Summary
Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.
Abstract
L'orecchio interno percepisce il suono e mantiene l'equilibrio usando la coclea e il vestibolo. Lo fa utilizzando un tipo di cellula meccanosensoriale dedicata nota come cellula ciliata. La ricerca di base nell'orecchio interno ha portato a una profonda comprensione di come funziona la cellula ciliata e di come la disregolazione può portare a perdita dell'udito e vertigini. Per questa ricerca, il topo è stato il sistema modello preminente. Tuttavia, i topi, come tutti i mammiferi, hanno perso la capacità di sostituire le cellule ciliate. Pertanto, quando si cerca di comprendere le terapie cellulari per ripristinare la funzione dell'orecchio interno, studi complementari in altre specie di vertebrati potrebbero fornire ulteriori approfondimenti. L'epitelio uditivo degli uccelli, la papilla basilare (BP), è un foglio di epitelio composto da cellule ciliate meccanosensoriali (HC) intercalate da cellule di supporto (SC). Sebbene l'architettura anatomica della papilla basilare e della coclea dei mammiferi differisca, i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno e dell'udito sono simili. Questo rende la papilla basilare un sistema utile non solo per studi comparativi, ma anche per comprendere la rigenerazione. Qui, descriviamo le tecniche di dissezione e manipolazione per l'orecchio interno del pollo. La tecnica mostra metodi di inibizione genetica e di piccole molecole, che offrono un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno. In questo articolo, discutiamo in ovo tecniche di elettroporazione per perturbare geneticamente la papilla basilare usando delezioni CRIPSR-Cas9, seguite dalla dissezione della papilla basilare. Dimostriamo anche la coltura dell'organo BP e l'uso ottimale delle matrici di coltura, per osservare lo sviluppo dell'epitelio e delle cellule ciliate.
Introduction
L'orecchio interno di tutti i vertebrati deriva da un semplice epitelio noto come placode otico 1,2. Ciò darà origine a tutti gli elementi strutturali e ai tipi cellulari necessari per trasdurre le informazioni meccanosensoriali associate all'udito e all'equilibrio della percezione. Le cellule ciliate (HC), il sensore ciliato dell'orecchio interno, sono circondate da cellule di supporto (SC). Gli HC trasmettono informazioni al cervello posteriore uditivo attraverso i neuroni dell'ottavo nervo cranico. Questi sono anche generati dal placode otico3. La trasduzione primaria del suono si ottiene sulla superficie apicale dell'HC uditivo, attraverso un fascio di capelli meccanicamente sensibile4. Questo è mediato attraverso protrusioni modificate a base di actina chiamate stereociglia, che sono disposte in un modello graduato di scala5. Inoltre, un ciglio primario modificato, chiamato kinocilium, organizza la formazione di fasci di capelli ed è adiacente alla fila più alta di stereociglia 6,7,8. L'architettura delle stereociglia è fondamentale per questo ruolo nella conversione di stimoli meccanici derivati dall'energia acustica in segnali neurali elettrici9. Danni all'HC uditivo dovuti all'invecchiamento, all'infezione, al trauma otoacustico o allo shock ototossico possono provocare una perdita parziale o completa dell'udito che, nei mammiferi, è irreversibile10.
Sono state proposte terapie cellulari sostitutive che potrebbero riparare tali danni11,12. L'approccio di questa ricerca è stato quello di comprendere il normale sviluppo della cellula ciliata dei mammiferi e chiedere se i programmi di sviluppo possono essere riavviati in cellule simili a progenitori che possono esistere all'interno dell'orecchio interno13. Un secondo approccio è stato quello di guardare al di fuori dei mammiferi, ai vertebrati non mammiferi in cui avviene una robusta rigenerazione delle cellule ciliate uditive, come gli uccelli14,15. Negli uccelli, la rigenerazione delle cellule ciliate avviene prevalentemente attraverso la de-differenziazione di una cellula di supporto in uno stato simile a un progenitore, seguita da una divisione mitotica asimmetrica per generare una cellula ciliata e una cellula di supporto16. Inoltre, è stata osservata anche la differenziazione diretta di una cellula di supporto per generare una cellula ciliata17.
Mentre i meccanismi dello sviluppo uditivo aviario mostrano somiglianze significative con quello dei mammiferi, ci sono differenze18. La differenziazione di HC e SC nel pulcino BP è evidente dal giorno embrionale (E) 7, diventando più distinta nel tempo. Con E12, è possibile visualizzare una papilla basilare (BP) ben modellata e ben polarizzata, e da E17 si possono vedere cellule ciliate ben sviluppate19. Questi punti temporali forniscono finestre sui meccanismi di differenziazione, pattern e polarità, nonché sulla maturazione delle cellule ciliate. Capire se tali meccanismi sono conservati o divergenti è importante, in quanto forniscono informazioni sulla profonda omologia delle origini delle cellule ciliate meccanosensoriali.
Qui, dimostriamo una serie di tecniche eseguite nelle fasi embrionali iniziali e tardive per studiare i processi cellulari come la proliferazione, la specifica del destino, la differenziazione, il pattern e il mantenimento durante lo sviluppo dell'organo dell'orecchio interno. Questo integra altri protocolli sulla comprensione dello sviluppo dell'orecchio interno nella coltura di espianti20,21,22. Per prima cosa discutiamo l'introduzione di DNA esogeno o RNA nei precursori della BP all'interno dell'otocisti E3.5 utilizzando l'elettroporazione ovo. Sebbene le manipolazioni genetiche possano fornire preziose informazioni, i fenotipi così generati possono essere pleiotropici e di conseguenza confondenti. Ciò è particolarmente vero durante il successivo sviluppo dell'orecchio interno, dove processi fondamentali come il rimodellamento citoscheletrico svolgono molteplici ruoli nella divisione cellulare, nella morfogenesi dei tessuti e nella specializzazione cellulare. Presentiamo protocolli per l'inibizione farmacologica negli espianti in coltura, che offrono vantaggi nel controllo del dosaggio e dei tempi e della durata del trattamento, offrendo una precisa manipolazione spaziotemporale dei meccanismi di sviluppo.
Diversi metodi di coltura degli organi possono essere utilizzati a seconda della durata del trattamento di piccoli inibitori. Qui dimostriamo due metodi di coltura degli organi che consentono approfondimenti sulla morfogenesi epiteliale e sulla specializzazione cellulare. Un metodo per la coltura 3D che utilizza il collagene come matrice per coltivare il dotto cocleare consente una coltura robusta e una visualizzazione dal vivo della BP in via di sviluppo. Per comprendere la formazione di stereociglia, presentiamo un metodo di coltura a membrana tale che il tessuto epiteliale viene coltivato su una matrice rigida che consente alle protrusioni di actina di crescere liberamente. Entrambi i metodi consentono l'elaborazione a valle come l'imaging di cellule vive, l'immunoistochimica, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la registrazione cellulare, ecc. Queste tecniche forniscono una tabella di marcia per l'uso efficace del pulcino come sistema modello per comprendere e manipolare lo sviluppo, la maturazione e la rigenerazione dell'epitelio uditivo aviario.
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Protocol
I protocolli che coinvolgono l'approvvigionamento, la coltura e l'uso di uova di gallina fecondate ed embrioni non nati sono stati approvati dal Comitato etico animale istituzionale del Centro nazionale per le scienze biologiche, Bangalore, Karnataka.
1. Elettroporazione in ovo di precursori uditivi pulcini
- Progettazione e clonazione di sgRNA per il knockout del gene CRISPR/Cas9
- Per la creazione di knockout genici, gli RNA guida alla progettazione per interrompere le regioni dell'esone del gene, preferibilmente più vicino all'estremità 5' della regione codificante.
- Selezionare i potenziali RNA guida utilizzando uno strumento web CRISPOR23. Impostare i dati del browser su Gallus gallus e la sequenza del motivo adiacente del protospacer (PAM) su 5'- NGG -3'. Il programma determina gli RNA guida dalla sequenza di input e assegna punteggi diversi in base all'attività on-target e off-target. Seleziona le prime quattro guide per ulteriori studi.
- Per la progettazione di oligo specifici del modello per la produzione di RNA guida (g), rimuovere la sequenza PAM (5′- NGG -3′) dall'output dello strumento di progettazione del gRNA. Questo non è necessario per il targeting, ma contiene la sequenza di riconoscimento della scissione Cas9. Sintetizzare due oligo complementari purificati HPLC con sito di restrizione BsmBI ad entrambe le estremità, per ogni potenziale gRNA.
- Clonare la sequenza guida nel frame con un'impalcatura di tracrRNA di un vettore di scelta (qui, pcU6_1sgRNA vettore è stato utilizzato24).
- Sciogliere gli oligonucleotidi sgRNA ad una concentrazione di 100 μM in acqua priva di DNasi/RNasi. Eseguire la ricottura delle due oligoguide senso e antisenso utilizzando un termociclatore con i seguenti parametri: 95 °C per 3 minuti, poi 37 °C per 15 minuti, quindi diminuire a 4 °C.
- Utilizzando tecniche standard di biologia molecolare come descritto in25, impostare la digestione di restrizione degli oligo ricotti e pcU6_1sgRNA vettore di clonazione con enzima BsmBI durante la notte. Impostare la legatura con il vettore pcU6_1sgRNA lineare BsmBI-digerito con gel e gli oligo sgRNA digeriti. Trasformarsi in una cellula competente DH5-alfa e confermare la sequenza del clone ottenuto.
- Gestione delle uova e windowing
- Procurati le uova appena deposte e puliscile pulendole con etanolo al 70% per evitare la contaminazione. Incubare a 37-38 °C, con 45% di umidità per 3,5-4 giorni.
- Dopo l'incubazione, posizionare l'uovo su un lato per almeno 5 minuti prima di aprire. Ciò consente all'embrione di riposizionarsi nella parte superiore del tuorlo. Utilizzare una pinza per praticare piccoli fori nella parte superiore e un'estremità smussata dell'uovo in modo che un ago da 21 G possa passare attraverso.
- Per evitare danni durante il windowing, rimuovere l'albumina per abbassare l'embrione lontano dal guscio. Per fare ciò, utilizzare una siringa da 5 ml e un ago da 21 G per prelevare con cura 2 ml di albumina da un foro all'estremità smussata dell'uovo. Utilizzare del nastro trasparente per coprire il foro all'estremità smussata.
- Per creare la finestra dell'uovo, applicare del nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Tagliare una finestra, lunga circa 2 cm e larga 1,5 cm, usando le forbici a molla ed esporre l'embrione. Utilizzare una pinza per aprire le membrane coriali sovrastanti l'embrione, consentendo l'accesso all'embrione.
- Plasmidi a microiniezione
- Per l'esperimento di knockout genico, preparare due soluzioni: la miscela knock-down contenente la proteina SpCas9 e il plasmide guida - pcU6_1sgRNA, e la miscela plasmidica tracciante di T2K-eGFP (questo è un promotore di ß-actina di pulcino che guida la cassetta GFP circondata dai siti di trasposone di Tol2) insieme al T2TP (la trasposasi Tol2 clonata nel costrutto Tol226,27). Il tracciante viene utilizzato per monitorare l'efficienza dell'elettroporazione.
- Quando si elettroporano più plasmidi, assicurarsi che la concentrazione finale di DNA sia di almeno 4 μg/μL. Mescolare i tre costrutti, plasmide guida - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, in un rapporto 1:1:1 con 1 μg di proteina SpCas9, 30% di saccarosio e 0,1% di colorante Fast Green in un volume finale di 10 μL.
- Tirare gli aghi per microiniezione da capillari di vetro standard (lunghezza 3 pollici, OD 1,0 mm) utilizzando un estrattore di pipette verticale. Utilizzare una pinza fine per rompere la punta capillare dopo aver tirato per ottenere un diametro della punta di circa 50 μm con un'estremità affusolata.
- Posare gli embrioni a E3.5 sul lato sinistro con la testa rivolta a destra. In questo modo solo la vescicola otica destra è accessibile per la microiniezione. Micro-iniettare la miscela knock-down nella vescicola otica. Iniettare circa un volume di 200 nL di miscela di soluzione di DNA per riempire la vescicola otica.
- Determinare l'efficienza della guida utilizzando un saggio di endonucleasi T728.
- Elettroporazione
- Aggiungere alcune gocce di soluzione salina allo 0,719% sulla parte superiore dell'embrione prima dell'elettroporazione per abbassare la resistenza elettrica e prevenire il surriscaldamento dell'embrione.
- Posizionare l'elettrodo positivo attraverso il foro praticato sul lato smussato dell'uovo quando l'albumina è stata rimossa. Manovra l'elettrodo in modo che sia sotto il tuorlo. Posizionare l'elettrodo negativo sopra l'otocisti riempita.
- Utilizzare l'elettroporazione per trasfettare i plasmidi nelle cellule dell'embrione. Utilizzare un generatore di impulsi quadrato e applicare cinque impulsi di 25 V e 100 ms di durata ciascuno, a 50 ms di distanza. Determinare le condizioni empiricamente in base a una configurazione di elettroporazione individuale.
- Idratare l'embrione dopo l'elettroporazione aggiungendo qualche goccia di soluzione salina allo 0,719%. Per pulire l'albumina denaturata dalla superficie degli elettrodi, sciacquarla accuratamente con acqua distillata. Richiudere l'uovo con nastro trasparente e tornare nell'incubatrice umidificata a 37-38 °C per un'ulteriore incubazione.
NOTA: Gli embrioni possono essere coltivati fino alla schiusa dopo l'elettroporazione, tuttavia vi è una forte riduzione della vitalità.
2. Dissezione della papilla basilare
- Utilizzare etanolo al 70% per disinfettare il tavolo chirurgico, lo stadio del microscopio e l'area circostante. Il calore o l'alcol sterilizzano le apparecchiature di microdissezione che includono forbici minimamente a molla, micro-curette e due paia di pinze sottili.
- Preparare le seguenti piastre di dissezione: una capsula di Petri di vetro con una base di silicio nero, una capsula di Petri di plastica da 90 mm e una capsula di Petri da 60 mm. Raffreddare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per le dissezioni.
- Rompere delicatamente l'uovo nella capsula di Petri da 90 mm. Identifica l'orecchio esterno del pulcino. Decapitare l'embrione tagliando il collo appena sotto il livello della mascella inferiore usando le forbici. Trasferire la testina in una capsula di Petri da 60 mm riempita con PBS ghiacciato.
- Orientare l'embrione con la parte superiore del becco rivolta verso lo sperimentatore e tenere il becco usando una delle pinze #5. Raccogli gli occhi usando la seconda pinza #5. Passando da rostrale a caudale, taglia il cranio lungo la sua linea mediana. Estrai il cervello.
- Aggiungi più PBS o HBSS ghiacciato e individua le due strutture lucide, vicino al livello del padiglione auricolare. Questi sono gli otoliti della lagena alla fine del dotto cocleare e si trovano vicino alla linea mediana.
- Tagliare approssimativamente tra le due lagene, e ben sopra e sotto questa regione per isolare due orecchie interne. Sotto l'illuminazione obliqua, visualizza il contorno dell'orecchio interno. Rimuovere il tessuto estraneo e il vestibolo.
- Trasferire la coclea isolata su una piastra di base in silicone nero con PBS ghiacciato. Utilizzando una pinza #5, rimuovere la capsula cocleare cartilaginea per ottenere il dotto cocleare. Individuare lo strato ondulato (tegmentum) del dotto cocleare e rimuovere usando una pinza #55 per esporre la BP. Utilizzando una pinza #55, rimuovere la membrana tettorica per esporre HC e SC.
3. Coltura di espianti di papilla basilare
- Coltura a membrana della BP
- Prendi una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e disponi un inserto di membrana di coltura per pozzetto.
- Raccogliere la papilla basilare sezionata (espianto) in una pipetta da 200 μL con 1x tampone HBSS e trasferirla su una membrana. Per evitare che il tessuto si attacchi alla parete della pipetta, aspirare alcuni supporti prima di aspirare il tessuto.
- Orientare l'espianto in modo tale che la papilla basilare sia rivolta verso l'alto, in modo che i capelli e le cellule di supporto siano visibili dall'alto29. Una volta posizionato l'espianto, aspirare lentamente il tampone HBSS dalla superficie della membrana di coltura. In questo processo, l'espianto si attaccherà alla membrana di coltura.
- Aggiungere 1,2 ml di terreno di coltura Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco tra l'inserto della membrana e la parete del pozzo per riempire i pozzetti della piastra a sei pozzetti. Fino a sei espianti possono essere coltivati su una singola membrana di coltura da 30 mm.
- Coltura di collagene del dotto cocleare
- Preparare la miscela di collagene aggiungendo 400 μL di 3 mg/ml di collagene a coda di ratto, 50 μL di 10x DMEM, 30 μL di NaHCO3 al 7,5% e 5 μL di HEPES in una cappa di coltura tissutale.
- Prendi una piastra a quattro pozzetti e aggiungi tre gocce di miscela di collagene in ciascun pozzetto. Trasferire il dotto cocleare sezionato ad ogni goccia di collagene. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 °C, 5% CO2 per polimerizzare la matrice di collagene.
- Trattamento di piccole molecole di colture
- Preparare terreni di coltura (DMEM, integratore N-2, penicillina) con il modulatore farmacologico o il suo solvente da solo (per l'uso come controllo). Sostituire i terreni di coltura con 700 μL di terreno integrato con l'inibitore. Coltura degli espianti in incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
- Sostituire il 50% dei terreni di coltura ogni giorno. Dopo un adeguato tempo di incubazione, rimuovere i terreni di coltura e utilizzare gli espianti per i saggi a valle.
4. Imaging e analisi
- Analisi immunofluorescente
- Rimuovere i terreni di coltura dai pozzetti e lavare gli espianti due volte con 1x HBSS. Utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nel pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PFA e lavare gli espianti tre volte con 1x PBS a temperatura ambiente. Per raccogliere gli espianti dalla membrana di coltura, fare un piccolo taglio attorno alla membrana contenente il pezzo di tessuto usando piccole forbici a molla e trasferire il tessuto insieme alla membrana su una piastra di coltura a 48 pozzetti usando una pinza.
NOTA: Se i tessuti galleggiano dopo la fissazione, aspirare con una pipetta da 200 μL e trasferirla su piastre da 48 pozzetti per ulteriori elaborazioni. Evitare il distacco forzato del tessuto dalla membrana. - Per la coltura di goccioline di collagene, utilizzare una pinza per trasferire l'intera goccia di collagene su una piastra di silicio. Aggiungere 200 μL di 1x PBS e rimuovere il collagene con l'aiuto di una pinza, quindi trasferire il tessuto in una piastra di coltura a 48 pozzetti.
- Permeabilizzare gli espianti con 1 mL di 1x PBS integrato con 0,3% Tween-20 (PBST) per 30 minuti a temperatura ambiente. Incubare gli espianti con 200 μL di tampone bloccante (10% siero di capra + 1% albumina sierica bovina in PBST) per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare gli espianti con 200 μL di soluzione anticorpale primaria (1:300, in tampone bloccante) per una notte a 4 °C. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST.
- Incubare gli espianti con 200 μL di falloidina e soluzione anticorpale secondaria (in tampone bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Rimuovere la falloidina e la soluzione anticorpale secondaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST.
NOTA: la concentrazione di anticorpi secondari e la lunghezza del lavaggio devono essere determinate per ogni singola applicazione di imaging. Per l'imaging mediante microscopia a super risoluzione, in genere aumentiamo la concentrazione dell'anticorpo secondario da 1:500 a 1:200 e aumentiamo la concentrazione di falloidina da 1:400 a 1:200. - Incubare gli espianti con una soluzione di DAPI (1:1000 in PBST) per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare gli espianti 3 x 5 minuti con PBST.
- Utilizzare il supporto di montaggio per montare gli espianti su una slitta con la pressione rivolta verso l'alto (contro il coprivetrino). Per l'imaging confocale utilizzare supporti di montaggio antidissolvenza. Lasciare asciugare il supporto di montaggio durante la notte a temperatura ambiente al buio. Visualizzare direttamente l'immagine o conservare i vetrini a 4 °C fino all'imaging.
- Fissazione OTOTO per analisi SEM
- Preparare tutte le soluzioni fresche e maneggiare secondo le linee guida di sicurezza locali. Fissare gli espianti coltivati a membrana (dal punto 4.1.4) in glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3) con 3 mM CaCl2. Eseguire la fissazione a 4 °C per 24-72 ore con un cambio di fissativo ogni 24 ore.
- Rimuovere il fissativo e lavare il tessuto con cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Correzione secondaria con OsO4 all'1% (diluito da un brodo di OsO 4 al4 % utilizzando tampone cacodilato di sodio 0,1 M) per 1 ora a temperatura ambiente. Eseguire questo e i passaggi successivi fino alla disidratazione in una cappa aspirante.
- Risciacquare con tampone cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Quindi risciacquare in acqua bidistillata o ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione allo 0,5% di tiocarboidrazide (TCH) in acqua ultrapura. Agitare a 75 °C per 10 minuti e filtrare la soluzione quando si è raffreddata a temperatura ambiente.
NOTA: TCH è estremamente pericoloso. L'uso deve essere approvato dal comitato di sicurezza locale e deve essere prestata attenzione durante la manipolazione. - Rimuovere l'acqua ultrapura dal campione e aggiungere lo 0,5% di TCH goccia a goccia. Se la soluzione diventa marrone, fermarsi e sciacquare il campione con acqua ultrapura, prima di aggiungere con attenzione la soluzione di TCH allo 0,5%. Una volta che la soluzione è limpida, sostituirla con 0,5% TCH. Incubare a temperatura ambiente per 20 min30,31.
- Risciacquare il campione con acqua ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 altre due volte terminando con l'incubazione di OsO4 seguita dal risciacquo.
- Disidratare i campioni in una serie di etanolo al 100% anidro (EtOH). Incubare prima in ETOH al 25% per 10 minuti, poi al 50% ETOH per 10 minuti, al 75% EtOH per 10 minuti, al 95% ETOH per 10 minuti, prima di incubare per un totale di 3x per 10 minuti ciascuno in ETOH al 100%.
- Eseguire l'essiccazione dei punti critici utilizzando CO2 liquido. Montare immediatamente i campioni su un tronchetto SEM con nastro biadesivo in carbonio. Procedere allo sputter coat per fornire 5-10 nm di rivestimento. Se non si esegue immediatamente l'imaging, conservare i campioni in un essiccatore sotto vuoto.
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Representative Results
Nella configurazione dell'elettroporazione, il posizionamento degli elettrodi può svolgere un ruolo nel dominio della trasfezione. L'elettrodo positivo è posto sotto il tuorlo e il negativo sopra l'embrione (Figura 1A). Ciò si traduce in una maggiore espressione di GFP in gran parte dell'orecchio interno e di entrambi gli organi vestibolari (Figura 1B) e nella papilla basilare uditiva (Figura 1C, D), confermando la trasfezione.
Nel valutare il fenotipo dei knockdown CRISPR, abbiamo progettato RNA guida per il fattore di trascrizione delle cellule ciliate Omologo atonale 1 (Atoh1). I mutanti murini di Atoh1 non sono in grado di formare cellule ciliate32; dopo l'elettroporazione degli RNA guida Atoh1 e l'incubazione fino a E10, troviamo che lo sviluppo di HC è compromesso rispetto al controllo del plasmide vuoto (Figura 2). Sebbene l'elettroporazione sia a mosaico (Figura 2E,F), le cellule elettroporate di controllo sono in grado di formare cellule ciliate. Nei campioni elettroporati di gRNA Atoh1, le cellule GFP positive non mostrano mai i marcatori dello sviluppo di HC (Figura 2B).
La coltura di organi della BP fornisce accessibilità al tessuto. Le colture in una matrice 3D, come il collagene, forniscono un'eccellente conservazione della morfologia del tessuto fino a 5 giorni. L'organizzazione di HC e SC è mantenuta in queste condizioni di coltura (Figura 3).
Le colture di organi su una membrana sono preferibili per l'imaging delle stereociglia. Tali colture possono essere coltivate fino a 5 giorni mantenendo l'integrità del fascio di capelli. Ciò può essere visto dalla localizzazione della proteina tip-link, protocaderina 1533 (Pcdh15) (Figura 4). Per interrogare lo sviluppo del fascio di capelli, è necessaria un'imaging ad alta risoluzione e tali approcci, utilizzando la microscopia a super-risoluzione (Figura 4D) o la microscopia elettronica a scansione (Figura 4E), forniscono informazioni più complete.
Figura 1. L'espressione della GFP è visibile a E10 dopo l'elettroporazione in ovo a E4. (A) Diagramma schematico che illustra la microiniezione in ovo e l'elettroporazione nella vescicola otica di pulcino a E4. La pipetta per iniezione viene riempita con plasmidi Tol2-eGFP (T2K-eGFP) e Tol2-trasposasi (T2TP), insieme a colorante verde veloce per la visualizzazione. (B) Immagine dell'orecchio interno elettropolato a E10 utilizzando una lente ad aria 0,63x su uno stereomicroscopio. L'orecchio interno sinistro è il controllo interno. La freccia rossa segna l'espressione di GFP nel dotto cocleare dell'orecchio interno destro e l'asterisco rosso mostra l'espressione di GFP negli organi vestibolari; la barra della scala è di 2 cm. (C) Immagine a fluorescenza a campo largo di una sezione trasversale del dotto cocleare destro utilizzando un obiettivo d'aria 20x di 0,5 NA. L'espressione della GFP è per lo più confinata all'epitelio sensoriale; La barra della scala è di 10 μm. (D) Immagine confocale dell'intera papilla basilare ripresa utilizzando l'obiettivo 10x dell'aria di 0,5 NA colorato con falloidina coniugata con fluoroforo Alexa 647. L'espressione della GFP è osservata dall'estremità prossimale a quella distale sul lato neurale della BP; La barra di scala è 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. L'elettroporazione del knockout del gene Atoh1 mediato da CRISPR / Cas9 provoca la perdita di cellule ciliate (HC). Il plasmide guida del gene Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA e i plasmidi traccianti Tol2-eGFP (T2K-eGFP) e Tol2-trasposasi (T2TP) con proteina SpCas9 sono microiniettati ed elettroporati nella vescicola otica di pulcino a E4. Tutte le immagini provengono da una papilla basilare E10 di pulcino con una barra di scala di 10 μm, catturata con un obiettivo di immersione in olio 60x di 1,42 NA utilizzando un microscopio confocale laser. Gli inserti ingranditi sono forniti per tutte le immagini. (A,B,C,D) Il pannello di sinistra contiene BP con cellule ciliate (HC), elettroporate con pcU6_1sgRNA vuote e T2K-eGFP e T2TP con proteina SpCas9. (E,F,G,H) Il pannello laterale destro contiene BP con perdita di HCs, elettroporate con guida Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) e T2K-eGFP, e T2TP con proteina SpCas9. (A,E) Immagine unita che mostra le cellule ciliate (HC) nella papilla basilare. Questi sono immunoreattivi per la miosina 7a (blu); F-actina colorata con falloidina coniugata con Alexa 647 (rosso); L'espressione di GFP dai plasmidi Tol2-eGFP viene rilevata utilizzando un anticorpo anti-GFP (verde). La perdita di HCs è evidente dall'immunoreattività della miosina 7a quando si confrontano i trattamenti con pcU6_1sgRNA vuoti (D) e pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). L'imaging F-actina da entrambi i trattamenti evidenzia il fascio di capelli dell'HC (B, F). (C,G) T2K-eGFP e T2TP sono utilizzati per misurare la posizione e l'efficienza della trasfezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. La coltura d'organo del dotto cocleare nella coltura di goccioline di collagene 3D mantiene l'organizzazione dell'epitelio sensoriale. La pressione sanguigna a E10 viene coltivata in una coltura di goccioline di collagene 3D per 1 giorno e ripresa utilizzando un obiettivo di immersione in olio 60x di 1,42 NA utilizzando un microscopio confocale laser. (A) Immagine dell'intera pressione sanguigna di E10 coltivata per 1 giorno in una goccia di collagene e colorata con anticorpi contro l'antigene delle cellule ciliate (HCA)34. La barra della scala è di 100 μm. (B) Immagine unita che mostra l'organizzazione conservata dell'epitelio sensoriale dal lato distale della BP colorato con (C) falloidina (verde) e (D) HCA (blu); La barra di scala è 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Fasci stereociliari di papilla basilare al microscopio elettronico e ottico. La pressione allo 0,1% trattata con dimetilsolossido (DMSO) è stata espiantata a E10 e coltivata per 3 giorni in vitro (DIV) su inserti di coltura a membrana. (A) Explant viene ripreso utilizzando un obiettivo di immersione in olio 60x di 1,42 NA con un microscopio confocale a scansione laser. L'immagine unita mostra l'espressione della protocaderina 15 (Pcdh15) e delle stereociglia contrassegnate da falloidina coniugata con Alexa 488 (verde). Vengono mostrate immagini a canale singolo di F-actina ( B) e Pcdh15 (C). La barra della scala è di 10 μm. (D) Immagine ad altissima risoluzione di stereociglia colorate con falloidina coniugata con la colorazione di Alexa 488 in verde. L'immagine è stata ottenuta utilizzando un obiettivo di immersione in olio 63x di 1,42 NA in modalità Airyscan del microscopio confocale a scansione laser. La barra della scala è di 5 μm. (E) L'immagine SEM è stata scattata con un ingrandimento di 16340x utilizzando una tensione elettronica ad alta tensione (EHT ) di 7 kV. L'asterisco rosso segna le kinocilia e il cuneo rosso segna le stereociglia. La luminosità e il contrasto sono stati regolati su auto e l'immagine è stata resa più nitida utilizzando FIJI. La barra della scala è 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il pulcino è un'aggiunta economica e conveniente agli organismi modello che un laboratorio può utilizzare per la ricerca sull'orecchio interno. I metodi qui descritti sono abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e completano la ricerca in corso nell'orecchio interno dei mammiferi. Nell'ovo l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre manipolazioni genetiche nel genoma del pulcino. L'elettroporazione può anche essere usata per introdurre costrutti che codificano proteine fluorescenti mirate a particolari organelli o strutture subcellulari35,36. Mentre questa è una procedura semplice, la manipolazione degli embrioni in ovo influisce sulla vitalità. Per un'elettroporazione efficiente, le uova devono essere procurate fresche (subito dopo la deposizione). Un aumento della mortalità e/o uno sviluppo anormale si osserva frequentemente nelle uova che sono state conservate per oltre 5 giorni. L'uso della tecnica sterile, assicurando che l'uovo sia adeguatamente sigillato in modo che non perda umidità e riducendo al minimo le manipolazioni eseguite sull'embrione migliorano la vitalità.
Abbiamo scoperto che il targeting dell'otocisti da E3,5 a E4 riduce il trauma che l'embrione deve affrontare e l'uso di elettrodi accuratamente posizionati consente un buon targeting dei precursori sensoriali della BP. Tuttavia, a questo punto, i precursori del ganglio acustico-vestibolare sono già migrati lontano dall'orecchio interno37,38. Per colpire queste cellule, devono essere selezionati i punti temporali più precoci per l'elettroporazione dell'otocisti e devono essere apportate sistemazioni per la corrispondente diminuzione della vitalità. Un'ulteriore nota di cautela è la possibilità di mosaicismo negli embrioni elettroporati. Non tutte le cellule assorbono tutto il plasmide, e quindi il mosaicismo può confondere l'interpretazione. L'uso di plasmidi traccianti aiuta nell'interpretazione dei dati e fornisce un certo controllo sui possibili effetti del mosaico. L'uso di ripetizioni multiple, analisi accurate e metodi statistici aiuterà nella valutazione dei fenotipi a mosaico. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare quaglie geneticamente modificate39. Attualmente, questi numeri sono limitati e non sono sempre disponibili per molti laboratori. Tuttavia, la disponibilità aumenterà e gli embrioni di quaglia, che esprimono costitutivamente proteine fluorescenti sub-cellulari mirate, sono una proposta interessante per gli esperimenti di imaging.
In questo metodo, elettroporiamo proteine e DNA per knockdown mediati da CRISPR attraverso l'end-joining non omologo (NHEJ)24. La generazione mediata da CRISPR / Cas9 di costrutti di fusione attraverso la riparazione diretta dall'omologia (HDR) rimane inefficiente in questo particolare paradigma (Singh et al., osservazioni non pubblicate). Il metodo di elettroporazione può essere adattato per l'uso con altri tipi di costrutti di DNA (questi potrebbero essere costrutti che codificano proteine di fusione), così come per RNA e proteine. Va notato che durante lo sviluppo (e la divisione cellulare) i costrutti di espressione basati sul DNA si diluiranno a meno che il vettore non incorpori siti che mediano l'inserimento del DNA esogeno nel genoma di queste cellule (ad esempio, Tol2 o PiggyBac). Ciò consente un'espressione più stabile del costrutto.
Dopo l'elettroporazione, gli embrioni vengono solitamente coltivati in ovo fino allo stadio E10 per la differenziazione delle cellule ciliate e gli studi sullo sviluppo. Ma se necessario, nella coltura ovo può essere continuato fino alla schiusa delle uova; Tuttavia, con l'aumentare della durata dell'incubazione si verifica un corrispondente calo della redditività. Per aggirare questo, l'elettroporazione in ovo può essere combinata con dissezioni BP seguite da coltura ex ovo a lungo termine. La coltura di espianti all'interno di una matrice 3D consente una buona conservazione della morfologia dei tessuti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel pattern tissutale, nella polarità e nella differenziazione. La coltura della BP su una membrana consente la visualizzazione del lato apicale del tessuto27, in particolare l'imaging ad alta risoluzione delle stereociglia.
In alcuni casi, i limiti della modificazione genetica possono essere superati utilizzando diversi trattamenti a base di piccole molecole. I composti farmacologicamente attivi agiscono come inibitori o agonisti per le vie di segnalazione o i processi biologici cellulari. La loro applicazione è particolarmente utile per sezionare il requisito temporale. Tuttavia, le modalità esatte di somministrazione e le concentrazioni ottimali devono essere determinate empiricamente, poiché in alcuni casi la standardizzazione eseguita nelle linee cellulari non è paragonabile al dosaggio richiesto nei tessuti. Il parto all'interno dell'embrione può essere problematico e la quantità necessaria combinata con l'impatto su altri sistemi di organi può compromettere significativamente la vitalità. Un'alternativa pronta sono i metodi di coltura degli organi20,21,22. Tuttavia, il metodo di coltura esatto dipende dai tipi di studio e analisi che sono destinati. Mentre la coltura di collagene preserva la morfologia tissutale della BP, la coltura di membrana è più adatta per studiare i fasci di capelli apicali dell'HC. Il tessuto può essere semplicemente posizionato sopra la membrana per visualizzare la superficie apicale utilizzando la microscopia elettronica a scansione o la microscopia a super-risoluzione. Le dissezioni per la coltura di organi richiedono buone pratiche. Questi includono il mantenimento di uno spazio di lavoro sterile e l'utilizzo di strumenti affilati. Tali strumenti di microdissezione sono sensibili e riteniamo che l'uso di piastre di silicio sia importante per preservare l'integrità degli strumenti microchirurgici.
Insieme, le tecniche rappresentano approcci preziosi per approfondire la comprensione dello sviluppo dell'orecchio interno. Le intuizioni in biologia comparata e rigenerazione che gli embrioni di pulcino offrono possono fornire informazioni significative sullo sviluppo e sulla funzione delle cellule ciliate.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo con gratitudine il supporto di NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e Royal National Institute for the Deaf. Vorremmo ringraziare Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Siamo grati al supporto di CIFF e EM facility and lab presso NCBS. Ringraziamo Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami per i costrutti Tol2-eGFP e T2TP, e Guy Richardson per l'HCA e l'anticorpo G19 Pcdh15. Siamo grati ai membri di Earlab per il loro costante supporto e prezioso feedback sul protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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