분석을 통해 핵 품질과 수율을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 최적 결과와 최적이 아닌 결과의 예를 제공하고 문제 해결에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 킬리피쉬 뇌를 위해 설계 및 최적화되었지만 갓 해부된 킬리피쉬 샘플에 대한 주요 수정 없이 사용할 수도 있습니다. 이 방법을 사용하여 분리된 킬리피쉬 뇌핵은 다운스트림 애플리케이션으로 단일 핵 RNA-seq(snRNA-seq)에 사용하도록 최적화되었지만 snATAC-seq 및 벌크 ATAC-seq에도 사용할 수 있어야 합니다.
Protocol
동물 관리 및 동물 실험은 승인 된 프로토콜 # 21215에 따라 남부 캘리포니아 대학 IACUC에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜을 사용하는 모든 작업의 경우 척추 동물에 대한 연구 작업을 시작하기 전에 기관의 IACUC의 승인을 받아야합니다.
참고: 급속 냉동 뇌 조직(3단계부터 시작)에서 시작하여 프로토콜을 완전히 실행하려면 6개의 샘플에 대해 ~2.5시간이 걸립니다(그림 1).
1. 킬리피쉬 뇌 해부
- 시스템 수에서 1.5g/L의 메타노설포네이트/트리카인(MS-222) 용액을 사용하여 킬리피쉬를 인도적으로 안락사시킵니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 모든 몸과 아가미의 움직임이 멈춘 후 킬리 피쉬를 빠르게 참수하십시오.
- 앞에서 설명한 대로 깨끗한 페트리 접시에 목이 잘린 머리를 해부합니다19.
- 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다 (8x-35x 배율 범위 사용). 분기 스테갈 광선에 초점이 맞춰지도록 머리를 돌립니다.
- 가위를 사용하여 지과 가두골이 드러나도록 치아를 자릅니다.
- 집게를 사용하여 두개골 양쪽의 가지스테갈 광선을 누르고 있습니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 두개골에서 남은 조직 조각을 제거하십시오. 뇌와 눈을 연결하는 V 자형 광학 교차가 보일 것입니다.
- 가위를 사용하여 광학 교차를 절단하여 뇌에서 두 눈을 분리합니다. 집게를 사용하여 두개골을 부드럽게 풀어줍니다.
- 두개골을 뒤집고 집게를 사용하여 두개골의 등쪽에서 근육을 긁습니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 두개골을 제자리에 고정하고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 두개골의 뼈를 부드럽게 제거하여 뇌를 드러냅니다.
- 뇌는 하얗고 부드러워 보입니다. 일단 보이면 모든 두개골 뼈를 제거 할 필요는 없습니다. 부드럽게 들어 올리고 긁어서 깨끗한 집게로 뇌를 제거하십시오.
- 드라이 아이스에 저장된 미세 원심 분리기 튜브에 뇌를 넣어 뇌를 얼립니다.
참고: 냉동 뇌 조직은 라이브러리 생성을 위해 처리할 때 배치 효과를 제한하기 위해 함께 처리할 모든 샘플이 수집될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. -80 ° C에서 보관 된 샘플은 무기한 저장할 수 없지만이 프로토콜은 눈에 띄는 품질 저하없이 최대 12 개월 동안 저장된 킬리 피쉬 뇌에서 성공적으로 수행되었습니다.
2. 신선한 버퍼 준비
- 핵 세척 완충액(1x PBS의 2% 소 혈청 알부민[BSA], 인산염 완충 식염수 pH 7.4 및 0.2 U/μL RNase 억제제)을 준비하고 얼음에 보관합니다. 최대 8개의 시료에 대해 250mL의 핵 세척 완충액을 준비합니다. 250mL의 경우 10% BSA 원액 50mL, 10x PBS 원액 25mL, 40U/μL RNase 억제제 스톡 1.25mL를 사용한 다음 RNAse가 없는ddH2O로 부피를 250mL로 가져옵니다.
- 핵 용해 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.4, 10mM NaCl, 3mMMgCl2, 0.01875% v/v NP-40 및 0.2U/μL RNase 억제제)을 준비하고 얼음에 보관합니다. 최대 8개의 시료에 대해 10mL의 핵 용해 완충액을 준비합니다. 10mL의 경우 1M Tris-HCl pH 7.4 원액 100μL, 5M NaCl 원액 20μL, 1M MgCl2 원액 30μL, 10% NP-40원액 18.75μL, 40U/μL RNase 억제제 스톡 50μL를 사용한 다음 RNAse가 없는ddH2O를 사용하여 부피를 10mL로 가져옵니다.
3. 핵 분리
- 냉동 샘플을 사용하는 경우 얼음에서 10분 동안 해동하십시오. 새로 해부된 뇌를 사용하는 경우 3단계로 바로 진행합니다.2
참고: 이 프로토콜은 단일 뇌에서 작동할 수 있지만 어린 물고기(5-6주령)의 작은 샘플은 수확량이 더 낮습니다. 물고기의 나이와 성별에 관계없이 두 개의 뇌를 하나의 샘플로 처리하여 항상 충분한 수율을 얻을 수 있습니다 (표 1). 이 프로토콜은 GRZ 및 ZMZ1001 균주의 동물을 포함하여 5-26 주 된 물고기에서 고품질 핵을 성공적으로 분리했습니다. 이 프로토콜을 다른 균주에 적용하는 데 예상되는 문제는 없습니다. - 2 mL Dounce 균질화기의 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 1mL에 뇌를 Dounce합니다. 균질화기를 얼음 위에 유지하고 샘플을 용해하는 동안 기포가 발생하지 않도록 하십시오. 사이클당 180° 비틀림으로 대략 0.5초/다운스트로크 및 0.5초/업스트로크의 속도로 도중합니다. 느슨한 유봉을 15회 동안 사용하거나 추가 스트로크가 필요한 경우 조직/용해 완충액 혼합물이 균질하게 나타날 때까지 Dounce합니다.
알림: Dounce 균질화기는 세척하고 증류수로 헹구고 사용 사이에 표준 건식 오토클레이브 멸균 주기로 멸균해야 합니다.- 단단한 유봉을 사용하여 30 스트로크, 30 초에서 1 분, 10 스트로크마다 작은 휴식과 함께 30 스트로크. 사이클당 180° 비틀림으로 대략 0.5초/다운스트로크 및 0.5초/업스트로크의 속도로 도중합니다. 샘플을 Dounce 균질화기의 얼음 위에 2분 동안 그대로 두십시오.
참고: 이 배양 시간은 적절한 용해를 보장하지만 핵 과용해가 관찰되는 경우 단축되어야 합니다.
- 단단한 유봉을 사용하여 30 스트로크, 30 초에서 1 분, 10 스트로크마다 작은 휴식과 함께 30 스트로크. 사이클당 180° 비틀림으로 대략 0.5초/다운스트로크 및 0.5초/업스트로크의 속도로 도중합니다. 샘플을 Dounce 균질화기의 얼음 위에 2분 동안 그대로 두십시오.
- 70μm 세포 필터를 통해 샘플을 5% BSA로 사전 코팅된 15mL 원뿔형 튜브에 변형시킵니다.
- 3.3단계의 70μm 세포 필터 위에 세척 버퍼를 피펫팅하여 샘플에 4mL의 핵 세척 버퍼를 추가하고 5회 반전으로 부드럽게 혼합합니다.
알림: 이렇게 하면 필터에 갇힐 수 있는 핵을 회수할 수 있고 수율이 향상됩니다. - 스윙 버킷 로터를 사용하여 500 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 액체 폐기물 용기에 부드럽게 부어 상청액을 버립니다. 샘플을 수직 위치로 되돌리고 P1000 피펫을 사용하여 남은 세척 버퍼를 제거합니다.
참고: 핵 펠릿은 하나의 샘플에서 두 개의 뇌에서 시작할 때 볼 수 있습니다. 그러나 어린 동물 (5-6 주령)의 단일 뇌를 처리 할 때 수확량이 낮아질 것으로 예상되며 펠릿이 항상 보이지 않을 수 있습니다. 이 경우 상청액은 튜브 바닥에서 펠릿의 위치를 가정하면서 조심스럽게 제거해야합니다. - 넓은 구멍의 P1000 피펫 팁으로 1mL의 핵 세척 완충액에 핵을 즉시 재현탁합니다.
- 4mL의 핵 세척 완충액을 추가하여 샘플을 5mL로 가져오고 5회 반전하여 부드럽게 혼합합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 500 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 넓은 구멍의 피펫 팁으로 1mL의 핵 세척 완충액에 핵을 재현탁하고 유세포분석(FACS) 튜브로 옮깁니다.
- 300μL의 이물질 제거 용액(재료 표)을 추가하고 혼합물이 균질해질 때까지 넓은 보어 팁으로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
- P1 피펫을 사용하여 3.9단계에서 준비한 핵 용액 위에 1mL의 핵 세척 버퍼를 부드럽게 덮고 튜브를 약간의 각도로 유지합니다(보충 그림 2). 파편 제거 용액 분획과 핵 세척 완충액 분획은 올바르게 계층화되면 명확한 인터페이스를 형성해야 합니다.
- 스윙 버킷 로터에서 3000 x g, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리합니다. P1000 피펫을 사용하여 상위 두 단계를 완전히 폐기하십시오.
알림: 투명한 FACS 튜브를 사용하면 원심분리 후 세 가지 별개의 위상(상단, 간상, 하단)을 시각화할 수 있습니다. 최대 파편 제거를 용이하게하기 위해, 상부 2 단계를 제거하는 데있어 보수적 인 것보다 더 공격적 인 것이 권고된다 (즉, 소량의 바닥 단계를 제거하는 것이 상부 상 중 어느 것을 운반하는 것보다 바람직하다. 보충 그림 2). 또한, 간기 층은 너무 얇아서 시각화 할 수 없습니다. 이 경우 간상 층을 포함하는 상단 (명백한) 층을 제거하십시오. 유지되는 바닥층은 ~1mL의 총 부피를 포함해야 합니다. - 바닥층을 5% BSA로 사전 코팅된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 원뿔형 튜브에서 핵 세척 완충액으로 부피를 15mL로 가져오고 세 번 뒤집어 혼합합니다.
- 스윙 버킷 로터에서 1000 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 150μL의 핵 세척 완충액에 즉시 재현탁합니다.
- ~300 μL로 설정된 표준 보어 피펫 팁으로 전환합니다. 전체 샘플을 흡수한 다음 샘플이 배출되지 않도록 주의하면서 파이펫 팁 끝에 40μm 온팁 필터를 부착합니다.
알림: 온팁 필터는 다운스트림 응용 분야를 위한 충분한 핵 농도를 유지하는 데 필요한 더 작은 부피를 얻기 위해 필요합니다. 예를 들어, 미세 유체 공학을 사용하는 snRNA-seq의 경우 최적 범위는 700-1200 핵 / μL18이지만 최소 농도는 >300 핵 / μL가 권장됩니다. 필요한 경우 더 높은 농도의 핵도 쉽게 희석 할 수 있습니다. - 필터를 통해 샘플을 낮은 DNA 결합 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 강제로 배출하여 샘플을 필터링합니다. 최종 용리 부피는 120-150 μL여야 합니다.
알림: 일부 거품은 여과로 인해 발생할 수 있습니다. 이것은 핵의 질에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.
4. 현미경으로 핵 품질 평가
- 별도의 미세 원심분리 튜브에서 여과된 샘플 10μL를 부드러운 피펫팅으로 0.4% 트리판 블루 용액 10μL와 혼합합니다. 샘플은 연장된 배양 시간이 필요하지 않으며 트리판 블루 용액과 혼합한 직후 시각화할 준비가 됩니다.
- 염색된 핵 10μL를 계수실 슬라이드의 챔버에 증착한다.
참고: 또는 염색된 핵 샘플 10μL를 혈구계 또는 현미경 슬라이드에 증착하고 커버 슬립으로 덮습니다. - 광학 현미경으로 핵 품질을 평가합니다.
참고: 낮은 배율은 핵을 확대하는 데만 사용해야 합니다., 핵 결함은 더 높은 배율(즉, 60x 이상)에서만 시각적으로 분명하기 때문입니다. 이 단계는 핵 준비의 성공을 평가하기 위해 신속하게 수행 할 수 있으며 육안 검사 이외의 2 차 분석이 필요하지 않습니다. 고품질의 손상되지 않은 핵은 날카롭게 정의 된 경계 (20 )를 가질 것이다 (그림 2A). 품질이 좋지 않은 핵은 핵막을 파괴하고, 잠재적인 핵산 누출을 나타내는 핵막 근처의 고르지 못한 트리판 블루 염색 및/또는 블리빙20 의 증거를 가질 것입니다(그림 2B). 건강한 핵은 직경이 10-15 μm 일 것으로 예상됩니다.
5. 유세포 분석에 의한 단일 핵, 파편 및 다중 비율 정량화
알림: 유세포분석기 소프트웨어의 특정 용어와 인터페이스는 기계 브랜드에 따라 다를 수 있지만 필요한 경우 이러한 단계를 다른 시스템에 쉽게 적용할 수 있어야 합니다.
- FACS 튜브에서 10μL의 여과된 핵 샘플을 1:10 희석을 위해 유세포분석에 권장되는 완충액 90μL에 재현탁합니다. 이를 위해, 0.22 μm 여과된 멸균 PBS, pH 7.2, 2 mM EDTA 및 0.5% BSA가 본 연구에 사용된다.
참고: 이 희석은 대부분의 핵 준비에 효과가 있지만, 수율이 낮은 샘플(즉, 희석된 샘플에서 <30 nuclei/μL)의 경우 품질 평가를 위해 충분한 핵을 샘플링하려면 더 낮은 희석(예: 1:5)이 필요할 수 있습니다. - 샘플을 1μg/mL의 최종 농도에서 요오드화프로피듐(PI)으로 염색합니다. 배양 시간이 필요하지 않으며 핵을 즉시 분석할 수 있습니다.
알림: 또는 최종 농도가 0.1μg/mL DAPI인 샘플을 염색합니다. DAPI는 PI와 다른 형광 채널(Vioblue-A V1-A 채널, 405nm에서 여기, 450/50nm에서 방출)에서 읽어야 합니다. - 다음과 같이 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다.
- 작업 영역 설정:
- 유세포분석기를 획득 모드로 설정합니다. 파일을 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 새 작업 영역을 선택합니다. 왼쪽 패널의 실험 탭에서 프로젝트 이름과 샘플 ID 를 해당 필드에 입력합니다.
- 왼쪽 위 도구 모음에서 새 분석 창 버튼(산점도 아이콘)을 클릭합니다. 팝업 메뉴에서 세 개의 플롯(플롯 4t)이 있는 상자를 클릭합니다. 세 개의 플롯이 화면에 나타납니다. 왼쪽 상단 도구 모음(A 아이콘)에서 분석 모드 버튼을 클릭하여 주황색이 아닌 회색이 되도록 합니다.
- 분석 플롯 설정:
- 세 플롯의 축을 다음과 같이 각각 X축과 Y축으로 변경합니다.
플롯 1 : X 축 : FSC-A, Y 축 : SSC-A
플롯 2 : X 축 : HDR-T, Y 축 : SSC-A
플롯 3 : X 축 : PerCP-Vio700-A B3-A, Y 축 : SSC-A - 축 레이블을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 원하는 채널을 선택하여 축 을 변경합니다.
- 각 플롯의 오른쪽 상단 모서리 옆에 나타나는 사각형 회색 "i" 아이콘을 클릭하여 플롯을 밀도 색상으로 구분하도록 설정합니다. 속성 창이 열리고 왼쪽에 버튼 패널이 표시됩니다. 속성 창에서 산점도 아이콘(패널 왼쪽 상단에서 두 번째)을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
참고: PerCP-Vio700-A B3-A 형광 채널은 488nm에서의 여기와 650-730nm 범위의 방출에 해당합니다.
- 세 플롯의 축을 다음과 같이 각각 X축과 Y축으로 변경합니다.
- 기기 설정 지정:
- 왼쪽 패널에서 채널 탭을 클릭합니다. 모든 채널 목록이 오른쪽에 세 개의 상자와 함께 나타납니다. 오른쪽의 첫 번째 상자에서 아래쪽 화살표를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Hlog를 선택하여 B3, FSC-A 및 SSC-A를 Hlog 로 설정합니다. 오른쪽의 각 중간 상자에 이 숫자를 입력하고 Enter 키를 눌러 SSC의 전압을 640V로, FSC를 300V로, B3를 480V로 설정합니다. 오른쪽의 세 번째 상자는 입력에 교대로 사용할 수 있는 토글입니다.
- 트리거 헤더 아래에서 아래쪽 화살표를 클릭하고 왼쪽의 드롭다운 메뉴에서 선택하고 오른쪽 상자에 숫자를 입력한 다음 Enter 키를 눌러 FSC 트리거를 4로 설정하고 SSC 및 B3 트리거를 0으로 설정합니다. 오른쪽에는 입력 대신 사용할 수 있는 토글 상자가 있습니다.
참고: PMT 전압은 각 특정 유세포분석 기계에 맞게 최적화되어야 하지만 핵에 대한 트리거는 일반적으로 세포에 사용되는 것보다 낮아야 합니다. 또한 축 배율을 h-log로 설정해야 합니다.
- 샘플 볼륨 텍스트 상자에 100 μL를 입력하고 흐름 소프트웨어 창의 왼쪽에 있는 텍스트 상자 Uptake Volume 에 50 μL를 입력합니다. 이 단계에서 핵 용해를 방지하기 위해 샘플 혼합 매개 변수가 Mix Gentle 로 설정되어 있는지 확인합니다. 오른쪽 하단 모서리에 있는 원(재생 아이콘) 안의 삼각형을 눌러 흐름을 시작합니다.
- 흐름 품질 확인:
- 측면 산란 영역(SSC-A)과 HDR-T를 비교하여 샘플에 기포나 덩어리가 있는지 확인합니다. 이 그림이 점의 매끄러운 연속체인지 확인합니다. 기포 또는 덩어리로 인해 SSC-A 대 HDR-T 플롯에서 빈 영역이 생성됩니다.
- 측면 산란(SSC-A) 대 순방향 산란(FSC-A) 플롯을 확인하여 사용된 전압이 샘플에 대해 올바른지 확인합니다.
참고: 세포와 달리 핵은 측면 산란도 대 전방 산점도의 파편에서 완전히 해결되지 않습니다. 그러나 파편에 해당하는 배경에 더 낮은 밀도의 이벤트 (더 차가운 색상)가있는 핵 (따뜻한 색)에 해당하는 플롯의 중간에 고밀도 이벤트 클러스터가 있어야합니다.
- 핵 수 및 품질 분석:
- 확대 보기를 위해 SSC-A 대 PerCp-Vio-700A 플롯 을 두 번 클릭합니다. 왼쪽 상단 도구 모음에서 수직선(사분면)이 있는 버튼을 클릭하여 사분면 게이트를 선택합니다. 그런 다음 SSC-A 대 PerCp-Vio-700A 플롯의 아무 곳이나 클릭하면 플롯 내부에 사분면이 나타납니다.
- 사분면 구분선의 아무 곳이나 클릭하고 커서를 밀어 사분면 배치를 수정합니다. 왼쪽 상단 사분면에 맨 왼쪽 개체군(파편)이 포함되고 오른쪽 위 사분면에 여러 개의 눈물방울 모양의 클러스터(핵)가 포함되도록 사분면을 배치합니다(파편 제거 단계를 포함하거나 포함하지 않는 준비가 포함된 일반적인 결과는 게이트 설정 및 흐름 결과의 예는 그림 3 참조).
- 파편 대 핵 수:
- 플롯의 오른쪽 상단 모서리에 있는 사각형 회색 "i" 아이콘을 클릭하여 속성 창을 엽니다. 지역 기능 탭을 클릭하십시오. 플롯 영역 및 함수 목록이 나타납니다.
- 영역 목록에서 전체 플롯이 선택되었음을 나타내는 상단 항목 옆에 녹색 확인 표시가 있는지 확인합니다. 함수 목록에서 Count/μL를 클릭하여 녹색 확인 표시를 생성합니다. 확인을 클릭하면 개수/μL 메트릭이 각 사분면에 나타납니다.
- 원시 개수와 백분율을 보려면 원하는 경우 영역 함수 탭에서 Count 및 %-T를 선택합니다. 왼쪽 상단 및 오른쪽 사분면의 카운트/μL는 각각 파편 및 핵 수율에 해당합니다.
- 싱글 릿 카운트 :
- 오른쪽 위 사분면의 아래 부분에있는 가장 왼쪽 눈물방울 모양의 클러스터는 단일 렛을 나타냅니다. 왼쪽 상단 도구 모음에서 다각형 단추(Polygon)를 클릭하여 이 인구 주위에 다각형 게이트를 그립니다.
- 한 번 클릭하고 마우스를 밀어 그리기를 시작한 다음 다시 클릭하여 게이트의 선형 세그먼트를 완료하고 다음 세그먼트를 시작합니다. 두 번 클릭하여 게이트를 완료합니다. 게이트의 경계를 클릭하고 마우스를 밀어 게이트의 위치를 변경합니다.
- 게이트의 정점을 클릭하여 모양을 수정합니다. 게이트된 모집단(싱글릿)의 개수/μL가 나타납니다. 이것은 초기 희석으로 준비된 핵의 농도입니다.
참고: 전방 산란 면적 대 높이 1:1 선형 관계, 일반적으로 세포가 흐를 때 일중항 속도를 결정하는 데 사용되며 핵에는 적용되지 않으며 무시할 수 있습니다.
- 희석된 핵 분취물의 농도와 희석 계수를 사용하여 초기 분취물의 농도를 역-계산합니다(예: 1:10 희석의 경우 관찰된 농도에 10을 곱함). >300 핵 / μL의 농도는 snRNA-seq에 적합합니다.
- 작업 영역 설정:
Representative Results
여기에 설명된 킬리피쉬 뇌핵 분리 프로토콜은 킬리피쉬에 대해 특별히 최적화되어 있으며 그림 1에 요약되어 있습니다. 핵 추출 외에도 프로토콜은 분리된 핵의 품질과 양을 평가하는 다양한 방법을 자세히 설명합니다. 그림 2는 광학 현미경으로 평가한 건강한(그림 2A) 및 건강하지 않은(그림 2B) 핵의 예를 보여줍니다. 다운스트림 분석에 적합한 건강한 핵(그림 2A)은 손상되지 않은 막을 가진 일중항 핵으로 존재합니다. 그림 2B에 도시된 바와 같이, 이 프로토콜(및 다른 핵 분리 프로토콜)의 가장 일반적인 실패 모드는 손상된 핵막을 특징으로 하는 과용해된 핵의 생성이다. 이것은 종종 핵 응집으로 이어지고 파열된 핵에서 핵산의 누출로 인해 다운스트림 응용 분야의 배경 신호에 기여할 수 있습니다. 과도한 응집이 관찰되면 도스 단계에서 더 부드럽게 하거나 용해 완충액에서 배양 시간을 줄이는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 분리 된 핵의 수를 정량화하고 샘플에서 다중 핵의 상대적 비율을 결정합니다. 또한 유세포분석을 사용하여 핵 샘플의 다운스트림 분석에 해로운 영향을 미칠 수 있는 오염 파편, 종종 파열된 핵 조각 및 기타 세포 파편의 상대적 함량을 평가할 수 있습니다. 대표적인 흐름 데이터는 그림 3에서 볼 수 있습니다. 고품질 핵 분리 절차는 1) 작은 파편 분획, 2) 단일 핵 대 다중 핵의 높은 분율 (핵 분획의 80 % >)을 생성합니다. 핵산을 염색하는 PI 염색을 사용하면 일중항 핵을 파편 및 다중 핵에서 분리할 수 있습니다. 그림 3A 는 파편으로 오염된 제제의 예인 반면, 그림 3B 는 고품질 실험의 예입니다.
그림 1: 킬리피쉬 뇌핵 분리 워크플로우. 냉동 또는 신선한 킬리피쉬 뇌에서 핵을 분리하기 위한 실험 워크플로. 일단 분리되고 평가되면, 핵은 다양한 다운스트림 "오믹스" 분석에 사용될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 현미경을 통한 핵 품질 평가. 핵을 0.4% 트리판 블루 용액에서 1:1로 혼합하고 60x에서 명시야 이미징으로 에코 회전 현미경으로 시각화했습니다. (A) 고품질 핵의 예. 핵은 일중항으로 존재하고 핵막은 손상되지 않습니다. (B) 품질이 좋지 않은 핵의 예. 핵막이 손상되고 핵이 이중선으로 뭉쳐지고 있는데, 이는 맨 위 핵의 상단에서 누출되는 것을 볼 수 있는 끈적끈적한 DNA의 누출로 인한 것 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유세포분석에 의한 핵 정량화 및 순도 평가. 핵 샘플을 PI의 1:100 희석으로 염색하고 유세포분석기에서 실행하였다. 핵은 (A,B)의 오른쪽 상단 사분면에 단일항 및 다중 형태로 존재하며, 단일선은 사건의 가장 낮은 구름으로 존재하고 이중선, 삼중항 등이 오름차순으로 이어집니다. 파편은 가장 왼쪽 두 사분면의 이벤트로 표시됩니다. (A) 파편 제거 단계가 생략되고 파편이 사건의 >40%를 차지하는 저품질 핵 준비의 예. (b) 파편 제거 단계가 포함된 고품질 핵 샘플의 예. 이 예에서 파편은 유세포 분석기에 의해 등록 된 모든 이벤트의 <10 %를 차지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플 유형(브레인 2개) | 평균 수율 (4 개의 독립적 인 준비) |
| 5주 남성 두뇌 | 3.59 ± 1.76 x 105 |
| 10 주 남성 두뇌 | 6.41 ± 1.33 x 105 |
| 15 주 남성 두뇌 | 14.59 ± 2.05 x 105 |
| 5주 여성 두뇌 | 2.54 ± 0.75 x 105 |
| 10 주 여성 두뇌 | 4.66 ± 1.29 x 105 |
| 15주 여성 두뇌 | 7.95 ± 3.51 x 105 |
표 1 : 성별과 연령에 따른 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 두 뇌에서 평균 기대 수확량. 105 개의 핵으로 표현된 평균 수율은 각 범주에서 4개의 독립적인 핵 제제에 대한 평균의 표준 오차±.
보충 그림 1: 표준 프로토콜을 사용한 핵 분리 품질과 냉동 킬리피쉬 뇌에 대한 최적화된 프로토콜 비교. (A) 현미경에 의한 핵 품질 평가. 핵을 0.4% Trypan Blue 용액에서 1:1로 혼합하고 60x에서 명시야 이미징으로 현미경으로 시각화했습니다. (B) 유세포분석에 의한 핵 및 파편 부하 정량화. 핵 샘플을 PI의 1:100 희석으로 염색하고 유세포분석기에서 실행하였다. (C) 다양한 벤치마킹 프로토콜을 사용한 현미경 및 유세포 분석에 의한 품질 평가 메트릭 요약. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 파편 제거 단계의 개략도 . (A) 파편 제거 계획 전 원심 분리 층. (B) 원심분리 후 상청액 제거 계획. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 재현 가능하게 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에 적용된 전형적인 포유류 기반 뇌핵 분리 프로토콜이 지속적으로 우리 손의 핵 품질을 저하시켰기 때문에 킬리피쉬 뇌를 위해 특별히 설계되어야 했습니다. 우리는 이것이 포유류의 뇌 세포 용해에 필요한 가혹한 조건에 반응하여 용해되고 응집되는 포유류에 비해 킬리 피쉬 뇌의 상대적 미엘린 함량이 낮기 때문이라고 생각합니다. 이 프로토콜은 척추 동물의 뇌 노화의 비용 및 시간 효율적인 모델에서 단일 세포 수준에서 뇌 노화의 탐구를 용이하게하기 때문에 노화 및 킬리 피쉬 분야의 발전입니다.
이 프로토콜은 신선 또는 냉동 샘플에 강력하지만 신선 또는 냉동 조직을 사용할 때 다운스트림 응용 분야를 고려해야 합니다. 냉동 조직은 샘플을 수집하는 동안 몇 달 동안 수집하고 보관할 수 있기 때문에 종종 편리합니다. 이러한 샘플은 snRNA-seq와 같은 애플리케이션에 안전하게 사용될 수 있습니다. 그러나 샘플을 동결하면 핵 구조가 파괴되어 ATAC-seq21로 염색질 풍경을 정확하게 측정 할 수 있습니다. 따라서 벌크 ATAC-seq 또는 snATAC-seq와 같은 다운스트림 애플리케이션의 경우 냉동 뇌 대신 새로 해부된 뇌를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 뇌 균질화 이후의 모든 단계를 병렬로 수행 할 수 있기 때문에이 프로토콜은 합리적인 시간 내에 여러 샘플을 실행할 수 있으므로 얼음에서의 장기간 배양으로 인한 RNA 분해를 제한합니다.
또한, 핵 추출을 수행하는 후 신선한 (몇 시간 이내에) 완충액을 준비하는 것이 필수적입니다. 우리는 BSA뿐만 아니라 세제도 프로토콜을 시작하기 직 전에 버퍼에 추가되어야 한다는 것을 발견했습니다. 염(PBS, NaCl 등)만을 포함하는 완충액은 농축액으로 만들어 필터 멸균(0.22μm)하여 실온에서 무기한 보관할 수 있다. BSA 스톡 용액은 핵 추출 후 며칠 이내에 4°C에서 제조, 멸균 및 저장될 수 있지만(분말로 제조된 경우) 프로토콜을 수행하기 직전에 항상 이 프로토콜에 사용되는 완충액에 첨가해야 합니다. 그러나 프로토콜 당일에 BSA 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 타사의 미리 만들어진 BSA 용액을 사용하는 경우, 개봉하지 않은 새 병을 사용하는 것이 좋습니다. 새로운 BSA를 사용하면 일반적으로 핵 준비에서 파편 함량이 낮아집니다.
신선 또는 냉동 샘플을 입력으로 사용하든 핵 분리 후 핵 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 과용해를 방지하기 위해 특별히 설계되었지만 이것이 핵 품질 손실의 가장 일반적인 원인입니다. 과잉 용해는 용해 완충액에서 너무 많은 시간을 소비하거나, 표준 보어 피펫 팁을 사용한 과도한 피펫팅과 같은 핵의 지나치게 거친 취급 또는 핵 분리와 다운스트림 적용 사이에 소요되는 과도한 시간(>1시간)으로 인해 발생할 수 있습니다. 과도하게 용해된 핵은 종종 핵 주변부를 손상시켜 DNA를 누출시키고 응집을 유발합니다(그림 2B). 이것은 증가된 다수의 멀티플릿으로 이어질 것이고 다운스트림 응용, 특히 snRNA-seq를 방해할 배경 핵산에 기여할 것이다. 두 특성 모두 핵 분리 후 현미경으로 평가할 수 있습니다. 과도한 핵 응집이 관찰되면 과다 용해 가능성을 줄이기 위해 용해 단계 배양을 단축하는 것이 좋습니다. 핵 싱글릿을 증가시키기 위한 대안적인 방법으로서, 형광-보조 세포 분류 (FACS)가 이 프로토콜의 다운스트림 싱글렛에 대해 농축하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 동결된 조직에서 이미 깨지기 쉬운 핵으로 작업할 때 분류 중에 발생하는 전단 응력으로 인해 핵 파열이 증가하여 주변 RNA/DNA가 증가할 수 있습니다. 또한 여러 샘플을 처리할 때 핵에 대한 FACS 수율 정렬을 실행하는 데 필요한 시간은 다른 샘플이 분류되는 동안 모든 핵 샘플이 몇 시간 동안 얼음 위에 남아 있어야 한다는 점에 주목합니다. 따라서 FACS 접근법과 병행하여 여러 샘플을 처리 할 때 대기 시간이 증가하면 전반적인 핵 품질이 저하되고 RNA 분해 위험이 증가 할 수 있습니다. 따라서 FACS가 이중 속도 감소를 원하는 경우 수율 분류 후 파편 함량을 다시 확인하고 잠재적 인 경고로 단일 세포 RNA-seq 응용 프로그램에 대해 RNA 품질 저하 가능성을 고려하는 것이 좋습니다.
핵 수와 일중항 비율의 정확한 추정치는 거의 모든 다운스트림 "omics" 응용 분야에 필수적이며 가장 중요합니다. 크기별로 핵을 쉽게 게이트하고 계수할 수 있는 능력으로 인해 유세포분석은 우리가 평가한 가장 정확한 핵 계수 방법입니다. 또는 Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터 또는 DeNovix CellDrop 자동 세포 카운터와 같은 세포 카운터를 사용하여 핵을 정량화할 수 있습니다. 참고로, Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터와 DeNovix는 파편을 핵으로 계산하여 핵 수를 과대평가하는 경향이 있으며, 이는 수동 크기 게이팅이 필요할 수 있음을 의미합니다. 또한 유세포 분석기를 사용하면 핵의 순도를 쉽게 평가할 수 있습니다. 단중항 대 다중 핵의 상대적 비율을 현미경으로는 어려운 정량적 방식으로 식별할 수 있습니다. 이는 snRNA-seq 및 snATAC-seq에 매우 중요한데, 이는 이러한 프로토콜이 다운스트림 분석에서 제외되어야 하는 다중 샘플의 잉여로 어려움을 겪을 것이기 때문입니다. 다중 항목 외에도 "파편"(단편화 된 핵, 세포 파편)의 상대적 비율은 유세포 분석으로 정량화 할 수 있으며,이 물질은 종종 배경 신호 및 손상된 단일 핵 "omics"데이터에 기여할 수있는 오염 핵산을 포함하기 때문에 상대적으로 낮아야합니다.
이전에 기술된 핵 분리 프로토콜과 마찬가지로, 원래 조직에서 세포 유형의 비율은 핵 준비19에서 충실하게 요약되지 않을 수 있으므로 주의해서 해석해야 합니다. 참고로, 모든 teleosts와 마찬가지로, 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 핵 적혈구를 가지고 있으며, 이는 또한 핵 준비에서 나타날 것으로 예상됩니다. 이러한 핵은 헤모글로빈 유전자의 더 높은 발현/접근성에 의해 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터 세트에서 식별될 수 있으며 원하는 경우 계산적으로 제외될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
일부 패널은 BioRender.com 로 생성되었습니다. 우리 실험실에서의 이 연구는 NIA T32 AG052374 BT에 대한 박사후 교육 보조금, 노화 뇌의 가소성을 위한 Simons Collaboration의 일환으로 Simons Foundation의 보조금, Navigage Foundation의 파일럿 보조금 및 BAB에 대한 Hanson-Thorell Family 상의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
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