Summary
Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.
Abstract
Het binnenoor neemt geluid waar en houdt het evenwicht met behulp van het slakkenhuis en de vestibule. Het doet dit door gebruik te maken van een speciaal mechanosensorisch celtype dat bekend staat als de haarcel. Fundamenteel onderzoek in het binnenoor heeft geleid tot een diep begrip van hoe de haarcel functioneert en hoe ontregeling kan leiden tot gehoorverlies en duizeligheid. Voor dit onderzoek is de muis het modelsysteem bij uitstek geweest. Muizen hebben echter, net als alle zoogdieren, het vermogen verloren om haarcellen te vervangen. Dus, bij het proberen te begrijpen van cellulaire therapieën voor het herstellen van de binnenoorfunctie, kunnen complementaire studies bij andere gewervelde soorten verdere inzichten bieden. Het auditieve epitheel van vogels, de basilaire papilla (BP), is een vel epitheel dat bestaat uit mechanosensorische haarcellen (HC's) geïncaleerd door ondersteunende cellen (SC's). Hoewel de anatomische architectuur van de basilaire papilla en het zoogdier slakkenhuis verschillen, zijn de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling en het gehoor van het binnenoor vergelijkbaar. Dit maakt de basilaire papilla een nuttig systeem voor niet alleen vergelijkende studies, maar ook om regeneratie te begrijpen. Hier beschrijven we dissectie- en manipulatietechnieken voor het binnenoor van de kip. De techniek toont genetische en kleine molecuul remmingsmethoden, die een krachtig hulpmiddel bieden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van het binnenoor. In dit artikel bespreken we in ovo elektroporatietechnieken om de basilaire papilla genetisch te verstoren met behulp van CRIPSR-Cas9-deleties, gevolgd door dissectie van de basilaire papilla. We demonstreren ook de BP-orgaancultuur en optimaal gebruik van kweekmatrices, om de ontwikkeling van het epitheel en de haarcellen te observeren.
Introduction
Het binnenoor van alle gewervelde dieren is afgeleid van een eenvoudig epitheel dat bekend staat als de otic placode 1,2. Dit zal aanleiding geven tot alle structurele elementen en de celtypen die nodig zijn om de mechanosensorische informatie in verband met gehoor- en evenwichtsperceptie te transduceren. Haarcellen (HCs), de trilhaarsensor van het binnenoor, zijn omgeven door ondersteunende cellen (SC's). HC's geven informatie door aan de auditieve achterhersenen via de neuronen van de achtste hersenzenuw. Deze worden ook gegenereerd uit de otic placode3. De primaire transductie van geluid wordt bereikt aan het apicale oppervlak van de auditieve HC, door een mechanisch gevoelige haarbundel4. Dit wordt gemedieerd door gemodificeerde op actine gebaseerde uitsteeksels genaamd stereocilia, die zijn gerangschikt in een gradueel trappatroon5. Bovendien organiseert een gemodificeerd primair cilium, het kinocilium genaamd, de vorming van haarbundels en grenst het aan de hoogste rij stereocilia 6,7,8. De architectuur van stereocilia is van cruciaal belang voor deze rol bij het omzetten van mechanische stimuli afgeleid van akoestische energie naar elektrische neurale signalen9. Schade aan de auditieve HC door veroudering, infectie, otoakoestisch trauma of ototoxische shock kan leiden tot gedeeltelijk of volledig gehoorverlies dat bij zoogdieren onomkeerbaar is10.
Cellulaire vervangingstherapieën zijn voorgesteld die dergelijke schade kunnen herstellen11,12. De benadering van dit onderzoek is geweest om de normale ontwikkeling van de haarcel van zoogdieren te begrijpen en te vragen of ontwikkelingsprogramma's opnieuw kunnen worden geïnitieerd in voorloperachtige cellen die mogelijk in het binnenoor bestaan13. Een tweede benadering is geweest om buiten zoogdieren te kijken, naar niet-zoogdier gewervelde dieren waarbij robuuste regeneratie van auditieve haarcellen plaatsvindt, zoals vogels14,15. Bij vogels vindt haarcelregeneratie voornamelijk plaats door de dedifferentiatie van een ondersteunende cel naar een voorloperachtige toestand, gevolgd door asymmetrische mitotische deling om een haarcel en ondersteunende cel16 te genereren. Daarnaast is ook directe differentiatie van een ondersteunende cel waargenomen om een haarcel te genereren17.
Hoewel de mechanismen van de auditieve ontwikkeling van vogels significante overeenkomsten vertonen met die van zoogdieren, zijn er verschillen18. HC- en SC-differentiatie in het kuiken BP is duidelijk vanaf embryonale dag (E) 7 en wordt in de loop van de tijd duidelijker. Door E12 kan een goed gevormde en goed gepolariseerde basilaire papilla (BP) worden gevisualiseerd, en door E17 kunnen goed ontwikkelde haarcellen worden gezien19. Deze tijdspunten bieden vensters op de mechanismen van differentiatie, patronen en polariteit, evenals haarcelrijping. Begrijpen of dergelijke mechanismen geconserveerd of divergent zijn, is belangrijk, omdat ze inzicht geven in de diepe homologie van de oorsprong van mechanosensorische haarcellen.
Hier demonstreren we een reeks technieken die in vroege en late embryonale stadia worden uitgevoerd om cellulaire processen te bestuderen, zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie, patronen en onderhoud tijdens de ontwikkeling van het binnenoororgaan. Dit is een aanvulling op andere protocollen voor het begrijpen van de ontwikkeling van het binnenoor in explantcultuur 20,21,22. We bespreken eerst de introductie van exogene DNA of RNA in BP-precursoren binnen de E3.5-otocyste met behulp van ovo-elektroporatie. Hoewel genetische manipulaties waardevolle inzichten kunnen opleveren, kunnen de aldus gegenereerde fenotypen pleiotroop en bijgevolg verwarrend zijn. Dit geldt met name tijdens de latere ontwikkeling van het binnenoor, waar fundamentele processen zoals cytoskeletale remodellering meerdere rollen spelen bij celdeling, weefselmorfogenese en cellulaire specialisatie. We presenteren protocollen voor farmacologische remming in gekweekte explantaten, die voordelen bieden bij het beheersen van de dosering en de timing en duur van de behandeling, en die nauwkeurige spatiotemporale manipulatie van ontwikkelingsmechanismen bieden.
Verschillende orgaankweekmethoden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandelingsduur van kleine remmers. Hier demonstreren we twee methoden van orgaancultuur die inzicht geven in epitheliale morfogenese en cellulaire specialisatie. Een methode voor 3D-cultuur met collageen als matrix om het cochleaire kanaal te kweken, maakt robuuste kweek en live visualisatie van de zich ontwikkelende BP mogelijk. Om de vorming van stereocilia te begrijpen, presenteren we een membraankweekmethode, zodat epitheelweefsel wordt gekweekt op een stijve matrix waardoor actine-uitsteeksels vrij kunnen groeien. Beide methoden maken downstream-verwerking mogelijk, zoals live-cell imaging, immunohistochemie, scanning elektronenmicroscopie (SEM), celregistratie, enz. Deze technieken bieden een routekaart voor het effectieve gebruik van het kuiken als een modelsysteem om de ontwikkeling, rijping en regeneratie van het auditieve epitheel van de aviaire te begrijpen en te manipuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protocollen met betrekking tot de aanschaf, kweek en het gebruik van bevruchte kippeneieren en niet-gehate embryo's werden goedgekeurd door de Institutionele Commissie voor Dierenethiek van het National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka.
1. In ovo-elektroporatie van auditieve precursoren van kuikens
- sgRNA-ontwerp en klonen voor CRISPR/Cas9-gen knock-out
- Voor het creëren van gen knock-outs, ontwerp gids RNA's om de exon regio's van het gen te verstoren, bij voorkeur dichter bij het 5 'einde van de coderende regio.
- Selecteer de potentiële gids RNA's met behulp van een webtool CRISPOR23. Stel de browsergegevens in op Gallus gallus en de protospacer adjacent motif (PAM)-reeks op 5'- NGG -3'. Het programma bepaalt gids-RNA's uit de invoervolgorde en wijst verschillende scores toe op basis van on-target en off-target activiteit. Selecteer de top vier gidsen voor verdere studies.
- Voor het ontwerpen van sjabloonspecifieke oligo's voor gids (g)RNA-productie verwijdert u de PAM-sequentie (5′- NGG -3′) uit de uitvoer van de gRNA-ontwerptool. Dit is niet nodig voor targeting, maar bevat de Cas9-splitsingsherkenningssequentie. Synthetiseer twee HPLC-gezuiverde complementaire oligo's met BsmBI-beperkingsplaats aan beide uiteinden, voor elk potentieel gRNA.
- Kloon de gidssequentie in frame met een tracrRNA-steiger van een vector naar keuze (hier werd pcU6_1sgRNA vector gebruikt24).
- Los de sgRNA-oligonucleotiden op in een concentratie van 100 μM in DNase/RNase-vrij water. Voer het gloeien van de twee sense en antisense oligogeleiders uit met behulp van een thermocycler met de volgende parameters: 95 °C gedurende 3 min, vervolgens 37 °C gedurende 15 minuten en vervolgens verlagen tot 4 °C.
- Met behulp van standaard moleculaire biologie technieken zoals beschreven in25, setup restrictie vertering van de gegloeide oligo's en pcU6_1sgRNA kloon vector met BsmBI enzym 's nachts. Stel ligatie in met de gel-gezuiverde lineaire BsmBI-verteerde pcU6_1sgRNA vector en verteerde sgRNA oligo's. Transformeer in een DH5-alfa competente cel en sequentie bevestig de verkregen kloon.
- Eierverwerking en vensters
- Koop vers gelegde eieren en reinig ze door ze af te vegen met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Incubeer bij 37-38 °C, met 45% luchtvochtigheid gedurende 3,5-4 dagen.
- Leg het ei na de incubatie minstens 5 minuten op zijn kant voordat het wordt geopend. Hierdoor kan het embryo zich verplaatsen naar de top van de dooier. Gebruik een tang om kleine gaatjes aan de bovenkant en het stompe uiteinde van het ei te maken, zodat een naald van 21 G kan passeren.
- Om schade tijdens het vensteren te voorkomen, verwijdert u albumine om het embryo uit de buurt van de schaal te laten zakken. Gebruik hiervoor een spuit van 5 ml en een naald van 21 G om voorzichtig 2 ml albumine uit een gat aan het stompe uiteinde van het ei te trekken. Gebruik doorzichtige tape om het gat aan het stompe uiteinde te bedekken.
- Om het eiervenster te maken, bevestigt u doorzichtige tape aan de bovenkant van de eierschaal. Knip een raam open, ongeveer 2 cm lang en 1,5 cm breed, met een veerboogschaar en leg het embryo bloot. Gebruik een tang om de chorionmembranen boven het embryo te openen, waardoor toegang tot het embryo mogelijk is.
- Micro-injecterende plasmiden
- Bereid voor het gen knock-out experiment twee oplossingen voor: de knock-down mix met SpCas9 eiwit en gids plasmide - pcU6_1sgRNA, en de tracer plasmide mix van T2K-eGFP (dit is een chick ß-actine promotor die GFP cassette aanstuurt omringd door de transposon sites van Tol2) samen met de T2TP (de Tol2 transposase gekloond in Tol2 construct26,27). De tracer wordt gebruikt om de efficiëntie van elektroporatie te volgen.
- Zorg er bij het elektropoderen van meerdere plasmiden voor dat de uiteindelijke concentratie DNA ten minste 4 μg / μL is. Meng de drie constructen, leid plasmide - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP en T2TP, in een verhouding van 1: 1: 1 met 1 μg SpCas9-eiwit, 30% sucrose en 0,1% Fast Green-kleurstof in een eindvolume van 10 μL.
- Trek naalden voor micro-injectie uit standaard glazen haarvaten (lengte 3 in, OD 1,0 mm) met behulp van een verticale pipettrekker. Gebruik een fijne tang om de capillaire punt af te breken na het trekken om een tipdiameter van ongeveer 50 μm te verkrijgen met een taps toelopend uiteinde.
- Leg de embryo's op E3.5 aan de linkerkant met de kop naar rechts gericht. Op deze manier is alleen het rechter blaasje toegankelijk voor micro-injectie. Micro-injecteer de knock-down mix in het otic blaasje. Injecteer ongeveer een volume van 200 ml DNA-oplossing om het oticblaasje te vullen.
- Bepaal de geleidingsefficiëntie met behulp van een T7-endonucleasetest28.
- Elektroporatie
- Voeg een paar druppels van 0,719% zoutoplossing toe aan het embryo voorafgaand aan elektroporatie om de elektrische weerstand te verlagen en oververhitting van het embryo te voorkomen.
- Plaats de positieve elektrode door het gat aan de stompe kant van het ei wanneer het albumine werd verwijderd. Manoeuvreer de elektrode zo dat deze onder de dooier zit. Plaats de negatieve elektrode over de gevulde otocyste.
- Gebruik elektroporatie om plasmiden in de cellen van het embryo te transfecteren. Gebruik een vierkante pulsgenerator en pas vijf pulsen toe van elk 25 V en 100 ms duur, 50 ms uit elkaar. Bepaal de omstandigheden empirisch op basis van een individuele elektroporatie-opstelling.
- Hydrateer het embryo na elektroporatie door een paar druppels van 0,719% zoutoplossing toe te voegen. Om gedenatureerd albumine van het oppervlak van de elektroden te reinigen, spoelt u het grondig af met gedestilleerd water. Sluit het ei opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de bevochtigde incubator bij 37-38 °C voor verdere incubatie.
OPMERKING: Embryo's kunnen worden gekweekt totdat ze uitkomen na elektroporatie, maar er is een sterke vermindering van de levensvatbaarheid.
2. Basilaire papilladissectie
- Gebruik 70% ethanol om de operatietafel, het microscoopstadium en de omgeving te desinfecteren. Warmte of alcohol steriliseren microdissectieapparatuur die minimaal een veer-boogschaar, micro-curette en twee paar fijne tangen omvat.
- Bereid de volgende snijplaten voor: een glazen petrischaal met een zwarte siliconenbasis, een plastic petrischaaltje van 90 mm en een petrischaaltje van 60 mm. Koel fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) voor dissecties.
- Kraak het ei voorzichtig in de petrischaal van 90 mm. Identificeer het buitenoor van het kuiken. Onthoofd het embryo door de nek net onder het niveau van de onderkaak door te snijden met een schaar. Breng de kop over in een petrischaaltje van 60 mm gevuld met ijskoude PBS.
- Richt het embryo met de bovenkant van de snavel naar de experimentator gericht en houd de snavel vast met behulp van een van de # 5-tangen. Schep de ogen uit met de tweede #5 tang. Ga van rostral naar caudaal en snijd de schedel langs de middellijn. Schep de hersenen eruit.
- Voeg meer ijskoude PBS of HBSS toe en lokaliseer de twee glanzende structuren, dicht bij het niveau van de pinna. Dit zijn de otolieten van de lagena aan het einde van het cochleaire kanaal en bevinden zich dicht bij de middellijn.
- Snijd grofweg tussen de twee lagena's, en ruim boven en onder dit gebied om twee binnenoren te isoleren. Visualiseer onder schuine verlichting de omtrek van het binnenoor. Verwijder vreemd weefsel en de vestibule.
- Breng het geïsoleerde slakkenhuis over op een zwarte siliconen bodemplaat met ijskoude PBS. Verwijder met behulp van # 5-tang de kraakbeenachtige cochleaire capsule om het cochleaire kanaal te verkrijgen. Lokaliseer de golvende laag (tegmentum) van het cochleaire kanaal en verwijder met # 55-tang om de BP bloot te leggen. Verwijder met # 55-tang het tectoriale membraan om HC's en SC's bloot te stellen.
3. Cultuur van basilaire papilla explantaten
- Membraancultuur van de BP
- Neem een weefselkweekplaat met zes putten en rangschik één kweekmembraaninzetstuk per put.
- Verzamel de ontlede basilaire papilla (explant) in een 200 μL pipet met 1x HBSS buffer en breng deze over op een membraan. Om te voorkomen dat het weefsel aan de wand van de pipet blijft plakken, trekt u wat media op voordat u het weefsel aspirateert.
- Oriënteer de explant zodanig dat de basilaire papilla naar boven is gericht, zodat het haar en de steuncellen zichtbaar zijn vanaf de top29. Zodra de explant is geplaatst, zuigt u de HBSS-buffer langzaam van het kweekmembraanoppervlak. In dit proces zal de explant zich hechten aan het kweekmembraan.
- Voeg 1,2 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) kweekmedium toe tussen het membraaninzetstuk en de putwand om de putten van de zesputtenplaat te vullen. Tot zes explantaten kunnen worden gekweekt op een enkel 30 mm kweekmembraan.
- Collageencultuur van het cochleaire kanaal
- Bereid collageenmengsel door toevoeging van 400 μL 3 mg/ml rattenstaartcollageen, 50 μL 10x DMEM, 30 μL 7,5% NaHCO3 en 5 μL HEPES in een weefselkweekkap.
- Neem een bord met vier putten en voeg drie druppels collageenmengsel toe aan elke put. Breng ontleed cochleair kanaal over naar elke collageendruppel. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 °C, 5% CO2 om de collageenmatrix uit te harden.
- Behandeling van culturen met kleine moleculen
- Bereid kweekmedia (DMEM, N-2-supplement, penicilline) met de farmacologische modulator of het oplosmiddel alleen (voor gebruik als controle). Vervang de kweekmedia door 700 μL media aangevuld met de remmer. Kweek de explantaten in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
- Vervang elke dag 50% van de cultuurmedia. Verwijder na de juiste incubatietijd de kweekmedia en gebruik de explantaten voor downstream-assays.
4. Beeldvorming en analyse
- Immunofluorescentie analyse
- Verwijder kweekmedia uit putten en was de explants twee keer met 1x HBSS. Pipetteer met behulp van een pipet 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de put en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder PFA en was de explants drie keer met 1x PBS op kamertemperatuur. Om de explantaten uit het kweekmembraan te verzamelen, maakt u een kleine snede rond het membraan met het stuk van het weefsel met behulp van een kleine veerboogschaar en brengt u het weefsel samen met het membraan over naar een 48-well kweekplaat met behulp van een tang.
OPMERKING: Als de weefsels na de fixatie drijven, aspirateer dan met een pipet van 200 μL en breng deze over naar 48-well platen voor verdere verwerking. Vermijd krachtige loslating van het weefsel van het membraan. - Gebruik voor collageendruppelcultuur een tang om de volledige collageendruppel over te brengen naar een siliciumplaat. Voeg 200 μL 1x PBS toe en verwijder collageen met behulp van een tang en breng het weefsel vervolgens over naar een kweekplaat met 48 putten.
- Permeabiliseer de explantaten met 1 ml 1x PBS aangevuld met 0,3% Tween-20 (PBST) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de explantaten met 200 μL blokkeringsbuffer (10% geitenserum + 1% runderserumalbumine in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de explantaten met 200 μL primaire antilichaamoplossing (1:300, in blokkerende buffer) gedurende een nacht bij 4 °C. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de explantaten grondig 5 x 20 minuten met PBST.
- Incubeer de explantaten met 200 μL falloïdine en secundaire antilichaamoplossing (in blokkerende buffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de falloïdine en secundaire antilichaamoplossing en was de explantaten grondig 5 x 20 min met PBST.
OPMERKING: De concentratie van secundaire antilichamen en de waslengte moeten voor elke afzonderlijke beeldvormingstoepassing worden bepaald. Voor beeldvorming met behulp van superresolutiemicroscopie verhogen we meestal de concentratie van het secundaire antilichaam van 1:500 tot 1:200 en verhogen we de concentratie van falloidine van 1:400 tot 1:200. - Incubeer de explantaten met een oplossing van DAPI (1:1000 in PBST) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de DAPI-oplossing en was de explants 3 x 5 min met PBST.
- Gebruik de montagemedia om explants op een glijbaan te monteren met BP in opwaarts gericht (tegen de coverlip). Gebruik voor confocale beeldvorming antifade montagemedia. Laat de montagemedia een nacht drogen bij kamertemperatuur in het donker. Beeld direct of bewaar de dia's bij 4 °C totdat ze in beeld worden gebracht.
- OTOTO-fixatie voor SEM-analyse
- Bereid alle oplossingen vers en handvat volgens de lokale veiligheidsrichtlijnen. Fixeer membraangekweekte explantaten (uit stap 4.1.4) in 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,3) met 3 mM CaCl2. Voer fixatie uit bij 4 °C gedurende 24 tot 72 uur met een verandering van fixatief om de 24 uur.
- Verwijder het fixatiemiddel en was het weefsel met 0,1 M natriumcacodylaat 3 x 5 min bij kamertemperatuur. Secundaire fix met 1% OsO4 (verdund uit een 4% OsO4-voorraad met behulp van 0,1 M natriumcacrodietbuffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voer deze en de volgende stappen uit tot uitdroging in een zuurkast.
- Spoel met 0,1 M natriumcacrodoliebuffer 3 x 5 min bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens in dubbel gedestilleerd of ultrapuur water 3 x 5 min bij kamertemperatuur.
- Bereid een 0,5% oplossing van thiocarbohydrazide (TCH) in ultrapuur water. Roer gedurende 10 minuten op 75 °C en filtreer de oplossing wanneer deze tot kamertemperatuur is afgekoeld.
OPMERKING: TCH is uiterst gevaarlijk. Het gebruik moet worden goedgekeurd door de lokale veiligheidscommissie en er moet voorzichtig mee worden omgegaan. - Verwijder ultrapuur water uit het monster en voeg druppelsgewijs 0,5% TCH toe. Als de oplossing bruin wordt, stop dan en spoel het monster met ultrapuur water, voordat u voorzichtig de 0,5% TCH-oplossing toevoegt. Zodra de oplossing duidelijk is, vervangt u deze door 0,5% TCH. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min30,31.
- Spoel het monster af met ultrapuur water 3 x 5 min bij kamertemperatuur. Herhaal stap 4.2.2, 4.2.3 en 4.2.5 nog twee keer, eindigend met OsO 4-incubatie gevolgd door spoelen.
- Droog de monsters in een ethanolreeks uit tot 100% watervrije ethanol (EtOH). Incubeer eerst in 25% ETOH gedurende 10 min, dan 50% ETOH gedurende 10 min, 75% EtOH gedurende 10 min, 95% ETOH gedurende 10 minuten, voordat u in totaal 3x gedurende 10 minuten elk in 100% ETOH broedt.
- Voer kritische puntdroging uit met behulp van vloeibare CO2. Monteer de monsters onmiddellijk op een SEM-stomp met dubbelzijdig carbon plakband. Ga verder met sputterlaag om 5-10 nm coating te bieden. Als u niet onmiddellijk beeldt, bewaar de monsters dan in een exsiccator onder vacuüm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de elektroporatieopstelling kan elektrodepositionering een rol spelen in het domein van transfectie. De positieve elektrode wordt onder de dooier geplaatst en de negatieve boven het embryo (figuur 1A). Dit resulteert in een hogere GFP-expressie in een groot deel van het binnenoor en zowel vestibulaire organen (figuur 1B) als auditieve basilaire papilla (figuur 1C, D), wat transfectie bevestigt.
Bij het beoordelen van het fenotype van CRISPR-knockdowns hebben we gids-RNA's ontworpen voor de transcriptiefactor van de haarcel Atonale homoloog 1 (Atoh1). Muismutanten van Atoh1 zijn niet in staat om haarcellen te vormen32; na elektroporatie van Atoh1-geleide-RNA's en incubatie tot E10, vinden we dat de HC-ontwikkeling is aangetast in vergelijking met controle, lege plasmidecontrole (figuur 2). Hoewel elektroporatie mozaïek is (figuur 2E, F), kunnen controle-elektroporated cellen haarcellen vormen. In Atoh1 gRNA-geëlektroporeerde monsters vertonen GFP-positieve cellen nooit de markers van HC-ontwikkeling (figuur 2B).
Orgaankweek van de BP zorgt voor toegankelijkheid van het weefsel. Culturen in een 3D-matrix, zoals collageen, bieden een uitstekend behoud van weefselmorfologie gedurende maximaal 5 dagen. De organisatie van HC en SC wordt in deze kweekomstandigheden gehandhaafd (figuur 3).
Orgaanculturen op een membraan hebben de voorkeur voor het afbeelden van stereocilie. Dergelijke culturen kunnen tot 5 dagen worden gekweekt met behoud van de integriteit van de haarbundel. Dit is te zien aan de lokalisatie van het tip-link eiwit, protocadherine 1533 (Pcdh15) (Figuur 4). Voor het ondervragen van de ontwikkeling van de haarbundel is beeldvorming met een hogere resolutie noodzakelijk, en dergelijke benaderingen, met behulp van superresolutiemicroscopie (figuur 4D) of scanningelektronenmicroscopie (figuur 4E), bieden meer volledige informatie.
Figuur 1. GFP-expressie is zichtbaar bij E10 na in ovo-elektroporatie op E4. (A) Schematisch diagram dat illustreert in ovo-microinjectie en elektroporatie in kuiken otisch blaasje op E4. De injectiepipet is gevuld met Tol2-eGFP (T2K-eGFP) en Tol2-transposases (T2TP) plasmiden, samen met snelle groene kleurstof voor visualisatie. (B) Afbeelding van het geëlektropoeerde binnenoor op E10 met behulp van een 0,63x lucht objectief op een stereomicroscoop. Het linker binnenoor is de interne controle. De rode pijl markeert de GFP-expressie in het cochleaire kanaal van het rechterbinnenoor en het rode sterretje toont de GFP-expressie in vestibulaire organen; schaalbalk is 2 cm. (C) Widefield fluorescentiebeeld van een dwarsdoorsnede van het rechter cochleaire kanaal met behulp van een 20x luchtdoel van 0,5 NA. GFP-expressie is meestal beperkt tot het sensorische epitheel; schaalbalk is 10 μm. (D) Confocale afbeelding van hele mount basilaire papilla afgebeeld met behulp van 10x luchtdoel van 0,5 NA gekleurd met falloidine geconjugeerd met Alexa 647 fluorofoor. GFP-expressie wordt waargenomen van proximaal tot distale uiteinde aan de neurale kant van de BP; schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. CRISPR/Cas9-gemedieerde Atoh1 gen knock-out viain ovo elektroporatie resulteert in verlies van haarcellen (HCs). Atoh1 gengids plasmide pcU6_1-Atoh1sgRNA en tracer plasmiden Tol2-eGFP (T2K-eGFP) en Tol2-transposases (T2TP) met SpCas9 eiwit worden micro geïnjecteerd en geëlektropoteerd in chick otic blaasje op E4. Alle beelden zijn afkomstig van kuiken E10 basilaire papilla met een schaalbalk van 10 μm, vastgelegd met een 60x olie-onderdompelingsdoel van 1,42 NA met behulp van een laser confocale microscoop. Ingezoomde inzetstukken zijn beschikbaar voor alle afbeeldingen. (A,B,C,D) Het linkerpaneel bevat BP met haarcellen (HCs), geëlektropoeerd met lege pcU6_1sgRNA en T2K-eGFP, en T2TP met SpCas9-eiwit. (E,F,G,H) Het rechterpaneel bevat BP met verlies van HC's, geëlektropoeerd met Atoh1-gids (pcU6_1-Atoh1sgRNA) en T2K-eGFP, en T2TP met SpCas9-eiwit. (A,E) Samengevoegde afbeelding met haarcellen (HC's) in de basilaire papilla. Deze zijn immunoreactief voor Myosine 7a (blauw); F-actine gekleurd met falloidine geconjugeerd met Alexa 647 (rood); GFP-expressie van Tol2-eGFP-plasmiden wordt gedetecteerd met behulp van een anti-GFP-antilichaam (groen). Het verlies van HC's is duidelijk uit myosine 7a immunoreactiviteit bij het vergelijken van behandelingen met lege pcU6_1sgRNA (D) en pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). F-actine beeldvorming van beide behandelingen benadrukt de haarbundel van de HC (B,F). (C,G) T2K-eGFP en T2TP worden gebruikt om de transfectielocatie en efficiëntie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Orgaancultuur van cochleair kanaal in 3D-collageendruppelcultuur handhaaft de organisatie van sensorisch epitheel. De BP op E10 wordt gekweekt in een 3D collageendruppelcultuur gedurende 1 dag en in beeld gebracht met behulp van 60x olie-onderdompelingsdoelstelling van 1,42 NA met behulp van een laser confocale microscoop. (A) Afbeelding van de volledige BP van E10 gekweekt gedurende 1 dag in een collageendruppel en gekleurd met antilichamen tegen haarcelantigeen (HCA)34. Schaalbalk is 100 μm. (B) Samengevoegde afbeelding toont de geconserveerde organisatie van sensorisch epitheel vanaf de distale kant van BP gekleurd met (C) falloïdine (groen) en (D) HCA (blauw); schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Stereociliaire bundels basilaire papilla onder elektronen- en lichtmicroscoop. 0,1% met dimethylsulfoxide (DMSO) behandelde BP werd geëxplanteerd op E10 en gedurende 3 dagen in vitro (DIV) gekweekt op membraankweekinzetstukken. (A) Explant wordt in beeld gebracht met een 60x olie-onderdompelingsobjectief van 1,42 NA met een laserscan confocale microscoop. De samengevoegde afbeelding toont de expressie van het protocadherine 15 (Pcdh15) en stereocilia gemarkeerd door falloidine geconjugeerd met Alexa 488 (groen). Eenkanaalsbeelden van F-actine (B) en Pcdh15 (C) worden getoond. Schaalbalk is 10 μm. (D) Superresolutiebeeld van stereocilia gekleurd met falloidine geconjugeerd met Alexa 488-kleuring in groen. Het beeld werd verkregen met behulp van een 63x olie-onderdompelingsobjectief van 1,42 NA in Airyscan-modus van laserscan confocale microscoop. Schaalbalk is 5 μm. (E) SEM-beeld werd genomen bij 16340x vergroting met behulp van 7 kV elektron hoogspanning (EHT) spanning. Rood sterretje markeert kinocilia en rode wig markeert stereocilia. Helderheid en contrast werden aangepast naar automatisch en het beeld werd verscherpt met FIJI. Schaalbalk is 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kuiken is een kosteneffectieve en handige aanvulling op de modelorganismen die een laboratorium kan gebruiken om het binnenoor te onderzoeken. De hier beschreven methoden worden routinematig gebruikt in ons laboratorium en vormen een aanvulling op lopend onderzoek in het binnenoor van zoogdieren. In ovo wordt elektroporatie gebruikt om genetische manipulaties in het kuikengenoom te introduceren. Elektroporatie kan ook worden gebruikt om constructen te introduceren die coderen voor fluorescerende eiwitten gericht op bepaalde organellen of subcellulaire structuren35,36. Hoewel dit een eenvoudige procedure is, heeft manipulatie van embryo's in ovo invloed op de levensvatbaarheid. Voor efficiënte elektroporatie moeten eieren vers worden verkregen (kort na het leggen). Een stijging van de sterfte en/of abnormale ontwikkeling wordt vaak waargenomen bij eieren die langer dan 5 dagen zijn bewaard. Het gebruik van steriele techniek, ervoor zorgen dat het ei goed wordt afgesloten zodat het geen vocht verliest, en het minimaliseren van de manipulaties die op het embryo worden uitgevoerd, verbeteren de levensvatbaarheid.
We ontdekten dat het richten van de otocyste op E3,5 tot E4 het trauma vermindert waarmee het embryo wordt geconfronteerd, en het gebruik van zorgvuldig gepositioneerde elektroden maakt een goede targeting van de sensorische voorlopers van de BP mogelijk. In dit stadium zijn de voorlopers van het akoestisch-vestibulaire ganglion echter al weggemigreerd van het binnenoor37,38. Om deze cellen te targeten, moeten eerdere tijdspunten voor otocyste elektroporatie worden geselecteerd en moeten aanpassingen worden gemaakt voor de overeenkomstige afname van de levensvatbaarheid. Een andere waarschuwing is de mogelijkheid van mozaïcisme in geëlektropoeerde embryo's. Niet alle cellen nemen al het plasmide op, en dus kan mozaïcisme de interpretatie verstoren. Het gebruik van tracerplasmiden helpt bij de interpretatie van gegevens en biedt enige controle over mogelijke mozaïekeffecten. Het gebruik van meerdere herhalingen, zorgvuldige analyses en statistische methoden zal helpen bij de beoordeling van mozaïekfenotypen. Een alternatieve aanpak is het gebruik van genetisch gemodificeerde kwartels39. Momenteel zijn deze aantallen beperkt en zijn ze niet altijd beschikbaar voor veel laboratoria. De beschikbaarheid zal echter toenemen en kwartembryo's, die constitutief subcellulair gerichte fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, zijn een aantrekkelijke propositie voor beeldvormingsexperimenten.
In deze methode elektropoteren we eiwit en DNA voor CRISPR-gemedieerde knockdowns door niet-homologe end joining (NHEJ)24. CRISPR/Cas9 gemedieerde generatie van fusieconstructies door homologie-gerichte reparatie (HDR) blijft inefficiënt in dit specifieke paradigma (Singh et al., ongepubliceerde waarnemingen). De elektroporatiemethode kan worden aangepast voor gebruik met andere soorten DNA-constructies (dit kunnen constructies zijn die coderen voor fusie-eiwitten), evenals voor RNA en eiwit. Opgemerkt moet worden dat tijdens de ontwikkeling (en celdeling) dna-gebaseerde expressieconstructies verdund zullen raken, tenzij de vector plaatsen bevat die het inbrengen van het exogene DNA in het genoom van deze cellen bemiddelen (bijv. Tol2 of PiggyBac). Dit maakt een stabielere expressie van de constructie mogelijk.
Na elektroporatie worden de embryo's meestal gekweekt in ovo tot E10-stadium voor haarceldifferentiatie en ontwikkelingsstudies. Maar indien nodig kan in ovo-cultuur worden voortgezet totdat de eieren uitkomen; echter, met toenemende incubatielengtes is er een overeenkomstige daling van de levensvatbaarheid. Om dit te omzeilen, kan in ovo elektroporatie worden gecombineerd met BP-dissecties gevolgd door langdurige ex-ovocultuur . Het kweken van explantaten binnen een 3D-matrix zorgt voor een goed behoud van weefselmorfologie. Deze methode kan worden gebruikt om veranderingen in weefselpatronen, polariteit en differentiatie te bestuderen. De kweek van de BP op een membraan maakt visualisatie van de apicale kant van het weefsel27 mogelijk, met name beeldvorming met hoge resolutie van de stereocilie.
In sommige gevallen kunnen de beperkingen van genetische modificatie worden overwonnen door verschillende behandelingen op basis van kleine moleculen te gebruiken. De farmacologisch actieve verbindingen fungeren als remmers of agonisten voor signaalroutes of celbiologische processen. Hun toepassing is vooral nuttig bij het ontleden van de temporele eis. Exacte toedieningswijzen en optimale concentraties moeten echter empirisch worden bepaald, omdat in sommige gevallen standaardisatie in cellijnen niet vergelijkbaar is met de vereiste dosering in weefsels. Levering binnen het embryo kan problematisch zijn en de benodigde hoeveelheid in combinatie met de impact op andere orgaansystemen kan de levensvatbaarheid aanzienlijk in gevaar brengen. Een kant-en-klaar alternatief is orgaankweekmethoden 20,21,22. De exacte kweekmethode is echter wel afhankelijk van de soorten onderzoek en analyses die bedoeld zijn. Terwijl collageenkweek de weefselmorfologie van de BP behoudt, is membraankweek beter geschikt voor het bestuderen van de apicale haarbundels van de HC. Het weefsel kan eenvoudig bovenop het membraan worden geplaatst om het apicale oppervlak te visualiseren met behulp van scanning elektronenmicroscopie of superresolutiemicroscopie. Dissecties voor orgaancultuur vereisen wel goede praktijken. Deze omvatten het onderhouden van een steriele werkruimte en het gebruik van geslepen instrumenten. Dergelijke microdissectietools zijn gevoelig en we vinden het gebruik van siliciumschalen belangrijk voor het behoud van de integriteit van microchirurgische hulpmiddelen.
Samen vertegenwoordigen de technieken waardevolle benaderingen om het begrip van de ontwikkeling van het binnenoor te bevorderen. De inzichten in vergelijkende biologie en regeneratie die de kuikenembryo's bieden, kunnen belangrijke inzichten bieden in de ontwikkeling en functie van haarcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de steun van NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB en het Royal National Institute for the Deaf. We willen graag de Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru bedanken. We zijn CIFF en EM-faciliteit en laboratoriumondersteuning bij NCBS dankbaar. We bedanken Yoshiko Takahashi en Koichi Kawakami voor de Tol2-eGFP en T2TP constructies, en Guy Richardson voor HCA en G19 Pcdh15 antilichaam. We zijn Earlab-leden dankbaar voor hun constante steun en waardevolle feedback op het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
