Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Ovo og Ex Ovo metoder til undersøgelse af aviær indre øre udvikling

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64172
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, *1, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology
* These authors contributed equally

Summary

Kyllingen er en omkostningseffektiv, tilgængelig og bredt tilgængelig modelorganisme til en række undersøgelser. Her er en række protokoller detaljeret for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udvikling og regenerering af fugle i det indre øre.

Abstract

Det indre øre opfatter lyd og opretholder balance ved hjælp af cochlea og vestibule. Det gør det ved hjælp af en dedikeret mekanosensorisk celletype kendt som hårcellen. Grundforskning i det indre øre har ført til en dyb forståelse af, hvordan hårcellen fungerer, og hvordan dysregulering kan føre til høretab og svimmelhed. Til denne forskning har musen været det fremtrædende modelsystem. Mus har dog, som alle pattedyr, mistet evnen til at erstatte hårceller. Når man forsøger at forstå cellulære terapier til genoprettelse af indre ørefunktion, kan komplementære undersøgelser i andre hvirveldyrarter således give yderligere indsigt. Det auditive epitel af fugle, basilar papilla (BP), er et ark epitel sammensat af mekanosensoriske hårceller (HC'er) interkaleret af understøttende celler (SC'er). Selvom den anatomiske arkitektur af basilar papilla og pattedyr cochlea er forskellige, er de molekylære mekanismer for indre øreudvikling og hørelse ens. Dette gør basilar papilla til et nyttigt system til ikke kun sammenlignende undersøgelser, men også til at forstå regenerering. Her beskriver vi dissektions- og manipulationsteknikker til kyllingens indre øre. Teknikken viser genetiske og små molekylehæmningsmetoder, som tilbyder et potent værktøj til at studere de molekylære mekanismer i udviklingen af det indre øre. I dette papir diskuterer vi i ovo elektroporationsteknikker til genetisk at forstyrre basilarpapillen ved hjælp af CRIPSR-Cas9-deletioner efterfulgt af dissektion af basilarpapillen. Vi demonstrerer også BP-organkulturen og optimal brug af kulturmatricer for at observere udviklingen af epitelet og hårcellerne.

Introduction

Det indre øre af alle hvirveldyr er afledt af et simpelt epitel kendt som den otiske placode 1,2. Dette vil give anledning til alle de strukturelle elementer og de celletyper, der er nødvendige for at transducere de mekanosensoriske oplysninger, der er forbundet med hørelse og balanceopfattelse. Hårceller (HC'er), den cilierede sensor i det indre øre, er omgivet af understøttende celler (SC'er). HC'er videresender information til den auditive baghjerne gennem neuronerne i den ottende kraniale nerve. Disse genereres også fra den otiske placode3. Den primære transduktion af lyd opnås ved den apikale overflade af den auditive HC gennem et mekanisk følsomt hårbundt4. Dette formidles gennem modificerede actinbaserede fremspring kaldet stereocilia, som er arrangeret i et gradueret trappemønster5. Derudover organiserer et modificeret primært cilium, kaldet kinocilium, hårbundtdannelse og støder op til den højeste række stereocilia 6,7,8. Stereocilias arkitektur er afgørende for denne rolle i at konvertere mekaniske stimuli afledt af akustisk energi til elektriske neurale signaler9. Skader på den auditive HC gennem aldring, infektion, otoakustisk traume eller ototoksisk shock kan resultere i delvist eller fuldstændigt høretab, der hos pattedyr er irreversibelt10.

Cellulære erstatningsterapier er blevet foreslået, der kan reparere sådanne skader11,12. Tilgangen til denne forskning har været at forstå den normale udvikling af pattedyrs hårcelle og spørge, om udviklingsprogrammer kan genoptages i stamfaderlignende celler, der kan eksistere i det indre øre13. En anden tilgang har været at se uden for pattedyr, til ikke-pattedyrs hvirveldyr, hvor robust regenerering af auditive hårceller finder sted, såsom fugle14,15. Hos fugle forekommer hårcelleregenerering overvejende gennem dedifferentiering af en understøttende celle til en stamfaderlignende tilstand efterfulgt af asymmetrisk mitotisk opdeling for at generere en hårcelle og understøttende celle16. Derudover er direkte differentiering af en understøttende celle til at generere en hårcelle også blevet observeret17.

Mens mekanismerne for fugleauditiv udvikling viser betydelige ligheder med pattedyrs, er der forskelle18. HC- og SC-differentieringen i kyllingen BP er tydelig fra fosterdagen (E) 7 og bliver mere tydelig over tid. Ved E12 kan en velmønstret og velpolariseret basilarpapilla (BP) visualiseres, og ved E17 kan veludviklede hårceller ses19. Disse tidspunkter giver vinduer ind i mekanismerne for differentiering, mønster og polaritet samt hårcellemodning. Det er vigtigt at forstå, om sådanne mekanismer er bevaret eller divergerende, da de giver indsigt i den dybe homologi af oprindelsen af mekanosensoriske hårceller.

Her demonstrerer vi en række teknikker udført på tidlige og sene embryonale stadier for at studere cellulære processer såsom spredning, skæbnespecifikation, differentiering, mønster og vedligeholdelse gennem udviklingen af det indre øreorgan. Dette supplerer andre protokoller til forståelse af indre øreudvikling i explantkultur20,21,22. Vi diskuterer først introduktionen af eksogent DNA eller RNA i BP-prækursorer inden for E3.5 otocyst ved anvendelse i ovo-elektroporation. Selvom genetiske manipulationer kan give værdifuld indsigt, kan de således genererede fænotyper være pleiotropiske og følgelig forvirrende. Dette gælder især under senere udvikling af indre øre, hvor grundlæggende processer såsom cytoskeletal ombygning spiller flere roller i celledeling, vævsmorfogenese og cellulær specialisering. Vi præsenterer protokoller for farmakologisk hæmning i dyrkede explants, som giver fordele ved at kontrollere dosering og behandlingstid og varighed, hvilket giver præcis spatiotemporal manipulation af udviklingsmekanismer.

Forskellige organkulturmetoder kan anvendes afhængigt af behandlingsvarigheden af små hæmmere. Her demonstrerer vi to metoder til organkultur, der giver indsigt i epitelmorfogenese og cellulær specialisering. En metode til 3D-kultur ved hjælp af kollagen som en matrix til dyrkning af cochlear-kanalen muliggør robust dyrkning og levende visualisering af den udviklende BP. For at forstå dannelsen af stereocilia præsenterer vi en membrankulturmetode, således at epitelvæv dyrkes på en stiv matrix, der gør det muligt for actinfremspring at vokse frit. Begge metoder tillader downstream-behandling såsom levende cellebilleddannelse, immunohistokemi, scanningselektronmikroskopi (SEM), celleoptagelse osv. Disse teknikker giver en køreplan for effektiv brug af kyllingen som et modelsystem til at forstå og manipulere udviklingen, modningen og regenereringen af fugleens auditive epitel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokoller, der involverer indkøb, dyrkning og brug af befrugtede kyllingæg og ikke-udklækkede embryoner, blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité ved National Center for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.

1. I ovo elektroporation af chick auditive prækursorer

  1. sgRNA-design og kloning til CRISPR/Cas9-gen-knockout
    1. For at skabe gen-knockouts skal du designe guide RNA'er for at forstyrre exonregionerne i genet, helst tættere på 5'-enden af kodningsregionen.
    2. Vælg de potentielle guide RNA'er ved hjælp af et webværktøj CRISPOR23. Indstil browserdataene til Gallus gallus og protospaceren tilstødende motiv (PAM) sekvens til 5 '- NGG -3'. Programmet bestemmer guide-RNA'er fra inputsekvensen og tildeler forskellige scoringer baseret på on-target og off-target aktivitet. Vælg de fire bedste vejledninger til yderligere undersøgelser.
    3. Til design af skabelonspecifikke oligoer til guide (g) RNA-produktion skal du fjerne PAM-sekvensen (5′- NGG -3′) fra gRNA-designværktøjets output. Dette er ikke nødvendigt til målretning, men indeholder Cas9-spaltningsgenkendelsessekvensen. Syntetiser to HPLC-rensede komplementære oligoer med BsmBI-begrænsningssted i begge ender for hvert potentielt gRNA.
    4. Klon guidesekvensen i ramme med et tracrRNA-stillads af en vektor efter eget valg (her blev pcU6_1sgRNA vektor brugt24).
    5. SgRNA-oligonukleotiderne opløses i en koncentration på 100 μM i DNase/RNase-frit vand. Udfør udglødning af de to sanse- og antisense oligo-guider ved hjælp af en termocykler med følgende parametre: 95 ° C i 3 minutter, derefter 37 ° C i 15 min, og fald derefter til 4 ° C.
    6. Ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker som beskrevet i25 opsættes restriktionsfordøjelsen af de udglødede oligoer og pcU6_1sgRNA kloningsvektor med BsmBI-enzym natten over. Opsætning af ligering med den geloprensede lineære BsmBI-fordøjede pcU6_1sgRNA vektor og fordøjede sgRNA-oligoer. Omdan til en DH5-alfa kompetent celle og sekvens bekræfte den opnåede klon.
  2. Æghåndtering og vinduesdeling
    1. Anskaf frisklagte æg og rengør dem ved at tørre dem med 70% ethanol for at forhindre forurening. Inkuberes ved 37-38 ° C med 45% fugtighed i 3,5-4 dage.
    2. Efter inkubation skal du placere ægget på siden i mindst 5 minutter før åbning. Dette gør det muligt for embryoet at omplacere sig til toppen af æggeblommen. Brug tang til at lave små huller i toppen og stump ende af ægget, så en 21G nål kan passere igennem.
    3. For at forhindre skader under vinduesvinduet skal du fjerne albumin for at sænke embryoet væk fra skallen. For at gøre dette skal du bruge en 5 ml sprøjte og en 21G nål til forsigtigt at trække 2 ml albumin fra et hul i den stumpe ende af ægget. Brug klar tape til at dække hullet i den stumpe ende.
    4. For at gøre ægvinduet skal du fastgøre klart tape på toppen af æggeskallen. Skær et vindue op, ca. 2 cm langt og 1,5 cm bredt, ved hjælp af fjederbuesaks og udsæt embryoet. Brug tang til at åbne chorionmembranerne, der ligger over embryoet, hvilket giver adgang til embryoet.
  3. Mikroinjektion af plasmider
    1. Til gen-knockout-eksperimentet skal du forberede to løsninger: knock-down-blandingen indeholdende SpCas9-protein og guideplasmid - pcU6_1sgRNA og sporplasmidblandingen af T2K-eGFP (dette er en chick ß-actin-promotor, der driver GFP-kassette omgivet af transposonstederne i Tol2) sammen med T2TP (Tol2-transposase klonet i Tol2-konstruktion26,27). Sporstoffet bruges til at spore elektroporationseffektivitet.
    2. Ved elektropering af flere plasmider skal du sikre dig, at den endelige koncentration af DNA er mindst 4 μg / μL. Bland de tre konstruktioner, guide plasmid - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP og T2TP, i et forhold på 1: 1: 1 med 1 μg SpCas9-protein, 30% saccharose og 0,1% hurtigt grønt farvestof i et slutvolumen på 10 μL.
    3. Træk nåle til mikroinjektion fra standard glaskapillærer (længde 3 tommer, OD 1,0 mm) ved hjælp af en lodret pipettetrækker. Brug fin tang til at afbryde kapillærspidsen efter træk for at opnå en spidsdiameter på ca. 50 μm med en tilspidset ende.
    4. Læg embryonerne ved E3.5 på deres venstre side med hovedet vendt mod højre. På denne måde er kun den højre otiske vesikel tilgængelig til mikroinjektion. Mikro-injicer knock-down blandingen i otic vesicle. Injicer omkring et 200 nL volumen DNA-opløsningsblanding for at fylde den otiske vesikel.
    5. Bestem vejledningens effektivitet ved hjælp af et T7-endonukleaseassay28.
  4. Elektroporation
    1. Tilsæt et par dråber 0,719% saltvand oven på embryoet før elektroporation for at sænke den elektriske modstand og forhindre overophedning af embryoet.
    2. Placer den positive elektrode gennem hullet lavet på den stumpe side af ægget, når albuminet blev fjernet. Manøvrer elektroden, så den er under æggeblommen. Placer den negative elektrode over den fyldte otocyst.
    3. Brug elektroporation til at transficere plasmider i embryoets celler. Brug en firkantet pulsgenerator og påfør fem impulser af 25 V og 100 ms varighed hver, 50 ms fra hinanden. Bestem betingelserne empirisk baseret på en individuel elektroporationsopsætning.
    4. Hydrere embryoet efter elektroporation ved at tilføje et par dråber 0,719% saltvand. For at rense denatureret albumin fra elektrodernes overflade skylles det grundigt med destilleret vand. Forsegl ægget igen med klart tape og vend tilbage til den befugtede inkubator ved 37-38 °C for yderligere inkubation.
      BEMÆRK: Embryoner kan dyrkes indtil udklækning efter elektroporation, men der er en kraftig reduktion i levedygtigheden.

2. Basilar papilla dissektion

  1. Brug 70% ethanol til at desinficere det kirurgiske bord, mikroskopstadiet og det omkringliggende område. Varme- eller alkoholsteriliserende mikrodissektionsudstyr, der inkluderer minimalt fjederbuesaks, mikro-curette og to par fine tang.
  2. Forbered følgende dissektionsplader: en glas petriskål med en sort siliciumbase, en 90 mm plast petriskål og en 60 mm petriskål. Afkøl enten fosfatbufferet saltvand (PBS) eller Hanks 'Balanceret saltopløsning (HBSS) til dissektioner.
  3. Knæk forsigtigt ægget i 90 mm petriskålen. Identificer kyllingens ydre øre. Afhug embryoet ved at skære halsen lige under niveauet af underkæben ved hjælp af en saks. Overfør hovedet til en 60 mm petriskål fyldt med iskold PBS.
  4. Orienter embryoet med toppen af næbbet vendt mod eksperimentatoren, og hold næbbet ved hjælp af en af #5 tang. Scoop ud øjnene ved hjælp af den anden # 5 tang. Gå fra rostral til caudal, skær kraniet langs midterlinjen. Øse hjernen ud.
  5. Tilføj mere iskold PBS eller HBSS og find de to skinnende strukturer tæt på pinnaens niveau. Disse er lagenaens otolitter i slutningen af cochlearkanalen og findes tæt på midterlinjen.
  6. Skær groft mellem de to lagenas og langt over og under denne region for at isolere to indre ører. Under skrå belysning visualiseres omridset af det indre øre. Fjern fremmed væv og vestibulen.
  7. Overfør den isolerede cochlea til en sort silikone bundplade med iskold PBS. Brug #5 tang til at skrælle bruskkapslen væk for at opnå cochlear-kanalen. Find det bølgede lag (tegmentum) af cochlearkanalen, og fjern det ved hjælp af #55 tang for at udsætte BP.

3. Kultur af basilar papilla explants

  1. Membrankultur af BP
    1. Tag en seks-brønds vævskulturplade og arranger en kulturmembranindsats pr. Brønd.
    2. Den dissekerede basilarpapilla (explant) samles i en 200 μL pipette med 1x HBSS-buffer, og overfør den til en membran. For at forhindre, at vævet klæber til pipettens væg, skal du tegne nogle medier, før du aspirerer vævet.
    3. Orienter explanten, så basilarpapillen vender opad, så hår- og støttecellerne er synlige fra top29. Når explanten er placeret, skal du aspirere HBSS-bufferen langsomt fra kulturmembranoverfladen. I denne proces vil explanten fastgøres til kulturmembranen.
    4. Tilsæt 1,2 ml af Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) kulturmedie mellem membranindsatsen og brøndvæggen for at fylde brøndene på den seks-brøndede plade. Op til seks explants kan dyrkes på en enkelt 30 mm kulturmembran.
  2. Kollagenkultur af cochlearkanalen
    1. Forbered kollagenblanding ved at tilsætte 400 μL 3 mg / ml rottehalekollagen, 50 μL 10x DMEM, 30 μL 7,5% NaHCO3 og 5 μL HEPES i en vævskulturhætte.
    2. Tag en fire-brønd plade og tilsæt tre dråber kollagenblanding i hver brønd. Overfør dissekeret cochlearkanal til hver kollagendråbe. Pladen inkuberes i 10 minutter ved 37 °C, 5 % CO2 for at hærde kollagenmatrixen.
  3. Småmolekylebehandling af kulturer
    1. Forbered kulturmedier (DMEM, N-2 supplement, Penicillin) med enten den farmakologiske modulator eller dets opløsningsmiddel alene (til brug som kontrol). Udskift kulturmediet med 700 μL medier suppleret med inhibitoren. Dyrkning af explanterne i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
    2. Udskift 50% af kulturmedierne hver dag. Efter passende inkubationstid skal du fjerne kulturmediet og bruge explanterne til nedstrøms assays.

4. Billeddannelse og analyse

  1. Immunofluorescerende analyse
    1. Fjern kulturmedier fra brønde og vask explanterne to gange med 1x HBSS. Brug en pipette til at tilsætte 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) til brønden og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
    2. Fjern PFA og vask explanterne tre gange med 1x PBS ved stuetemperatur. For at opsamle explanterne fra kulturmembranen skal du lave et lille snit omkring membranen, der indeholder vævsstykket ved hjælp af en lille fjederbuesaks og overføre vævet sammen med membranen til en 48-brønds kulturplade ved hjælp af tang.
      BEMÆRK: Hvis vævene flyder efter fikseringen, skal du aspirere med en 200 μL pipette og overføre den til 48-brøndplader til videre behandling. Undgå kraftig løsrivelse af vævet fra membranen.
    3. Til kollagendråbekultur skal du bruge tang til at overføre hele kollagendråben til en siliciumplade. Tilsæt 200 μL 1x PBS og fjern kollagen ved hjælp af tang, og overfør derefter vævet til en 48-brønds kulturplade.
    4. Permeabilize explants med 1 ml 1x PBS suppleret med 0,3% Tween-20 (PBST) i 30 min ved stuetemperatur. Explanterne inkuberes med 200 μL blokerende buffer (10% gedeserum + 1% bovin serumalbumin i PBST) i 1 time ved stuetemperatur.
    5. Explanterne inkuberes med 200 μL primær antistofopløsning (1:300, i blokerende buffer) natten over ved 4 °C. Fjern den primære antistofopløsning og vask explanterne grundigt 5 x 20 min med PBST.
    6. Explanterne inkuberes med 200 μL phalloidin og sekundær antistofopløsning (i blokerende buffer) i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Phalloidin og sekundær antistofopløsning fjernes og explanterne vaskes grundigt 5 x 20 min med PBST.
      BEMÆRK: Sekundær antistofkoncentration og vaskelængde skal bestemmes for hver enkelt billeddannelsesapplikation. Til billeddannelse ved hjælp af superopløsningsmikroskopi øger vi typisk koncentrationen af det sekundære antistof fra 1:500 til 1:200 og øger koncentrationen af phalloidin fra 1:400 til 1:200.
    7. Udruges med en opløsning af DAPI (1:1000 i PBST) i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern DAPI-opløsningen og vask explanterne 3 x 5 min med PBST.
    8. Brug monteringsmediet til at montere explants på et dias med BP vendt opad (mod dækslippet). Til konfokal billeddannelse skal du bruge antifade monteringsmedier. Lad monteringsmediet tørre natten over ved stuetemperatur i mørke. Enten billede direkte eller gemme diasene ved 4 ° C indtil billeddannelse.
  2. OTOTO-fiksering til SEM-analyse
    1. Forbered alle løsninger friske og håndter i henhold til lokale sikkerhedsretningslinjer. Membrandyrkede eksplanter (fra trin 4.1.4) fikseres i 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylatbuffer (pH 7,3) med 3 mM CaCl2. Udfør fiksering ved 4 °C i 24 til 72 timer med et fikseringsmiddel hver 24. time.
    2. Fjern fikseringsmidlet og vask vævet med 0,1 M natriumcacodylate 3 x 5 min ved stuetemperatur. Sekundær fiksering med 1% OsO 4 (fortyndet fra en 4% OsO4-bestand ved hjælp af 0,1 M natriumkacodylatbuffer) i 1 time ved stuetemperatur. Udfør dette og de efterfølgende trin indtil dehydrering i en røghætte.
    3. Skyl med 0,1 M natriumcacodylatbuffer 3 x 5 min ved stuetemperatur. Skyl derefter i dobbeltdestilleret eller ultrarent vand 3 x 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Forbered en 0,5% opløsning af thiocarbohydrazid (TCH) i ultrarent vand. Rør ved 75 °C i 10 minutter, og filtrer opløsningen, når den er afkølet til stuetemperatur.
      BEMÆRK: TCH er ekstremt farligt. Brugen skal godkendes af det lokale sikkerhedsudvalg, og der skal udvises forsigtighed ved håndtering.
    5. Fjern ultrarent vand fra prøven og tilsæt 0,5% TCH dråbe for dråbe. Hvis opløsningen bliver brun, skal prøven stoppes og skylles med ultrarent vand, inden 0,5% TCH-opløsningen forsigtigt tilsættes. Når opløsningen er klar, skal du udskifte den med 0,5% TCH. Inkuberes ved stuetemperatur i 20 min30,31.
    6. Skyl prøven med ultrarent vand 3 x 5 min ved stuetemperatur. Gentag trin 4.2.2, 4.2.3 og 4.2.5 yderligere to gange, der slutter med OsO 4-inkubation efterfulgt af skylning.
    7. Dehydrere prøverne i en ethanolserie til 100% vandfri ethanol (EtOH). Inkuber først i 25% ETOH i 10 min, derefter 50% ETOH i 10 min, 75% EtOH i 10 min, 95% ETOH i 10 min, før der inkuberes i alt 3x i 10 min hver i 100% ETOH.
    8. Udfør kritisk punkttørring ved hjælp af flydende CO2. Monter straks prøverne på en SEM-stub med dobbeltsidet kulstofklæbebånd. Fortsæt med at sprøjte frakke for at give 5-10 nm belægning. Hvis du ikke billeddanner med det samme, skal prøverne opbevares i en ekssikkator under vakuum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I elektroporationsopsætningen kan elektrodepositionering spille en rolle inden for transfektion. Den positive elektrode placeres under æggeblommen og den negative over embryoet (figur 1A). Dette resulterer i højere GFP-ekspression i meget af det indre øre og både vestibulære organer (figur 1B) og auditiv basilar papilla (figur 1C, D), hvilket bekræfter transfektion.

Ved vurderingen af fænotypen af CRISPR-knockdowns designede vi guide-RNA'er til hårcelletranskriptionsfaktoren Atonal homolog 1 (Atoh1). Musemutanter af Atoh1 er ikke i stand til at danne hårceller32; efter elektroporation af Atoh1-guide-RNA'er og inkubation indtil E10 finder vi, at HC-udvikling er nedsat sammenlignet med kontrol, tom plasmidkontrol (figur 2). Selvom elektroporation er mosaik (figur 2E, F), er kontrolelektroporerede celler i stand til at danne hårceller. I Atoh1 gRNA elektroporerede prøver viser GFP-positive celler aldrig markørerne for HC-udvikling (figur 2B).

BP's organkultur giver adgang til vævet. Kulturer i en 3D-matrix, såsom kollagen, giver fremragende bevarelse af vævsmorfologi i op til 5 dage. Organiseringen af HC og SC opretholdes under disse kulturforhold (figur 3).

Orgelkulturer på en membran foretrækkes til billeddannelse af stereocilia. Sådanne kulturer kan dyrkes i op til 5 dage, samtidig med at hårbundtets integritet opretholdes. Dette kan ses ved lokaliseringen af tip-link-proteinet, protocadherin 1533 (Pcdh15) (figur 4). For at forhøre udviklingen af hårbundtet er billeddannelse med højere opløsning nødvendig, og sådanne tilgange ved hjælp af enten superopløsningsmikroskopi (figur 4D) eller scanningselektronmikroskopi (figur 4E) giver mere fuldstændige oplysninger.

Figure 1
Figur 1. GFP-ekspression er synlig ved E10 efter i ovo-elektroporation ved E4. (A) Skematisk diagram, der illustrerer i ovo-mikroinjektion og elektroporation i chick otic vesikel ved E4. Injektionspipetten er fyldt med Tol2-eGFP (T2K-eGFP) og Tol2-transposaser (T2TP) plasmider sammen med hurtigt grønt farvestof til visualisering. (B) Billede af det elektroporerede indre øre ved E10 ved hjælp af et 0,63x luftobjektivobjektiv på et stereomikroskop. Det venstre indre øre er den interne kontrol. Den røde pil markerer GFP-udtrykket i cochlearkanalen i højre indre øre, og den røde stjerne viser GFP-udtryk i vestibulære organer; skalastang er 2 cm. (C) Widefield fluorescensbillede af et tværsnit af højre cochlear-kanal ved hjælp af et 20x luftmål på 0,5 NA. GFP-ekspression er for det meste begrænset til det sensoriske epitel; skalabjælke er 10 μm. (D) Konfokalbillede af hele monteringsbasilar papilla afbildet ved hjælp af 10x luftmål på 0,5 NA farvet med phalloidin konjugeret med Alexa 647 fluorophore. GFP-ekspression observeres fra proksimal til distal ende på den neurale side af BP; Skalabjælken er 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. CRISPR/Cas9-medieret Atoh1 gen knockout viain ovo elektroporation resulterer i tab af hårceller (HC'er). Atoh1 genguide plasmid pcU6_1-Atoh1sgRNA og sporplasmiderne Tol2-eGFP (T2K-eGFP) og Tol2-transposaser (T2TP) med SpCas9-protein mikroinjiceres og elektroporeres i chick otic vesikel ved E4. Alle billederne er fra chick E10 basilar papilla med en 10 μm skala bar, taget med et 60x olienedsænkningsmål på 1,42 NA ved hjælp af et laserkonfokalmikroskop. Der er zoomet ind på alle billeder. (A, B, C, D) Venstre panel indeholder BP med hårceller (HC'er), elektroporeret med tom pcU6_1sgRNA og T2K-eGFP og T2TP med SpCas9-protein. (E,F,G,H) Panelet i højre side indeholder BP med tab af HC'er, elektroporeret med Atoh1-guide (pcU6_1-Atoh1sgRNA) og T2K-eGFP og T2TP med SpCas9-protein. (A,E) Flettet billede, der viser hårceller (HC'er) i basilarpapillen. Disse er immunreaktive for Myosin 7a (blå); F-actin farvet med phalloidin konjugeret med Alexa 647 (rød); GFP-ekspression fra Tol2-eGFP-plasmider detekteres ved anvendelse af et anti-GFP-antistof (grønt). Tabet af HC'er fremgår af Myosin 7a immunreaktivitet, når man sammenligner behandlinger med tom pcU6_1sgRNA (D) og pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). F-actin-billeddannelse fra begge behandlinger fremhæver hårbundtet af HC (B, F). (C,G) T2K-eGFP og T2TP bruges til at måle transfektionsplacering og effektivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Organkultur af cochlearkanal i 3D-kollagendråbekultur opretholder organisationen af sensorisk epitel. BP ved E10 dyrkes i en 3D-kollagendråbekultur i 1 dag og afbildes ved hjælp af 60x olienedsænkningsmål på 1,42 NA ved hjælp af et laserkonfokalmikroskop. (A) Billede af hele BP af E10 dyrket i 1 dag i en kollagendråbe og farvet med antistoffer mod hårcelleantigen (HCA)34. Skalabjælke er 100 μm. (B) Flettet billede, der viser den bevarede organisering af sensorisk epitel fra den distale side af BP farvet med (C) phalloidin (grøn) og (D) HCA (blå); Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Stereociliære bundter af basilar papilla under elektron og lysmikroskop. 0,1% dimethylsulfoxid (DMSO)-behandlet BP blev explantet ved E10 og dyrket i 3 dage in vitro (DIV) på membrankulturindsatser. (A) Explant er afbildet ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål på 1,42 NA med et laserscanningskonfokalmikroskop. Det fusionerede billede viser udtrykket af protocadherin 15 (Pcdh15) og stereocilia markeret med phalloidin konjugeret med Alexa 488 (grøn). Enkeltkanalsbilleder af F-actin ( B ) og Pcdh15 (C) vises. Skalabjælken er 10 μm. (D) Superopløsningsbillede af stereocilia farvet med phalloidin konjugeret med Alexa 488-farvning i grønt. Billedet blev opnået ved hjælp af et 63x olienedsænkningsmål på 1,42 NA i Airyscan-tilstand af laserscanning af konfokalmikroskop. Skalabjælken er 5 μm. ( E) SEM-billedet blev taget ved 16340x forstørrelse ved hjælp af 7 kV elektronhøjspænding (EHT) spænding. Rød stjerne markerer kinocilia og røde kilemærker stereocilia. Lysstyrke og kontrast blev justeret til auto, og billedet blev skærpet ved hjælp af FIJI. Skalabjælken er 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kyllingen er en omkostningseffektiv og bekvem tilføjelse til de modelorganismer, som et laboratorium kan bruge til at undersøge det indre øre. De metoder, der er beskrevet her, anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium og supplerer løbende forskning i pattedyrs indre øre. I ovo elektroporation bruges til at indføre genetiske manipulationer i kyllingens genom. Elektroporation kan også bruges til at introducere konstruktioner, der koder for fluorescerende proteiner målrettet mod bestemte organeller eller subcellulære strukturer35,36. Selv om dette er en simpel procedure, påvirker manipulation af embryoner i ovo levedygtigheden. For effektiv elektroporation skal æg købes frisk (kort efter lægning). En stigning i dødelighed og / eller unormal udvikling observeres ofte i æg, der har været opbevaret i over 5 dage. Brug af steril teknik, der sikrer, at ægget er ordentligt forseglet, så det ikke mister fugt, og minimering af manipulationerne udført på embryoet forbedrer levedygtigheden.

Vi fandt ud af, at målretning af otocysten ved E3.5 til E4 reducerer det traume, som embryoet står over for, og ved hjælp af omhyggeligt placerede elektroder muliggør god målretning af BP's sensoriske forstadier. På dette stadium er forløberne for den akustisk-vestibulære ganglion imidlertid allerede migreret væk fra det indre øre37,38. For at målrette disse celler skal tidligere tidspunkter for otocystelektroporation vælges, og der skal foretages tilpasninger til det tilsvarende fald i levedygtigheden. En yderligere advarsel er muligheden for mosaik i elektroporerede embryoner. Ikke alle celler optager hele plasmidet, og dermed kan mosaik forvirre fortolkningen. Brugen af sporplasmider hjælper med datafortolkning og giver en vis kontrol over mulige mosaikeffekter. Brug af flere gentagelser, omhyggelige analyser og statistiske metoder vil hjælpe med vurderingen af mosaikfænotyper. En alternativ tilgang er at anvende genetisk modificerede vagtler39. I øjeblikket er disse tal begrænsede og er ikke altid tilgængelige for mange laboratorier. Tilgængeligheden vil dog stige, og vagtelembryoner, som konstitutivt udtrykker subcellulært målrettede fluorescerende proteiner, er et attraktivt forslag til billeddannelseseksperimenter.

I denne metode elektroporerer vi protein og DNA til CRISPR-medierede knockdowns gennem ikke-homologe slutsammenføjning (NHEJ)24. CRISPR/Cas9 medieret generering af fusionskonstruktioner gennem homologi-rettet reparation (HDR) forbliver ineffektiv i dette særlige paradigme (Singh et al., upublicerede observationer). Elektroporationsmetoden kan tilpasses til brug med andre typer DNA-konstruktioner (disse kan være konstruktioner, der koder for fusionsproteiner) såvel som til RNA og protein. Det skal bemærkes, at DNA-baserede ekspressionskonstruktioner under udvikling (og celledeling) vil blive fortyndet, medmindre vektoren inkorporerer steder, der medierer indsættelse af det eksogene DNA i genomet af disse celler (f.eks. Tol2 eller PiggyBac). Dette giver et mere stabilt udtryk for konstruktionen.

Efter elektroporation dyrkes embryonerne normalt i ovo indtil E10-stadiet til hårcelledifferentierings- og udviklingsundersøgelser. Men hvis det er nødvendigt, kan i ovo-kulturen fortsættes, indtil æggene klækkes; Men med stigende inkubationslængder er der et tilsvarende fald i levedygtigheden. For at omgå dette kan i ovo-elektroporation kombineres med BP-dissektioner efterfulgt af langvarig ex ovo-kultur. Dyrkning af explants i en 3D-matrix muliggør god bevarelse af vævsmorfologi. Denne metode kan bruges til at studere ændringer i vævsmønster, polaritet og differentiering. Kulturen af BP på en membran tillader visualisering af den apikale side af vævet27, især højopløsningsbilleddannelse af stereocilia.

I nogle tilfælde kan begrænsningerne ved genetisk modifikation overvindes ved hjælp af forskellige småmolekylebaserede behandlinger. De farmakologisk aktive forbindelser fungerer som hæmmere eller agonister til signalering af veje eller cellebiologiske processer. Deres anvendelse er særlig nyttig til at dissekere det tidsmæssige krav. Imidlertid skal nøjagtige leveringsmåder og optimale koncentrationer bestemmes empirisk, da standardisering udført i cellelinjer i nogle tilfælde ikke kan sammenlignes med den dosis, der kræves i væv. Levering i embryoet kan være problematisk, og den nødvendige mængde kombineret med indvirkningen på andre organsystemer kan kompromittere levedygtigheden betydeligt. Et klart alternativ er organkulturmetoder20,21,22. Den nøjagtige dyrkningsmetode afhænger dog af de typer undersøgelser og analyser, der er beregnet. Mens kollagenkultur bevarer vævsmorfologi af BP, er membrankultur bedre egnet til at studere HC's apikale hårbundter. Vævet kan simpelthen placeres oven på membranen for at visualisere den apikale overflade ved hjælp af scanningselektronmikroskopi eller superopløsningsmikroskopi. Dissektioner for organkultur kræver god praksis. Disse omfatter vedligeholdelse af et sterilt arbejdsområde og brug af skærpede instrumenter. Sådanne mikrodissektionsværktøjer er følsomme, og vi finder brugen af siliciumretter vigtig for at bevare integriteten af mikrokirurgiske værktøjer.

Tilsammen repræsenterer teknikkerne værdifulde tilgange til at fremme forståelsen af indre øres udvikling. Den indsigt i komparativ biologi og regenerering, som kyllingembryonerne tilbyder, kan give betydelig indsigt i hårcelleudvikling og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt støtte fra NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB og Royal National Institute for the Deaf. Vi vil gerne takke Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi er taknemmelige for CIFF og EM facilitet og lab support på NCBS. Vi takker Yoshiko Takahashi og Koichi Kawakami for Tol2-eGFP- og T2TP-konstruktionerne og Guy Richardson for HCA- og G19 Pcdh15-antistoffet. Vi er taknemmelige for Earlab-medlemmer for deres konstante støtte og værdifulde feedback på protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies 1081061 High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody Abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Calcium Chloride Dihydrate Thermo Fisher Scientific Q12135
Collagen I, rat tail Thermo Fisher Scientific A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 Leica
CUY-21 Electroporator Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
DM5000B Widefield Microscope Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569010
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252
Fluoroshield Sigma-Aldrich F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope Olympus
Glutaraldehyde (25 %) Sigma-Aldrich 340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
Goat Serum Sterile filtered HiMedia RM10701 Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025092
LSM980 Airyscan Microscope Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Sigma-Aldrich PICM03050
MVX10 Stereo Microscope Olympus
MYO7A antibody DSHB 138-1 Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope Leica
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'') World Precision Instruments 501237
Osmium tetroxide (4%) Sigma-Aldrich 75632
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PC-10 Puller Narishige
pcU6_1sgRNA Addgene 92395 Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
SMZ1500 Dissecting microscope Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M Electron Microscopy Sciences 11652
Sodium chloride HiMedia GRM853
Sputtre Coater K550X Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament World Precision Instruments 1B100-3
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
The MERLIN Compact VP Zeiss
Thiocarbohydrazide Alfa Aesar L01205
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 184
<em>I</em> Ovo og <em>Ex Ovo</em> metoder til undersøgelse af aviær indre øre udvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, N., Prakash, A.,… More

Singh, N., Prakash, A., Chakravarthy, S. R., Kaushik, R., Ladher, R. K. In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (184), e64172, doi:10.3791/64172 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter