Summary
O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.
Abstract
O ouvido interno percebe o som e mantém o equilíbrio usando a cóclea e o vestíbulo. Ele faz isso usando um tipo de célula mecanossensorial dedicada conhecida como célula ciliada. A pesquisa básica no ouvido interno levou a uma compreensão profunda de como as células ciliadas funcionam e como a desregulação pode levar à perda auditiva e vertigem. Para esta pesquisa, o mouse tem sido o sistema modelo proeminente. No entanto, os ratos, como todos os mamíferos, perderam a capacidade de substituir as células ciliadas. Assim, ao tentar entender as terapias celulares para restaurar a função do ouvido interno, estudos complementares em outras espécies de vertebrados poderiam fornecer mais insights. O epitélio auditivo de aves, a papila basilar (PA), é uma folha de epitélio composta por células ciliadas mecanossensoriais (HCs) intercaladas por células de suporte (SCs). Embora a arquitetura anatômica da papila basilar e da cóclea de mamíferos difiram, os mecanismos moleculares do desenvolvimento da orelha interna e da audição são semelhantes. Isso torna a papila basilar um sistema útil não apenas para estudos comparativos, mas também para entender a regeneração. Aqui, descrevemos técnicas de dissecação e manipulação para o ouvido interno da galinha. A técnica mostra métodos genéticos e de inibição de moléculas pequenas, que oferecem uma ferramenta potente para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do ouvido interno. Neste trabalho, discutimos em ovo-eletroporação técnicas para perturbar geneticamente a papila basilar utilizando deleções CRIPSR-Cas9, seguidas de dissecção da papila basilar. Também demonstramos a cultura de órgãos da PA e o uso ideal das matrizes de cultura, para observar o desenvolvimento do epitélio e das células ciliadas.
Introduction
A orelha interna de todos os vertebrados é derivada de um epitélio simples conhecido como placode ótico 1,2. Isso dará origem a todos os elementos estruturais e aos tipos de células necessários para transduzir a informação mecanossensorial associada à audição e à percepção de equilíbrio. As células ciliadas (HCs), o sensor ciliado do ouvido interno, são cercadas por células de suporte (SCs). Os HCs transmitem informações para o rombencéfalo auditivo através dos neurônios do oitavo nervo craniano. Estes também são gerados a partir do placode ótico3. A transdução primária do som é realizada na superfície apical do HC auditivo, através de um feixe capilar mecanicamente sensível4. Isso é mediado por meio de saliências modificadas à base de actina chamadas estereocílios, que são dispostas em um padrão de escada graduada5. Além disso, um cílio primário modificado, chamado de cinocílio, organiza a formação de feixes capilares e é adjacente à fileira mais alta de estereocílios 6,7,8. A arquitetura dos estereocílios é fundamental para esse papel na conversão de estímulos mecânicos derivados da energia acústica em sinais neurais elétricos9. Danos à HC auditiva por envelhecimento, infecção, trauma otoacústico ou choque ototóxico podem resultar em perda auditiva parcial ou completa que, em mamíferos, é irreversível10.
Terapias de substituição celular têm sido propostas que podem reparar tais danos11,12. A abordagem desta pesquisa tem sido compreender o desenvolvimento normal da célula ciliada de mamíferos e perguntar se os programas de desenvolvimento podem ser reiniciados em células semelhantes a progenitores que possam existir dentro da orelha interna13. Uma segunda abordagem tem sido olhar para fora dos mamíferos, para vertebrados não mamíferos nos quais ocorre regeneração robusta das células ciliadas auditivas, como as aves14,15. Em aves, a regeneração das células ciliadas ocorre predominantemente através da desdiferenciação de uma célula de suporte para um estado semelhante ao de progenitor, seguida de divisão mitótica assimétrica para gerar uma célula ciliada e uma célula de suporte16. Além disso, a diferenciação direta de uma célula de suporte para gerar uma célula ciliada também tem sido observada17.
Embora os mecanismos de desenvolvimento auditivo aviário mostrem semelhanças significativas com os dos mamíferos, existem diferenças18. A diferenciação de HC e SC na PA do pintinho é aparente a partir do dia embrionário (E) 7, tornando-se mais distinta ao longo do tempo. Por E12, uma papila basilar (PA) bem padronizada e bem polarizada pode ser visualizada, e por E17 células ciliadas bem desenvolvidas podem ser vistas19. Esses pontos de tempo fornecem janelas para os mecanismos de diferenciação, padronização e polaridade, bem como a maturação das células ciliadas. Entender se tais mecanismos são conservados ou divergentes é importante, pois eles fornecem insights sobre a homologia profunda das origens das células ciliadas mecanossensoriais.
Aqui, demonstramos uma série de técnicas realizadas em estágios embrionários iniciais e tardios para estudar processos celulares, como proliferação, especificação de destino, diferenciação, padronização e manutenção ao longo do desenvolvimento do órgão do ouvido interno. Isso complementa outros protocolos de compreensão do desenvolvimento da orelha interna em cultura de explante20,21,22. Primeiro, discutimos a introdução de DNA ou RNA exógeno em precursores da PA dentro do otocisto E3.5 usando na ovo-eletroporação. Embora as manipulações genéticas possam fornecer informações valiosas, os fenótipos assim gerados podem ser pleiotrópicos e, consequentemente, confusos. Isto é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento posterior do ouvido interno, onde processos fundamentais, como o remodelamento citoesquelético, desempenham múltiplos papéis na divisão celular, morfogênese tecidual e especialização celular. Apresentamos protocolos de inibição farmacológica em explantes cultivados, que oferecem vantagens no controle da dosagem e do tempo e duração do tratamento, oferecendo manipulação espaço-temporal precisa dos mecanismos de desenvolvimento.
Diferentes métodos de cultura de órgãos podem ser utilizados, dependendo da duração do tratamento de pequenos inibidores. Aqui demonstramos dois métodos de cultura de órgãos que permitem insights sobre a morfogênese epitelial e a especialização celular. Um método para cultura 3D usando colágeno como matriz para cultivar o ducto coclear permite a cultura robusta e a visualização ao vivo da PA em desenvolvimento. Para a compreensão da formação de estereocílios, apresentamos um método de cultura de membrana de tal forma que o tecido epitelial seja cultivado em uma matriz rígida, permitindo que as saliências de actina cresçam livremente. Ambos os métodos permitem o processamento a jusante, como imagens de células vivas, imuno-histoquímica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), gravação celular, etc. Essas técnicas fornecem um roteiro para o uso efetivo do pintinho como um sistema modelo para entender e manipular o desenvolvimento, maturação e regeneração do epitélio auditivo aviário.
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Protocol
Protocolos envolvendo a aquisição, cultura e uso de ovos de galinha fertilizados e embriões não eclodidos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Centro Nacional de Ciências Biológicas, Bengaluru, Karnataka.
1. Na eletroporação de ovoporação de precursores auditivos de pintos
- Projeto de sgRNA e clonagem para knockout do gene CRISPR/Cas9
- Para criar nocautes de genes, o projeto guia RNAs para interromper as regiões éxons do gene, de preferência mais perto da extremidade 5' da região codificadora.
- Selecione os potenciais RNAs guia usando uma ferramenta web CRISPOR23. Defina os dados do navegador como Gallus gallus e a sequência de motivos adjacentes do protoespaçador (PAM) como 5'- NGG -3'. O programa determina os RNAs de guia a partir da sequência de entrada e atribui pontuações diferentes com base na atividade no alvo e fora do alvo. Selecione os quatro principais guias para estudos adicionais.
- Para o projeto de oligos específicos do modelo para a produção de RNA do guia (g), remova a sequência PAM (5′- NGG -3′) da saída da ferramenta de projeto do gRNA. Isso não é necessário para a segmentação, mas contém a sequência de reconhecimento de clivagem Cas9. Sintetizar dois oligos complementares purificados por HPLC com local de restrição de BsmBI em ambas as extremidades, para cada potencial gRNA.
- Clone a sequência guia em quadro com um andaime de tracrRNA de um vetor de escolha (aqui, pcU6_1sgRNA vetor foi utilizado24).
- Dissolver os oligonucleotídeos de sgRNA a uma concentração de 100 μM em água isenta de DNase/RNase. Realizar o recozimento das duas guias oligo sense e antisense usando um termociclador com os seguintes parâmetros: 95 °C por 3 min, depois 37 °C por 15 min e, em seguida, diminuir para 4 °C.
- Usando técnicas padrão de biologia molecular, conforme descrito em25, a digestão de restrição de configuração dos oligos recozidos e pcU6_1sgRNA vetor de clonagem com a enzima BsmBI durante a noite. Ajuste a ligadura com o vetor de pcU6_1sgRNA linear BsmBI digerido por gel e oligos de sgRNA digeridos. Transformar-se em uma célula competente DH5-alfa e sequência confirmar o clone obtido.
- Manuseamento e janelas de ovos
- Procure ovos recém-postos e limpe-os limpando-os com etanol a 70% para evitar a contaminação. Incubar a 37-38 °C, com 45% de umidade por 3,5-4 dias.
- Após a incubação, coloque o ovo de lado por pelo menos 5 minutos antes de abrir. Isso permite que o embrião se reposicione no topo da gema. Use fórceps para fazer pequenos orifícios na parte superior e na extremidade romba do ovo, de modo que uma agulha 21G possa passar.
- Para evitar danos durante a janela, remova a albumina para abaixar o embrião para longe da casca. Para fazer isso, use uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para extrair cuidadosamente 2 mL de albumina de um orifício na extremidade contundente do ovo. Use fita adesiva transparente para cobrir o orifício na extremidade contundente.
- Para fazer a janela do ovo, afixe fita adesiva no topo da casca do ovo. Corte uma janela, com cerca de 2 cm de comprimento e 1,5 cm de largura, usando uma tesoura de arco de mola e exponha o embrião. Use fórceps para abrir as membranas coriônicas que recobrem o embrião, permitindo o acesso ao embrião.
- Plasmídeos de microinjeção
- Para o experimento de knockout de genes, prepare duas soluções: a mistura knock-down contendo a proteína SpCas9 e o plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, e a mistura de plasmídeo traçador de T2K-eGFP (este é um de GFP de condução de chick ß-actin conduzindo GFP cercado pelos locais de transposon de Tol2) juntamente com o T2TP (a transposase de Tol2 clonada na construção de Tol226,27). O traçador é usado para rastrear a eficiência da eletroporação.
- Ao eletroporar múltiplos plasmídeos, certifique-se de que a concentração final de DNA seja de pelo menos 4 μg/μL. Misture as três construções, plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, em uma proporção de 1:1:1 com 1 μg de proteína SpCas9, 30% de sacarose e 0,1% de corante Fast Green em um volume final de 10 μL.
- Puxe as agulhas para microinjeção dos capilares de vidro padrão (comprimento 3 pol, OD 1,0 mm) usando um puxador de pipeta vertical. Use pinça fina para quebrar a ponta capilar após a tração para obter um diâmetro da ponta de aproximadamente 50 μm com uma extremidade cônica.
- Coloque os embriões em E3.5 no lado esquerdo com a cabeça voltada para a direita. Desta forma, apenas a vesícula ótica direita é acessível para micro-injeção. Micro-injete a mistura knock-down na vesícula ótica. Injete cerca de um volume de 200 nL de mistura de solução de DNA para encher a vesícula ótica.
- Determinar a eficiência da guia usando um ensaio de endonuclease T728.
- Eletroporação
- Adicione algumas gotas de solução salina a 0,719% em cima do embrião antes da eletroporação para diminuir a resistência elétrica e evitar o superaquecimento do embrião.
- Coloque o eletrodo positivo através do orifício feito no lado rombudo do ovo quando a albumina foi removida. Manobrar o eletrodo para que ele fique sob a gema. Coloque o eletrodo negativo sobre o otocisto cheio.
- Use eletroporação para transfectar plasmídeos para as células do embrião. Use um gerador de pulso quadrado e aplique cinco pulsos de 25 V e 100 ms de duração cada, separados por 50 ms. Determine as condições empiricamente com base em uma configuração de eletroporação individual.
- Hidrate o embrião após a eletroporação adicionando algumas gotas de solução salina a 0,719%. Para limpar a albumina desnaturada da superfície dos eletrodos, enxágue-a completamente com água destilada. Voltar a selar o ovo com fita adesiva e regressar à incubadora humidificada a 37-38 °C para posterior incubação.
NOTA: Os embriões podem ser cultivados até a eclosão após a eletroporação, no entanto, há uma redução acentuada na viabilidade.
2. Dissecção da papila basilar
- Use etanol a 70% para desinfetar a mesa cirúrgica, o estágio do microscópio e a área circundante. O calor ou o álcool esterilizam equipamentos de microdissecação que incluem tesouras de arco de mola mínimas, microcurette e dois pares de pinças finas.
- Prepare as seguintes placas de dissecação: uma placa de Petri de vidro com uma base de silício preto, uma placa de Petri de plástico de 90 mm e uma placa de Petri de 60 mm. Resfrie a solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou a Solução Salgada Balanceada de Hanks (HBSS) para dissecações.
- Quebre suavemente o ovo na placa de Petri de 90 mm. Identifique a orelha externa do pintinho. Decapitar o embrião cortando o pescoço logo abaixo do nível da mandíbula inferior usando uma tesoura. Transfira a cabeça para uma placa de Petri de 60 mm cheia de PBS gelada.
- Oriente o embrião com a parte superior do bico voltada para o experimentador e segure o bico usando uma das pinças #5. Retire os olhos usando o segundo fórceps #5. Indo de rostral para caudal, corte o crânio ao longo de sua linha média. Tire o cérebro.
- Adicione mais PBS ou HBSS gelado e localize as duas estruturas brilhantes, perto do nível do pavilhão auricular. Estes são os otólitos da lagena no final do ducto coclear e são encontrados perto da linha média.
- Corte aproximadamente entre as duas lagenas, e bem acima e abaixo desta região para isolar duas orelhas internas. Sob iluminação oblíqua, visualize o contorno do ouvido interno. Remova o tecido estranho e o vestíbulo.
- Transfira a cóclea isolada para uma placa de base de silicone preto com PBS gelado. Usando pinça # 5, descasque a cápsula coclear cartilaginosa para obter o ducto coclear. Localize a camada ondulada (tegmento) do ducto coclear e remova usando pinça #55 para expor a PA. Usando pinça #55, remova a membrana tectorial para expor HCs e SCs.
3. Cultura de explantes de papila basilar
- Cultura de membrana da PA
- Pegue uma placa de cultura de tecido de seis poços e organize uma inserção de membrana de cultura por poço.
- Recolher a papila basilar dissecada (explante) numa pipeta de 200 μL com 1x tampão HBSS e transferi-la para uma membrana. Para evitar que o tecido grude na parede da pipeta, desenhe alguns meios antes de aspirar o tecido.
- Oriente o explante de tal forma que a papila basilar esteja voltada para cima, de modo que o cabelo e as células de suporte sejam visíveis a partir do topo29. Uma vez que o explante esteja posicionado, aspirar o tampão HBSS lentamente da superfície da membrana de cultura. Neste processo, o explante se ligará à membrana de cultura.
- Adicione 1,2 mL do meio de cultura Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco entre a inserção da membrana e a parede do poço para encher os poços da placa de seis poços. Até seis explantes podem ser cultivados em uma única membrana de cultura de 30 mm.
- Cultura de colágeno do ducto coclear
- Prepare a mistura de colágeno adicionando 400 μL de 3 mg/mL de colágeno de cauda de rato, 50 μL de 10x DMEM, 30 μL de 7,5% de NaHCO3 e 5 μL de HEPES em um exaustor de cultura de tecidos.
- Pegue um prato de quatro poços e adicione três gotas de mistura de colágeno em cada poço. Transfira o ducto coclear dissecado para cada gota de colágeno. Incubar a placa por 10 min a 37 °C, 5% de CO2 para curar a matriz de colágeno.
- Tratamento de pequenas moléculas de culturas
- Preparar meios de cultura (DMEM, suplemento de N-2, penicilina) com o modulador farmacológico ou seu solvente sozinho (para uso como controle). Substitua o meio de cultura por 700 μL de meio suplementado com o inibidor. Cultivar os explantes em incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
- Substitua 50% da mídia cultural todos os dias. Após o tempo de incubação adequado, remova o meio de cultura e utilize os explantes para ensaios a jusante.
4. Imagem e análise
- Análise imunofluorescente
- Remova os meios de cultura dos poços e lave os explantes duas vezes com 1x HBSS. Usando uma pipeta, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) ao poço e incube por 20 min à temperatura ambiente.
- Retire o PFA e lave os explantes três vezes com 1x PBS à temperatura ambiente. Para coletar os explantes da membrana de cultura, faça um pequeno corte ao redor da membrana contendo o pedaço do tecido usando uma pequena tesoura de arco de mola e transfira o tecido junto com a membrana para uma placa de cultura de 48 poços usando pinça.
NOTA: Se os tecidos estiverem flutuando após a fixação, aspirar com uma pipeta de 200 μL e transferi-la para placas de 48 poços para processamento adicional. Evite o descolamento forçado do tecido da membrana. - Para a cultura de gotículas de colágeno, use fórceps para transferir toda a gota de colágeno para uma placa de silício. Adicione 200 μL de 1x PBS e remova o colágeno com a ajuda de fórceps e, em seguida, transfira o tecido para uma placa de cultura de 48 poços.
- Permeabilizar os explantes com 1 mL de 1x PBS suplementado com Tween-20 a 0,3% (PBST) por 30 min à temperatura ambiente. Incubar os explantes com 200 μL de tampão bloqueador (10% de soro de cabra + 1% de albumina sérica bovina em PBST) por 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar os explantes com 200 μL de solução de anticorpos primários (1:300, em tampão de bloqueio) durante a noite a 4 °C. Retire a solução primária de anticorpos e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST.
- Incubar os explantes com 200 μL de faloidina e solução de anticorpos secundários (em tampão de bloqueio) por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Retire a faloidina e a solução de anticorpos secundários e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST.
NOTA: A concentração secundária de anticorpos e o comprimento de lavagem devem ser determinados para cada aplicação individual de imagem. Para imagens usando microscopia de super resolução, normalmente aumentamos a concentração do anticorpo secundário de 1:500 para 1:200 e aumentamos a concentração de faloidina de 1:400 para 1:200. - Incubar os explantes com uma solução de DAPI (1:1000 em PBST) durante 15 min à temperatura ambiente. Retire a solução DAPI e lave os explantes 3 x 5 min com PBST.
- Use o meio de montagem para montar explantes em uma lâmina com a pressão arterial voltada para cima (contra a tampa). Para imagens confocais, use meios de montagem antifade. Deixe o meio de montagem secar durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Escreva a imagem diretamente ou armazene os slides a 4 °C até a geração de imagens.
- Fixação ototo para análise de MEV
- Prepare todas as soluções frescas e manuseie de acordo com as diretrizes de segurança locais. Fixar explantes cultivados por membrana (a partir da etapa 4.1.4) em glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3) com CaCl2 3 mM. Efectuar a fixação a 4 °C durante 24 a 72 h com uma mudança de fixador a cada 24 h.
- Retire o fixador e lave o tecido com cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Fixação secundária com 1% de OsO 4 (diluído a partir de um estoque de OsO 4a 4% usando tampão de cacodilato de sódio 0,1 M) por 1 h à temperatura ambiente. Execute esta e as etapas subsequentes até a desidratação em um exaustor.
- Enxaguar com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, enxaguar em água duplamente destilada ou ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente.
- Preparar uma solução a 0,5% de tiocarbohidrazida (TCH) em água ultrapura. Agitar a 75 °C durante 10 min e filtrar a solução quando esta tiver arrefecido à temperatura ambiente.
NOTA: O TCH é extremamente perigoso. O uso deve ser aprovado pelo comitê de segurança local e deve-se tomar cuidado ao manusear. - Remova a água ultrapura da amostra e adicione 0,5% de TCH gota a gota. Se a solução ficar castanha, pare e lave a amostra com água ultrapura, antes de adicionar cuidadosamente a solução de TCH a 0,5%. Quando a solução estiver limpa, substitua-a por 0,5% de TCH. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min30,31.
- Enxaguar a amostra com água ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente. Repita as etapas 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 mais duas vezes, terminando com a incubação de OsO4 seguida de enxágue.
- Desidratar as amostras em uma série de etanol para etanol 100% anidro (EtOH). Incubar primeiro em 25% ETOH por 10 min, depois 50% ETOH por 10 min, 75% EtOH por 10 min, 95% ETOH por 10 min, antes de incubar por um total de 3x por 10 min cada em 100% ETOH.
- Realizar secagem por ponto crítico utilizando COlíquido 2. Monte imediatamente as amostras em um stub SEM com fita adesiva de carbono de dupla face. Prossiga para o revestimento de esguicho para fornecer 5-10 nm de revestimento. Se não houver imagens imediatas, armazene as amostras em um exsicador sob vácuo.
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Representative Results
Na configuração de eletroporação, o posicionamento do eletrodo pode desempenhar um papel no domínio da transfecção. O eletrodo positivo é colocado sob a gema e o negativo acima do embrião (Figura 1A). Isso resulta em maior expressão de GFP em grande parte da orelha interna e em ambos os órgãos vestibulares (Figura 1B) e na papila basilar auditiva (Figura 1C,D), confirmando a transfecção.
Na avaliação do fenótipo dos knockdowns de CRISPR, projetamos RNAs guia para o fator de transcrição de células ciliadas Atonal homólogo 1 (Atoh1). Camundongos mutantes de Atoh1 são incapazes de formar células ciliadas32; após eletroporação dos RNAs guia de Atoh1 e incubação até E10, verifica-se que o desenvolvimento de HC está prejudicado quando comparado ao controle, controle plasmídico vazio (Figura 2). Embora a eletroporação seja mosaico (Figura 2E,F), as células eletroporadas de controle são capazes de formar células ciliadas. Em amostras eletroporadas de gRNA Atoh1, as células GFP positivas nunca apresentam os marcadores de desenvolvimento de HC (Figura 2B).
A cultura de órgãos da PA proporciona acessibilidade ao tecido. Culturas em matriz 3D, como o colágeno, proporcionam excelente preservação da morfologia tecidual por até 5 dias. A organização do HC e do SC é mantida nessas condições de cultura (Figura 3).
Culturas de órgãos em uma membrana são preferíveis para imagens de estereocílios. Tais culturas podem ser cultivadas por até 5 dias, mantendo a integridade do feixe de cabelo. Isso pode ser observado pela localização da proteína tip-link, protocaderina 1533 (Pcdh15) (Figura 4). Para interrogar o desenvolvimento do feixe capilar, são necessárias imagens de maior resolução, e tais abordagens, usando microscopia de super-resolução (Figura 4D) ou microscopia eletrônica de varredura (Figura 4E), fornecem informações mais completas.
Figura 1. A expressão de GFP é visível em E10 após em ovo-eletroporação em E4. (A) Diagrama esquemático ilustrando em ovo microinjeção e eletroporação em vesícula ótica de pintinhos em E4. A pipeta de injeção é preenchida com plasmídeos Tol2-eGFP (T2K-eGFP) e Tol2-transposases (T2TP), juntamente com corante verde rápido para visualização. (B) Imagem do ouvido interno eletroporado em E10 usando uma lente objetiva de ar de 0,63x em um estereomicroscópio. O ouvido interno esquerdo é o controle interno. A seta vermelha marca a expressão da GFP no ducto coclear da orelha interna direita, e o asterisco vermelho mostra a expressão da GFP nos órgãos vestibulares; A barra de escala é de 2 cm. (C) Imagem de fluorescência de campo largo de uma seção transversal do ducto coclear direito usando uma objetiva de ar de 20x de 0,5 NA. A expressão de GFP está confinada principalmente ao epitélio sensorial; A barra de escala é de 10 μm. (D) Imagem confocal de papila basilar de montagem inteira fotografada usando objetiva de ar 10x de 0,5 NA corada com faloidina conjugada com fluoróforo Alexa 647. A expressão da GFP é observada da extremidade proximal à distal no lado neural da PA; a barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O knockout do gene Atoh1 mediado por CRISPR/Cas9 via ovo , a eletroporação resulta em perda de células ciliadas (HCs). O plasmídeo guia do gene Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA e os plasmídeos traçadores Tol2-eGFP (T2K-eGFP) e Tol2-transposases (T2TP) com proteína SpCas9 são microinjetados e eletroporados na vesícula ótica de pintos em E4. Todas as imagens são de papila basilar de pintinho E10 com barra de escala de 10 μm, capturadas com uma objetiva de imersão em óleo de 60x de 1,42 NA, utilizando microscópio confocal a laser. Inserições ampliadas são fornecidas para todas as imagens. (A, B, C, D) O painel esquerdo contém PA com células ciliadas (HCs), eletroporadas com pcU6_1sgRNA vazias e T2K-eGFP, e T2TP com proteína SpCas9. (E, F, G, H) O painel do lado direito contém PA com perda de HCs, eletroporada com guia de Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) e T2K-eGFP, e T2TP com proteína SpCas9. (A,E) Imagem mesclada mostrando células ciliadas (HCs) na papila basilar. Estes são imunorreativos para a miosina 7a (azul); F-actina corada com faloidina conjugada com Alexa 647 (vermelho); A expressão de GFP dos plasmídeos de Tol2-eGFP é detectada usando um anticorpo anti-GFP (verde). A perda de HCs é evidente a partir da imunorreatividade da miosina 7a quando comparados os tratamentos com pcU6_1sgRNA vazias (D) e pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). A imagem de F-actina de ambos os tratamentos destaca o feixe capilar do HC (B,F). (C,G) T2K-eGFP e T2TP são usados para medir a localização e a eficiência da transfecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A cultura de órgãos do ducto coclear em cultura de gotículas de colágeno 3D mantém a organização do epitélio sensorial. A PA em E10 é cultivada em uma cultura de gotículas de colágeno 3D por 1 dia e fotografada usando uma objetiva de imersão em óleo de 60x de 1,42 NA usando um microscópio confocal a laser. (A) Imagem de PA inteira de E10 cultivada por 1 dia em gotícula de colágeno e corada com anticorpos contra antígeno de células ciliadas (ACH)34. A barra de escala é de 100 μm. (B) Imagem mesclada mostrando a organização preservada do epitélio sensorial do lado distal da PA corada com (C) faloidina (verde) e (D) HCA (azul); barra de escala é de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Feixes estereociliares de papila basilar sob microscópio eletrônico e de luz. A BP tratada com dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,1% foi explantada em E10 e cultivada por 3 dias in vitro (DIV) em pastilhas de cultura de membrana. (A) O Explant é fotografado usando uma objetiva de imersão em óleo de 60x de 1,42 NA com um microscópio confocal de varredura a laser. A imagem mesclada mostra a expressão da protocaderina 15 (Pcdh15) e estereocílios marcados por faloidina conjugada com Alexa 488 (verde). Imagens de canal único de F-actina ( B ) e Pcdh15 (C) são mostradas. A barra de escala é de 10 μm. (D) Imagem de super-resolução de estereocílios corados com faloidina conjugada com coloração Alexa 488 em verde. A imagem foi obtida utilizando-se uma objetiva de imersão em óleo de 63x de 1,42 NA no modo Airyscan do microscópio confocal de varredura a laser. A barra de escala é de 5 μm. (E) A imagem MEV foi obtida com ampliação de 16340x usando tensão de alta tensão eletrônica (EHT ) de 7 kV. O asterisco vermelho marca os cinocílios e a cunha vermelha marca os estereocílios. O brilho e o contraste foram ajustados para automático e a imagem foi nítida usando FIJI. A barra de escala é de 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O pintinho é uma adição econômica e conveniente aos organismos modelo que um laboratório pode usar para pesquisar o ouvido interno. Os métodos descritos aqui são rotineiramente usados em nosso laboratório e complementam a pesquisa em andamento no ouvido interno dos mamíferos. No ovo, a eletroporação é usada para introduzir manipulações genéticas no genoma do pintinho. A eletroporação também pode ser usada para introduzir construtos que codificam proteínas fluorescentes direcionadas a organelas ou estruturas subcelulares específicas35,36. Embora este seja um procedimento simples, a manipulação de embriões em ovo, afeta a viabilidade. Para uma eletroporação eficiente, os ovos devem ser obtidos frescos (logo após a postura). Um aumento na mortalidade e / ou desenvolvimento anormal é frequentemente observado em ovos que foram armazenados por mais de 5 dias. O uso de técnica estéril, garantindo que o óvulo seja devidamente selado para que não perca umidade, e minimizando as manipulações realizadas no embrião aumentam a viabilidade.
Descobrimos que a segmentação do otocisto em E3,5 a E4 reduz o trauma que o embrião enfrenta, e o uso de eletrodos cuidadosamente posicionados permite um bom direcionamento dos precursores sensoriais da PA. Entretanto, nessa fase, os precursores do gânglio acústico-vestibular já migraram para longe da orelha interna37,38. Para atingir essas células, devem ser selecionados prazos mais precoces para a eletroporação do otocisto, e adaptações feitas para a diminuição correspondente da viabilidade. Uma outra nota de cautela é a possibilidade de mosaicismo em embriões eletroporosos. Nem todas as células absorvem todo o plasmídeo e, portanto, o mosaicismo pode confundir a interpretação. O uso de plasmídeos traçadores ajuda na interpretação dos dados e fornece algum controle sobre possíveis efeitos do mosaico. O uso de repetições múltiplas, análises cuidadosas e métodos estatísticos ajudará na avaliação dos fenótipos do mosaico. Uma abordagem alternativa é o uso de codornas geneticamente modificadas39. Atualmente, esses números são limitados e nem sempre estão disponíveis para muitos laboratórios. No entanto, a disponibilidade aumentará, e os embriões de codornas, que expressam constitutivamente proteínas fluorescentes subcelulares direcionadas, são uma proposta atraente para experimentos de imagem.
Neste método, eletroporamos proteínas e DNA para knockdowns mediados por CRISPR através de junção final não homóloga (NHEJ)24. A geração mediada por CRISPR/Cas9 de construtos de fusão através do reparo dirigido por homologia (HDR) permanece ineficiente neste paradigma particular (Singh et al., observações não publicadas). O método de eletroporação pode ser adaptado para uso com outros tipos de construções de DNA (estas podem ser construções que codificam proteínas de fusão), bem como para RNA e proteínas. Deve-se notar que, durante o desenvolvimento (e a divisão celular), as construções de expressão baseadas em DNA serão diluídas, a menos que o vetor incorpore locais que medeiam a inserção do DNA exógeno no genoma dessas células (por exemplo, Tol2 ou PiggyBac). Isso permite uma expressão mais estável do construto.
Após a eletroporação, os embriões são geralmente cultivados em ovo até o estágio E10 para estudos de diferenciação e desenvolvimento de células ciliadas. Mas, se necessário, na ovocultura pode ser continuada até que os ovos eclodam; no entanto, com o aumento dos comprimentos de incubação, há uma queda correspondente na viabilidade. Para contornar isso, a eletroporação in ovo pode ser combinada com dissecções de PA seguidas de cultura ex ovo a longo prazo. A cultura de explantes dentro de uma matriz 3D permite uma boa preservação da morfologia do tecido. Este método pode ser usado para estudar mudanças no padrão, polaridade e diferenciação do tecido. A cultura da PA em uma membrana permite a visualização do lado apical do tecido27, particularmente imagens de alta resolução dos estereocílios.
Em alguns casos, as limitações da modificação genética podem ser superadas usando diferentes tratamentos baseados em pequenas moléculas. Os compostos farmacologicamente ativos atuam como inibidores ou agonistas para vias de sinalização ou processos biológicos celulares. Sua aplicação é particularmente útil para dissecar a exigência temporal. No entanto, os modos exatos de entrega e as concentrações ideais precisam ser determinados empiricamente, pois em alguns casos a padronização realizada em linhagens celulares não é comparável à dosagem necessária nos tecidos. O parto dentro do embrião pode ser problemático, e a quantidade necessária combinada com o impacto em outros sistemas de órgãos pode comprometer significativamente a viabilidade. Uma alternativa pronta são os métodos de cultura de órgãos20,21,22. No entanto, o método exato de cultura depende dos tipos de estudo e análises que se destinam. Enquanto a cultura de colágeno preserva a morfologia tecidual da PA, a cultura de membrana é mais adequada para estudar os feixes capilares apicais do HC. O tecido pode simplesmente ser colocado no topo da membrana para visualizar a superfície apical usando microscopia eletrônica de varredura ou microscopia de super-resolução. As dissecções para cultura de órgãos requerem boas práticas. Isso inclui a manutenção de um espaço de trabalho estéril e o uso de instrumentos afiados. Tais ferramentas de microdissecção são sensíveis, e achamos o uso de pratos de silício importante na preservação da integridade das ferramentas microcirúrgicas.
Juntas, as técnicas representam abordagens valiosas para aprofundar a compreensão do desenvolvimento do ouvido interno. Os insights em biologia comparativa e regeneração que os embriões de pintinhos oferecem podem fornecer insights significativos sobre o desenvolvimento e a função das células ciliadas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio do NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e do Royal National Institute for the Deaf. Gostaríamos de agradecer à Organização Central de Desenvolvimento Avícola e ao Instituto de Treinamento, Hesaraghatta, Bangalore. Somos gratos ao CIFF e ao apoio laboratorial e às instalações do EM no NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami pelas construções Tol2-eGFP e T2TP, e a Guy Richardson pelo HCA e anticorpo G19 Pcdh15. Somos gratos aos membros da Earlab por seu apoio constante e feedback valioso sobre o protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W.
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y.
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H.
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
