병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
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방법 논문
조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
내이는 달팽이관과 현관을 사용하여 소리를 감지하고 균형을 유지합니다. 그것은 유모 세포로 알려진 전용 기계 감각 세포 유형을 사용하여 이를 수행합니다. 내이에 대한 기초 연구는 유모 세포가 어떻게 기능하는지, 그리고 조절 장애가 어떻게 청력 상실과 현기증을 유발할 수 있는지에 대한 깊은 이해로 이어졌습니다. 이 연구에서 마우스는 탁월한 모델 시스템이었습니다. 그러나 마우스는 모든 포유류와 마찬가지로 유모 세포를 대체 할 수있는 능력을 상실했습니다. 따라서 내이 기능 회복을위한 세포 요법을 이해하려고 할 때 다른 척추 동물 종에 대한 보완 연구는 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 조류의 청각 상피 인 기저 유두 (BP)는지지 세포 (SC)에 의해 삽입 된 기계 감각 유모 세포 (HC)로 구성된 상피 시트입니다. 기저 유두와 포유류 달팽이관의 해부학 적 구조는 다르지만 내이 발달과 청력의 분자 메커니즘은 비슷합니다. 이것은 기저 유두를 비교 연구뿐만 아니라 재생을 이해하는 데 유용한 시스템으로 만듭니다. 여기에서는 닭 내이의 해부 및 조작 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 내이 발달의 분자 메커니즘을 연구하기위한 강력한 도구를 제공하는 유전 적 및 소분자 억제 방법을 보여줍니다. 이 논문에서는 CRIPSR-Cas9 결실을 사용하여 기저 유두를 유 전적으로 교란시킨 다음 기저 유두를 해부하는 ovo 전기 천공 기술에 대해 논의합니다. 우리는 또한 상피와 유모 세포의 발달을 관찰하기 위해 BP 기관 배양과 배양 매트릭스의 최적 사용을 보여줍니다.
서론
모든 척추동물의 내이는 귀 플라코드 1,2로 알려진 단순한 상피에서 파생됩니다. 이것은 청각 및 균형 인식과 관련된 기계 감각 정보를 전달하는 데 필요한 모든 구조적 요소와 세포 유형을 발생시킵니다. 내이의 섬모 센서인 유모 세포(HC)는 지지 세포(SC)로 둘러싸여 있습니다. HC는 여덟 번째 뇌신경의 뉴런을 통해 청각 후뇌에 정보를 전달합니다. 이들은 또한 otic placode3에서 생성됩니다. 소리의 일차 변환은 청각 HC의 정점 표면에서 기계적으로 민감한 모발 다발4을 통해 달성됩니다. 이것은 입체 섬모라고 불리는 변형 된 액틴 기반 돌출부를 통해 매개되며, 이는 등급이 매겨진 계단 패턴5로 배열됩니다. 또한, kinocilium이라고하는 변형 된 1 차 섬모는 모발 다발 형성을 조직하고 입체 섬모 6,7,8의 가장 높은 줄에 인접 해 있습니다. 입체 섬모의 구조는 음향 에너지에서 파생 ....
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프로토콜
수정 된 닭고기 난자와 부화되지 않은 배아의 조달, 배양 및 사용과 관련된 프로토콜은 카르 나 타카 벵갈 루루에있는 국립 생명 과학 센터의 기관 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 병아리 청각 전구체의 ovo 전기 천공에서
- CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃을 위한 sgRNA 설계 및 클로닝
- 유전자 녹아웃을 생성하기 위해, 가이드 RNA는 유전자의 엑손 영역, 바람직하게는 코딩 영역의 5' 말단에 더 가깝게 파괴되도록 설계한다.
- 웹 도구 CRISPOR23을 사용하여 잠재적 가이드 RNA를 선택하십시오. 브라우저 데이터를 갈 루스 갈루스 로 설정하고 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 시퀀스를 5'-NGG -3'으로 설정합니다. 이 프로그램은 입력 서열에서 가이드 RNA를 결정하고 온 타겟 및 오프 타겟 활동에 따라 다른 점수를 할당합니다. 추가 연구를 위해 상위 4 개의 가이드를 선택하십시오.
- 가이드 (g)RNA 생산을 위한 주형 특이적 올리고의 설계를 위해, gRNA 설계 도구 출력에서 PAM 서열(5'- NGG -3')을 제거한다. 이것은 타겟팅에 필요하지 않....
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결과
전기천공 셋업에서, 전극 위치 결정은 형질주입의 영역에서 역할을 할 수 있다. 양극은 노른자 아래에 배치되고 음극은 배아 위에 위치합니다 (그림 1A). 그 결과 내이의 대부분과 전정 기관(그림 1B) 및 청각 기저 유두(그림 1C, D)에서 GFP 발현이 증가하여 형질감염을 확인합니다.
CRISPR-녹다운의 표현형을 평가할 때, 우리는 유모 세포 전사 인자 Atonal 동족체 1(Atoh1)에 대한 가이드 RNA를 설계했습니다. Atoh1의 마우스 돌연변이체는 유모 세포32를 형성할 수 없고; Atoh1 가이드 RNA를 전기천공하고 E10까지 배양한 후, 대조군인 빈 플라스미드 대조군과 비교할 때 HC 발달이 손상되었음을 발견했습니다(
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토론
병아리는 실험실에서 내이를 연구하는 데 사용할 수 있는 모델 유기체에 비용 효율적이고 편리한 추가 물입니다. 여기에 설명 된 방법은 우리 실험실에서 일상적으로 사용되며 포유류 내이에 대한 지속적인 연구를 보완합니다. ovo에서 전기 천공은 병아리 게놈에 유전자 조작을 도입하는 데 사용됩니다. 전기천공은 또한 특정 세포 기관 또는 세포하 구조(35, 36)에 표적화된 형광 단백질을 인코딩하는 작제물을 도입하는데 사용될 수 있다. 이것은 간단한 절차이지만 ovo에서 배아를 조작하면 생존력에 영향을 미칩니다. 효율적인 전기 천공을 위해서는 계란을 신선하게 조달해야합니다 (산란 직후). 사망률 증가 및/또는 비정상적인 발달은 5일 이상 보관된 알에서 자주 관찰됩니다. 멸균 기술을 사용하여 난자가 수분을 잃지 않도록 적절하게 밀봉하고 배아에서 수행되는 조작을 최소화하면 생존력이 향상됩니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
감사의 글
우리는 NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB 및 Royal National Institute for the Deaf의 지원에 감사드립니다. 벵갈루루 헤사라가타에 있는 중앙 가금류 개발 기구 및 교육 기관에 감사드립니다. NCBS의 CIFF 및 EM 시설 및 실험실 지원에 감사드립니다. Tol2-eGFP 및 T2TP 구조체의 Yoshiko Takahashi 및 Koichi Kawakami와 HCA 및 G19 Pcdh15 항체의 Guy Richardson에게 감사드립니다. 프로토콜에 대한 지속적인 지원과 귀중한 피드백에 대해 Earlab 회원들에게 감사드립니다.
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재료
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| Bovine Serum 알부민 | 시그마-알드리치 | A9647 | |
| 염화칼슘 이수화물 | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| 콜라겐 I, 쥐 | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
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참고문헌
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Dev....
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