Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner fra hjernen til den kortvarige virveldyrmodellen Nothobranchius furzeri for nedstrøms applikasjoner som enkeltkjerne RNA-sekvensering eller enkeltkjerneanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (ATAC-seq).
Å studere hjernens aldring ved enkeltcelleoppløsning i vertebratsystemer er fortsatt utfordrende på grunn av kostnader, tid og tekniske begrensninger. Her demonstrerer vi en protokoll for å generere enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) biblioteker fra hjernen til den naturlig kortvarige vertebraten afrikanske turkise killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanske turkise killifish har en levetid på 4-6 måneder og kan plasseres på en kostnadseffektiv måte, og reduserer dermed kostnads- og tidsbarrierer for å studere vertebrat hjerne aldring. Imidlertid er det behov for skreddersydde protokoller for å isolere kjerner av tilstrekkelig kvalitet for nedstrøms enkeltcelleforsøk fra hjernen til ung og eldre fisk. Her demonstrerer vi en empirisk optimalisert protokoll for isolering av høykvalitets kjerner fra hjernen til voksen afrikansk turkis killifish, et kritisk skritt i genereringen av høykvalitets enkeltkjerner omiske biblioteker. Videre viser vi at trinnene for å redusere forurensende bakgrunns-RNA er viktige for å tydelig skille celletyper. Oppsummert demonstrerer denne protokollen muligheten for å studere hjernens aldring i ikke-tradisjonelle vertebratmodellorganismer.
Å forstå mekanismene for vertebrat hjerne aldring er avgjørende for å håndtere aldersrelaterte neurodegenerative sykdommer som Alzheimers og demens1. Den afrikanske turkise killifish (Nothobranchus furzeri) er den korteste levde vertebraten som kan avles i fangenskap, og på grunn av sin korte levetid og aldersassosierte kognitive svekkelse, er det en utmerket hjerne aldringsmodell 2,3,4,5. Nylig har adventen av encellede “omics” -teknologier, som enkeltkjerner RNA-seq (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalyse for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (snATAC-seq), tillatt forskere å forhøre den aldrende hjernen med en enestående oppløsning 6,7,8. Disse metodene er avhengige av kjerneisolering, siden gjenoppretting av hjerneceller som nevroner ofte er for utfordrende til å isolere 6,7,8,9,10. Imidlertid er de fleste publiserte kjerneisolasjonsprotokoller optimalisert for pattedyrmodellorganismer 11,12,13,14,15. Siden det for tiden er et udekket behov for å isolere hjernekjerner i killifish som en kommende ny modellorganisme innen aldringsforskning2, er målet med denne protokollen å etablere en metode for å isolere høykvalitetskjerner fra frosset hjerne killifish vev.
Her etableres en strømlinjeformet og robust arbeidsflyt som bruker allment tilgjengelige materialer for å isolere kjerner av høy kvalitet fra killifish hjerner. Denne protokollen ble modifisert fra en 10x Genomics-protokoll for musehjerner for å imøtekomme hjernene med lavere myelininnhold i afrikanske turkise killifish, skjørheten til frosset vev og behovet for å redusere innholdet av omgivende rusk for sekvenseringsrelaterte applikasjoner16. Faktisk fører tidligere optimaliserte protokoller for pattedyrs hjernevev17,18 til dårlig kjernekvalitet (dvs. overlyse) og / eller høyt ruskinnhold når de brukes på frosne killifish-hjerner, noe som gjør dem uegnet til bruk med snRNA-seq i henhold til anbefalinger for enkeltkjerner RNA-seq ved bruk av mikrofluidikk (supplerende figur 1).
I tillegg til kjerneisolering demonstrerer vi hvordan man vurderer kjernekvalitet og utbytte ved mikroskopi og flowcytometri. Denne artikkelen gir eksempler på både optimale og suboptimale resultater og diskuterer feilsøking. Denne protokollen ble designet og optimalisert for frosne killifish hjerner, men kan også brukes uten store modifikasjoner på nydissekerte killifish prøver. Killifish hjernekjerner isolert ved hjelp av denne metoden er optimalisert for bruk i enkeltkjerne RNA-seq (snRNA-seq) som en nedstrøms applikasjon, men bør også være egnet for bruk i snATAC-seq og bulk ATAC-seq.
Protokollen som presenteres her kan brukes til å reproduserbart generere høykvalitets kjerner fra killifish hjerner. Denne protokollen måtte være spesielt designet for killifish-hjernen, da typiske pattedyrbaserte hjernekjerneisolasjonsprotokoller brukt på killifish-hjerner konsekvent resulterte i dårlig kjernekvalitet i våre hender. Vi mistenker at dette skyldes det lavere relative myelininnholdet i killifish-hjernen sammenlignet med deres pattedyrs kolleger, noe som vil lyse og klumpe seg som svar på de tøffe forholdene som kreves for pattedyrs hjernecellelyse. Denne protokollen er et fremskritt i aldrings- og killifish-feltene, da det letter utforskningen av hjernens aldring på enkeltcellenivå i en kostnads- og tidseffektiv modell av vertebrat hjerne aldring.
Denne protokollen er robust for ferske eller frosne prøver, selv om man må vurdere nedstrømsapplikasjonene når man bruker ferskt eller frosset vev. Frosset vev er ofte praktisk da det kan samles inn og lagres i flere måneder mens prøver samles inn. Slike prøver kan trygt brukes til applikasjoner som snRNA-seq. Frysing av prøver kan imidlertid forstyrre kjernestrukturen og dermed evnen til nøyaktig å måle kromatinlandskapet ved hjelp av ATAC-seq21. For nedstrøms applikasjoner som bulk ATAC-seq eller snATAC-seq anbefales det derfor å bruke nydissekerte hjerner i stedet for frosne hjerner. I tillegg, fordi alle trinn etter hjernehomogenisering kan utføres parallelt, er denne protokollen egnet til å kjøre flere prøver i en rimelig tidsramme, og dermed begrense RNA-nedbrytning forårsaket av langvarig inkubasjon på is.
Videre er det viktig å forberede buffere friske (innen timer) for å utføre kjerneutvinning. Vi fant ut at vaskemidler samt BSA må tilsettes buffere umiddelbart før protokollen begynner. Buffere som bare inneholder salter (PBS, NaCl, etc.) kan fremstilles som konsentrater, filtersteriliseres (0,22 μm) og lagres på ubestemt tid ved romtemperatur. BSA-stamløsninger kan fremstilles, steriliseres og oppbevares ved 4 °C innen dager etter at kjernene er ekstraksjon (hvis de fremstilles fra et pulver), men bør alltid tilsettes bufferne som brukes i denne protokollen umiddelbart før protokollen overtas. Vi anbefaler imidlertid å forberede BSA-løsninger på protokolldagen. Hvis du bruker forhåndslagde BSA-løsninger fra en tredjepart, anbefales det å bruke friske, uåpnede flasker. Bruk av fersk BSA fører generelt til lavere ruskinnhold i kjernepreps.
Enten ferske eller frosne prøver brukes som input, er det viktig å vurdere kjernekvaliteten etter kjerneisolering. Selv om denne protokollen er spesielt utviklet for å unngå overlys, er dette den vanligste årsaken til tap av kjernekvalitet. Overlysis kan skyldes for mye tid brukt i lysisbufferen, altfor grov håndtering av kjernene, for eksempel overdreven pipettering med en standard borepipettespiss, eller for mye tid brukt mellom kjerneisolasjon og nedstrøms applikasjoner (>1 time). Overlyserte kjerner vil ofte ha skadede kjernefysiske periferier, som lekker DNA og forårsaker klumping (figur 2B). Dette vil føre til et økt antall multipleter og bidra med bakgrunnsnukleinsyrer som vil forstyrre nedstrøms applikasjoner, spesielt snRNA-seq. Begge kvaliteter kan vurderes ved mikroskopi etter kjerneisolering. Hvis overdreven kjernefysisk klumping observeres, anbefaler vi at du prøver å forkorte lysistrinnets inkubasjon for å redusere sjansen for overlys. Som en alternativ metode for å øke nuclei singlets, kan fluorescensassistert cellesortering (FACS) brukes til å berike for singleter nedstrøms for denne protokollen. Vi bemerker imidlertid at når du arbeider med allerede skjøre kjerner fra frosset vev, kan skjærspenningen som oppstår under sortering føre til økt nukleær ruptur og dermed økt omgivende RNA / DNA. I tillegg bemerker vi at tiden som kreves for å kjøre en FACS-utbyttesortering for kjerner ved behandling av flere prøver, vil kreve at alle kjerneprøver forblir på is i flere timer, mens andre prøver blir sortert. Dermed kan økte ventetider ved behandling av flere prøver parallelt med FACS-tilnærmingen også sannsynligvis føre til total redusert kjernekvalitet og øke risikoen for RNA-nedbrytning. Hvis FACS er ønsket for redusert dobbelhastighet, anbefaler vi derfor at ruskinnholdet kontrolleres igjen etter utbyttesorteringen, og at mulig redusert RNA-kvalitet tas i betraktning for enkeltcellede RNA-seq-applikasjoner som et potensielt forbehold.
Et nøyaktig estimat av kjernetall og singlet-andel er avgjørende for nesten alle nedstrøms “omics” -applikasjoner og er av største betydning. På grunn av muligheten til enkelt å portere og telle kjerner etter størrelse, er flowcytometri den mest nøyaktige metoden for å telle kjerner som vi har vurdert. Alternativt kan man kvantifisere kjerner ved hjelp av celletellere som Invitrogens grevinne 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. For å merke seg, har Invitrogens grevinne 2 FL Automated Cell Counter, og i mye mindre grad DeNovix, en tendens til å overvurdere kjernetellinger ved å telle rusk som kjerner, noe som betyr at manuell størrelse gating kan være nødvendig. Videre gjør flowcytometeret det mulig å enkelt vurdere renheten til kjernene. Man kan skjelne den relative andelen singlet versus multiplet kjerner på en kvantitativ måte som er vanskelig ved mikroskopi. Dette er viktig for snRNA-seq og snATAC-seq, siden disse protokollene vil lide av et overskudd av multipletprøver, som må utelukkes fra nedstrømsanalyser. I tillegg til multipleter kan den relative andelen “rusk” (fragmenterte kjerner, cellulært rusk) kvantifiseres ved flowcytometri og må være relativt lav, siden dette materialet ofte inneholder forurensende nukleinsyrer som kan bidra med bakgrunnssignal og korrupte enkeltkjerne “omics” -data.
Som med tidligere beskrevne kjerneisolasjonsprotokoller, kan proporsjonene av celletyper i det opprinnelige vevet ikke rekapituleres trofast i kjernene prep19, og bør derfor tolkes med forsiktighet. For å merke seg, som alle teleosts, har afrikanske turkise killifish nukleerte erytrocytter, som også forventes å være representert i kjernene prep. Disse kjernene kan identifiseres i snRNA-seq og snATAC-seq datasett ved høyere uttrykk / tilgjengelighet av hemoglobingener og kan utelukkes beregningsmessig om ønskelig.
The authors have nothing to disclose.
Noen paneler ble generert med BioRender.com. Dette arbeidet i laboratoriet vårt ble støttet av NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant til B.T., et stipend fra Simons Foundation som en del av Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, et pilotstipend fra Navigage Foundation, og en Hanson-Thorell Family-pris til B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |