Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolare i nuclei dal cervello del modello di vertebrati di breve durata Nothobranchius furzeri per applicazioni a valle come il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo o il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq).
Abstract
Studiare l'invecchiamento cerebrale alla risoluzione di singole cellule nei sistemi di vertebrati rimane impegnativo a causa di costi, tempi e vincoli tecnici. Qui, dimostriamo un protocollo per generare librerie di sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) dal cervello del killifish turchese africano vertebrato naturalmente di breve durata Nothobranchius furzeri. Il killifish turchese africano ha una durata di vita di 4-6 mesi e può essere ospitato in modo economico, riducendo così i costi e i tempi per studiare l'invecchiamento cerebrale dei vertebrati. Tuttavia, sono necessari protocolli su misura per isolare nuclei di qualità sufficiente per esperimenti a valle a singola cellula dal cervello di pesci giovani e anziani. Qui, dimostriamo un protocollo empiricamente ottimizzato per l'isolamento di nuclei di alta qualità dal cervello di killifish turchesi africani adulti, un passo fondamentale nella generazione di librerie omiche a singoli nuclei di alta qualità. Inoltre, dimostriamo che i passaggi per ridurre l'RNA di fondo contaminante sono importanti per distinguere chiaramente i tipi di cellule. In sintesi, questo protocollo dimostra la fattibilità dello studio dell'invecchiamento cerebrale in organismi modello di vertebrati non tradizionali.
Introduction
Comprendere i meccanismi dell'invecchiamento cerebrale dei vertebrati è fondamentale per affrontare le malattie neurodegenerative legate all'età come l'Alzheimer e la demenza1. Il killifish turchese africano (Nothobranchus furzeri) è il vertebrato più breve che può essere allevato in cattività e, grazie alla sua breve durata di vita e al deterioramento cognitivo associato all'età, è un eccellente modello di invecchiamento cerebrale 2,3,4,5. Recentemente, l'avvento di tecnologie "omiche" a singola cellula, come l'RNA-seq a nucleo singolo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (snATAC-seq), hanno permesso ai ricercatori di interrogare il cervello che invecchia a una risoluzione senza precedenti 6,7,8. Questi metodi si basano sull'isolamento dei nuclei, poiché il recupero delle cellule cerebrali come i neuroni è spesso troppo difficile da isolare 6,7,8,9,10. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli di isolamento dei nuclei pubblicati sono ottimizzati per organismi modello di mammiferi 11,12,13,14,15. Pertanto, poiché attualmente esiste un bisogno insoddisfatto di isolare i nuclei cerebrali nel killifish come nuovo organismo modello emergente nel campo della ricerca sull'invecchiamento2, l'obiettivo di questo protocollo è stabilire un metodo per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto killifish cerebrale congelato.
Qui, viene stabilito un flusso di lavoro semplificato e robusto che utilizza materiali comunemente disponibili per isolare nuclei di alta qualità dai cervelli killifish. Questo protocollo è stato modificato da un protocollo di genomica 10x per cervelli di topo per accogliere i cervelli a basso contenuto di mielina del killifish turchese africano, la fragilità del tessuto congelato e la necessità di ridurre il contenuto di detriti ambientali per applicazioni correlate al sequenziamento16. Infatti, protocolli precedentemente ottimizzati per il tessuto cerebrale dei mammiferi17,18 portano a una scarsa qualità dei nuclei (cioè overlysis) e / o ad un alto contenuto di detriti quando utilizzati su cervelli di killifish congelati, rendendoli inadatti per l'uso con snRNA-seq secondo le raccomandazioni per i singoli nuclei RNA-seq usando la microfluidica (Figura supplementare 1).
Oltre all'isolamento dei nuclei, dimostriamo come valutare la qualità e la resa dei nuclei mediante microscopia e citometria a flusso. In questo articolo vengono forniti esempi di risultati ottimali e non ottimali e viene illustrata la risoluzione dei problemi. Questo protocollo è stato progettato e ottimizzato per i cervelli di killifish congelati, ma può anche essere utilizzato senza grandi modifiche su campioni di killifish appena sezionati. I nuclei cerebrali di Killifish isolati usando questo metodo sono stati ottimizzati per l'uso in RNA-seq a singolo nucleo (snRNA-seq) come applicazione a valle, ma dovrebbero anche essere suscettibili di uso in snATAC-seq e bulk ATAC-seq.
Protocol
La cura degli animali e la sperimentazione animale sono state eseguite in conformità con la University of Southern California IACUC secondo i protocolli approvati # 21215. Per qualsiasi lavoro che utilizza questo protocollo, è necessario ottenere l'approvazione dalla IACUC dell'istituzione prima di iniziare qualsiasi lavoro di ricerca sugli animali vertebrati.
NOTA: Una corsa completa attraverso il protocollo a partire dal tessuto cerebrale congelato (a partire dal passaggio 3) dovrebbe richiedere ~ 2,5 ore per sei campioni (Figura 1).
1. Seziona i cervelli killifish
- Eutanasia umana killifish usando una soluzione di 1,5 g / L di metanosolfonato / tricaina (MS-222) nell'acqua di sistema.
- Usa forbici affilate per decapitare rapidamente i killifish dopo che tutti i movimenti del corpo e delle branchie sono cessati.
- Sezionare la testa decapitata su una capsula di Petri pulita come descritto in precedenza19.
- Posizionare il piatto sotto un microscopio da dissezione (utilizzando un intervallo di ingrandimento 8x-35x). Gira la testa in modo tale che i raggi branchiostegali siano a fuoco
- Usando le forbici, tagliare il dentario in modo tale che i raggi branchiostegali e il cranio siano rivelati.
- Usando una pinza, tieni premuti i raggi branchiostegali su entrambi i lati del cranio. Utilizzare un altro paio di pinze per rimuovere eventuali frammenti di tessuto rimanenti dal cranio. Il chiasma ottico a forma di V che collega il cervello e gli occhi dovrebbe diventare visibile.
- Tagliare il chiasma ottico usando le forbici per staccare entrambi gli occhi dal cervello. Utilizzare una pinza per liberare delicatamente il cranio.
- Capovolgere il cranio e usare una pinza per raschiare il muscolo dal lato dorsale del cranio.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere il cranio in posizione e un altro paio di pinze per rimuovere delicatamente le ossa del cranio, rivelando il cervello.
- Il cervello appare bianco e morbido. Una volta visibile, non è necessario rimuovere tutte le ossa craniche. Rimuovere il cervello con una pinza pulita sollevando delicatamente e raschiando.
- Flash congelare il cervello inserendolo in un tubo di microcentrifuga conservato su ghiaccio secco.
NOTA: Il tessuto cerebrale congelato può essere conservato a -80 °C fino a quando tutti i campioni da elaborare insieme sono stati raccolti per limitare gli effetti batch durante l'elaborazione per la generazione della libreria. Mentre i campioni conservati a -80 °C non possono essere conservati indefinitamente, questo protocollo è stato eseguito con successo su cervelli killifish conservati per un massimo di 12 mesi senza un notevole calo di qualità.
2. Preparare nuovi buffer
- Preparare il tampone di lavaggio dei nuclei (albumina sierica bovina al 2% [BSA] in 1x PBS, pH salino tamponato fosfato 7,4 e inibitore della RNasi 0,2 U/μL) e conservare su ghiaccio. Preparare 250 ml di tampone di lavaggio dei nuclei per un massimo di otto campioni. Per 250 ml, utilizzare 50 mL di soluzione madre di BSA al 10%, 25 mL di una soluzione madre 10x PBS, 1,25 mL dello stock di inibitori della RNasi 40 U/μL, quindi portare il volume a 250 mL conddH 2O privo di RNAsi.
- Preparare il tampone di lisi dei nuclei (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,01875% v/v NP-40 e0,2 U/μL RNasi inibitore) e conservare su ghiaccio. Preparare 10 ml di tampone di lisi nucleica per un massimo di otto campioni. Per 10 mL, utilizzare 100 μL di soluzione madre 1 M Tris-HCl pH 7,4, 20 μL di soluzione madre 5 M NaCl, 30 μL di 1 M MgCl2 soluzione madre, 18,75 μL di una soluzione madre NP-40 al 10%, 50 μL dello stock di inibitori della RNasi 40 U/μL, quindi portare il volume a 10 mL conddH 2O privo di RNAsi.
3. Isolare i nuclei
- Se si utilizzano campioni congelati, scongelarli sul ghiaccio per 10 minuti. Se si utilizzano cervelli appena sezionati, procedere direttamente al passaggio 3.2
NOTA: Sebbene questo protocollo possa funzionare su cervelli singoli, campioni più piccoli di pesci giovani (5-6 settimane di età) avranno una resa inferiore. Rese sufficienti possono sempre essere ottenute elaborando due cervelli come un campione, indipendentemente dall'età e dal sesso del pesce (Tabella 1). Questo protocollo ha isolato con successo nuclei di alta qualità da pesci di età compresa tra 5 e 26 settimane, compresi animali provenienti da entrambi i ceppi GRZ e ZMZ1001. Non ci sono problemi nell'applicazione di questo protocollo ad altri ceppi. - Rimbalzare il cervello in 1 mL di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati in un omogeneizzatore Dounce da 2 ml. Tenere l'omogeneizzatore sul ghiaccio ed evitare di generare bolle durante la lisatura del campione. Dounce a una velocità approssimativa di 0,5 s/corsa verso il basso e 0,5 s/corsa verso l'alto con una torsione di 180° per ciclo. Rimbalzare usando il pestello sciolto per 15 colpi, o fino a quando la miscela tampone tissutale/lisi appare omogenea se sono necessari ulteriori colpi.
NOTA: gli omogeneizzatori Dounce devono essere lavati, sciacquati con acqua distillata e sterilizzati con cicli di sterilizzazione standard in autoclave a secco tra un utilizzo e l'altro.- Raddoppia usando il pestello stretto per 30 colpi con piccole pause, da 30 s a 1 minuto, ogni 10 colpi. Dounce a una velocità approssimativa di 0,5 s/corsa verso il basso e 0,5 s/corsa verso l'alto con una torsione di 180° per ciclo. Lasciare riposare il campione sul ghiaccio nell'omogeneizzatore Dounce per 2 minuti.
NOTA: Questo tempo di incubazione garantisce un'adeguata lisi, ma deve essere abbreviato se si osserva una sovralisi nucleare.
- Raddoppia usando il pestello stretto per 30 colpi con piccole pause, da 30 s a 1 minuto, ogni 10 colpi. Dounce a una velocità approssimativa di 0,5 s/corsa verso il basso e 0,5 s/corsa verso l'alto con una torsione di 180° per ciclo. Lasciare riposare il campione sul ghiaccio nell'omogeneizzatore Dounce per 2 minuti.
- Filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 15 mL preverniciato in BSA al 5%.
- Aggiungere 4 mL di tampone di lavaggio nuclei al campione pipettando il tampone di lavaggio sul filtro cellulare da 70 μm del punto 3.3 e mescolare delicatamente per inversione cinque volte.
NOTA: Ciò consente il recupero dei nuclei che possono essere intrappolati sul filtro e migliora la resa. - Centrifugare con rotore a benna oscillante a 500 x g, 4 °C, per 10 min. Scartare il surnatante versandolo delicatamente in un contenitore di rifiuti liquidi. Riportare il campione in posizione verticale e rimuovere il tampone di lavaggio rimanente utilizzando una pipetta P1000.
NOTA: È probabile che il pellet dei nuclei sia visibile quando si parte da due cervelli in un campione. Tuttavia, quando si elaborano singoli cervelli di animali giovani (5-6 settimane), ci si aspetta una resa inferiore e i pellet potrebbero non essere sempre visibili. In questo caso, il surnatante deve essere accuratamente rimosso assumendo la posizione del pellet sul fondo del tubo. - Risospendere immediatamente i nuclei in 1 mL di tampone di lavaggio nuclei con una punta per pipetta P1000 ad ampio foro.
- Portare il campione a 5 mL aggiungendo 4 mL di tampone di lavaggio dei nuclei e mescolare delicatamente per inversione cinque volte. Centrifugare con un rotore a benna oscillante a 500 x g, 4 °C, per 10 minuti, ed eliminare il surnatante.
- Risospendere i nuclei in 1 mL di tampone di lavaggio dei nuclei con una punta di pipetta ad ampio foro e trasferirli in un tubo di citometria a flusso (FACS).
- Aggiungere 300 μL di soluzione per la rimozione dei detriti (tabella dei materiali) e mescolare accuratamente mediante pipettaggio con una punta a foro largo fino a quando la miscela è omogenea.
- Sovrapporre delicatamente 1 mL di tampone di lavaggio nuclei sopra la soluzione di nuclei preparata al punto 3.9 utilizzando una pipetta P1000 e tenendo il tubo con una leggera angolazione (Figura supplementare 2). La frazione della soluzione di rimozione dei detriti e la frazione tampone di lavaggio dei nuclei dovrebbero formare un'interfaccia chiara se stratificate correttamente.
- Centrifugare in un rotore a benna oscillante a 3000 x g, 4 °C, per 10 min. Eliminare completamente le due fasi superiori utilizzando una pipetta P1000.
NOTA: Il tubo FACS trasparente consentirà la visualizzazione delle tre fasi distinte dopo la centrifugazione (superiore, interfase, inferiore). Per facilitare la massima rimozione dei detriti, si consiglia di essere più aggressivi che conservativi nella rimozione delle due fasi superiori (cioè, rimuovere una piccola quantità della fase inferiore è preferibile al trasporto di una qualsiasi delle fasi superiori; Figura supplementare 2). Inoltre, il livello di interfase potrebbe essere troppo sottile per essere visualizzato. In questo caso, rimuovete il livello superiore (apparente), che contiene il livello di interfase. Lo strato inferiore che viene mantenuto dovrebbe contenere ~ 1 mL di volume totale. - Trasferire lo strato inferiore in un tubo conico da 15 mL preverniciato con BSA al 5%.
- Nel tubo conico, portare il volume a 15 ml con tampone di lavaggio dei nuclei e capovolgere tre volte per miscelare.
- Centrifugare in un rotore a benna oscillante a 1000 x g, 4 °C, per 10 min. Rimuovere accuratamente il surnatante .
- Risospendere immediatamente in 150 μL di tampone di lavaggio nuclei utilizzando una punta per pipetta ad ampio foro.
- Passare a una punta per pipetta standard impostata su ~300 μL. Prelevare l'intero campione e quindi collegare un filtro sulla punta da 40 μm all'estremità della punta della pipetta, facendo attenzione a non espellere il campione.
NOTA: i filtri a punta sono necessari per ottenere volumi più piccoli, necessari per mantenere una concentrazione di nuclei sufficiente per le applicazioni a valle. Ad esempio, per snRNA-seq che utilizza la microfluidica, si raccomanda una concentrazione minima di >300 nuclei/μL, sebbene l'intervallo ottimale sia 700-1200 nuclei/μL18. Concentrazioni più elevate di nuclei possono anche essere facilmente diluite se necessario. - Filtrare il campione espellendolo con forza attraverso il filtro in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL a basso legame del DNA. Il volume finale di eluizione deve essere di 120-150 μL.
NOTA: Dalla filtrazione può derivare una schiuma. Ciò non sembra influire sulla qualità dei nuclei.
4. Valutare la qualità dei nuclei al microscopio
- In una provetta separata per microcentrifuga, mescolare 10 μL del campione filtrato con 10 μL di soluzione di tripano blu allo 0,4% mediante pipettaggio delicato. I campioni non richiedono tempi di incubazione prolungati e sono pronti per la visualizzazione immediatamente dopo la miscelazione con la soluzione di tripano blu.
- Depositare 10 μL dei nuclei colorati in una camera di un vetrino della camera di conteggio.
NOTA: In alternativa, depositare 10 μL del campione di nuclei colorati su un emocitometro o un vetrino da microscopia e coprire con un vetrino di copertura. - Valutare la qualità dei nuclei mediante microscopia ottica.
NOTA: gli ingrandimenti più bassi devono essere utilizzati solo per ingrandire i nuclei, poiché i difetti dei nuclei saranno visivamente evidenti solo a ingrandimenti più elevati (cioè 60x o superiori). Questo passaggio può essere fatto rapidamente per valutare il successo della preparazione dei nuclei e non richiede un'analisi secondaria oltre l'ispezione visiva. I nuclei intatti di alta qualità avranno un bordo nettamente definito20 (Figura 2A). I nuclei di scarsa qualità avranno membrane nucleari interrotte, colorazione blu tripano irregolare vicino alla membrana nucleare indicativa di potenziale perdita di acido nucleico e / o evidenza di blebbing20 (Figura 2B). I nuclei sani dovrebbero avere un diametro di 10-15 μm.
5. Quantificare nuclei di singoletto, detriti e proporzione di multipletti mediante citometria a flusso
NOTA: la terminologia specifica e l'interfaccia del software del citometro a flusso possono differire in base alla marca della macchina, ma questi passaggi dovrebbero essere facilmente adattati ad altri sistemi, se necessario.
- In una provetta FACS, risospendere 10 μL del campione di nuclei filtrati in 90 μL del tampone raccomandato per la citometria a flusso per una diluizione 1:10. A tale scopo, in questo studio viene utilizzato PBS sterilizzato filtrato da 0,22 μm, pH 7,2, con 2 mM EDTA e 0,5% di BSA.
NOTA: Sebbene questa diluizione funzioni per la maggior parte delle preparazioni dei nuclei, potrebbe essere necessaria una diluizione inferiore (ad esempio, 1:5) per campionare abbastanza nuclei per la valutazione della qualità nel caso di un campione a resa inferiore (cioè <30 nuclei / μL nel campione diluito). - Colorare i campioni con ioduro di propidio (PI) ad una concentrazione finale di 1 μg/ml. Non è richiesto alcun tempo di incubazione e i nuclei possono essere analizzati immediatamente.
NOTA: In alternativa, colorare i campioni con una concentrazione finale di 0,1 μg/mL DAPI. Si noti che DAPI deve essere letto su un canale di fluorescenza diverso da PI (canale Vioblue-A V1-A; eccitazione a 405 nm, emissione a 450/50 nm). - Analizzare i campioni su un citometro a flusso come segue:
- Configurare un'area di lavoro:
- Avere il citometro a flusso in modalità di acquisizione. Fare clic su File, quindi selezionare Nuova area di lavoro dal menu a discesa. Nella scheda Esperimento nel riquadro di sinistra, inserisci il nome del progetto e l'ID campione nei rispettivi campi.
- Nella barra degli strumenti in alto a sinistra, fate clic sul pulsante Nuova finestra di analisi (icona del grafico a dispersione). Fate clic sulla casella con tre grafici (Plot 4t) dal menu a comparsa. Tre grafici appariranno sullo schermo. Fare clic sul pulsante Modalità analisi nella barra degli strumenti in alto a sinistra (icona A) in modo che sia grigio e non arancione.
- Impostare i grafici di analisi:
- Modificate gli assi dei tre grafici come segue, ordinati rispettivamente come asse X e asse Y:
Grafico 1: Asse X: FSC-A, asse Y: SSC-A
Grafico 2: asse X: HDR-T, asse Y: SSC-A
Grafico 3: Asse X: PerCP-Vio700-A B3-A, asse Y: SSC-A - Modificare gli assi facendo clic sull'etichetta dell'asse e selezionando il canale desiderato dal menu a discesa.
- Impostate i grafici in modo che siano codificati a colori per densità facendo clic sull'icona quadrata grigia "i" visualizzata accanto all'angolo superiore destro di ogni grafico. Viene visualizzata una finestra Proprietà con un pannello di pulsanti sulla sinistra. Nella finestra Proprietà, fare clic sull'icona Grafico a dispersione (seconda dall'alto a sinistra del pannello). Fare clic su OK.
NOTA: Il canale di fluorescenza PerCP-Vio700-A B3-A corrisponde a un'eccitazione a 488 nm e ad un'emissione nell'intervallo 650-730 nm.
- Modificate gli assi dei tre grafici come segue, ordinati rispettivamente come asse X e asse Y:
- Impostare le impostazioni dello strumento:
- Fai clic sulla scheda Canali nel pannello di sinistra. Apparirà un elenco di tutti i canali con tre caselle a destra. Impostare B3, FSC-A e SSC-A su Hlog facendo clic sulla freccia rivolta verso il basso nelle rispettive prime caselle a destra e selezionando Hlog dal menu a discesa. Impostare la tensione di SSC su 640 V, FSC su 300 V e B3 su 480 V digitando questi numeri nelle rispettive caselle centrali a destra e premendo il tasto Invio . Si noti che la terza casella a destra è un interruttore che può essere utilizzato alternativamente per la digitazione.
- Sotto l'intestazione Trigger , impostare il trigger FSC su 4 e il trigger SSC e B3 su 0 facendo clic sulla freccia giù, selezionandoli dal menu a discesa a sinistra, digitando il numero nella casella a destra e quindi premendo il tasto Invio . Si noti che c'è una casella di attivazione / disattivazione sulla destra che può essere utilizzata in alternativa alla digitazione.
NOTA: Le tensioni PMT devono essere ottimizzate per ogni particolare macchina di citometria a flusso, ma il trigger per i nuclei deve essere inferiore a quello tipicamente utilizzato per le cellule. Inoltre, la scala dell'asse deve essere impostata su h-log.
- Digitare 100 μL nella casella di testo Volume campione e 50 μL nella casella di testo Volume di assorbimento sul lato sinistro della finestra del software di flusso. Verificare che il parametro Mix Sample sia impostato su Mix Gentle per evitare nuclei di lisatura in questo passaggio. Premi il triangolo all'interno di un cerchio (icona Play ) nell'angolo in basso a destra per avviare il flusso.
- Verificare la qualità del flusso:
- Utilizzare l'area di dispersione laterale (SSC-A) rispetto all'HDR-T per verificare la presenza di bolle d'aria o grumi nel campione. Assicuratevi che questo grafico sia un continuum regolare di punti. Bolle d'aria o grumi si tradurranno in regioni vuote nel grafico SSC-A rispetto a HDR-T.
- Controllare il grafico dello scatter laterale (SSC-A) rispetto allo scatter diretto (FSC-A) per verificare che le tensioni utilizzate siano corrette per il campione.
NOTA: A differenza delle cellule, i nuclei non si risolvono completamente dai detriti in un grafico a dispersione laterale rispetto al grafico a dispersione in avanti. Tuttavia, dovrebbe esserci un gruppo di eventi ad alta densità verso il centro del grafico corrispondente ai nuclei (di colore più caldo) con una densità inferiore di eventi (colorati più freddi) sullo sfondo corrispondenti ai detriti.
- Analizzare il conteggio e la qualità dei nuclei:
- Fare doppio clic sul grafico SSC-A rispetto a PerCp-Vio-700A per ingrandire. Fare clic sul pulsante sulla barra degli strumenti in alto a sinistra con linee perpendicolari (quadrante) per selezionare un cancello del quadrante. Quindi, fai clic in un punto qualsiasi del grafico SSC-A rispetto a PerCp-Vio-700A e i quadranti appariranno all'interno del grafico.
- Fare clic in un punto qualsiasi delle linee divisorie del quadrante e far scorrere il cursore per modificare il posizionamento del quadrante. Posizionare i quadranti in modo tale che il quadrante in alto a sinistra contenga la popolazione all'estrema sinistra (detriti) e il quadrante superiore destro contenga diversi cluster a forma di lacrima (nuclei) (vedere la Figura 3 per la configurazione del cancello ed esempi di risultati di flusso per risultati tipici con preparazioni che includono o non includono una fase di rimozione dei detriti).
- Detriti contro conteggi dei nuclei:
- Fare clic sull'icona quadrata grigia "i" nell'angolo in alto a destra del grafico per aprire la finestra Proprietà . Fare clic sulla scheda Funzioni regione ; Appariranno elenchi di regioni e funzioni di plot.
- Nell'elenco Regioni , assicurati un segno di spunta verde accanto all'elemento superiore, indicando che l'intero grafico è selezionato. Nell'elenco Funzioni , fare clic su Conteggio/μL per produrre un segno di spunta verde. Fare clic su OK e in ogni quadrante verrà visualizzata una metrica di conteggio / μL.
- Per visualizzare i conteggi e le percentuali non elaborati, selezionare Conteggio e %-T dalla scheda Funzioni regione , se lo si desidera. I conteggi/μL nei quadranti superiore sinistro e destro corrispondono rispettivamente alla resa dei detriti e dei nuclei.
- Conteggi di singoletti:
- Il grappolo a forma di lacrima più a sinistra nella parte inferiore del quadrante in alto a destra rappresenta le canottiere. Disegna una porta poligonale attorno a questa popolazione facendo clic sul pulsante poligono (Poligono) sulla barra degli strumenti in alto a sinistra.
- Fare clic una sola volta, far scorrere il mouse per iniziare a disegnare e fare nuovamente clic per completare un segmento lineare del cancello e iniziare quello successivo. Fare doppio clic per completare il cancello. Fare clic sul bordo del cancello e far scorrere il mouse per riposizionarlo.
- Fare clic sui vertici del cancello per modificare la forma. Appariranno conteggi/μL della popolazione gated (singoletti). Questa è la concentrazione della preparazione dei nuclei con la diluizione iniziale.
NOTA: La relazione lineare 1:1 tra area di dispersione diretta e altezza, comunemente usata per determinare la velocità di singoletto quando le cellule scorre, non si applica ai nuclei e può essere ignorata.
- Utilizzando la concentrazione della preparazione dei nuclei diluiti e il fattore di diluizione, calcolare la concentrazione della preparazione iniziale (ad esempio, per una diluizione 1:10, moltiplicare la concentrazione osservata per 10). Concentrazioni a partire da >300 nuclei/μL sono adatte per snRNA-seq.
- Configurare un'area di lavoro:
Representative Results
Il protocollo di isolamento dei nuclei cerebrali killifish qui descritto è ottimizzato specificamente per il killifish ed è riassunto nella Figura 1. Oltre all'estrazione dei nuclei, il protocollo descrive diversi metodi per valutare la qualità e la quantità dei nuclei isolati. La Figura 2 mostra esempi di nuclei sani (Figura 2A) e non sani (Figura 2B) valutati al microscopio ottico. Nuclei sani adatti all'analisi a valle (Figura 2A) si presentano come nuclei singoletti con membrane intatte. Come mostrato nella Figura 2B, la modalità di guasto più comune di questo protocollo (e di altri protocolli di isolamento dei nuclei) è la generazione di nuclei sovralisati, che sono caratterizzati da membrane nucleari danneggiate. Ciò porta spesso all'aggregazione dei nuclei e può contribuire ai segnali di fondo nelle applicazioni a valle a causa della perdita di acidi nucleici dai nuclei rotti. Se si osserva un'aggregazione eccessiva, si raccomanda di essere più delicati durante le fasi di dounce e/o di ridurre i tempi di incubazione nel tampone di lisi.
Questo protocollo utilizza la citometria a flusso per quantificare il numero di nuclei isolati e determinare la proporzione relativa di nuclei multipli in un campione. Inoltre, la citometria a flusso può essere utilizzata per valutare il contenuto relativo di detriti contaminanti, frammenti di nuclei spesso rotti e altri detriti cellulari che possono influenzare negativamente i saggi a valle nel campione di nuclei. I dati di flusso rappresentativi possono essere visualizzati nella Figura 3. Una procedura di isolamento dei nuclei di alta qualità produrrà: 1) una piccola frazione di detriti e 2) un'alta frazione di nuclei singoletto rispetto a multipli (> l'80% della frazione nucleica). L'uso della colorazione PI, che colora gli acidi nucleici, consente di separare i nuclei di singoletto dai detriti e dai nuclei multipli. La figura 3A è un esempio di preparazione contaminata da detriti, mentre la figura 3B è un esempio di esperimento di alta qualità.
Figura 1: Flusso di lavoro di isolamento dei nuclei cerebrali di Killifish. Flusso di lavoro sperimentale per l'isolamento di nuclei da cervelli di killifish congelati o freschi. Una volta isolati e valutati, i nuclei possono essere utilizzati per varie analisi "omiche" a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione della qualità dei nuclei mediante microscopia. I nuclei sono stati miscelati 1:1 in una soluzione di 0,4% di Trypan Blue e visualizzati su un microscopio Echo Revolve mediante imaging a campo chiaro a 60x. (A) Un esempio di nucleo di alta qualità. Il nucleo è presente come singoletto e la membrana nucleare è intatta. (B) Un esempio di nuclei di scarsa qualità. Le membrane nucleari sono danneggiate e i nuclei si stanno aggregando in un doppietto, probabilmente a causa della perdita di DNA appiccicoso, che può essere visto fuoriuscire dalla parte superiore del nucleo più alto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dei nuclei e valutazione della purezza mediante citometria a flusso. I campioni di nuclei sono stati colorati con una diluizione 1:100 di PI e eseguiti su un citometro a flusso. I nuclei sono presenti in forme singoletto e multipletto nel quadrante superiore destro di (A,B) con singoletti come la nube più bassa di eventi seguita da doppietti, terzine, ecc. in ordine crescente. I detriti sono contrassegnati dagli eventi nei due quadranti più a sinistra. (A) Un esempio di preparazione dei nuclei di bassa qualità, in cui la fase di rimozione dei detriti è stata omessa e i detriti costituiscono il >40% degli eventi. (B) Un esempio di campione di nuclei di alta qualità, con la fase di rimozione dei detriti inclusa. In questo esempio, i detriti costituiscono il <10% di tutti gli eventi registrati dal citometro a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Tipo di campione (2 cervelli) | Resa media (4 preparazioni indipendenti) |
| Cervelli maschili di 5 settimane | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| Cervelli maschili di 10 settimane | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| Cervelli maschili di 15 settimane | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| Cervelli femminili di 5 settimane | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| Cervelli femminili di 10 settimane | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| Cervelli femminili di 15 settimane | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Tabella 1: Rese medie attese da due cervelli di killifish turchese africano attraverso il sesso e l'età. Le rese medie espresse in 105 nuclei ± errore standard della media su quattro preparazioni di nuclei indipendenti in ciascuna categoria.
Figura supplementare 1: Confronto della qualità dell'isolamento dei nuclei utilizzando protocolli standard e il nostro protocollo ottimizzato su cervelli di killifish congelati. (A) Valutazione della qualità dei nuclei mediante microscopia. I nuclei sono stati miscelati 1:1 in una soluzione di 0,4% di Trypan Blue e visualizzati al microscopio mediante imaging a campo luminoso a 60x. (B) Quantificazione del carico di nuclei e detriti mediante citometria a flusso. I campioni di nuclei sono stati colorati con una diluizione 1:100 di PI e eseguiti su un citometro a flusso. (C) Riepilogo delle metriche di valutazione della qualità mediante microscopia e citometria a flusso con i diversi protocolli di riferimento. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Rappresentazione schematica delle fasi di rimozione dei detriti. (A) Schema di stratificazione della stratificazione per la rimozione dei detriti. (B) Schema di rimozione del surnatante dopo centrifugazione. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per generare in modo riproducibile nuclei di alta qualità da cervelli killifish. Questo protocollo doveva essere specificamente progettato per il cervello killifish poiché i tipici protocolli di isolamento dei nuclei cerebrali basati sui mammiferi applicati ai cervelli killifish hanno costantemente portato a una scarsa qualità dei nuclei nelle nostre mani. Sospettiamo che ciò sia dovuto al più basso contenuto di mielina relativa del cervello killifish rispetto alle loro controparti dei mammiferi, che si liserebbero e si aggregherebbero in risposta alle dure condizioni richieste per la lisi delle cellule cerebrali dei mammiferi. Questo protocollo è un progresso nei campi dell'invecchiamento e dei killifish in quanto facilita l'esplorazione dell'invecchiamento cerebrale a livello di singola cellula in un modello economico e tempestivo di invecchiamento cerebrale dei vertebrati.
Questo protocollo è robusto per campioni freschi o congelati, anche se è necessario considerare le applicazioni a valle quando si utilizza tessuto fresco o congelato. Il tessuto congelato è spesso conveniente in quanto può essere raccolto e conservato per mesi mentre vengono raccolti i campioni. Tali campioni possono essere tranquillamente utilizzati per applicazioni come snRNA-seq. Tuttavia, il congelamento dei campioni può interrompere la struttura nucleare e quindi la capacità di misurare con precisione il paesaggio cromatinico da ATAC-seq21. Pertanto, per applicazioni a valle come ATAC-seq o snATAC-seq, si raccomanda di utilizzare cervelli appena sezionati invece di cervelli congelati. Inoltre, poiché tutti i passaggi dopo l'omogeneizzazione cerebrale possono essere eseguiti in parallelo, questo protocollo è suscettibile di eseguire più campioni in un lasso di tempo ragionevole, limitando così la degradazione dell'RNA causata da un'incubazione prolungata sul ghiaccio.
Inoltre, è imperativo preparare i tamponi freschi (entro poche ore) dall'esecuzione dell'estrazione dei nuclei. Abbiamo scoperto che i detergenti e BSA devono essere aggiunti ai tamponi immediatamente prima di iniziare il protocollo. I tamponi contenenti solo sali (PBS, NaCl, ecc.) possono essere prodotti come concentrati, sterilizzati con filtro (0,22 μm) e conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente. Le soluzioni madre BSA possono essere preparate, sterilizzate e conservate a 4 °C entro pochi giorni dall'estrazione dei nuclei (se preparate da polvere), ma devono sempre essere aggiunte ai tamponi utilizzati in questo protocollo immediatamente prima di intraprendere il protocollo. Tuttavia, si consiglia di preparare le soluzioni BSA il giorno del protocollo. Se si utilizzano soluzioni BSA prefabbricate da terzi, si consiglia di utilizzare bottiglie fresche e non aperte. L'uso di BSA fresco porta generalmente a un contenuto inferiore di detriti nella preparazione dei nuclei.
Sia che vengano utilizzati campioni freschi o congelati come input, è importante valutare la qualità dei nuclei dopo l'isolamento dei nuclei. Sebbene questo protocollo sia specificamente progettato per evitare l'eccessiva, questa è la causa più comune di perdita di qualità dei nuclei. L'eccessiva lisi può derivare da un tempo eccessivo trascorso nel tampone di lisi, da una manipolazione eccessivamente approssimativa dei nuclei come un pipettaggio eccessivo con una punta di pipetta standard o da una quantità eccessiva di tempo trascorso tra l'isolamento dei nuclei e le applicazioni a valle (>1 ora). I nuclei sovralisati hanno spesso periferie nucleari danneggiate, che perdono DNA e causano aggregazione (Figura 2B). Ciò porterà ad un aumento del numero di multipletti e contribuirà agli acidi nucleici di fondo che interferiranno con le applicazioni a valle, in particolare snRNA-seq. Entrambe le qualità possono essere valutate al microscopio dopo l'isolamento dei nuclei. Se si osserva un eccessivo aggregazione nucleare, si consiglia di provare ad abbreviare l'incubazione della fase di lisi per ridurre la possibilità di iperlisi. Come metodo alternativo per aumentare i singoletti dei nuclei, la selezione cellulare assistita da fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per arricchire i singoletti a valle di questo protocollo. Tuttavia, notiamo che, quando si lavora con nuclei già fragili da tessuto congelato, lo stress di taglio che si verifica durante la selezione può portare ad un aumento della rottura nucleare e quindi ad un aumento dell'RNA / DNA ambientale. Inoltre, notiamo che il tempo necessario per eseguire un FACS yield sort per i nuclei durante l'elaborazione di più campioni richiederebbe che tutti i campioni di nuclei rimangano sul ghiaccio per ore, mentre altri campioni vengono ordinati. Pertanto, l'aumento dei tempi di attesa durante l'elaborazione di più campioni in parallelo con l'approccio FACS potrebbe anche portare a una qualità complessiva ridotta dei nuclei e aumentare il rischio di degradazione dell'RNA. Pertanto, se FACS è desiderato per una velocità di doppietto ridotta, raccomandiamo che il contenuto di detriti venga controllato nuovamente dopo il tipo di resa e che la possibile qualità ridotta dell'RNA sia presa in considerazione per le applicazioni di RNA-seq a singola cellula come potenziale avvertimento.
Una stima accurata della conta dei nuclei e della proporzione di singoletto è essenziale per quasi tutte le applicazioni "omiche" a valle ed è della massima importanza. Grazie alla capacità di controllare e contare facilmente i nuclei per dimensione, la citometria a flusso è il metodo più accurato di conteggio dei nuclei che abbiamo valutato. In alternativa, è possibile quantificare i nuclei utilizzando contatori di cellule come il contatore automatico di cellule Countess 2 FL di Invitrogen o il contatore automatico di celle DeNovix CellDrop. Da notare, il contatore automatico di celle Countess 2 FL di Invitrogen e, in misura molto minore, il DeNovix, tendono a sovrastimare i conteggi dei nuclei contando i detriti come nuclei, il che significa che potrebbe essere necessario il gating manuale delle dimensioni. Inoltre, il citometro a flusso consente di valutare facilmente la purezza dei nuclei. Si può discernere la proporzione relativa dei nuclei di singoletto rispetto ai nuclei di multipletti in un modo quantitativo che è difficile al microscopio. Ciò è vitale per snRNA-seq e snATAC-seq, poiché tali protocolli soffriranno di un surplus di campioni multipli, che devono essere esclusi dalle analisi a valle. Oltre ai multipletti, la proporzione relativa di "detriti" (nuclei frammentati, detriti cellulari) può essere quantificata mediante citometria a flusso e deve essere relativamente bassa, poiché questo materiale contiene spesso acidi nucleici contaminanti che possono contribuire a un segnale di fondo e corrompere i dati "omici" del singolo nucleo.
Come per i protocolli di isolamento dei nuclei precedentemente descritti, le proporzioni dei tipi cellulari nel tessuto originale potrebbero non essere ricapitolate fedelmente nella preparazione dei nuclei19, e quindi dovrebbero essere interpretate con cautela. Da notare, come tutti i teleostei, i killifish turchesi africani hanno eritrociti nucleati, che dovrebbero anche essere rappresentati nella preparazione dei nuclei. Questi nuclei possono essere identificati nei set di dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla maggiore espressione/accessibilità dei geni dell'emoglobina e possono essere esclusi computazionalmente se lo si desidera.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Alcuni pannelli sono stati generati con BioRender.com. Questo lavoro nel nostro laboratorio è stato supportato dal NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant a B.T., una sovvenzione della Simons Foundation come parte della Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, una sovvenzione pilota della Navigage Foundation e un premio Hanson-Thorell Family a B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
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