Summary
병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
내이는 달팽이관과 현관을 사용하여 소리를 감지하고 균형을 유지합니다. 그것은 유모 세포로 알려진 전용 기계 감각 세포 유형을 사용하여 이를 수행합니다. 내이에 대한 기초 연구는 유모 세포가 어떻게 기능하는지, 그리고 조절 장애가 어떻게 청력 상실과 현기증을 유발할 수 있는지에 대한 깊은 이해로 이어졌습니다. 이 연구에서 마우스는 탁월한 모델 시스템이었습니다. 그러나 마우스는 모든 포유류와 마찬가지로 유모 세포를 대체 할 수있는 능력을 상실했습니다. 따라서 내이 기능 회복을위한 세포 요법을 이해하려고 할 때 다른 척추 동물 종에 대한 보완 연구는 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 조류의 청각 상피 인 기저 유두 (BP)는지지 세포 (SC)에 의해 삽입 된 기계 감각 유모 세포 (HC)로 구성된 상피 시트입니다. 기저 유두와 포유류 달팽이관의 해부학 적 구조는 다르지만 내이 발달과 청력의 분자 메커니즘은 비슷합니다. 이것은 기저 유두를 비교 연구뿐만 아니라 재생을 이해하는 데 유용한 시스템으로 만듭니다. 여기에서는 닭 내이의 해부 및 조작 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 내이 발달의 분자 메커니즘을 연구하기위한 강력한 도구를 제공하는 유전 적 및 소분자 억제 방법을 보여줍니다. 이 논문에서는 CRIPSR-Cas9 결실을 사용하여 기저 유두를 유 전적으로 교란시킨 다음 기저 유두를 해부하는 ovo 전기 천공 기술에 대해 논의합니다. 우리는 또한 상피와 유모 세포의 발달을 관찰하기 위해 BP 기관 배양과 배양 매트릭스의 최적 사용을 보여줍니다.
Introduction
모든 척추동물의 내이는 귀 플라코드 1,2로 알려진 단순한 상피에서 파생됩니다. 이것은 청각 및 균형 인식과 관련된 기계 감각 정보를 전달하는 데 필요한 모든 구조적 요소와 세포 유형을 발생시킵니다. 내이의 섬모 센서인 유모 세포(HC)는 지지 세포(SC)로 둘러싸여 있습니다. HC는 여덟 번째 뇌신경의 뉴런을 통해 청각 후뇌에 정보를 전달합니다. 이들은 또한 otic placode3에서 생성됩니다. 소리의 일차 변환은 청각 HC의 정점 표면에서 기계적으로 민감한 모발 다발4을 통해 달성됩니다. 이것은 입체 섬모라고 불리는 변형 된 액틴 기반 돌출부를 통해 매개되며, 이는 등급이 매겨진 계단 패턴5로 배열됩니다. 또한, kinocilium이라고하는 변형 된 1 차 섬모는 모발 다발 형성을 조직하고 입체 섬모 6,7,8의 가장 높은 줄에 인접 해 있습니다. 입체 섬모의 구조는 음향 에너지에서 파생 된 기계적 자극을 전기 신경 신호로 변환하는 데 중요합니다9. 노화, 감염,이 음향 외상 또는이 독성 쇼크를 통한 청각 HC 손상은 포유류에서 돌이킬 수없는 부분 또는 완전한 청력 상실을 초래할 수 있습니다10.
그러한 손상을 복구 할 수있는 세포 대체 요법이 제안되었습니다11,12. 이 연구의 접근법은 포유류 유모 세포의 정상적인 발달을 이해하고 내이 내에 존재할 수있는 전구 세포에서 발달 프로그램이 재개 될 수 있는지 묻는 것이 었습니다13. 두 번째 접근법은 포유류 외부, 조류14,15와 같이 청각 유모 세포의 강력한 재생이 일어나는 비 포유류 척추 동물을 살펴 보는 것입니다. 조류에서, 유모 세포 재생은 주로 지지 세포를 전구세포와 유사한 상태로 역분화시킴으로써 발생하고, 이어서 유모 세포 및 지지 세포(16)를 생성하기 위한 비대칭 유사분열 분열을 통해 일어난다. 또한, 유모 세포를 생성하는 지지세포의 직접 분화도 관찰되었다17.
조류 청각 발달 메커니즘은 포유류의 메커니즘과 상당한 유사점을 보여 주지만 차이점이 있습니다18. 병아리 BP에서의 HC 및 SC 분화는 배아 일 (E) 7에서 명백하며, 시간이 지남에 따라 더욱 뚜렷해진다. E12에 의해, 잘 패턴화되고 잘 편광된 기저 유두(BP)가 가시화될 수 있고, E17에 의해 잘 발달된 유모 세포가19로 보일 수 있다. 이러한 시점은 분화, 패턴 및 극성뿐만 아니라 유모 세포 성숙의 메커니즘에 대한 창을 제공합니다. 그러한 메커니즘이 보존되는지 또는 발산되는지 이해하는 것은 기계 감각 유모 세포의 기원에 대한 깊은 상동성에 대한 통찰력을 제공하기 때문에 중요합니다.
여기에서는 내이 기관의 발달 전반에 걸쳐 증식, 운명 사양, 분화, 패턴 화 및 유지와 같은 세포 과정을 연구하기 위해 초기 및 후기 배아 단계에서 수행되는 일련의 기술을 보여줍니다. 이것은 체외이식편 배양20,21,22에서 내이 발달을 이해하는 다른 프로토콜을 보완합니다. 우리는 먼저 난자 전기천공을 사용하여 E3.5 이주머니 내의 BP 전구체에 외인성 DNA 또는 RNA를 도입하는 것에 대해 논의합니다. 유전자 조작이 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 이렇게 생성 된 표현형은 다방성이며 결과적으로 혼란 스러울 수 있습니다. 이것은 세포 골격 리모델링과 같은 기본 과정이 세포 분열, 조직 형태 형성 및 세포 전문화에서 여러 역할을 하는 후기 내이 발달 중에 특히 그렇습니다. 우리는 배양 된 체외 이식편에서 약리학 적 억제를위한 프로토콜을 제시하며, 이는 투여 량과 치료시기 및 기간을 제어하는 데 이점을 제공하여 발달 메커니즘의 정확한 시공간 조작을 제공합니다.
작은 억제제의 치료 기간에 따라 다른 장기 배양 방법을 활용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 상피 형태 형성과 세포 전문화에 대한 통찰력을 제공하는 두 가지 장기 배양 방법을 보여줍니다. 콜라겐을 매트릭스로 사용하여 달팽이관을 배양하는 3D 배양 방법은 발달 중인 BP의 강력한 배양 및 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 입체섬모의 형성을 이해하기 위해 상피 조직이 뻣뻣한 매트릭스에서 배양되어 액틴 돌출부가 자유롭게 성장할 수 있도록 하는 막 배양 방법을 제시합니다. 두 방법 모두 라이브 셀 이미징, 면역 조직 화학, 주사 전자 현미경 (SEM), 세포 기록 등과 같은 다운 스트림 처리를 허용합니다. 이러한 기술은 조류 청각 상피의 발달, 성숙 및 재생을 이해하고 조작하기 위한 모델 시스템으로 병아리를 효과적으로 사용하기 위한 로드맵을 제공합니다.
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Protocol
수정 된 닭고기 난자와 부화되지 않은 배아의 조달, 배양 및 사용과 관련된 프로토콜은 카르 나 타카 벵갈 루루에있는 국립 생명 과학 센터의 기관 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 병아리 청각 전구체의 ovo 전기 천공에서
- CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃을 위한 sgRNA 설계 및 클로닝
- 유전자 녹아웃을 생성하기 위해, 가이드 RNA는 유전자의 엑손 영역, 바람직하게는 코딩 영역의 5' 말단에 더 가깝게 파괴되도록 설계한다.
- 웹 도구 CRISPOR23을 사용하여 잠재적 가이드 RNA를 선택하십시오. 브라우저 데이터를 갈 루스 갈루스 로 설정하고 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 시퀀스를 5'-NGG -3'으로 설정합니다. 이 프로그램은 입력 서열에서 가이드 RNA를 결정하고 온 타겟 및 오프 타겟 활동에 따라 다른 점수를 할당합니다. 추가 연구를 위해 상위 4 개의 가이드를 선택하십시오.
- 가이드 (g)RNA 생산을 위한 주형 특이적 올리고의 설계를 위해, gRNA 설계 도구 출력에서 PAM 서열(5'- NGG -3')을 제거한다. 이것은 타겟팅에 필요하지 않지만 Cas9 절단 인식 시퀀스를 포함합니다. 각각의 잠재적 gRNA에 대해 양쪽 말단에 BsmBI 제한 부위가 있는 2개의 HPLC 정제된 상보성 올리고를 합성합니다.
- 가이드 서열을 선택된 벡터의 tracrRNA 스캐폴드로 프레임에 복제한다(여기서, 벡터pcU6_1sgRNA24를 사용하였다).
- sgRNA 올리고뉴클레오티드를 DNase/RNase가 없는 물에 100μM 농도로 용해시킵니다. 다음 매개 변수와 함께 thermocycler를 사용하여 두 개의 센스 및 안티센스 올리고 가이드의 어닐링을 수행하십시오 : 3 분 동안 95 °C, 15 분 동안 37 °C, 다음 4 °C로 감소.
- 도 25에 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 어닐링된 올리고의 제한 소화를 설정하고 밤새 BsmBI 효소로 클로닝 벡터를 pcU6_1sgRNA하였다. 겔 정제된 선형 BsmBI-분해된 pcU6_1sgRNA 벡터 및 분해된 sgRNA 올리고로 라이게이션을 설정합니다. DH5-알파 적격 세포로 형질전환하고 서열을 수득하여 수득된 클론을 확인한다.
- 계란 취급 및 창
- 갓 낳은 알을 조달하고 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 닦아서 청소하십시오. 37-38 °C에서 45 % 습도로 3.5-4 일 동안 배양하십시오.
- 배양 후 개봉하기 전에 알을 옆으로 5분 이상 눕힙니다. 이것은 배아가 노른자의 꼭대기로 재배치 할 수있게합니다. 집게를 사용하여 계란의 상단과 뭉툭한 끝에 작은 구멍을 만들어 21G 바늘이 통과할 수 있도록 합니다.
- 윈도우 중 손상을 방지하려면 알부민을 제거하여 배아를 껍질에서 멀리 떨어 뜨립니다. 이렇게하려면 5mL 주사기와 21G 바늘을 사용하여 계란의 무딘 끝에있는 구멍에서 2mL의 알부민을 조심스럽게 뽑습니다. 투명 테이프를 사용하여 무딘 끝의 구멍을 덮으십시오.
- 달걀 창을 만들려면 달걀 껍질 상단에 투명 테이프를 붙입니다. 봄 활 가위를 사용하여 길이 약 2cm, 너비 약 1.5cm의 창을 자르고 배아를 노출시킵니다. 집게를 사용하여 배아 위에 있는 융모막 막을 열어 배아에 접근할 수 있도록 합니다.
- 미세 주입 플라스미드
- 유전자 녹아웃 실험을 위해 SpCas9 단백질과 가이드 플라스미드-pcU6_1sgRNA를 포함하는 녹다운 믹스와 T2K-eGFP의 추적 플라스미드 믹스 (이것은 Tol2의 트랜스포존 부위로 둘러싸인 GFP 카세트를 구동하는 병아리 ß- 액틴 프로모터)와 T2TP (Tol2 구조26,27에서 클로닝 된 Tol2 트랜스포아제)의 두 가지 솔루션을 준비하십시오. 트레이서는 전기 천공 효율을 추적하는 데 사용됩니다.
- 여러 플라스미드를 전기천공할 때 DNA의 최종 농도가 최소 4μg/μL인지 확인하십시오. 가이드 플라스미드(pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP, T2TP)의 세 가지 구조물을 1:1:1 비율로 혼합하고 1μg의 SpCas9 단백질, 30% 자당 및 0.1% 패스트 그린 염료를 최종 부피 10μL로 혼합합니다.
- 수직 피펫 풀러를 사용하여 표준 유리 모세관(길이 3인치, OD 1.0mm)에서 미세 주입용 바늘을 당깁니다. 미세한 집게를 사용하여 당긴 후 모세관 팁을 분리하여 끝이 가늘어진 약 50μm의 팁 직경을 얻습니다.
- 머리가 오른쪽을 향하도록 왼쪽의 E3.5에 배아를 놓습니다. 이렇게 하면 오른쪽 귀 소포만 미세 주사에 접근할 수 있습니다. 녹다운 혼합물을 귀 소포에 미세 주입합니다. 귀 소포를 채우기 위해 약 200nL 부피의 DNA 용액 혼합물을 주입합니다.
- T7 엔도뉴클레아제 분석법28을 사용하여 가이드 효율을 결정한다.
- 전기 천공
- 전기 천공 전에 배아 위에 0.719% 식염수 몇 방울을 추가하여 전기 저항을 낮추고 배아의 과열을 방지합니다.
- 알부민을 제거할 때 계란의 무딘 쪽에 생긴 구멍을 통해 양극을 놓습니다. 전극이 노른자 아래에 있도록 조작하십시오. 채워진 이염용 위에 음극을 놓습니다.
- 전기 천공을 사용하여 플라스미드를 배아의 세포로 형질감염시킵니다. 사각 펄스 발생기를 사용하고 각각 25V 및 100ms 기간의 펄스 50ms를 50ms 간격으로 적용합니다. 개별 전기천공 설정을 기반으로 경험적으로 조건을 결정합니다.
- 전기 천공 후 0.719 % 식염수 몇 방울을 첨가하여 배아를 수화시킵니다. 전극 표면에서 변성 된 알부민을 청소하려면 증류수로 완전히 헹굽니다. 투명 테이프로 계란을 다시 밀봉하고 추가 배양을 위해 37-38 ° C의 가습 인큐베이터로 돌아갑니다.
참고: 배아는 전기천공 후 부화할 때까지 배양할 수 있지만 생존력이 급격히 감소합니다.
2. 기저 유두 박리
- 70 % 에탄올을 사용하여 수술대, 현미경 단계 및 주변 부위를 소독하십시오. 열 또는 알코올은 최소 스프링 활 가위, 마이크로 큐렛 및 두 쌍의 미세 집게를 포함하는 미세 해부 장비를 살균합니다.
- 다음 해부 판을 준비하십시오 : 검은 색 실리콘베이스가있는 유리 페트리 접시, 90mm 플라스틱 페트리 접시 및 60mm 페트리 접시. 해부를 위해 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 식힙니다.
- 계란을 90mm 페트리 접시에 부드럽게 깨뜨립니다. 병아리의 외이를 확인하십시오. 가위를 사용하여 아래턱 바로 아래의 목을 잘라 배아를 참수하십시오. 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 60mm 페트리 접시에 헤드를 옮깁니다.
- 부리의 상단이 실험자를 향하도록 배아의 방향을 맞추고 #5 집게 중 하나를 사용하여 부리를 잡습니다. 두 번째 #5 집게를 사용하여 눈을 퍼냅니다. 주둥이에서 꼬리로 이동하여 정중선을 따라 두개골을 자릅니다. 뇌를 퍼내십시오.
- 얼음처럼 차가운 PBS 또는 HBSS를 더 추가하고 피나 높이에 가까운 두 개의 반짝이는 구조물을 찾습니다. 이들은 달팽이관 끝에 있는 lagena의 이석이며 정중선 근처에서 발견됩니다.
- 두 개의 라게나 사이를 대략적으로 자르고이 부위의 위와 아래를 잘라 두 개의 내이를 분리합니다. 비스듬한 조명 아래에서 내이의 윤곽을 시각화하십시오. 외부 조직과 현관을 제거하십시오.
- 분리된 달팽이관을 얼음처럼 차가운 PBS가 있는 검은색 실리콘 베이스 플레이트에 옮깁니다. #5 집게를 사용하여 연골 달팽이관 캡슐을 벗겨내어 달팽이관을 얻습니다. 달팽이관의 물결 모양의 층(tegmentum)을 찾고 #55 집게를 사용하여 제거하여 BP를 노출시킵니다. #55 집게를 사용하여 텍토리얼 멤브레인을 제거하여 HC와 SC를 노출시킵니다.
3. 기저유두 체외이식편의 배양
- BP의 막 배양
- 6웰 조직 배양 플레이트를 가져다가 웰당 하나의 배양막 삽입물을 배열합니다.
- 해부된 기저 유두(이식편)를 1x HBSS 버퍼가 있는 200μL 피펫에 수집하고 멤브레인으로 옮깁니다. 조직이 피펫 벽에 달라 붙지 않도록하려면 조직을 흡인하기 전에 일부 매체를 추출하십시오.
- 기저 유두가 위쪽을 향하도록 체외 이식편을 향하게하여 모발과지지 세포가 상단29에서 보이도록합니다. 체외이식편이 위치되면 배양막 표면에서 HBSS 완충액을 천천히 흡인합니다. 이 과정에서 체외이식편은 배양막에 부착됩니다.
- 6웰 플레이트의 웰을 채우기 위해 멤브레인 삽입물과 웰 벽 사이에 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 배양 배지 1.2mL를 추가합니다. 단일 30mm 배양막에서 최대 6개의 체외이식편을 배양할 수 있습니다.
- 달팽이관의 콜라겐 배양
- 조직 배양 후드에 3mg/mL 쥐꼬리 콜라겐 400μL, 10x DMEM 50μL, 7.5% NaHCO3 30μL, hepes 5μL를 추가하여 콜라겐 혼합물을 준비합니다.
- 4 웰 플레이트를 가져 와서 각 웰에 콜라겐 혼합물 3 방울을 넣으십시오. 해부된 달팽이관을 각 콜라겐 방울로 옮깁니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 에서 10분 동안 인큐베이션하여 콜라겐 매트릭스를 경화시킨다.
- 배양 물의 소분자 처리
- 배양 배지 (DMEM, N-2 보충제, 페니실린)를 약리학 적 조절제 또는 그 용매 만 사용하여 (대조군으로 사용)로 준비하십시오. 배양 배지를 억제제가 보충된 700μL의 배지로 교체합니다. 체외이식편을 37°C, 5%CO2의 배양기에서 배양한다.
- 매일 배양 배지의 50 %를 교체하십시오. 적절한 배양 시간 후, 배양 배지를 제거하고 하류 분석을 위해 체외이식편을 사용합니다.
4. 이미징 및 분석
- 면역형광 분석
- 웰에서 배양 배지를 제거하고 1x HBSS로 체외이식편을 두 번 세척합니다. 피펫을 사용하여 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 웰에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- PFA를 제거하고 실온에서 1x PBS로 체외이식편을 3회 세척한다. 배양 막에서 체외 이식편을 수집하려면 작은 스프링 활 가위를 사용하여 조직 조각이 들어있는 막 주위를 작게 자르고 집게를 사용하여 막과 함께 조직을 48 웰 배양 플레이트로 옮깁니다.
알림: 고정 후 조직이 떠 있으면 200μL 피펫으로 흡인하고 추가 처리를 위해 48 웰 플레이트로 옮깁니다. 멤브레인에서 조직을 강제로 분리하지 마십시오. - 콜라겐 액적 배양의 경우 집게를 사용하여 전체 콜라겐 방울을 실리콘 플레이트로 옮깁니다. 200μL의 1x PBS를 추가하고 집게를 사용하여 콜라겐을 제거한 다음 조직을 48웰 배양 플레이트로 옮깁니다.
- 실온에서 30분 동안 0.3% 트윈-20(PBST)이 보충된 1x PBS 1mL로 체외이식편을 투과화합니다. 체외이식편을 200μL의 차단 완충액(PBST 중 10% 염소 혈청 + PBST 중 1% 소 혈청 알부민)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 체외이식편을 200μL의 1차 항체 용액(1:300, 블로킹 완충액 중)과 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션합니다. 1차 항체 용액을 제거하고 PBST로 5 x 20분 동안 체외이식편을 완전히 세척합니다.
- 체외이식편을 200μL의 팔로이딘 및 2차 항체 용액(블로킹 완충액 중)과 함께 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 팔로이딘 및 2차 항체 용액을 제거하고 PBST로 5 x 20분 동안 체외이식편을 완전히 세척합니다.
참고: 2차 항체 농도와 세척 길이는 각 개별 영상 적용에 대해 결정해야 합니다. 초고해상도 현미경을 사용한 이미징의 경우 일반적으로 2차 항체의 농도를 1:500에서 1:200으로 높이고 팔로이딘의 농도를 1:400에서 1:200으로 높입니다. - 실온에서 15분 동안 DAPI 용액(PBST 중 1:1000)으로 체외이식편을 인큐베이션한다. DAPI 용액을 제거하고 PBST로 체외이식편을 3 x 5분 동안 세척합니다.
- 장착 매체를 사용하여 BP가 위쪽 방향(커버슬립에 대해)을 향하도록 슬라이드에 체외이식편을 장착합니다. 컨포칼 이미징의 경우 페이드 방지 마운팅 미디어를 사용하십시오. 마운팅 미디어를 어두운 실온에서 밤새 건조시키십시오. 이미지를 직접 촬영하거나 이미징할 때까지 슬라이드를 4°C에서 보관합니다.
- SEM 분석을 위한 오토토 고정
- 모든 용액을 신선하게 준비하고 현지 안전 지침에 따라 취급하십시오. 막 배양된 체외이식편(단계 4.1.4로부터)을 3mMCaCl2와 함께 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액(pH 7.3) 중 2.5% 글루타르알데히드 중에 고정합니다. 4 ° C에서 24-72 시간 동안 고정을 수행하고 24 시간마다 정착액을 교체하십시오.
- 고정액을 제거하고 실온에서 3 x 5분 동안 0.1 M 나트륨 카코딜레이트로 조직을 세척한다. 실온에서 1 시간 동안 1 % OsO 4 (0.1 M 나트륨 카코 딜레이트 완충액을 사용하여 4 % OsO4 스톡으로부터 희석)로 2 차 수정. 흄 후드에서 탈수 될 때까지이 단계와 후속 단계를 수행하십시오.
- 실온에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액을 사용하여 3 x 5분 동안 헹굽니다. 그런 다음 이중 증류수 또는 초순수로 실온에서 3 x 5분 동안 헹굽니다.
- 초순수에서 티오카르보히드라지드(TCH)의 0.5% 용액을 준비합니다. 75°C에서 10분 동안 교반하고 실온으로 냉각되면 용액을 여과합니다.
알림: TCH는 매우 위험합니다. 사용법은 지역 안전위원회의 승인을 받아야하며 취급시주의를 기울여야합니다. - 샘플에서 초순수를 제거하고 0.5% TCH를 한 방울씩 추가합니다. 용액이 갈색으로 변하면 0.5% TCH 용액을 조심스럽게 추가하기 전에 초순수로 샘플을 멈추고 헹굽니다. 용액이 깨끗해지면 0.5 % TCH로 교체하십시오. 실온에서 20분동안 30,31 배양합니다.
- 실온에서 초순수로 3 x 5분 동안 샘플을 헹굽니다. 4.2.2, 4.2.3 및 4.2.5단계를OsO4 배양으로 끝나는 두 번 더 반복한 후 헹굼합니다.
- 에탄올 시리즈의 샘플을 100% 무수 에탄올(EtOH)로 탈수시킨다. 먼저 25% ETOH에서 10분 동안 배양한 다음 50% ETOH에서 10분, 75% ETOH에서 10분, 95% ETOH에서 10분 동안 배양한 다음 100% ETOH에서 각각 10분 동안 총 3회 배양합니다.
- 액체CO2를 사용하여 임계점 건조를 수행하십시오. 양면 탄소 접착 테이프로 SEM 스터브에 샘플을 즉시 장착하십시오. 5-10 nm의 코팅을 제공하기 위해 스퍼터 코팅을 진행하십시오. 즉시 이미징하지 않는 경우 샘플을 진공 상태의 데시케이터에 보관하십시오.
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Representative Results
전기천공 셋업에서, 전극 위치 결정은 형질주입의 영역에서 역할을 할 수 있다. 양극은 노른자 아래에 배치되고 음극은 배아 위에 위치합니다 (그림 1A). 그 결과 내이의 대부분과 전정 기관(그림 1B) 및 청각 기저 유두(그림 1C, D)에서 GFP 발현이 증가하여 형질감염을 확인합니다.
CRISPR-녹다운의 표현형을 평가할 때, 우리는 유모 세포 전사 인자 Atonal 동족체 1(Atoh1)에 대한 가이드 RNA를 설계했습니다. Atoh1의 마우스 돌연변이체는 유모 세포32를 형성할 수 없고; Atoh1 가이드 RNA를 전기천공하고 E10까지 배양한 후, 대조군인 빈 플라스미드 대조군과 비교할 때 HC 발달이 손상되었음을 발견했습니다(그림 2). 전기 천공은 모자이크이지만 (그림 2E, F), 제어 전기 천공 세포는 유모 세포를 형성 할 수 있습니다. Atoh1 gRNA 전기천공 샘플에서 GFP 양성 세포는 HC 발달 마커를 나타내지 않습니다(그림 2B).
BP의 장기 배양은 조직에 대한 접근성을 제공합니다. 콜라겐과 같은 3D 매트릭스의 배양은 최대 5일 동안 조직 형태를 탁월하게 보존합니다. HC 및 SC의 조직은 이러한 배양 조건에서 유지됩니다 (그림 3).
막상의 장기 배양은 입체 섬모를 영상화하는 데 바람직합니다. 이러한 배양물은 모발 다발 무결성을 유지하면서 최대 5일 동안 배양될 수 있다. 이는 팁-링크 단백질인 프로토카데린 1533 (Pcdh15)의 국소화에 의해 알 수 있다(도 4). 모발 다발의 발달을 조사하기 위해서는 고해상도 이미징이 필요하며 초고해상도 현미경(그림 4D) 또는 주사 전자 현미경(그림 4E)을 사용하는 이러한 접근 방식은 보다 완전한 정보를 제공합니다.
그림 1. GFP 발현은 E4에서 난자 전기천공을 한 후 E10에서 볼 수 있습니다. (A) E4에서 병아리 귀 소포에서 ovo 미세 주입 및 전기 천공을 보여주는 개략도. 주입 피펫은 시각화를 위한 빠른 녹색 염료와 함께 Tol2-eGFP(T2K-eGFP) 및 Tol2-트랜스포자제(T2TP) 플라스미드로 채워집니다. (B) 실체 현미경의 10x 공기 대물 렌즈를 사용한 E0.63의 전기 천공 된 내이 이미지. 왼쪽 내이는 내부 제어입니다. 빨간색 화살표는 오른쪽 내이의 달팽이관에서 GFP 발현을 표시하고 빨간색 별표는 전정 장기에서 GFP 발현을 나타냅니다. 스케일 바는 2cm입니다. (C) 0.5 NA의 20x 공기 대물 렌즈를 사용한 오른쪽 달팽이관 단면의 광시야 형광 이미지. GFP 발현은 대부분 감각 상피에 국한됩니다. 스케일 바는 10 μm입니다. (D) Alexa 647 형광단과 접합된 팔로이딘으로 염색된 0.5NA의 10x 공기 대물렌즈를 사용하여 이미징된 전체 마운트 기저 유두의 공초점 이미지. GFP 발현은 BP의 신경 측에서 근위부에서 말단까지 관찰됩니다. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CRISPR / Cas9 매개 Atoh1 유전자 녹아웃 비아인 오보 전기 천공은 유모 세포 (HC)의 손실을 초래합니다. Atoh1 유전자 가이드 플라스미드 pcU6_1-Atoh1sgRNA 및 SpCas9 단백질을 사용한 추적 플라스미드 Tol2-eGFP(T2K-eGFP) 및 Tol2-트랜스포자제(T2TP)를 E4의 병아리 귀 소포에 미세 주입하고 전기천공합니다. 모든 이미지는 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 1.42 NA의 60배 오일 이멀젼 대물렌즈로 캡처한 10μm 스케일 바가 있는 병아리 E10 기저 유두에서 가져온 것입니다. 확대된 인셋은 모든 이미지에 제공됩니다. (A, B, C, D) 왼쪽 패널에는 빈 pcU6_1sgRNA 및 T2K-eGFP로 전기천공된 유모 세포(HC)가 있는 BP와 SpCas9 단백질이 있는 T2TP가 포함되어 있습니다. (E, F, G, H) 오른쪽 패널에는 Atoh1 가이드 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) 및 T2K-eGFP로 전기 천공 된 HC가 손실 된 BP와 SpCas9 단백질이있는 T2TP가 포함되어 있습니다. (ᅡ,E) 기저 유두의 유모 세포(HC)를 보여주는 병합된 이미지입니다. 이들은 Myosin 7a (파란색)에 대해 면역 반응성입니다. Alexa 647 (빨간색)과 접합 된 팔로이딘으로 염색 된 F- 액틴; Tol2-eGFP 플라스미드의 GFP 발현은 항-GFP 항체(녹색)를 사용하여 검출됩니다. HC의 손실은 빈 pcU6_1sgRNA (D) 및 pcU6_1-Atoh1sgRNA (H)와의 치료를 비교할 때 Myosin 7a 면역 반응성에서 분명합니다. 두 치료법의 F- 액틴 이미징은 HC (B, F)의 모발 다발을 강조합니다. (씨, 지) T2K-eGFP 및 T2TP는 형질주입 위치 및 효율을 측정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 3D- 콜라겐 액적 배양에서 달팽이관의 장기 배양은 감각 상피의 조직을 유지합니다. E10의 BP를 3D 콜라겐 액적 배양에서 1일 동안 배양하고 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 1.42NA의 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지화합니다. (A) 콜라겐 방울에서 1일 동안 배양하고 유모 세포 항원(HCA)34에 대한 항체로 염색한 E10의 전체 BP의 이미지. 스케일 바는 100 μm입니다. (B) (C) 팔로이딘(녹색) 및 (D) HCA(파란색)로 염색된 BP의 원위측으로부터 감각 상피의 보존된 조직을 보여주는 병합된 이미지; 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 전자 및 광학 현미경 아래 기저 유두의 입체 섬모 번들. 0.1% 디메틸설폭사이드(DMSO) 처리된 BP를 E10에서 이식하고 막 배양 삽입물에서 3일 동안 시험관내 (DIV) 배양했습니다. (A) 체외이식편은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 1.42NA의 60배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지화됩니다. 병합 된 이미지는 protocadherin 15 (Pcdh15) 및 Alexa 488 (녹색)과 접합 된 phalloidin으로 표시된 입체 섬모의 발현을 보여줍니다. F- 액틴 ( B) 및 Pcdh15 (C) 의 단일 채널 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 10 μm입니다. (D) 녹색으로 Alexa 488 염색과 접합 된 phalloidin으로 염색 된 입체 섬모의 초 고해상도 이미지. 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 Airyscan 모드에서 1.42 NA의 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 획득되었습니다. 스케일 바는 5 μm입니다. ( E ) SEM 이미지는 7 kV 전자 고장력(EHT) 전압을 사용하여 16340x 배율로 촬영하였다. 빨간색 별표는 키노실리아를 표시하고 빨간색 쐐기는 입체섬모를 표시합니다. 밝기와 대비는 자동으로 조정되었으며 이미지는 피지를 사용하여 선명하게 조정되었습니다. 스케일 바는 1 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
병아리는 실험실에서 내이를 연구하는 데 사용할 수 있는 모델 유기체에 비용 효율적이고 편리한 추가 물입니다. 여기에 설명 된 방법은 우리 실험실에서 일상적으로 사용되며 포유류 내이에 대한 지속적인 연구를 보완합니다. ovo에서 전기 천공은 병아리 게놈에 유전자 조작을 도입하는 데 사용됩니다. 전기천공은 또한 특정 세포 기관 또는 세포하 구조(35, 36)에 표적화된 형광 단백질을 인코딩하는 작제물을 도입하는데 사용될 수 있다. 이것은 간단한 절차이지만 ovo에서 배아를 조작하면 생존력에 영향을 미칩니다. 효율적인 전기 천공을 위해서는 계란을 신선하게 조달해야합니다 (산란 직후). 사망률 증가 및/또는 비정상적인 발달은 5일 이상 보관된 알에서 자주 관찰됩니다. 멸균 기술을 사용하여 난자가 수분을 잃지 않도록 적절하게 밀봉하고 배아에서 수행되는 조작을 최소화하면 생존력이 향상됩니다.
우리는 E3.5에서 E4까지의 이낭을 표적으로 삼으면 배아가 직면하는 외상을 줄이고 신중하게 배치 된 전극을 사용하면 혈압의 감각 전구체를 잘 표적화 할 수 있음을 발견했습니다. 그러나 이 단계에서 음향 전정 신경절의 전구체는 이미 내이에서 멀어졌습니다(37,38). 이러한 세포를 표적으로 삼기 위해서는 이포낭 전기천공을 위한 더 이른 시점을 선택하고 해당 생존력 감소에 대한 조정을 해야 합니다. 주의해야 할 점은 전기 천공 된 배아에서 모자이크의 가능성입니다. 모든 세포가 모든 플라스미드를 차지하는 것은 아니므로 모자이크주의는 해석을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 추적 플라스미드를 사용하면 데이터 해석에 도움이 되며 가능한 모자이크 효과를 어느 정도 제어할 수 있습니다. 다중 반복, 신중한 분석 및 통계적 방법을 사용하면 모자이크 표현형을 평가하는 데 도움이 됩니다. 대안적인 접근법은 유전자 변형 메추라기39를 사용하는 것이다. 현재 이러한 숫자는 제한되어 있으며 많은 실험실에서 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 그러나 가용성이 증가하고 세포 내 표적 형광 단백질을 구성적으로 발현하는 메추라기 배아는 이미징 실험에 매력적인 제안입니다.
이 방법에서는 비상동 말단 접합(NHEJ)24를 통해 CRISPR 매개 녹다운을 위해 단백질과 DNA를 전기천공합니다. 상동성-지향 복구(HDR)를 통한 융합 구축물의 CRISPR/Cas9 매개 생성은 이러한 특정 패러다임에서 비효율적이다 (Singh et al., 미공개 관찰). 전기 천공 방법은 RNA 및 단백질뿐만 아니라 다른 유형의 DNA 구조물 (융합 단백질을 암호화하는 구조물 일 수 있음)과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. 발달 (및 세포 분열) 동안 DNA 기반 발현 작제물은 벡터가 외인성 DNA를 이들 세포의 게놈 (예 : Tol2 또는 PiggyBac)에 삽입하는 부위를 통합하지 않는 한 희석됩니다. 이를 통해 구문을보다 안정적으로 표현할 수 있습니다.
전기천공 후, 배아는 일반적으로 유모 세포 분화 및 발달 연구를 위해 E10 단계까지 난자에서 배양됩니다. 그러나 필요한 경우 난자 배양에서 알이 부화 할 때까지 계속 할 수 있습니다. 그러나 배양 기간이 길어질수록 생존력이 떨어집니다. 이를 피하기 위해 ovo 전기 천공을 BP 해부와 결합한 후 장기간 ex ovo 배양을 할 수 있습니다. 3D 매트릭스 내에서 체외이식편을 배양하면 조직 형태를 잘 보존할 수 있습니다. 이 방법은 조직 패턴, 극성 및 분화의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 막 상의 BP의 배양은 조직(27)의 정점측의 시각화, 특히 입체섬모의 고해상도 이미징을 가능하게 한다.
어떤 경우에는 유전자 변형의 한계가 다른 소분자 기반 치료법을 사용하여 극복 될 수 있습니다. 약리학적 활성 화합물은 신호전달 경로 또는 세포 생물학적 과정에 대한 억제제 또는 작용제로서 작용한다. 이들의 적용은 시간적 요구 사항을 해부하는 데 특히 유용합니다. 그러나 정확한 전달 방식 및 최적 농도는 경험적으로 결정되어야 하며, 일부 경우에는 세포주에서 수행되는 표준화가 조직에서 필요한 투여량과 비교할 수 없습니다. 배아 내 분만은 문제가 될 수 있으며 다른 장기 시스템에 미치는 영향과 함께 필요한 양은 생존력을 크게 손상시킬 수 있습니다. 준비된 대안은 장기 배양 방법20,21,22입니다. 그러나 정확한 배양 방법은 의도 한 연구 및 분석 유형에 따라 다릅니다. 콜라겐 배양은 BP의 조직 형태를 보존하지만 막 배양은 HC의 정점 모발 다발을 연구하는 데 더 적합합니다. 조직은 주사 전자 현미경 또는 초 고해상도 현미경을 사용하여 정점 표면을 시각화하기 위해 막 위에 간단히 배치 할 수 있습니다. 장기 배양을 위한 해부에는 좋은 연습이 필요합니다. 여기에는 멸균 작업 공간을 유지하고 날카로운 도구를 사용하는 것이 포함됩니다. 이러한 미세 해부 도구는 민감하며 미세 수술 도구의 무결성을 유지하는 데 실리콘 접시의 사용이 중요하다는 것을 알게되었습니다.
함께이 기술은 내이 발달에 대한 이해를 높이는 귀중한 접근 방식을 나타냅니다. 병아리 배아가 제공하는 비교 생물학 및 재생에 대한 통찰력은 유모 세포 발달 및 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB 및 Royal National Institute for the Deaf의 지원에 감사드립니다. 벵갈루루 헤사라가타에 있는 중앙 가금류 개발 기구 및 교육 기관에 감사드립니다. NCBS의 CIFF 및 EM 시설 및 실험실 지원에 감사드립니다. Tol2-eGFP 및 T2TP 구조체의 Yoshiko Takahashi 및 Koichi Kawakami와 HCA 및 G19 Pcdh15 항체의 Guy Richardson에게 감사드립니다. 프로토콜에 대한 지속적인 지원과 귀중한 피드백에 대해 Earlab 회원들에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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