Summary
Kyllingen er en kostnadseffektiv, tilgjengelig og allment tilgjengelig modellorganisme for en rekke studier. Her er en rekke protokoller detaljert for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for aviær indre øreutvikling og regenerering.
Abstract
Det indre øret oppfatter lyd og opprettholder balanse ved hjelp av sneglehuset og vestibylen. Det gjør dette ved å bruke en dedikert mekanosensorisk celletype kjent som hårcellen. Grunnforskning i det indre øret har ført til en dyp forståelse av hvordan hårcellen fungerer, og hvordan dysregulering kan føre til hørselstap og svimmelhet. For denne forskningen har musen vært det fremste modellsystemet. Imidlertid har mus, som alle pattedyr, mistet evnen til å erstatte hårceller. Således, når man prøver å forstå cellulære terapier for å gjenopprette indre ørefunksjon, kan komplementære studier hos andre vertebratarter gi ytterligere innsikt. Det hørbare epitelet av fugler, basilær papilla (BP), er et epitelark sammensatt av mekanosensoriske hårceller (HCs) interkalert av støtteceller (SCs). Selv om den anatomiske arkitekturen til basilær papilla og pattedyrs cochlea er forskjellige, er de molekylære mekanismene for indre øreutvikling og hørsel like. Dette gjør basilar papilla til et nyttig system for ikke bare komparative studier, men også for å forstå regenerering. Her beskriver vi disseksjons- og manipulasjonsteknikker for kyllingens indre øre. Teknikken viser genetiske og små molekylinhiberingsmetoder, som tilbyr et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer for indre øreutvikling. I dette papiret diskuterer vi i ovo-elektroporeringsteknikker for genetisk å forstyrre basilær papilla ved bruk av CRIPSR-Cas9-delesjoner, etterfulgt av disseksjon av basilær papilla. Vi demonstrerer også BP-organkultur og optimal bruk av kulturmatriser, for å observere utviklingen av epitelet og hårcellene.
Introduction
Det indre øret til alle virveldyr er avledet fra et enkelt epitel kjent som otic placode 1,2. Dette vil gi opphav til alle strukturelle elementer og celletyper som er nødvendige for å transdusere mekanosensorisk informasjon knyttet til hørsel og balanseoppfattelse. Hårceller (HCs), den cilierte sensoren i det indre øret, er omgitt av støtteceller (SCs). HCs videresender informasjon til den hørbare bakhjernen gjennom nevronene i den åttende kranialnerven. Disse genereres også fra otic placode3. Den primære transduksjonen av lyd oppnås på den apikale overflaten av den auditive HC, gjennom en mekanisk følsom hårbunt4. Dette formidles gjennom modifiserte aktinbaserte fremspring kalt stereocilia, som er ordnet i et gradert trappemønster5. I tillegg organiserer en modifisert primær cilium, kalt kinocilium, hårbuntdannelse og ligger ved siden av den høyeste raden av stereocilia 6,7,8. Arkitekturen til stereocilia er kritisk for denne rollen i å konvertere mekaniske stimuli avledet fra akustisk energi til elektriske nevrale signaler9. Skade på hørsels-HC gjennom aldring, infeksjon, otoakustisk traume eller ototoksisk sjokk kan resultere i delvis eller fullstendig hørselstap som hos pattedyr er irreversibelt10.
Cellulære erstatningsterapier har blitt foreslått som kan reparere slike skader11,12. Tilnærmingen til denne forskningen har vært å forstå den normale utviklingen av pattedyrhårcellen og spørre om utviklingsprogrammer kan gjenopptas i stamcellelignende celler som kan eksistere i det indre øret13. En annen tilnærming har vært å se utenfor pattedyr, til ikke-pattedyrvirveldyr der robust regenerering av auditive hårceller finner sted, for eksempel fugler14,15. Hos fugler skjer hårcelleregenerering hovedsakelig gjennom dedifferensiering av en støttecelle til en stamcellelignende tilstand, etterfulgt av asymmetrisk mitotisk deling for å generere en hårcelle og støttecelle16. I tillegg er det også observert direkte differensiering av en støttecelle for å generere en hårcelle17.
Mens mekanismene for aviær auditiv utvikling viser betydelige likheter med pattedyr, er det forskjeller18. HC- og SC-differensiering hos kyllingen BP er tydelig fra embryonal dag (E) 7, og blir tydeligere over tid. Ved E12 kan en velmønstret og godt polarisert basilær papilla (BP) visualiseres, og ved E17 kan velutviklede hårceller ses19. Disse tidspunktene gir vinduer inn i mekanismene for differensiering, mønster og polaritet, samt hårcellemodning. Det er viktig å forstå om slike mekanismer er konserverte eller divergerende, da de gir innsikt i den dype homologien til opprinnelsen til mekanosensoriske hårceller.
Her demonstrerer vi en rekke teknikker utført på tidlige og sene embryonale stadier for å studere cellulære prosesser som spredning, skjebnespesifikasjon, differensiering, mønster og vedlikehold gjennom utviklingen av det indre øreorganet. Dette utfyller andre protokoller for å forstå utviklingen av det indre øret i eksplantkultur20,21,22. Vi diskuterer først introduksjonen av eksogent DNA eller RNA i BP-forløpere i E3.5-otocysten ved bruk i ovo-elektroporering. Selv om genetiske manipulasjoner kan gi verdifull innsikt, kan fenotypene som genereres være pleiotropiske og følgelig forvirrende. Dette gjelder spesielt under senere indre øreutvikling, hvor grunnleggende prosesser som cytoskeletal remodeling spiller flere roller i celledeling, vevmorfogenese og cellulær spesialisering. Vi presenterer protokoller for farmakologisk inhibering i dyrkede eksplanter, som gir fordeler ved å kontrollere dosering og behandlingstidspunkt og varighet, og tilbyr presis spatiotemporal manipulering av utviklingsmekanismer.
Ulike organkulturmetoder kan benyttes avhengig av behandlingsvarigheten av små hemmere. Her demonstrerer vi to metoder for organkultur som gir innsikt i epitelmorfogenese og cellulær spesialisering. En metode for 3D-kultur ved å bruke kollagen som en matrise for å dyrke cochleakanalen muliggjør robust dyrking og levende visualisering av utviklings-BP. For å forstå dannelsen av stereocilia presenterer vi en membrankulturmetode slik at epitelvev dyrkes på en stiv matrise som gjør det mulig for aktinfremspring å vokse fritt. Begge metodene tillater nedstrøms prosessering som levende celleavbildning, immunhistokjemi, skanning elektronmikroskopi (SEM), celleopptak, etc. Disse teknikkene gir et veikart for effektiv bruk av kyllingen som et modellsystem for å forstå og manipulere utviklingen, modningen og regenereringen av aviært hørselsepitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoller som involverer innkjøp, kultur og bruk av befruktede kyllingegg og uutviklede embryoer ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee ved National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. I ovo elektroporering av kylling auditive forløpere
- sgRNA design og kloning for CRISPR / Cas9 gen knockout
- For å lage gen knockouts, design guide RNA for å forstyrre eksonregionene i genet, helst nærmere 5 'enden av kodingsområdet.
- Velg potensielle guide-RNA-er ved hjelp av et webverktøy CRISPOR23. Sett nettleserdataene til Gallus gallus og protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens til 5'- NGG -3'. Programmet bestemmer guide RNA fra inngangssekvensen og tildeler forskjellige score basert på on-target og off-target aktivitet. Velg de fire beste guidene for videre studier.
- For utforming av malspesifikke oligoer for guide (g) RNA-produksjon, fjern PAM-sekvensen (5′- NGG -3′) fra gRNA-designverktøyet. Dette er ikke nødvendig for målretting, men inneholder Cas9-sekvensen for spaltningsgjenkjenning. Syntetiser to HPLC-rensede komplementære oligoer med BsmBI-begrensningssted i begge ender, for hvert potensielle gRNA.
- Klon styresekvensen i ramme med et tracrRNA-stillas av en valgt vektor (her ble pcU6_1sgRNA vektor brukt24).
- Løs opp sgRNA-oligonukleotidene i en konsentrasjon på 100 μM i DNase/RNase-fritt vann. Utfør gløding av de to sanse- og antisense oligoguidene ved hjelp av en termosykler med følgende parametere: 95 °C i 3 minutter, deretter 37 °C i 15 minutter, og reduser deretter til 4 °C.
- Ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker som beskrevet i25, oppsett begrensning fordøyelse av annealed oligos og pcU6_1sgRNA kloning vektor med BsmBI enzym over natten. Oppsett ligering med gel-renset lineær BsmBI-fordøyd pcU6_1sgRNA vektor og fordøyd sgRNA oligoer. Transformer til en DH5-alfa-kompetent celle og sekvens bekreft den oppnådde klonen.
- Egghåndtering og vindusbehandling
- Skaff nylagte egg og rengjør dem ved å tørke dem med 70% etanol for å forhindre forurensning. Inkuber ved 37-38 °C, med 45% fuktighet i 3,5-4 dager.
- Etter inkubasjon, legg egget på siden i minst 5 minutter før åpning. Dette gjør at embryoet kan flytte seg til toppen av eggeplommen. Bruk tang til å lage små hull på toppen og stump ende av egget slik at en 21G nål kan passere gjennom.
- For å forhindre skade under vindu, fjern albumin for å senke embryoet bort fra skallet. For å gjøre dette, bruk en 5 ml sprøyte og en 21G nål for å forsiktig trekke 2 ml albumin fra et hull i den stumpe enden av egget. Bruk klar tape for å dekke hullet i den stumpe enden.
- For å lage eggvinduet, fest klar tape til toppen av eggeskallet. Klipp opp et vindu, rundt 2 cm langt og 1,5 cm bredt, ved hjelp av fjærbuesaks og eksponer embryoet. Bruk tang for å åpne de chorioniske membranene som ligger over embryoet, slik at du får tilgang til embryoet.
- Mikroinjiserende plasmider
- For genet knockout-eksperimentet, lag to løsninger: knock-down-blandingen som inneholder SpCas9-protein og guideplasmid-pcU6_1sgRNA, og tracerplasmidblandingen av T2K-eGFP (dette er en chick ß-actin-promotor som driver GFP-kassett omgitt av transposonstedene til Tol2) sammen med T2TP (Tol2-transposasen klonet i Tol2-konstruksjon26,27). Traceren brukes til å spore elektroporeringseffektivitet.
- Når du elektroponerer flere plasmider, må du sørge for at den endelige konsentrasjonen av DNA er minst 4 μg / μL. Bland de tre konstruksjonene, guide plasmid - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP og T2TP, i et 1: 1: 1-forhold med 1 μg SpCas9-protein, 30% sukrose og 0,1% Fast Green-fargestoff i et endelig volum på 10 μL.
- Trekk nåler for mikroinjeksjon fra standard glasskapillærer (lengde 3 tommer, OD 1,0 mm) ved hjelp av en vertikal pipettetrekker. Bruk fine tang til å bryte av kapillærspissen etter trekk for å oppnå en spissdiameter på ca. 50 μm med en konisk ende.
- Legg embryoene ved E3.5 på venstre side med hodet vendt mot høyre. På denne måten er bare den rette otiske vesikkelen tilgjengelig for mikroinjeksjon. Mikroinjiser knock-down-blandingen i den otiske vesikkelen. Injiser rundt et 200 nL volum av DNA-løsningsblanding for å fylle den otiske vesikkelen.
- Bestem veiledningseffektiviteten ved hjelp av en T7-endonukleaseanalyse28.
- Elektroporering
- Tilsett noen dråper 0,719% saltvann på toppen av embryoet før elektroporering for å senke den elektriske motstanden og forhindre overoppheting av embryoet.
- Plasser den positive elektroden gjennom hullet som er laget på den stumpe siden av egget når albuminet ble fjernet. Manøvrer elektroden slik at den er under eggeplommen. Plasser den negative elektroden over den fylte otocysten.
- Bruk elektroporering til å transfektere plasmider inn i cellene i embryoet. Bruk en firkantet pulsgenerator og bruk fem pulser på 25 V og 100 ms varighet hver, 50 ms fra hverandre. Bestem forholdene empirisk basert på et individuelt elektroporeringsoppsett.
- Hydrater embryoet etter elektroporering ved å tilsette noen dråper 0,719% saltvann. For å rengjøre denaturert albumin fra overflaten av elektrodene, skyll det grundig med destillert vann. Lukk egget med klar tape og gå tilbake til den fuktede inkubatoren ved 37-38 °C for videre inkubasjon.
MERK: Embryoer kan dyrkes til klekking etter elektroporering, men det er en bratt reduksjon i levedyktighet.
2. Basilar papilla disseksjon
- Bruk 70% etanol til å desinfisere operasjonsbordet, mikroskopstadiet og området rundt. Varme eller alkohol sterilisere mikrodisseksjon utstyr som inkluderer minimalt fjær-bue saks, mikro-curette, og to par fine tang.
- Forbered følgende disseksjonsplater: en petriskål i glass med en svart silisiumbase, en 90 mm petriskål av plast og en 60 mm petriskål. Chill enten fosfatbufret saltvann (PBS) eller Hanks 'balansert saltløsning (HBSS) for disseksjoner.
- Knekk egget forsiktig i 90 mm petriskålen. Identifiser det ytre øret til kyllingen. Halshugg embryoet ved å kutte nakken like under nivået på underkjeven ved hjelp av saks. Overfør hodet til en 60 mm petriskål fylt med iskald PBS.
- Orienter embryoet med toppen av nebbet vendt mot eksperimentøren og hold nebbet ved hjelp av en av #5 tangene. Øs ut øynene ved hjelp av den andre # 5 tang. Gå fra rostral til caudal, kutt skallen langs midtlinjen. Øs ut hjernen.
- Legg til mer iskald PBS eller HBSS og finn de to skinnende strukturene, nær nivået på pinna. Dette er otolittene i lagena på enden av cochlearkanalen og finnes nær midtlinjen.
- Klipp omtrent mellom de to lagenaene, og godt over og under denne regionen for å isolere to indre ører. Under skrå belysning, visualiser omrisset av det indre øret. Fjern eksternt vev og vestibulen.
- Overfør det isolerte sneglehuset til en svart silikonbunnplate med iskald PBS. Bruk #5 tang, og fjern den brusk-cochleakapselen for å oppnå cochleakanalen. Finn det bølgede laget (tegmentum) av cochleakanalen og fjern med # 55 tang for å eksponere BP. Bruk # 55 tang, fjern tectorial membranen for å eksponere HCs og SCs.
3. Kultur av basilar papilla explants
- Membrankultur av BP
- Ta en seks-brønns vevskulturplate og ordne en kulturmembraninnsats per brønn.
- Samle den dissekerte basilære papillen (explant) i en 200 μL pipette med 1x HBSS-buffer og overfør den til en membran. For å forhindre at vevet fester seg til pipetteveggen, må du tegne opp noen medier før du aspirerer vevet.
- Orienter utstillingen slik at basilarpapillen vender oppover, slik at håret og støttecellene er synlige fra topp29. Når eksplanten er plassert, aspirer HBSS-bufferen sakte fra kulturmembranoverflaten. I denne prosessen vil explant feste seg til kulturmembranen.
- Tilsett 1,2 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) kulturmedier mellom membraninnsatsen og brønnveggen for å fylle opp brønnene på seksbrønnsplaten. Opptil seks eksplanter kan dyrkes på en enkelt 30 mm kulturmembran.
- Kollagenkultur i cochleakanalen
- Forbered kollagenblandingen ved å tilsette 400 μL 3 mg / ml rottehalekollagen, 50 μL 10x DMEM, 30 μL 7,5% NaHCO3 og 5 μL HEPES i en vevskulturhette.
- Ta en fire-brønns plate og tilsett tre dråper kollagenblanding i hver brønn. Overfør dissekert cochleakanal til hver kollagendråpe. Inkuber platen i 10 minutter ved 37 °C, 5% CO2 for å herde kollagenmatrisen.
- Småmolekylær behandling av kulturer
- Forbered kulturmedier (DMEM, N-2 supplement, Penicillin) med enten farmakologisk modulator eller dets løsningsmiddel alene (for bruk som kontroll). Erstatt kulturmediet med 700 μL media supplert med inhibitoren. Dyrk eksplantene i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
- Bytt ut 50% av kulturmediene hver dag. Etter passende inkubasjonstid, fjern kulturmediet og bruk eksplantene for nedstrøms analyser.
4. Avbildning og analyse
- Immunfluorescerende analyse
- Fjern kulturmedier fra brønner og vask plantene to ganger med 1x HBSS. Bruk en pipette, tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) til brønnen og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- Fjern PFA og vask plantene tre ganger med 1x PBS ved romtemperatur. For å samle eksplantene fra kulturmembranen, lag et lite kutt rundt membranen som inneholder vevstykket ved hjelp av liten fjærbuesaks og overfør vevet sammen med membranen til en 48-brønns kulturplate ved hjelp av tang.
MERK: Hvis vevet flyter etter fikseringen, må du aspirere med en 200 μL pipette og overføre den til 48-brønnplater for videre behandling. Unngå kraftig løsrivelse av vevet fra membranen. - For kollagendråpekultur, bruk tang for å overføre hele kollagendråpen til en silisiumplate. Tilsett 200 μL 1x PBS og fjern kollagen ved hjelp av tang, og overfør deretter vevet til en 48-brønns kulturplate.
- Permeabiliser eksplantene med 1 ml 1x PBS supplert med 0,3% Tween-20 (PBST) i 30 minutter ved romtemperatur. Inkuber eksplantene med 200 μL blokkeringsbuffer (10% geitserum + 1% bovint serumalbumin i PBST) i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber eksplantene med 200 μL primær antistoffløsning (1:300, i blokkerende buffer) over natten ved 4 °C. Fjern den primære antistoffoppløsningen og vask eksplantene grundig 5 x 20 min med PBST.
- Inkuber eksplantene med 200 μL phalloidin og sekundær antistoffløsning (i blokkerende buffer) i 1 time ved romtemperatur i mørket. Fjern phalloidin og sekundær antistoffløsning og vask eksplantene grundig 5 x 20 min med PBST.
MERK: Sekundær antistoffkonsentrasjon og vaskelengde må bestemmes for hvert enkelt bildebehandlingsprogram. For avbildning ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi øker vi vanligvis konsentrasjonen av det sekundære antistoffet fra 1:500 til 1:200 og øker konsentrasjonen av phalloidin fra 1:400 til 1:200. - Inkuber eksplantene med en løsning av DAPI (1:1000 i PBST) i 15 minutter ved romtemperatur. Fjern DAPI-løsningen og vask eksplantene 3 x 5 min med PBST.
- Bruk monteringsmediet til å montere eksplanter på et lysbilde med BP vendt i oppadgående retning (mot dekselet). For konfokal avbildning bruk antifade monteringsmedier. La monteringsmediet tørke over natten ved romtemperatur i mørket. Enten bilde direkte eller lagre lysbildene ved 4 °C til bildebehandling.
- OTOTO-fiksering for SEM-analyse
- Forbered alle løsninger ferske og håndter i henhold til lokale sikkerhetsretningslinjer. Fest membrandyrkede eksplanter (fra trinn 4.1.4) i 2.5% glutaraldehyd i 0.1 M natriumkakodylatbuffer (pH 7.3) med 3 mM CaCl2. Utfør fiksering ved 4 °C i 24 til 72 timer med endring av fikseringsmiddel hver 24.
- Fjern fikseringsmiddelet og vask vevet med 0,1 M natriumkakodylat 3 x 5 min ved romtemperatur. Sekundær fiksering med 1% OsO 4 (fortynnet fra en 4% OsO4-bestand ved bruk av 0,1 M natriumkakodylatbuffer) i 1 time ved romtemperatur. Utfør dette og de påfølgende trinnene til dehydrering i en avtrekkshette.
- Skyll med 0,1 M natriumkakodylatbuffer 3 x 5 min ved romtemperatur. Skyll deretter i dobbeltdestillert eller ultrarent vann 3 x 5 minutter ved romtemperatur.
- Forbered en 0,5% løsning av tiokarbohydrazid (TCH) i ultrarent vann. Rør ved 75 °C i 10 minutter og filtrer oppløsningen når den er avkjølt til romtemperatur.
MERK: TCH er ekstremt farlig. Bruk må godkjennes av den lokale sikkerhetskomiteen, og det må utvises forsiktighet ved håndtering. - Fjern ultrarent vann fra prøven og tilsett 0,5% TCH dråpe for dråpe. Hvis løsningen blir brun, stopp og skyll prøven med ultrarent vann, før du forsiktig tilsetter 0,5% TCH-løsningen. Når løsningen er klar, bytt den ut med 0,5% TCH. Inkuber ved romtemperatur i 20 min30,31.
- Skyll prøven med ultrarent vann 3 x 5 min ved romtemperatur. Gjenta trinn 4.2.2, 4.2.3 og 4.2.5 to ganger til som slutter med OsO 4-inkubasjon etterfulgt av skylling.
- Dehydrer prøvene i en etanolserie til 100% vannfri etanol (EtOH). Inkuber først i 25% ETOH i 10 min, deretter 50% ETOH i 10 min, 75% EtOH i 10 min, 95% ETOH i 10 min, før du inkuberer totalt 3x i 10 minutter hver i 100% ETOH.
- Utfør tørking av kritiske punkter ved bruk av flytende CO2. Monter prøvene umiddelbart på en SEM-stubbe med dobbeltsidig karbontape. Fortsett å sputter pels for å gi 5-10 nm belegg. Hvis du ikke avbilder umiddelbart, lagre prøvene i en tørkemiddel under vakuum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I elektroporeringsoppsettet kan elektrodeposisjonering spille en rolle i transfeksjonsdomenet. Den positive elektroden er plassert under eggeplommen, og den negative over embryoet (figur 1A). Dette resulterer i høyere GFP-uttrykk i mye av det indre øret og begge vestibulære organer (figur 1B) og auditiv basilær papilla (figur 1C, D), som bekrefter transfeksjon.
Ved vurdering av fenotypen av CRISPR-knockdowns designet vi guide RNA til hårcelletranskripsjonsfaktoren Atonal homolog 1 (Atoh1). Musmutanter av Atoh1 er ikke i stand til å danne hårceller32; etter elektroporering av Atoh1 guide RNA og inkubasjon frem til E10, finner vi at HC-utviklingen er svekket sammenlignet med kontroll, tom plasmidkontroll (figur 2). Selv om elektroporering er mosaikk (figur 2E, F), er kontrollelektroporerte celler i stand til å danne hårceller. I Atoh1 gRNA-elektroporerte prøver viser GFP-positive celler aldri markørene for HC-utvikling (figur 2B).
Organkultur av BP gir tilgjengelighet til vevet. Kulturer i en 3D-matrise, som kollagen, gir utmerket bevaring av vevsmorfologi i opptil 5 dager. Organiseringen av HC og SC opprettholdes under disse kulturforholdene (figur 3).
Organkulturer på en membran er å foretrekke for avbildning av stereocilia. Slike kulturer kan dyrkes i opptil 5 dager samtidig som hårbuntens integritet opprettholdes. Dette kan ses ved lokalisering av tip-link-proteinet, protocadherin 1533 (Pcdh15) (figur 4). For å undersøke utviklingen av hårbunten er det nødvendig med høyere oppløsning, og slike tilnærminger, enten ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi (figur 4D) eller skanningelektronmikroskopi (figur 4E), gir mer fullstendig informasjon.
Figur 1. GFP-uttrykk er synlig ved E10 etter i ovo-elektroporering ved E4. (A) Skjematisk diagram som illustrerer i ovomikroinjeksjon og elektroporering i chick otic vesikkel ved E4. Injeksjonspipetten er fylt med Tol2-eGFP (T2K-eGFP) og Tol2-transposaser (T2TP) plasmider, sammen med raskt grønt fargestoff for visualisering. (B) Bilde av det elektroporerte indre øret ved E10 ved hjelp av en 0,63x luftobjektivlinse på et stereomikroskop. Det venstre indre øret er den interne kontrollen. Den røde pilen markerer GFP-uttrykket i cochleakanalen i høyre indre øre, og den røde stjernen viser GFP-uttrykk i vestibulære organer; skala bar er 2 cm. (C) Widefield fluorescens bilde av et tverrsnitt av høyre cochlear kanal ved hjelp av en 20x luft mål på 0,5 NA. GFP-uttrykk er for det meste begrenset til det sensoriske epitelet; skala bar er 10 μm. (D) Konfokal bilde av hele mount basilar papilla avbildet med 10x luftmål på 0,5 NA farget med phalloidin konjugert med Alexa 647 fluorofor. GFP-uttrykk observeres fra proksimal til distal ende på nevrale siden av BP; skala bar er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. CRISPR / Cas9-mediert Atoh1 gen knockout viain ovo elektroporering resulterer i tap av hårceller (HCs). Atoh1 genguide plasmid pcU6_1-Atoh1sgRNA og tracer plasmider Tol2-eGFP (T2K-eGFP) og Tol2-transposaser (T2TP) med SpCas9 protein er mikroinjisert og elektroporert i chick otic vesikkel ved E4. Alle bildene er fra chick E10 basilar papilla med en 10 μm skala bar, tatt med en 60x olje nedsenking mål på 1,42 NA ved hjelp av en laser konfokal mikroskop. Innzoomede innsatser er tilgjengelig for alle bilder. (A,B,C,D) Det venstre panelet inneholder BP med hårceller (HCs), elektroporert med tom pcU6_1sgRNA og T2K-eGFP, og T2TP med SpCas9-protein. (E,F,G,H) Høyre sidepanel inneholder BP med tap av HCs, elektroporert med Atoh1 guide (pcU6_1-Atoh1sgRNA) og T2K-eGFP, og T2TP med SpCas9 protein. (A,E) Sammenslått bilde som viser hårceller (HCs) i basilar papilla. Disse er immunreaktive for Myosin 7a (blå); F-aktin farget med phalloidin konjugert med Alexa 647 (rød); GFP-uttrykk fra Tol2-eGFP-plasmider detekteres ved hjelp av et anti-GFP-antistoff (grønt). Tapet av HCs er tydelig fra Myosin 7a immunoreaktivitet når man sammenligner behandlinger med tom pcU6_1sgRNA (D) og pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). F-aktinavbildning fra begge behandlingene fremhever hårbunten til HC (B, F). (C,G) T2K-eGFP og T2TP brukes til å måle transfeksjonsplassering og effektivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Organkultur av cochleakanalen i 3D-kollagendråpekultur opprettholder organiseringen av sensorisk epitel. BP ved E10 dyrkes i en 3D kollagendråpekultur i 1 dag og avbildes ved hjelp av 60x oljenedsenkingsmål på 1,42 NA ved hjelp av et laserkonfokalt mikroskop. (A) Bilde av hele BP av E10 dyrket i 1 dag i en kollagendråpe og farget med antistoffer mot hårcelleantigen (HCA)34. Skalastang er 100 μm. (B) Sammenslått bilde som viser den bevarte organiseringen av sensorisk epitel fra den distale siden av BP farget med (C) phalloidin (grønn) og (D) HCA (blå); skala bar er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Stereociliary bunter av basilær papilla under elektron og lysmikroskop. 0,1 % dimetylsulfoksid (DMSO)-behandlet BP ble eksplantert ved E10 og dyrket i 3 dager in vitro (DIV) på membrankulturinnlegg. (A) Explant er avbildet ved hjelp av et 60x oljenedsenkningsmål på 1,42 NA med et laserskanning konfokalt mikroskop. Det sammenslåtte bildet viser uttrykket til protocadherin 15 (Pcdh15) og stereocilia merket med phalloidin konjugert med Alexa 488 (grønn). Enkeltkanalsbilder av F-aktin ( B ) og Pcdh15 (C) vises. Skala bar er 10 μm. (D) Superoppløsningsbilde av stereocilia farget med phalloidin konjugert med Alexa 488-flekker i grønt. Bildet ble oppnådd ved hjelp av et 63x olje-nedsenkningsmål på 1,42 NA i Airyscan-modus for laserskanning konfokalt mikroskop. Skala bar er 5 μm. (E) SEM bildet ble tatt ved 16340x forstørrelse ved hjelp av 7 kV elektron høyspenning (EHT ) spenning. Rød stjerne markerer kinocilia og rød kile markerer stereocilia. Lysstyrke og kontrast ble justert til auto og bildet ble skjerpet ved hjelp av FIJI. Skalalinjen er 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kyllingen er et kostnadseffektivt og praktisk tillegg til modellorganismene som et laboratorium kan bruke til å undersøke det indre øret. Metodene beskrevet her brukes rutinemessig i vårt laboratorium og utfyller pågående forskning i pattedyrets indre øre. I ovo brukes elektroporering til å introdusere genetiske manipulasjoner i kyllinggenomet. Elektroporering kan også brukes til å introdusere konstruksjoner som koder for fluorescerende proteiner rettet mot bestemte organeller eller subcellulære strukturer35,36. Selv om dette er en enkel prosedyre, påvirker manipulering av embryoer i ovo levedyktigheten. For effektiv elektroporering bør egg anskaffes ferske (kort tid etter legging). En økning i dødelighet og / eller unormal utvikling observeres ofte i egg som har blitt lagret i over 5 dager. Bruken av steril teknikk, som sikrer at egget er ordentlig forseglet slik at det ikke mister fuktighet, og minimerer manipulasjonene som utføres på embryoet, øker levedyktigheten.
Vi fant at målretting av otocysten ved E3.5 til E4 reduserer traumer som embryoet står overfor, og bruk av nøye plasserte elektroder tillater god målretting av sensoriske forløpere til BP. Men på dette stadiet har forløperne til den akustisk-vestibulære ganglion allerede migrert bort fra det indre øret37,38. For å målrette mot disse cellene, må tidligere tidspunkter for otocystelektroporering velges, og innkvartering gjøres for tilsvarende reduksjon i levedyktighet. En ytterligere advarsel er muligheten for mosaikk i elektroporerte embryoer. Ikke alle celler tar opp alt plasmidet, og dermed kan mosaikk forvirre tolkningen. Bruken av tracerplasmider hjelper til med datatolkning og gir en viss kontroll over mulige mosaikkeffekter. Bruk av flere repetisjoner, nøye analyser og statistiske metoder vil hjelpe til med vurdering av mosaikkfenotyper. En alternativ tilnærming er å bruke genmodifiserte vaktler39. For tiden er disse tallene begrenset og er ikke alltid tilgjengelige for mange laboratorier. Tilgjengeligheten vil imidlertid øke, og vaktelembryoer, som konstitutivt uttrykker subcellulært målrettede fluorescerende proteiner, er et attraktivt forslag for avbildningseksperimenter.
I denne metoden elektroporaterer vi protein og DNA for CRISPR-medierte knockdowns gjennom ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ)24. CRISPR/Cas9-mediert generering av fusjonskonstruksjoner gjennom homologistyrt reparasjon (HDR) forblir ineffektiv i dette spesielle paradigmet (Singh et al., upubliserte observasjoner). Elektroporeringsmetoden kan tilpasses for bruk med andre typer DNA-konstruksjoner (disse kan være konstruksjoner som koder for fusjonsproteiner), samt for RNA og protein. Det skal bemerkes at DNA-baserte ekspresjonskonstruksjoner under utvikling (og celledeling) vil bli fortynnet med mindre vektoren inkorporerer steder som formidler innsetting av eksogent DNA i genomet til disse cellene (f.eks. Tol2 eller PiggyBac). Dette gir mer stabilt uttrykk for konstruksjonen.
Etter elektroporering dyrkes embryoene vanligvis i ovo til E10-stadiet for hårcelledifferensiering og utviklingsstudier. Men om nødvendig, i ovo kultur kan fortsette til eggene klekkes; Men med økende inkubasjonslengder er det en tilsvarende nedgang i levedyktighet. For å omgå dette, kan elektroporering i ovo kombineres med BP-disseksjoner etterfulgt av langsiktig ex ovo-kultur . Dyrking av eksplanter i en 3D-matrise tillater god bevaring av vevsmorfologi. Denne metoden kan brukes til å studere endringer i vevsmønster, polaritet og differensiering. Kulturen av BP på en membran tillater visualisering av den apikale siden av vevet27, spesielt høyoppløselig avbildning av stereocilia.
I noen tilfeller kan begrensningene ved genetisk modifisering overvinnes ved å bruke forskjellige små molekylbaserte behandlinger. De farmakologisk aktive forbindelsene virker som inhibitorer eller agonister for signalveier eller cellebiologiske prosesser. Deres søknad er spesielt nyttig for å dissekere det tidsmessige kravet. Imidlertid må eksakte leveringsmåter og optimale konsentrasjoner bestemmes empirisk, da standardisering utført i cellelinjer i noen tilfeller ikke er sammenlignbar med doseringen som kreves i vev. Levering i embryoet kan være problematisk, og mengden som trengs kombinert med virkningen på andre organsystemer, kan kompromittere levedyktigheten betydelig. Et klart alternativ er orgelkulturmetoder20,21,22. Den eksakte kulturmetoden avhenger imidlertid av hvilke typer studier og analyser som er ment. Mens kollagenkultur bevarer vevsmorfologien til BP, er membrankulturen bedre egnet for å studere HC-hårbuntene. Vevet kan enkelt plasseres på toppen av membranen for å visualisere den apikale overflaten ved hjelp av skanningelektronmikroskopi eller superoppløsningsmikroskopi. Disseksjoner for organkultur krever god praksis. Disse inkluderer å opprettholde et sterilt arbeidsområde og bruke skjerpede instrumenter. Slike mikrodisseksjonsverktøy er følsomme, og vi finner bruk av silisiumretter viktig for å bevare integriteten til mikrokirurgiske verktøy.
Sammen representerer teknikkene verdifulle tilnærminger for å fremme forståelsen av utviklingen av det indre øret. Innsikten i komparativ biologi og regenerering som kyllingembryoene tilbyr, kan gi betydelig innsikt i hårcelleutvikling og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker for støtte fra NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB og Royal National Institute for the Deaf. Vi vil gjerne takke Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi er takknemlige for CIFF og EM-anlegg og laboratoriestøtte på NCBS. Vi takker Yoshiko Takahashi og Koichi Kawakami for Tol2-eGFP- og T2TP-konstruksjonene, og Guy Richardson for HCA- og G19 Pcdh15-antistoffet. Vi er takknemlige for Earlab-medlemmer for deres konstante støtte og verdifulle tilbakemeldinger på protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W.
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y.
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H.
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
