Summary
Kycklingen är en kostnadseffektiv, tillgänglig och allmänt tillgänglig modellorganism för en mängd olika studier. Här beskrivs en serie protokoll för att förstå de molekylära mekanismerna bakom fåglarnas utveckling och regenerering i innerörat.
Abstract
Innerörat uppfattar ljud och upprätthåller balans med hjälp av snäckan och vestibulen. Det gör detta genom att använda en dedikerad mekanosensorisk celltyp som kallas hårcellen. Grundforskning i innerörat har lett till en djup förståelse för hur hårcellen fungerar, och hur dysreglering kan leda till hörselnedsättning och svindel. För denna forskning har musen varit det främsta modellsystemet. Möss, som alla däggdjur, har dock förlorat förmågan att ersätta hårceller. Således, när man försöker förstå cellulära terapier för att återställa innerörats funktion, kan kompletterande studier på andra ryggradsdjur ge ytterligare insikter. Fåglarnas hörselepitel, basilarpapillen (BP), är ett epitelark som består av mekanosensoriska hårceller (HC) interkalerade av stödjande celler (SC). Även om den anatomiska arkitekturen hos basilarpapillen och däggdjurssnäckan skiljer sig åt, är de molekylära mekanismerna för innerörats utveckling och hörsel likartade. Detta gör basilarpapillen till ett användbart system för inte bara jämförande studier utan också för att förstå regenerering. Här beskriver vi dissektions- och manipulationstekniker för kycklingens inre öra. Tekniken visar genetiska och småmolekylära hämningsmetoder, som erbjuder ett kraftfullt verktyg för att studera de molekylära mekanismerna för innerörats utveckling. I detta dokument diskuterar vi i ovo-elektroporationstekniker för att genetiskt störa basilarpapillen med hjälp av CRIPSR-Cas9-deletioner, följt av dissektion av basilarpapillen. Vi demonstrerar också BP-organkulturen och optimal användning av odlingsmatriser för att observera utvecklingen av epitelet och hårcellerna.
Introduction
Innerörat hos alla ryggradsdjur härrör från ett enkelt epitel som kallas den otiska plakoden 1,2. Detta kommer att ge upphov till alla strukturella element och de celltyper som är nödvändiga för att överföra den mekanosensoriska informationen i samband med hörsel- och balansuppfattning. Hårceller (HC), den avkalkade sensorn i innerörat, är omgivna av stödceller (SC). HCs vidarebefordrar information till den auditiva bakhjärnan genom neuronerna i den åttonde kranialnerven. Dessa genereras också från den otiska plakoden3. Den primära transduktionen av ljud uppnås vid den apikala ytan av hörsel-HC, genom en mekaniskt känslig hårbunt4. Detta förmedlas genom modifierade aktinbaserade utsprång som kallas stereocilia, som är ordnade i ett graderat trappmönster5. Dessutom organiserar ett modifierat primärt cilium, kallat kinocilium, hårbuntbildning och ligger intill den högsta raden av stereocilia 6,7,8. Arkitekturen av stereocilia är avgörande för denna roll i att omvandla mekaniska stimuli härledda från akustisk energi till elektriska neurala signaler9. Skador på hörsel-HC genom åldrande, infektion, otoakustiskt trauma eller ototoxisk chock kan leda till partiell eller fullständig hörselnedsättning som hos däggdjur är irreversibel10.
Cellulära ersättningsterapier har föreslagits som kan reparera sådana skador11,12. Tillvägagångssättet för denna forskning har varit att förstå den normala utvecklingen av däggdjurshårcellen och fråga om utvecklingsprogram kan återinitieras i stamfaderliknande celler som kan finnas i innerörat13. Ett andra tillvägagångssätt har varit att titta utanför däggdjur, till ryggradsdjur som inte är däggdjur där robust regenerering av hörselhårceller äger rum, såsom fåglar14,15. Hos fåglar sker hårcellsregenerering huvudsakligen genom dedifferentiering av en stödjande cell till ett stamfaderliknande tillstånd, följt av asymmetrisk mitotisk uppdelning för att generera en hårcell och stödjande cell16. Dessutom har direkt differentiering av en stödjande cell för att generera en hårcell också observerats17.
Medan mekanismerna för aviär hörselutveckling visar betydande likheter med däggdjurens, finns det skillnader18. HC- och SC-differentiering i kyckling-BP framgår av embryonal dag (E) 7 och blir mer distinkt med tiden. Vid E12 kan en välmönstrad och välpolariserad basilarpapilla (BP) visualiseras, och av E17 kan välutvecklade hårceller ses19. Dessa tidpunkter ger fönster in i mekanismerna för differentiering, mönstring och polaritet, liksom hårcellsmognad. Att förstå om sådana mekanismer är bevarade eller divergerande är viktigt, eftersom de ger insikter i den djupa homologin av ursprunget till mekanosensoriska hårceller.
Här demonstrerar vi en rad tekniker som utförs i tidiga och sena embryonala stadier för att studera cellulära processer som spridning, ödesspecifikation, differentiering, mönstring och underhåll under hela utvecklingen av inneröratorganet. Detta kompletterar andra protokoll för att förstå innerörats utveckling i explantkultur20,21,22. Vi diskuterar först införandet av exogent DNA eller RNA i BP-prekursorer inom E3.5-otocysten med användning av ovo-elektroporering. Även om genetiska manipulationer kan ge värdefulla insikter, kan de fenotyper som sålunda genereras vara pleiotropa och följaktligen förvirrande. Detta gäller särskilt under senare utveckling av innerörat, där grundläggande processer som cytoskeletal ombyggnad spelar flera roller i celldelning, vävnadsmorfogenes och cellulär specialisering. Vi presenterar protokoll för farmakologisk hämning i odlade explantor, som erbjuder fördelar när det gäller att kontrollera dosering och behandlingstid och varaktighet, vilket ger exakt spatiotemporal manipulation av utvecklingsmekanismer.
Olika organodlingsmetoder kan användas beroende på behandlingstiden för små hämmare. Här demonstrerar vi två metoder för organkultur som möjliggör insikter i epitelmorfogenes och cellulär specialisering. En metod för 3D-odling som använder kollagen som en matris för att odla den cochleära kanalen möjliggör robust odling och levande visualisering av den utvecklande BP. För att förstå bildandet av stereocilia presenterar vi en membranodlingsmetod så att epitelvävnad odlas på en styv matris som gör det möjligt för aktinutsprång att växa fritt. Båda metoderna tillåter nedströms bearbetning såsom levande cellavbildning, immunohistokemi, svepelektronmikroskopi (SEM), cellinspelning etc. Dessa tekniker ger en färdplan för effektiv användning av kycklingen som ett modellsystem för att förstå och manipulera utvecklingen, mognaden och regenereringen av det aviära hörselepitelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll som involverar tillvaratagande, odling och användning av befruktade kycklingägg och oskadade embryon godkändes av Institutional Animal Ethics Committee vid National Center for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. Vid ovo elektroporering av kyckling hörselprekursorer
- sgRNA-design och kloning för CRISPR/Cas9-genutslag
- För att skapa genutslag, designguide RNA för att störa exonregionerna i genen, helst närmare 5'-änden av den kodande regionen.
- Välj potentiella guide-RNA med hjälp av ett webbverktyg CRISPOR23. Ställ in webbläsardata på Gallus gallus och protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens till 5'- NGG -3'. Programmet bestämmer guide-RNA från ingångssekvensen och tilldelar olika poäng baserat på on-target och off-target aktivitet. Välj de fyra bästa guiderna för vidare studier.
- För utformning av mallspecifika oligos för guide (g) RNA-produktion, ta bort PAM-sekvensen (5′- NGG -3′) från gRNA-designverktygets utdata. Detta behövs inte för inriktning, men innehåller Cas9-klyvningsigenkänningssekvensen. Syntetisera två HPLC-renade komplementära oligos med BsmBI-restriktionsställe i båda ändar, för varje potentiellt gRNA.
- Klona styrsekvensen i ram med en tracrRNA-ställning av en valfri vektor (här användes pcU6_1sgRNA vektor24).
- Lös upp sgRNA-oligonukleotiderna i en koncentration av 100 μM i DNas/RNas-fritt vatten. Utför glödgning av de två sense- och antisense-oligostyrningarna med hjälp av en termocykler med följande parametrar: 95 °C i 3 min, sedan 37 °C i 15 minuter och minska sedan till 4 °C.
- Med hjälp av vanliga molekylärbiologiska tekniker som beskrivs i25, ställa in begränsning matsmältning av glödgade oligos och pcU6_1sgRNA kloning vektor med BsmBI enzym över natten. Inställningsligering med den gelrenade linjära BsmBI-smälta pcU6_1sgRNA vektorn och smälta sgRNA-oligos. Transformera till en DH5-alfa kompetent cell och sekvensbekräfta den erhållna klonen.
- Ägghantering och fönster
- Skaffa nylagda ägg och rengör dem genom att torka av dem med 70% etanol för att förhindra kontaminering. Inkubera vid 37-38 °C, med 45% luftfuktighet i 3,5-4 dagar.
- Efter inkubation, placera ägget på sin sida i minst 5 minuter innan det öppnas. Detta gör att embryot kan omplaceras till toppen av äggulan. Använd pincett för att göra små hål på äggets övre och trubbiga ände så att en 21G-nål kan passera igenom.
- För att förhindra skador under fönster, ta bort albumin för att sänka embryot bort från skalet. För att göra detta, använd en 5 ml spruta och en 21G nål för att försiktigt dra 2 ml albumin från ett hål i äggets trubbiga ände. Använd klar tejp för att täcka hålet i den trubbiga änden.
- För att göra äggfönstret, fäst klar tejp på toppen av äggskalet. Skär upp ett fönster, cirka 2 cm långt och 1,5 cm brett, med hjälp av fjäderbågsax och exponera embryot. Använd pincett för att öppna korionmembranen över embryot, vilket ger tillgång till embryot.
- Mikroinjicerande plasmider
- För genutslagsexperimentet, förbered två lösningar: knock-down-blandningen som innehåller SpCas9-protein och styrplasmid-pcU6_1sgRNA, och spårplasmidblandningen av T2K-eGFP (detta är en chick ß-actin-promotor som driver GFP-kassett omgiven av transposonplatserna för Tol2) tillsammans med T2TP (Tol2-transposaset klonat i Tol2-konstruktion26,27). Spårämnet används för att spåra elektroporationseffektivitet.
- Vid elektroporering av flera plasmider, se till att den slutliga koncentrationen av DNA är minst 4 μg / μL. Blanda de tre konstruktionerna, styr plasmid-pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP och T2TP, i ett förhållande 1: 1: 1 med 1 μg SpCas9-protein, 30% sackaros och 0,1% Fast Green-färgämne i en slutlig volym av 10 μL.
- Dra nålar för mikroinjektion från vanliga glaskapillärer (längd 3 tum, OD 1,0 mm) med en vertikal pipettdragare. Använd fina pincett för att bryta av kapillärspetsen efter dragning för att få en spetsdiameter på cirka 50 μm med en avsmalnande ände.
- Lägg embryona vid E3.5 på vänster sida med huvudet vänt åt höger. På så sätt är endast rätt otisk vesikel tillgänglig för mikroinjektion. Mikroinjicera knock-down-blandningen i den otiska vesikeln. Injicera cirka 200 nL volym DNA-lösningsblandning för att fylla den otiska vesikeln.
- Bestäm styreffektiviteten med hjälp av en T7-endonukleasanalys28.
- Elektroporering
- Tillsätt några droppar 0,719% saltlösning ovanpå embryot före elektroporering för att sänka det elektriska motståndet och förhindra överhettning av embryot.
- Placera den positiva elektroden genom hålet som gjordes på äggets trubbiga sida när albuminet togs bort. Manövrera elektroden så att den ligger under äggulan. Placera den negativa elektroden över den fyllda otocysten.
- Använd elektroporation för att transfektera plasmider i embryonets celler. Använd en fyrkantig pulsgenerator och applicera fem pulser med 25 V och 100 ms varaktighet vardera, 50 ms från varandra. Bestäm villkoren empiriskt baserat på en individuell elektroporeringsinställning.
- Hydrera embryot efter elektroporering genom att tillsätta några droppar 0,719% saltlösning. För att rengöra denaturerat albumin från elektrodernas yta, skölj det noggrant med destillerat vatten. Återförslut ägget med klar tejp och återgå till den fuktade inkubatorn vid 37-38 °C för ytterligare inkubation.
OBS: Embryon kan odlas tills de kläcks efter elektroporering, men det finns en kraftig minskning av livskraften.
2. Basilar papilla dissektion
- Använd 70% etanol för att desinficera operationsbordet, mikroskopstadiet och omgivningen. Värme- eller alkoholsteriliserar mikrodissektionsutrustning som inkluderar minimalt fjäderbågsax, mikrocurette och två par fina pincett.
- Förbered följande dissektionsplattor: en petriskål i glas med en svart kiselbas, en 90 mm plastskål och en 60 mm petriskål. Kyl antingen fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för dissektioner.
- Knäck försiktigt ägget i 90 mm petriskålen. Identifiera kycklingens yttre öra. Halshugga embryot genom att skära nacken strax under underkäkens nivå med sax. Överför huvudet till en 60 mm petriskål fylld med iskall PBS.
- Orientera embryot med toppen av näbben vänd mot experimentet och håll näbben med en av #5-tångarna. Skopa ut ögonen med den andra #5 pincetten. Gå från rostral till caudal, skär skallen längs mittlinjen. Skopa ut hjärnan.
- Lägg till mer iskall PBS eller HBSS och lokalisera de två glänsande strukturerna, nära pinnanivån. Dessa är otoliterna i lagena i slutet av den cochleära kanalen och finns nära mittlinjen.
- Skär ungefär mellan de två lagenorna, och långt över och under denna region för att isolera två inre öron. Under sned belysning, visualisera konturen av innerörat. Ta bort främmande vävnad och vestibulen.
- Överför den isolerade snäckan till en svart silikonplatta med iskall PBS. Använd #5-tången och dra bort den broskiga cochleakapseln för att få fram den cochleära kanalen. Leta reda på det böljande lagret (tegmentum) i den cochleära kanalen och ta bort med # 55 pincett för att exponera BP. Använd # 55 pincett, ta bort tectorialmembranet för att exponera HCs och SCs.
3. Kultur av basilarpapilla explants
- Membrankultur av BP
- Ta en vävnadsodlingsplatta med sex brunnar och ordna en odlingsmembraninsats per brunn.
- Samla den dissekerade basilarpapillan (explant) i en 200 μL pipett med 1x HBSS-buffert och överför den till ett membran. För att förhindra att vävnaden fastnar på pipettens vägg, dra upp lite media innan du aspirerar vävnaden.
- Orientera explanten så att basilarpapillen är vänd uppåt, så att håret och stödcellerna är synliga från topp29. När explanten är placerad, aspirera HBSS-bufferten långsamt från odlingsmembranytan. I denna process kommer explanten att fästa vid odlingsmembranet.
- Tillsätt 1,2 ml av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) odlingsmedium mellan membraninsatsen och brunnsväggen för att fylla upp brunnarna på sexbrunnsplattan. Upp till sex explanter kan odlas på ett enda 30 mm odlingsmembran.
- Kollagenkulturen i cochleakanalen
- Bered kollagenblandningen genom att tillsätta 400 μl 3 mg/ml kollagen på råttsvansen, 50 μl 10x DMEM, 30 μl 7,5 % NaHCO3 och 5 μl HEPES i en vävnadsodlingshuv.
- Ta en tallrik med fyra brunnar och tillsätt tre droppar kollagenblandning i varje brunn. Överför dissekerad cochleakanal till varje kollagendroppe. Inkubera plattan i 10 min vid 37 °C, 5 %CO2 för att härda kollagenmatrisen.
- Småmolekylär behandling av kulturer
- Förbered odlingsmedia (DMEM, N-2-tillskott, penicillin) med antingen den farmakologiska modulatorn eller dess lösningsmedel ensamt (för användning som kontroll). Byt ut odlingsmediet med 700 μL media kompletterat med hämmaren. Odla explanterna i en inkubator vid 37 °C, 5 %CO2.
- Byt ut 50% av kulturmedierna varje dag. Efter lämplig inkubationstid, ta bort odlingsmediet och använd explanterna för nedströmsanalyser.
4. Bildbehandling och analys
- Immunofluorescerande analys
- Ta bort odlingsmedia från brunnar och tvätta explanterna två gånger med 1x HBSS. Tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) med pipett till brunnen och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort PFA och tvätta explanterna tre gånger med 1x PBS vid rumstemperatur. För att samla explanterna från odlingsmembranet, gör ett litet snitt runt membranet som innehåller vävnadsbiten med hjälp av en liten fjäderbågsax och överför vävnaden tillsammans med membranet till en odlingsplatta med 48 brunnar med pincett.
OBS: Om vävnaderna flyter efter fixeringen, aspirera sedan med en 200 μL pipett och överför den till 48-brunnsplattor för vidare bearbetning. Undvik kraftig avlägsnande av vävnaden från membranet. - För kollagendroppsodling, använd pincett för att överföra hela kollagendroppen till en kiselplatta. Tillsätt 200 μL 1x PBS och ta bort kollagen med hjälp av pincett och överför sedan vävnaden till en odlingsplatta med 48 brunnar.
- Permeabilize explanterna med 1 ml 1x PBS kompletterat med 0,3% Tween-20 (PBST) i 30 min vid rumstemperatur. Inkubera explanterna med 200 μl blockerande buffert (10 % getserum + 1 % bovint serumalbumin i PBST) i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera explanterna med 200 μl primär antikroppslösning (1:300, i blockerande buffert) över natten vid 4 °C. Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta explanterna noggrant 5 x 20 min med PBST.
- Inkubera explanterna med 200 μl falloidin och sekundär antikroppslösning (i blockerande buffert) i 1 timme vid rumstemperatur i mörkret. Ta bort falloidin och sekundär antikroppslösning och tvätta explanterna noggrant 5 x 20 min med PBST.
OBS: Sekundär antikroppskoncentration och tvättlängd måste bestämmas för varje enskild avbildningsapplikation. För avbildning med superupplösningsmikroskopi ökar vi vanligtvis koncentrationen av den sekundära antikroppen från 1:500 till 1:200 och ökar koncentrationen av falloidin från 1:400 till 1:200. - Inkubera explanterna med en lösning av DAPI (1:1000 i PBST) i 15 minuter vid rumstemperatur. Ta bort DAPI-lösningen och tvätta explanterna 3 x 5 min med PBST.
- Använd monteringsmediet för att montera utväxter på en bild med BP vänd uppåt (mot täckglaset). För konfokal avbildning använd antifade monteringsmedia. Låt monteringsmediet torka över natten vid rumstemperatur i mörkret. Antingen avbilda direkt eller lagra bilderna vid 4 °C tills de bildas.
- OTOTO-fixering för SEM-analys
- Förbered alla lösningar fräscha och hantera enligt lokala säkerhetsriktlinjer. Fixera membranodlade explanter (från steg 4.1.4) i 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,3) med 3 mM CaCl2. Utför fixering vid 4 °C i 24 till 72 timmar med byte av fixativ var 24:e timme.
- Ta bort fixeringsmedlet och tvätta vävnaden med 0,1 M natriumkakodylat 3 x 5 min vid rumstemperatur. Sekundär fixering med 1% OsO4 (utspädd från en 4%OsO4-stam med 0,1 M natriumkakodylatbuffert) i 1 h vid rumstemperatur. Utför detta och de efterföljande stegen tills uttorkning i en rökhuv.
- Skölj med 0,1 M natriumkakodylatbuffert 3 x 5 min vid rumstemperatur. Skölj sedan i dubbeldestillerat eller ultrarent vatten 3 x 5 min vid rumstemperatur.
- Förbered en 0,5% lösning av tiokarbohydrazid (TCH) i ultrarent vatten. Rör om vid 75 °C i 10 min och filtrera lösningen när den har svalnat till rumstemperatur.
OBS: TCH är extremt farligt. Användningen måste godkännas av den lokala skyddskommittén och försiktighet måste iakttas vid hantering. - Ta bort ultrarent vatten från provet och tillsätt 0,5% TCH droppe för droppe. Om lösningen blir brun, stoppa och skölj provet med ultrarent vatten innan du försiktigt tillsätter 0,5% TCH-lösningen. När lösningen är klar, byt ut den med 0,5% TCH. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min30,31.
- Skölj provet med ultrarent vatten 3 x 5 min vid rumstemperatur. Upprepa steg 4.2.2, 4.2.3 och 4.2.5 ytterligare två gånger och avsluta med OsO 4-inkubation följt av sköljning.
- Dehydratisera proverna i en etanolserie till 100% vattenfri etanol (EtOH). Inkubera först i 25% ETOH i 10 min, sedan 50% ETOH i 10 min, 75% EtOH i 10 min, 95% ETOH i 10 min, innan du inkuberar i totalt 3x i 10 min vardera i 100% ETOH.
- Utför kritisk punkttorkning med flytande CO2. Montera omedelbart proverna på en SEM-stubbe med dubbelsidig koltejp. Fortsätt att spruta beläggningen för att ge 5-10 nm beläggning. Om du inte avbildar omedelbart, förvara proverna i en exsickator under vakuum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I elektroporationsinställningen kan elektrodpositionering spela en roll inom transfektionsområdet. Den positiva elektroden placeras under äggulan och negativet ovanför embryot (figur 1A). Detta resulterar i högre GFP-uttryck i stora delar av innerörat och både vestibulära organ (figur 1B) och auditiv basilarpapill (figur 1C,D), vilket bekräftar transfektion.
Vid bedömningen av fenotypen av CRISPR-knockdowns utformade vi guide-RNA till hårcellstranskriptionsfaktorn Atonal homolog 1 (Atoh1). Musmutanter av Atoh1 kan inte bilda hårceller32; efter elektroporering av Atoh1-styr-RNA och inkubation fram till E10 finner vi att HC-utvecklingen försämras jämfört med kontroll, tom plasmidkontroll (figur 2). Även om elektroporering är mosaik (figur 2E, F), kan kontrollelektroporerade celler bilda hårceller. I Atoh1 gRNA-elektroporerade prover visar GFP-positiva celler aldrig markörerna för HC-utveckling (figur 2B).
Organkulturen i BP ger tillgång till vävnaden. Kulturer i en 3D-matris, såsom kollagen, ger utmärkt bevarande av vävnadsmorfologi i upp till 5 dagar. Organisationen av HC och SC upprätthålls under dessa odlingsförhållanden (figur 3).
Organkulturer på ett membran är att föredra för avbildning av stereocilier. Sådana kulturer kan odlas i upp till 5 dagar samtidigt som hårbuntens integritet bibehålls. Detta kan ses genom lokaliseringen av spetslänkproteinet, protokadherin 1533 (Pcdh15) (Figur 4). För att förhöra utvecklingen av hårbunten är avbildning med högre upplösning nödvändig, och sådana tillvägagångssätt, med antingen superupplösningsmikroskopi (figur 4D) eller svepelektronmikroskopi (figur 4E), ger mer fullständig information.
Figur 1. GFP-uttryck är synligt vid E10 efter i ovo-elektroporering vid E4. (A) Schematiskt diagram som illustrerar i ovo-mikroinjektion och elektroporering i kycklingblåsor vid E4. Injektionspipetten är fylld med Tol2-eGFP (T2K-eGFP) och Tol2-transposaser (T2TP) plasmider, tillsammans med snabbgrönt färgämne för visualisering. (B) Bild av det elektroporerade innerörat vid E10 med en 0,63x luftobjektivlins på ett stereomikroskop. Det vänstra innerörat är den inre kontrollen. Den röda pilen markerar GFP-uttrycket i den cochleära kanalen i höger inneröra, och den röda asterisken visar GFP-uttryck i vestibulära organ; skalstången är 2 cm. (C) Widefield-fluorescensbild av ett tvärsnitt av höger cochleakanal med ett 20x luftmål på 0,5 NA. GFP-uttryck är mestadels begränsat till det sensoriska epitelet; skalstången är 10 μm. (D) Konfokal bild av basilarpapilla med hela berget avbildad med 10x luftmål på 0,5 NA färgad med falloidin konjugerad med Alexa 647 fluorofor. GFP-uttryck observeras från proximal till distal ände på den neurala sidan av BP; skalstrecket är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CRISPR/Cas9-medierad Atoh1-gen knockout viain ovo elektroporation resulterar i förlust av hårceller (HC). Atoh1-genguideplasmid pcU6_1-Atoh1sgRNA och spårplasmider Tol2-eGFP (T2K-eGFP) och Tol2-transposaser (T2TP) med SpCas9-protein mikroinjiceras och elektroporeras i kycklingotisk vesikel vid E4. Alla bilder är från chick E10 basilar papilla med en 10 μm skala bar, fångad med ett 60x oljedoppningsmål på 1,42 NA med hjälp av ett laserkonfokalmikroskop. Inzoomade indrag tillhandahålls för alla bilder. (A,B,C,D) Den vänstra panelen innehåller BP med hårceller (HC), elektroporerade med tomma pcU6_1sgRNA och T2K-eGFP och T2TP med SpCas9-protein. (E,F,G,H) Den högra sidopanelen innehåller BP med förlust av HC, elektroporerad med Atoh1-guide (pcU6_1-Atoh1sgRNA) och T2K-eGFP och T2TP med SpCas9-protein. (A,E) Sammanslagen bild som visar hårceller (HC) i basilarpapillen. Dessa är immunreaktiva för Myosin 7a (blå); F-aktin färgad med falloidin konjugerad med Alexa 647 (röd); GFP-uttryck från Tol2-eGFP-plasmider detekteras med användning av en anti-GFP-antikropp (grön). Förlusten av HC framgår av Myosin 7a immunoreaktivitet vid jämförelse av behandlingar med tomma pcU6_1sgRNA (D) och pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). F-aktinavbildning från båda behandlingarna belyser hårbunten i HC (B,F). (C,G) T2K-eGFP och T2TP används för att mäta transfektionsplats och effektivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Organkultur av cochleakanal i 3D-kollagendroppsodling upprätthåller organisationen av sensoriskt epitel. BP vid E10 odlas i en 3D-kollagendroppkultur i 1 dag och avbildas med 60x oljedoppningsmål på 1,42 NA med hjälp av ett laserkonfokalmikroskop. (A) Bild av hela BP av E10 odlad i 1 dag i en kollagendroppe och färgad med antikroppar mot hårcellsantigen (HCA)34. Skalstången är 100 μm. (B) Sammanslagen bild som visar den bevarade organisationen av sensoriskt epitel från den distala sidan av BP färgad med (C) falloidin (grön) och (D) HCA (blå); Skalfältet är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Stereociliära buntar av basilarpapill under elektron- och ljusmikroskop. 0,1% dimetylsulfoxid (DMSO)-behandlad BP explanterades vid E10 och odlades i 3 dagar in vitro (DIV) på membranodlingsinsatser. (A) Explant avbildas med ett 60x oljedoppningsmål på 1,42 NA med ett laserskanningskonfokalmikroskop. Den sammanslagna bilden visar uttrycket av protocadherin 15 (Pcdh15) och stereocilia markerad med falloidin konjugerad med Alexa 488 (grön). Enkanalsbilder av F-aktin ( B ) och Pcdh15 (C) visas. Skalstången är 10 μm. (D) Superupplöst bild av stereocilia färgad med falloidin konjugerad med Alexa 488-färgning i grönt. Bilden erhölls med hjälp av ett 63x oljefördjupningsmål på 1,42 NA i Airyscan-läge för laserskanningskonfokalmikroskop. Skalstången är 5 μm. ( E) SEM-bilden togs vid 16340x förstoring med 7 kV elektronhögspänningsspänning (EHT) spänning. Röd asterisk markerar kinocilia och röd kil markerar stereocilia. Ljusstyrka och kontrast justerades till auto och bilden skärptes med FIJI. Skalstrecket är 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kycklingen är ett kostnadseffektivt och bekvämt tillskott till modellorganismerna som ett laboratorium kan använda för att undersöka innerörat. De metoder som beskrivs här används rutinmässigt i vårt labb och kompletterar pågående forskning i däggdjurets inneröra. I ovo används elektroporation för att införa genetiska manipuleringar i kycklinggenomet. Elektroporering kan också användas för att introducera konstruktioner som kodar för fluorescerande proteiner riktade mot särskilda organeller eller subcellulära strukturer35,36. Även om detta är ett enkelt förfarande, påverkar manipulation av embryon i ovo livskraften. För effektiv elektroporering bör ägg anskaffas färska (strax efter läggning). En ökning av dödligheten och / eller onormal utveckling observeras ofta i ägg som har lagrats i över 5 dagar. Användningen av steril teknik, som säkerställer att ägget är ordentligt förseglat så att det inte förlorar fukt och minimerar manipuleringarna som utförs på embryot förbättrar livskraften.
Vi fann att inriktning på otocysten vid E3.5 till E4 minskar det trauma som embryot står inför, och användning av noggrant placerade elektroder möjliggör god inriktning av de sensoriska prekursorerna till BP. Men i detta skede har föregångarna till den akustisk-vestibulära ganglionen redan migrerat bort från innerörat37,38. För att rikta in sig på dessa celler måste tidigare tidpunkter för otocystelektroporering väljas och anpassningar göras för motsvarande minskning av livskraften. En ytterligare försiktighet är möjligheten till mosaicism i elektroporerade embryon. Inte alla celler tar upp all plasmid, och därmed kan mosaicism förvirra tolkningen. Användningen av spårplasmider hjälper till vid datatolkning och ger viss kontroll över möjliga mosaikeffekter. Användning av flera upprepningar, noggranna analyser och statistiska metoder kommer att hjälpa till vid bedömningen av mosaikfenotyper. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda genetiskt modifierade vaktlar39. För närvarande är dessa nummer begränsade och är inte alltid tillgängliga för många laboratorier. Tillgängligheten kommer dock att öka, och vaktelembryon, som konstitutivt uttrycker subcellulärt riktade fluorescerande proteiner, är ett attraktivt förslag för avbildningsexperiment.
I denna metod elektropolerar vi protein och DNA för CRISPR-medierade knockdowns genom icke-homolog ändfogning (NHEJ)24. CRISPR/Cas9-medierad generering av fusionskonstruktioner genom homologistyrd reparation (HDR) förblir ineffektiv i just detta paradigm (Singh et al., opublicerade observationer). Elektroporeringsmetoden kan anpassas för användning med andra typer av DNA-konstruktioner (dessa kan vara konstruktioner som kodar för fusionsproteiner), liksom för RNA och protein. Det bör noteras att under utveckling (och celldelning) kommer DNA-baserade uttryckskonstruktioner att spädas ut om inte vektorn innehåller platser som förmedlar införandet av det exogena DNA i genomet hos dessa celler (t.ex. Tol2 eller PiggyBac). Detta möjliggör ett mer stabilt uttryck för konstruktionen.
Efter elektroporering odlas embryona vanligtvis i ovo fram till E10-stadiet för hårcellsdifferentiering och utvecklingsstudier. Men om det behövs kan i ovokulturen fortsättas tills äggen kläcks; Men med ökande inkubationslängder finns det en motsvarande minskning av livskraften. För att kringgå detta kan ovo-elektroporering kombineras med BP-dissektioner följt av långsiktig ex ovo-kultur. Odling av explanter inom en 3D-matris möjliggör god bevarande av vävnadsmorfologi. Denna metod kan användas för att studera förändringar i vävnadsmönster, polaritet och differentiering. Kulturen av BP på ett membran möjliggör visualisering av den apikala sidan av vävnaden27, särskilt högupplöst avbildning av stereocilia.
I vissa fall kan begränsningarna av genetisk modifiering övervinnas genom att använda olika småmolekylbaserade behandlingar. De farmakologiskt aktiva föreningarna fungerar som hämmare eller agonister för signalvägar eller cellbiologiska processer. Deras tillämpning är särskilt användbar för att dissekera det tidsmässiga kravet. Exakta leveranssätt och optimala koncentrationer måste dock bestämmas empiriskt, eftersom standardisering som utförs i cellinjer i vissa fall inte är jämförbar med den dos som krävs i vävnader. Leverans inom embryot kan vara problematiskt, och den mängd som behövs i kombination med påverkan på andra organsystem kan äventyra livskraften avsevärt. Ett färdigt alternativ är orgelodlingsmetoder20,21,22. Den exakta odlingsmetoden beror dock på vilka typer av studier och analyser som är avsedda. Medan kollagenkulturen bevarar vävnadsmorfologin hos BP, är membrankulturen bättre lämpad för att studera de apikala hårbuntarna i HC. Vävnaden kan helt enkelt placeras ovanpå membranet för att visualisera den apikala ytan med hjälp av svepelektronmikroskopi eller superupplösningsmikroskopi. Dissektioner för organodling kräver god praxis. Dessa inkluderar att upprätthålla en steril arbetsyta och använda vässade instrument. Sådana mikrodissektionsverktyg är känsliga, och vi finner användningen av kiselskålar viktig för att bevara integriteten hos mikrokirurgiska verktyg.
Tillsammans representerar teknikerna värdefulla tillvägagångssätt för att främja förståelsen av innerörats utveckling. De insikter i jämförande biologi och regenerering som kycklingembryon erbjuder kan ge betydande insikter i hårcellsutveckling och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt stöd från NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB och Royal National Institute for the Deaf. Vi vill tacka Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi är tacksamma för CIFF och EM-anläggning och labbstöd på NCBS. Vi tackar Yoshiko Takahashi och Koichi Kawakami för Tol2-eGFP- och T2TP-konstruktionerna, och Guy Richardson för HCA- och G19 Pcdh15-antikroppen. Vi är tacksamma mot Earlabs medlemmar för deras ständiga stöd och värdefulla feedback på protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W.
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y.
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H.
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
