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Neuroscience

माउस एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव और प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग

Published: July 7, 2022 doi: 10.3791/64175
Automatic Translation
1,2,3, 2, 1,2
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

Summary

यहां हम प्रसवोत्तर चूहों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स की अत्यधिक समृद्ध संस्कृतियों को उत्पन्न करने और प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा कार्यात्मक न्यूरॉन्स में उनके प्रत्यक्ष रूपांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

डायरेक्ट न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग मल्टीपोटेंट इंटरमीडिएट्स से गुजरने के बिना विभिन्न स्टार्टर सेल आबादी से कार्यात्मक न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। यह तकनीक न केवल रोग मॉडलिंग के क्षेत्र में महान वादे रखती है, क्योंकि यह परिवर्तित करने की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से पीड़ित रोगियों के लिए फाइब्रोब्लास्ट न्यूरॉन्स में, बल्कि सेल-आधारित प्रतिस्थापन उपचारों के लिए एक आशाजनक विकल्प का भी प्रतिनिधित्व करती है। इस संदर्भ में, एक प्रमुख वैज्ञानिक सफलता यह प्रदर्शन था कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर विभेदित गैर-तंत्रिका कोशिकाओं, जैसे कि एस्ट्रोसाइट्स, को इन विट्रो में कार्यात्मक न्यूरॉन्स में परिवर्तित किया जा सकता है। तब से, न्यूरॉन्स में एस्ट्रोसाइट्स के इन विट्रो डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग ने मजबूर पहचान रूपांतरण के अंतर्निहित आणविक तंत्र और कुशल रिप्रोग्रामिंग को रोकने वाली बाधाओं में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, विभिन्न प्रयोगशालाओं में किए गए इन विट्रो प्रयोगों के परिणामों की तुलना एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने, संस्कृति और पुन: प्रोग्राम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों में अंतर के कारण करना मुश्किल है। यहां, हम चुंबकीय सेल सॉर्टिंग के माध्यम से प्रसवोत्तर उम्र में चूहों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों से उच्च शुद्धता के साथ एस्ट्रोसाइट्स को मज़बूती से अलग करने और संस्कृति करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम वायरल ट्रांसडक्शन या डीएनए अभिकर्मक के माध्यम से न्यूरॉन्स में सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स को फिर से प्रोग्राम करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस सुव्यवस्थित और मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग सेल पहचान रखरखाव, एक नई न्यूरोनल पहचान की स्थापना, साथ ही विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकारों की पीढ़ी और उनके कार्यात्मक गुणों के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अत्यधिक जटिल है, जिसमें सैकड़ों विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें विभिन्न न्यूरोनलउपप्रकारों की एक बड़ी संख्या 1,2,3,4,5,6 शामिल है। अन्य अंगों याऊतकों 7,8,9 के विपरीत, स्तनधारी सीएनएस में बहुत सीमित पुनर्योजी क्षमता है; दर्दनाक मस्तिष्क की चोट या न्यूरोडीजेनेरेशन के बाद न्यूरोनल हानि अपरिवर्तनीय है और अक्सर मोटर और संज्ञानात्मक घाटे में परिणामहोता है 10. मस्तिष्क के कार्यों को बचाने के उद्देश्य से, खोए हुए न्यूरॉन्स को बदलने के लिए विभिन्न रणनीतियों की गहन जांच की जा रहीहै 11. उनमें से, कार्यात्मक न्यूरॉन्स में दैहिक कोशिकाओं का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण12 के रूप में उभर रहा है। डायरेक्ट रिप्रोग्रामिंग, या ट्रांसडिफरेंशिएशन, एक मध्यवर्ती प्रोलिफेरेटिव या प्लुरिपोटेंट राज्य13,14,15,16 से गुजरने के बिना एक विभेदित सेल प्रकार को एक नई पहचान में परिवर्तित करने की प्रक्रिया है। फाइब्रोब्लास्ट्स को मांसपेशियों की कोशिकाओं17,18 में परिवर्तित करने के लिए पर्याप्त कारक के रूप में मायोडी 1 की पहचान से अग्रणी, इस विधि को कई सेल प्रकारों को कार्यात्मक न्यूरॉन्स19,20,21 में पुन: प्रोग्राम करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है।

एस्ट्रोसाइट्स, सीएनएस22,23 में सबसे प्रचुर मात्रा में मैक्रोग्लिया, कई कारणों से प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग के लिए एक विशेष रूप से आशाजनक सेल प्रकार है। सबसे पहले, वे सीएनएस में व्यापक रूप से और समान रूप से वितरित किए जाते हैं, जो नए न्यूरॉन्स के लिए लोको स्रोत में प्रचुर मात्रा में प्रदान करते हैं। दूसरा, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स विकासशील रूप से निकटता से संबंधित हैं, क्योंकि वे भ्रूण के विकास के दौरान एक सामान्य पूर्वज साझा करते हैं, रेडियल ग्लियाल कोशिकाएं24. दो कोशिका प्रकारों की सामान्य भ्रूण उत्पत्ति विभिन्न रोगाणु परतों19,21 से कोशिकाओं के पुन: प्रोग्रामिंग की तुलना में न्यूरोनल रूपांतरण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, उनके रेडियल ग्लिया मूल के माध्यम से एस्ट्रोसाइट्स द्वारा विरासत में मिली पैटर्निंग जानकारी वयस्क एस्ट्रोसाइट्स 25,26,27 में भी बनाए रखी जाती है, और क्षेत्रीय रूप से उपयुक्त न्यूरोनल उपप्रकार28,29,30 की पीढ़ी में योगदान देती है। इसलिए, न्यूरॉन्स में एस्ट्रोसाइट्स के रूपांतरण की जांच और समझना सेल-आधारित प्रतिस्थापन रणनीतियों के लिए इस तकनीक की पूरी क्षमता प्राप्त करने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है।

इन विट्रो सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के न्यूरॉन्स में रूपांतरण ने प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग के क्षेत्र में कई सफलताओं को जन्म दिया है, जिनमें शामिल हैं: i) एस्ट्रोसाइट्स से न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त प्रतिलेखन कारकों की पहचान15,19,31, ii) एक ही सेलुलर संदर्भ में विभिन्न रिप्रोग्रामिंग कारकों द्वारा ट्रिगर किए गए आणविक तंत्र का खुलासा32 , और iii) विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकारों 28,29,33 को प्रेरित करने पर एस्ट्रोसाइट्स की विकासात्मक उत्पत्ति के प्रभाव को उजागर करना। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स के इन विट्रो प्रत्यक्ष रूपांतरण ने कई प्रमुख बाधाओं को उजागर किया जो प्रत्यक्ष न्यूरोनलरिप्रोग्रामिंग 34,35 को सीमित करते हैं, जैसे कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादनमें वृद्धि 34 और एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स35 के माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम के बीच अंतर। इसलिए, ये टिप्पणियां जीव विज्ञान12 में कई मौलिक प्रश्नों की जांच करने के लिए प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग के लिए एक मॉडल के रूप में एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियों के उपयोग का दृढ़ता से समर्थन करती हैं, सेल पहचान रखरखाव से संबंधित, सेल भाग्य परिवर्तनों को रोकने वाली बाधाएं, साथ ही रीप्रोग्रामिंग में चयापचय की भूमिका।

यहां हम बहुत उच्च शुद्धता के साथ प्रसवोत्तर (पी) उम्र में चूहों से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जैसा कि म्यूरिन रीढ़ की हड्डी29 से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करके प्रदर्शित किया गया है। हम वायरल ट्रांसडक्शन या डीएनए प्लास्मिड अभिकर्मक के माध्यम से न्यूरॉन्स में एस्ट्रोसाइट्स को फिर से प्रोग्राम करने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। रिप्रोग्रामिंग कोशिकाओं का विश्लेषण विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए 7 दिनों के बाद पारगमन (7 डीपीटी) पर किया जा सकता है, जैसे कि रीप्रोग्रामिंग दक्षता और न्यूरोनल आकृति विज्ञान, या समय के साथ उनकी परिपक्वता का आकलन करने के लिए कई हफ्तों तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट्स के लिए विशिष्ट नहीं है और कॉर्टिकल ग्रे मैटर, मिडब्रेन और सेरिबैलम सहित विभिन्न अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रक्रिया वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार हेल्महोल्ट्ज़ ज़ेंट्रम म्यूनिख के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करती है। कृपया उस संस्था के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करना सुनिश्चित करें जहां विच्छेदन किया जाता है।

1. विच्छेदन, पृथक्करण और संस्कृति सामग्री की तैयारी

नोट: एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर सभी संस्कृति अभिकर्मकों को तैयार करें और केवल आटोक्लेव या बाँझ उपकरणों का उपयोग करके काम करें। विच्छेदन और पृथक्करण अभिकर्मकों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट के बाहर तैयार किया जा सकता है।

  1. एमएल; न्यूनतम 2 घंटे के लिए एच 2 ओ में पॉली-डी-लाइसिन (स्टॉक 1 मिलीग्राम / एमएल; कामकाजी समाधान 20 μg / एमएल) के साथ एक टी25संस्कृति फ्लास्क कोटिंग करके संस्कृति फ्लास्क तैयार करें। बाद में, एच2ओ के साथ 3x कुल्ला और हवा सूखी।
  2. हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 500 एमएल में 1 एम एचईपीईएस बफर समाधान के 5 एमएल जोड़कर विच्छेदन बफर तैयार करें।
  3. तंत्रिका ऊतक पृथक्करण किट से बफर एक्स के 1950 μL जोड़कर छह रीढ़ की हड्डी प्रति एक सी-ट्यूब (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। विच्छेदन के दौरान बर्फ पर स्टोर करें। बफर वाई के 20 μL और सी-ट्यूब प्रति बफर ए के 10 μL जोड़कर एंजाइमेटिक पाचन मास्टर मिश्रण तैयार करें (तंत्रिका ऊतक पृथक्करण किट का हिस्सा; सामग्री की तालिका देखें)। अच्छी तरह मिलाएं और जरूरत पड़ने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 1x फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) तैयार करें और बर्फ पर रखें। डीएमईएम / एफ 12 के 485 एमएल में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता, 100 यू / एमएल), 45% डी-ग्लूकोज के 5 एमएल, और ग्लूटामाइन पूरक के 5 एमएल (अंतिम एकाग्रता 2 एमएम; सामग्री की तालिका देखें) के 5 एमएल जोड़कर बुनियादी संस्कृति माध्यम तैयार करें। मूल माध्यम 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
  5. बुनियादी संस्कृति माध्यम के 44 मिलीलीटर के लिए बी 27-पूरक और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 5 एमएल के 1 एमएल जोड़कर एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम तैयार करें। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और बेसिक-फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) (10 एनजी / एमएल प्रत्येक) के साथ पूरक माध्यम। माध्यम की उचित मात्रा में उपयोग करने से ठीक पहले ईजीएफ और बीएफजीएफ जोड़ें।
  6. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के विच्छेदन के लिए, तुला टिप के साथ बड़े संदंश की एक जोड़ी, तुला टिप के साथ छोटे संदंश की एक जोड़ी, छोटे संदंश की एक जोड़ी, छोटे कैंची की एक जोड़ी, और एक छोटा स्पैटुला का उपयोग करें।

2. एस्ट्रोसाइट अलगाव

  1. कार्यात्मक न्यूरॉन्स (चित्रा 1 ए) में अपने प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग करने के लिए प्रसवोत्तर चूहों की रीढ़ की हड्डी से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, जन्म के बाद दिन 2-3 पर चूहों से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को इकट्ठा करें। एस्ट्रोसाइट अलगाव के लिए छह से आठ रीढ़ की हड्डी इकट्ठा करें। तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों, जैसे कॉर्टेक्स, मिडब्रेन और सेरिबैलम से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए इसी प्रोटोकॉल का उपयोग करें। इन क्षेत्रों के लिए, जन्म के पांच से सात दिनों बाद कोशिकाएं प्राप्त करें।
    नोट: जब इस प्रोटोकॉल में उल्लेख नहीं कर रहे हैं कि क्षेत्रों से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने का लक्ष्य, उम्र और इनपुट सामग्री प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

3. रीढ़ की हड्डी ऊतक विच्छेदन

नोट: ऊतक का विच्छेदन एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के बाहर किया जा सकता है।

  1. जानवर को संवेदनाहारी के बिना विघटन द्वारा पी 2-पी 3 पर चूहों का बलिदान करें। धड़ को 35 मिमी पेट्री डिश में रखें और बर्फ पर रखें।
  2. कैंची के साथ त्वचा खोलें, छोटे कैंची के साथ कशेरुकाओं को हटा दें, रीढ़ की हड्डी निकालें, और इसे बर्फ पर विच्छेदन बफर में रखें। 2x आवर्धन के साथ एक स्टीरियोटैक्टिक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग कर पृथक रीढ़ की हड्डी से मेनिन्जेस को हटा दें और विच्छेदित और साफ रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को सी-ट्यूब में स्थानांतरित करें।

4. चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस)

  1. तंत्रिका ऊतक पृथक्करण किट से एंजाइम पी के 50 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और प्रत्येक सी-ट्यूब के लिए पहले से तैयार एंजाइम मिश्रण के 30 μL। सी-ट्यूबों को पलटें और उन्हें गर्म पृथक्करणक पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें), यह सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक ट्यूब के ढक्कन में एकत्र किए गए हैं।
  2. लगभग 22 मिनट के रन टाइम के साथ 37_NTDK_1 पृथक्करण कार्यक्रम चलाएं। कार्यक्रम के अंत से कुछ समय पहले, उपयोग किए गए सी-ट्यूबों की संख्या के बराबर 15 एमएल ट्यूबों की संख्या पर 70 μm छलनी (सामग्री की तालिका देखें) रखें और 2 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ छलनी को पूर्व-गीला करें। पूरे एमएसीएस प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर 1 एक्स पीबीएस स्टोर करें।
  3. कार्यक्रम के पूरा होने के बाद, सी-ट्यूबों को हटा दें और ट्यूबों के तल पर ऊतक को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। छलनी के माध्यम से पारित करके तैयार 15 एमएल ट्यूबों के लिए सी-ट्यूबों से पृथक ऊतक स्थानांतरण। छलनी को 15 एमएल ट्यूबों पर छोड़ दें।
  4. बचे हुए ऊतक को इकट्ठा करने के लिए 1 एक्स पीबीएस के 10 एमएल के साथ सी-ट्यूब कुल्ला और एक बार फिर छलनी से गुजरकर उसी 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर पृथक ऊतक युक्त 15 एमएल ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
    नोट: इस चरण के बाद अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  5. 1x पीबीएस के 80 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने से पहले सेल गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें; माउस एंटी-एसीएसए -2 माइक्रोबीड किट से अवरुद्ध अभिकर्मक के 10 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं।
  6. अंधेरे (फ्रिज) में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एंटी-एस्ट्रोसाइट सेल सतह एंटीजन -2-युग्मित माइक्रोबीड्स के 10 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और धीरे-धीरे पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर 1 एक्स पीबीएस और अपकेंद्रित्र के 3 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। सेंट्रीफ्यूजिंग करते समय, नीचे 15 एमएल संग्रह ट्यूब के साथ विभाजक पर चुंबकीय छँटाई स्तंभों (सामग्री की तालिका देखें) की उचित संख्या रखकर एक चुंबकीय विभाजक (सामग्री की तालिका देखें) को इकट्ठा करें। 1x पीबीएस के 500 μL के साथ स्तंभों कुल्ला।
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें और चुंबकीय स्तंभों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करने से पहले 1x पीबीएस के 500 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। गुरुत्वाकर्षण द्वारा नाली दें। 1x पीबीएस के 500 μL के साथ 15 एमएल ट्यूबों को धो लें और कॉलम पर लागू करें। एक अतिरिक्त दो धोने के लिए 1x पीबीएस के 500 μL के साथ कॉलम धो लें।
  9. विभाजक से स्तंभ को हटाकर, एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम के 800 μL जोड़कर और शामिल सवार के साथ स्तंभ से कोशिकाओं को धक्का देकर एल्यूट कोशिकाएं।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर ईजीएफ और बीएफजीएफ और संस्कृति के साथ पूरक एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम के4.2 मिलीलीटर जोड़कर पहले से तैयार संस्कृति फ्लास्क में प्लेट कोशिकाएं।
    नोट: कोटिंग संस्कृति फ्लास्क अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से पृथक एस्ट्रोसाइट्स के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन रीढ़ की हड्डी से पृथक एस्ट्रोसाइट्स के लिए एक बेहतर सब्सट्रेट प्रदान करता है।
  11. संगम (80% -90%) तक लगभग 7 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाएं। यदि कोशिकाएं 7 दिनों के बाद संगम नहीं करती हैं, तो उन्हें चढ़ाने से पहले 10 दिनों तक प्रतीक्षा करें। 10 दिनों के बाद, कोशिकाएं अब और नहीं फैलती हैं, और रीप्रोग्रामिंग दक्षता में गिरावट आती है।

5. रीप्रोग्रामिंग के लिए एस्ट्रोसाइट्स का बीजारोपण

नोट: सुरक्षा स्तर 1 (एसएल 1) के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जाना है।

  1. पॉली-डी-लाइसिन लेपित ग्लास कवरलिप्स के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें, उसी तरह संस्कृति फ्लास्क पहले तैयार किए गए थे। आवश्यक प्लेटों की संख्या निर्धारित करने के लिए, विचार करें कि एस्ट्रोसाइट्स24-अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 5-5.5 x 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया जाता है। आमतौर पर, पी 2 चूहों से छह रीढ़ की हड्डी को अलग करने से लगभग 1 x 106 कोशिकाएं पैदा होती हैं।
  2. सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स युक्त टी 25 संस्कृति फ्लास्क से एस्पिरेट मीडिया और 1 एक्स पीबीएस के साथ एक बार धो लें। ईडीटीए के 0.5 एमएल जोड़कर संस्कृति फ्लास्क से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। संस्कृति फ्लास्क सतह से कोशिकाओं को छोड़ने के लिए धीरे-धीरे फ्लास्क के किनारे टैप करें और 10 एक्स आवर्धन का उपयोग करके ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत टुकड़ी की जांच करें।
  3. एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम के 2.5 एमएल के साथ ट्रिप्सिनाइजेशन बंद करें और 15 एमएल ट्यूबों में सेल निलंबन एकत्र करें। एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में 5 मिनट, एस्पिरेट सतह पर तैरनेवाला, और पुन: निलंबित कोशिकाओं के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। एक हीमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें।
  4. कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, एमएल प्रति 1-1.1 x 105 कोशिकाओं का समाधान प्राप्त करने के लिए ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम के साथ सेल निलंबन को पतला करें। प्रति कारक 10 एनजी / एमएल पर ईजीएफ और बीएफजीएफ के साथ माध्यम को पूरक करें। सेल निलंबन के 500 μL जोड़ें, 5-5.5 x 104 कोशिकाओं के बराबर, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर पहले से तैयार 24-अच्छी तरह से प्लेटों और संस्कृति कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं के लिए।

6. प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति

नोट: प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले, प्रयोग को ठीक से डिजाइन करना आवश्यक है। विशेष रूप से, हमेशा रिप्रोग्रामिंग के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है, अर्थात् एक ऐसी स्थिति जहां कोई रीप्रोग्रामिंग कारक व्यक्त नहीं किया जाता है। उदाहरण के लिए, जब रीप्रोग्रामिंग कारक और एक रिपोर्टर (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), डीएसरेड) के लिए सीडीएनए ले जाने वाले वैक्टर का उपयोग करते हैं, तो नकारात्मक नियंत्रण को केवल रिपोर्टर ले जाने वाले एक ही वेक्टर द्वारा दर्शाया जाता है। विभिन्न संवाददाताओं को ले जाने वाले कई कारकों को व्यक्त करते समय, नकारात्मक नियंत्रण को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

  1. चढ़ाना के एक दिन बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेटों का निरीक्षण करें कि कोशिकाओं ने कवरलिप्स का पालन किया है।
  2. प्रयोगात्मक उद्देश्य और उपलब्ध संसाधनों के आधार पर, रीप्रोग्रामिंग कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति वायरल पारगमन (चरण 6.3 देखें) या डीएनए अभिकर्मक (चरण 6.4 देखें) द्वारा प्राप्त की जा सकती है।
    नोट: रेट्रोवायरस या लेंटिवायरस के उपयोग के लिए सरकारी अधिकारियों की मंजूरी की आवश्यकता होती है और सुरक्षा स्तर 2 (एसएल 2) के साथ एक प्रयोगशाला के भीतर जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए।
  3. नीचे वर्णित ब्याज के रिप्रोग्रामिंग कारक (कारकों) को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक जानकारी ले जाने वाले रेट्रोवायरस या लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करके एस्ट्रोसाइट्स को पुन: प्रोग्राम करें।
    1. एस्ट्रोसाइट माध्यम में सीधे सेल निलंबन के 1 μL जोड़कर1 x 10 10-1 x 10 12 कणों / एमएल के उच्च वायरस टिटर के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। यह उच्च संक्रमण दर सुनिश्चित करता है। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर धारा 7 या धारा 8 के साथ आगे बढ़ने से पहले 24-36 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वायरल कणों वाले एस्ट्रोसाइट माध्यम के साथ कोशिकाओं की संस्कृति।
      नोट: ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए विभिन्न प्रमोटरों का उपयोग किया जा सकता है (प्रतिनिधि परिणाम भी देखें)। संवैधानिक प्रमोटर (जैसे, सीएमवी, सीएजी) प्रेरक प्रमोटरों की तुलना में पहले ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं; हालाँकि, दोनों प्रकार के प्रमोटर प्रकारों का सफलतापूर्वक न्यूरॉन्स में कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के लिए उपयोग किया गया है।
  4. डीएनए प्लास्मिड को डीएनए अभिकर्मक के माध्यम से एस्ट्रोसाइट्स में भी पेश किया जा सकता है जैसा कि नीचे वर्णित है।
    नोट: यह एसएल 1 के लिए अनुमोदित जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया जा सकता है।
    1. अभिकर्मक से पहले, अभिकर्मक अभिकर्मक, वांछित निर्माणों का एक प्लास्मिड डीएनए, ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम और सीरम-कम माध्यम प्राप्त करें (सामग्री की तालिका देखें)। सीरम-कम माध्यम की आवश्यक मात्रा की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें) इस बात पर विचार करके कि 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को सीरम-कम माध्यम के 300 μL की आवश्यकता होती है। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सीरम कम माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. जब सीरम-कम माध्यम गर्म होता है, तो सभी कुओं से एस्पिरेट एस्ट्रोसाइट माध्यम और इसे 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। अलग कोशिकाओं को हटाने के लिए 0.45 μM सिरिंज फिल्टर के साथ एकत्रित एस्ट्रोसाइट माध्यम फ़िल्टर करें।
    3. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर एस्ट्रोसाइट माध्यम जोड़ने के लिए पर्याप्त समाधान प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर किए गए माध्यम में ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम की एक समान मात्रा जोड़ें। उपयोग तक इनक्यूबेटर में एस्ट्रोसाइट वातानुकूलित माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें (चरण 6.4.9)।
      नोट: संस्कृति माध्यम का फिर से उपयोग किया जाता है क्योंकि इसमें कई स्रावित कारक होते हैं जो संस्कृति की व्यवहार्यता का समर्थन करते हैं।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व गर्म सीरम कम माध्यम के 300 μL जोड़ें और इनक्यूबेटर के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेट वापस जगह है।
    5. डीएनए और सीरम-कम माध्यम से मिलकर समाधान ए तैयार करें। प्रत्येक कुएं के लिए, डीएनए के कुल 0.6 μg का उपयोग करें और इसे सीरम-कम माध्यम के 50 μL में जोड़ें। उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर समाधान ए स्टोर करें।
      नोट: आमतौर पर, प्रति स्थिति एक तकनीकी ट्रिप्लिकेट माना जाता है। इसलिए, 3.5 प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त मिश्रण तैयार किया जाता है (उदाहरण के लिए, सीरम-कम माध्यम के 175 μL में पतला कुल डीएनए का 2.1 μg) ताकि 24-अच्छी तरह से प्लेट के तीन कुओं को ट्रांसफेक्ट करने के लिए पर्याप्त सामग्री सुनिश्चित की जा सके।
    6. अभिकर्मक अभिकर्मक और सीरम-कम माध्यम से बना समाधान बी तैयार करें। प्रत्येक कुएं के लिए, अभिकर्मक अभिकर्मक के 0.75 μL को सीरम-कम माध्यम के 50 μL में जोड़ें। चूंकि यह समाधान सभी अभिकर्मक स्थितियों के लिए आम है, अभिकर्मकों में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इसे थोक में तैयार करें।
    7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान बी सेते हैं। समाधान में समाधान बी जोड़ें 1: 1 अनुपात में ड्रॉप द्वारा एक बूंद और धीरे से मिश्रण। भंवर मत करो। हुड के तहत कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए समाधान ए + बी सेते हैं।
    8. सभी अभिकर्मक स्थितियों के लिए चरण 6.4.5-6.4.7 दोहराएँ। 20-30 मिनट के बाद, 100 μL की अंतिम मात्रा के लिए ड्रॉप द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से ड्रॉप करने के लिए समाधान ए + बी जोड़ें धीरे प्लेट हिला और कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    9. 4 घंटे के बाद, अभिकर्मक माध्यम को हटा दें और चरण 6.4.3 में तैयार पूर्व-गर्म एस्ट्रोसाइट वातानुकूलित माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर धारा 7 या धारा 8 के साथ आगे बढ़ने से पहले 36-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।

7. एस्ट्रोसाइट्स का रीप्रोग्रामिंग (7 दिन का विश्लेषण)

  1. बुनियादी संस्कृति माध्यम के 49 मिलीलीटर के लिए बी 27-पूरक के 1 एमएल जोड़कर न्यूरोनल भेदभाव माध्यम तैयार करें (चरण 1.4 देखें)। 24-48 घंटे के बाद, इस बात पर निर्भर करता है कि कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस या ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है (क्रमशः चरण 6.3 और 6.4 देखें), एस्ट्रोसाइट माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस और 9% सीओ2 पर प्रति न्यूरोनल भेदभाव माध्यम और संस्कृति कोशिकाओं के 1 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    नोट: कोशिकाओं को 5% सीओ2 पर भी रखा जा सकता है यदि कोई 9% सीओ2 इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है। हालांकि, इन स्थितियों के तहत न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग अधिक कुशल है।
  2. वैकल्पिक: रीप्रोग्रामिंग दक्षता बढ़ाने के लिए, एस्ट्रोसाइट माध्यम को भेदभाव माध्यम में बदलते समय फोर्स्कोलिन (30 μM की अंतिम एकाग्रता) और डोरसोमोर्फिन (1 μM की अंतिम एकाग्रता) के साथ न्यूरोनल भेदभाव माध्यम को पूरक करें। फोर्स्कोलिन और डोरसोमोर्फिन के साथ कोशिकाओं का इलाज करने का विकल्प चुनते समय, प्रारंभिक उपचार के 2 दिन बाद डोरसोमोर्फिन की दूसरी खुराक प्रदान करें। इस दूसरे उपचार को सीधे संस्कृति माध्यम में जोड़ें।
  3. न्यूरोनल कोशिकाओं में म्यूरिन एस्ट्रोसाइट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग आमतौर पर माध्यम बदलने के बाद 7 दिनों के भीतर होता है। इसलिए, न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग की दीक्षा के 7 दिन बाद, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को ठीक या इकट्ठा करें।

8. परिपक्व न्यूरॉन्स (दीर्घकालिक संस्कृतियों) में एस्ट्रोसाइट्स का रीप्रोग्रामिंग

  1. बुनियादी संस्कृति माध्यम के 49 मिलीलीटर के लिए बी 27-पूरक के 1 एमएल जोड़कर न्यूरोनल भेदभाव माध्यम तैयार करें (चरण 1.4 देखें)। 24-48 घंटे के बाद, इस बात पर निर्भर करता है कि कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस या ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था (क्रमशः चरण 6.3 और 6.4 देखें), एस्ट्रोसाइट माध्यम को 1 एमएल न्यूरोनल भेदभाव माध्यम के साथ बदलें फोर्स्कोलिन (30 μM की अंतिम एकाग्रता) और डोरसोमोर्फिन (1 μM की अंतिम एकाग्रता) प्रति अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस और 9% सीओ2 पर संस्कृति कोशिकाएं।
    नोट: कोशिकाओं को 5% सीओ2 पर भी रखा जा सकता है यदि कोई 9% सीओ2 इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है। हालांकि, इन स्थितियों के तहत न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग अधिक कुशल है।
  2. प्रारंभिक उपचार के 2 दिन बाद इसे सीधे न्यूरोनल भेदभाव माध्यम में जोड़कर डोरसोमोर्फिन उपचार दोहराएं।
  3. न्यूरोनल रीप्रोग्रामिंग की शुरुआत से 7 दिनों के बाद, एन 2 के 6 μL, NT3 के 1.2 μL (स्टॉक 20 μg / एमएल), बीडीएनएफ के 1.2 μL (स्टॉक 20 μg / एमएल), जीडीएनएफ के 1.2 μL (स्टॉक 20 μg / एमएल), और 1.2 μL cAMP (स्टॉक 100 एमएम) को जोड़कर परिपक्वता माध्यम तैयार करें। परिपक्वता माध्यम के 200 μL के साथ प्रत्येक कुएं में मौजूद पूरक न्यूरोनल भेदभाव माध्यम।
    नोट: परिपक्वता माध्यम केवल पहले उपचार के लिए पूरक है। बाद के सभी उपचार आंशिक रूप से न्यूरोनल भेदभाव माध्यम को बदलकर किए जाते हैं जैसा कि नीचे वर्णित है।
  4. न्यूरोनल भेदभाव माध्यम के 200 μL को हटाकर और 6 सप्ताह तक सप्ताह में दो बार ताजा परिपक्वता माध्यम के 200 μL जोड़कर छोटे अणुओं के साथ उपचार दोहराएं। परिपक्वता के दौरान, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों (आमतौर पर, दिन 21 या बाद में) के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस) के लिए ठीक करें।

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Representative Results

एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियां आमतौर पर मैक-सॉर्टिंग और चढ़ाना (चित्रा 1 बी) के बाद 7 से 10 दिनों के बीच 80% -90% संगम तक पहुंचती हैं। आम तौर पर, एक एकल टी 25 संस्कृति फ्लास्क 1-1.5 x 106 कोशिकाओं के आसपास पैदावार करता है, जो 5-5.5 x 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को बोने पर 20-30 कवरलिप्सके लिए पर्याप्त है। चढ़ाना के बाद दिन, कोशिकाएं आमतौर पर कवरस्लिप सतह (चित्रा 1 सी) के 50% -60% को कवर करती हैं। इस स्तर पर, संस्कृतियों में लगभग विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स होते हैं, जबकि अन्य सेल प्रकार, जैसे न्यूरोब्लास्ट, लगभग अनुपस्थित होते हैं (चित्रा 1 डी)29।

रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से या डीएनए प्लास्मिड के अभिकर्मक के माध्यम से एस्ट्रोसाइट्स को रीप्रोग्रामिंग कारकों को वितरित किया जा सकता है। आमतौर पर, वायरल ट्रांसडक्शन अभिकर्मक की तुलना में अधिक कोशिकाओं को संक्रमित करता है। चूंकि प्रत्यक्ष न्यूरोनल रूपांतरण पर्याप्त मात्रा में कोशिका मृत्यु34,35 का कारण बनता है, विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल पारगमन को प्राथमिकता दी जाती है। विभिन्न प्रमोटरों का उपयोग रीप्रोग्रामिंग कारकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है: संवैधानिक (जैसे, सीएमवी, सीएजी) 15,32, प्रेरक (जैसे, टेट-उत्तरदायी तत्व, टेट-ऑन)21, या सेल प्रकार विशिष्ट (जैसे, जीएफएपी प्रमोटर)36,37। संवैधानिक या सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करते समय, एस्ट्रोसाइट्स ट्रांसजीन के पता लगाने योग्य स्तरों को व्यक्त करना शुरू कर देते हैं, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति (जैसे, जीएफपी, डीएसआरईडी) द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, जीन डिलीवरी के बाद 24 घंटे के भीतर, प्रत्येक सेल दूसरों के लिए स्वतंत्र होता है। इसके विपरीत, प्रेरक प्रमोटर ट्रांसड्यूड कोशिकाओं में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति को सिंक्रनाइज़ करने की अनुमति देते हैं, क्योंकि वे संस्कृति माध्यम में एक छोटे अणु (जैसे, डॉक्सीसाइक्लिन) के अलावा सक्रिय होते हैं। प्रतिलेखन कारकों का पता लगाने योग्य स्तर आमतौर पर प्रमोटर के सक्रियण के बाद 18-20 घंटे तक पहुंच जाते हैं। ज्यादातर मामलों में, रिप्रोग्रामिंग कारक अभिव्यक्ति का शिखर लगभग 48 घंटे तक पहुंच जाता है, जिसमें लेंटीवायरस-मध्यस्थता अभिव्यक्ति में थोड़ा अधिक समय लगता है।

जबकि रिप्रोग्रामिंग कारकों की अभिव्यक्ति के बाद ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों को 4 घंटे 32 के रूप में पता लगाया जा सकता है,24 घंटे और बाद में29,32 के बाद मजबूत परिवर्तन होते हैं। रूपात्मक परिवर्तन ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का पालन करते हैं, और रूपांतरण के पहले संकेत 3 दिनों के बाद पारगमन / अभिकर्मक (3 डीपीटी) के आसपास देखे जा सकते हैं। 7 डीपीटी पर, प्रेरित न्यूरोनल कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स से स्पष्ट रूप से अलग होती हैं: उनका सोमा नियंत्रण या अन-रिप्रोग्राम्ड एस्ट्रोसाइट्स से छोटा होता है, उनके पास लंबी प्रक्रियाएं होती हैं, और वे न्यूरोनल मार्कर βIII-टब के लिए सकारात्मक होते हैं और एस्ट्रोसाइट मार्कर जीएफएपी (चित्रा 1 ई) के लिए नकारात्मक होते हैं। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि कुछ कोशिकाएं या तो जीएफएपी और βIII-टब दोनों के लिए सकारात्मक हो सकती हैं, यह सुझाव देते हुए कि न्यूरोनल प्रोग्राम को प्रेरित किया गया है, लेकिन एस्ट्रोसाइट पहचान को बाधित नहीं किया गया है, या दोनों मार्करों के लिए नकारात्मक है, जो एस्ट्रोसाइट पहचान के दमन का संकेत देता है लेकिन न्यूरोनल कैस्केड के प्रेरण की अनुपस्थिति है। किसी भी मामले में, कोशिकाएं आमतौर पर एक एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान बनाए रखती हैं।

अधिक कार्यात्मक विश्लेषण के लिए, जैसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या उत्पन्न न्यूरोनल उपप्रकारों का मूल्यांकन, संस्कृतियों को आमतौर पर न्यूनतम 21 डीपीटी के लिए बनाए रखा जाता है और परिपक्वता माध्यम के साथ इलाज किया जाता है। 21 डीपीटी पर, कई प्रेरित न्यूरॉन्स एक्शन पोटेंशिअल फायरिंग करने में सक्षम हैं और परिपक्व न्यूरोनल मार्कर न्यूएन के साथ-साथ पैन-सिनैप्टिक प्रोटीन सिनैप्टोफिसिन29 (चित्रा 1 एफ) के लिए सकारात्मक हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एस्ट्रोसाइट संस्कृति और रीप्रोग्रामिंग का अवलोकन( ए) एस्ट्रोसाइट-टू-न्यूरॉन प्रत्यक्ष रूपांतरण की समयरेखा। प्रत्येक काली रेखा प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है। (बी) संस्कृति में 7 दिनों के बाद सुसंस्कृत रीढ़ की हड्डी-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। तस्वीरें एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप और 10x उद्देश्य का उपयोग करके ली गई थीं। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है (सी) रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट्स के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों 1 दिन बाद24-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 5.5 x 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर फिर से चढ़ाना। छवियों को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप और 10x उद्देश्य का उपयोग करके लिया गया था। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है (डी) संस्कृति शुद्धता का प्रदर्शन करने के लिए चढ़ाना के 1 दिन बाद तय किए गए एस्ट्रोसाइट्स पर एक βIII-टब, सोक्स 9, जीएफएपी ट्रिपल धुंधला की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और 1x पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था। कोशिकाओं को 1x पीबीएस समाधान में 3% बीएसए, 0.5% ट्राइटन-एक्स 100 का उपयोग करके अवरुद्ध किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी को उचित एकाग्रता पर पतला किया गया था (उदाहरण के लिए, एंटी-जीएफएपी 1:250; एंटी-βIII-टब 1:250; एंटी-सिप 1 1:500) अवरुद्ध समाधान में और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। माउंट के साथ बढ़ते से पहले कवरलिप्स को 1 एक्स पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था। छवियों को एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और 40x उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (E) βIII-टब की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि, 7 डीपीटी के बाद एएससीएल 1 के साथ न्यूरॉन रूपांतरण के लिए एस्ट्रोसाइट प्रदर्शित करने के लिए डीएसरेड डबल धुंधला। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि अधिग्रहण का प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित था। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है (F) एएससीएल 1 के साथ रीप्रोग्रामिंग के 21 डीपीटी के बाद न्यूरोनल परिपक्वता प्रदर्शित करने के लिए एक βIII-टब, डीएसरेड, सिनैप्टोफिसिन 1 (सिप 1) ट्रिपल धुंधला की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि अधिग्रहण का प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित था। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

म्यूरिन एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृतियां प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल सिस्टम में एक उल्लेखनीय हैं। वास्तव में, प्रसवोत्तर चरण में पृथक होने के बावजूद, कोशिकाएं विशिष्ट एस्ट्रोसाइट मार्कर29 व्यक्त करती हैं, पैटर्निंग जीन28,29 की अभिव्यक्ति को बनाए रखती हैं, और38 वर्ष की तुलनीय आयु में विवो एस्ट्रोसाइट्स के समान प्रसार करने की क्षमता बनाए रखती हैं। एमएसीएस-मध्यस्थता अलगाव के बाद, कोशिकाएं पहले फ्लास्क का पालन करती हैं और फिर प्रसार करना शुरू कर देती हैं, जिससे अत्यधिक समृद्ध एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों को जन्म मिलताहै 29. महत्वपूर्ण रूप से, सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स एक मल्टीपोटेंट सेल राज्य में विघटित नहीं होते हैं और न ही अमर हो जाते हैं। इसके अलावा, वे एक रिपोर्टर प्रोटीन (जैसे, डीएसरेड या जीएफपी) की अभिव्यक्ति के बाद अनायास न्यूरॉन्स उत्पन्न नहीं करते हैं, लेकिन एक एस्ट्रोसाइट पहचान बनाए रखते हैं। इसके अलावा, वे अनिश्चित काल तक प्रसार नहीं करते हैं, बल्कि उनके प्रसार और संक्रमण को अधिक परिपक्व चरण में धीमा कर देते हैं, जो उनकी प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग क्षमता32,39 को कम करता है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: सबसे पहले, ब्याज के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक अलग करना और किसी भी दूषित ऊतकों को हटाना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट्स तैयार करने के लिए, रीढ़ की हड्डी को कशेरुकाओं से निकाला जाता है और पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है। दूसरा, परिवर्तित कोशिकाएं महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु34 से गुजरती हैं, जिसका आसपास के एस्ट्रोसाइट्स द्वारा फागोसाइटोसिस की उत्तेजना के साथ-साथ परिवर्तित मीडिया परासरण के कारण ट्रांसड्यूड कोशिकाओं और समग्र संस्कृति पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। इसलिए, भेदभाव माध्यम की पर्याप्त मात्रा के साथ एस्ट्रोसाइट माध्यम को बदलना महत्वपूर्ण है (आमतौर पर 24-अच्छी तरह से प्लेट का 1 एमएल / इसके अतिरिक्त, प्लास्मिड डीएनए का अभिकर्मक वायरल पारगमन की तुलना में एक आसान और अधिक सुलभ दृष्टिकोण है, जिसके लिए अनुमोदित सुरक्षा स्तर 2 सेल संस्कृति कक्ष की आवश्यकता होती है। हालांकि, अभिकर्मक दर और रिप्रोग्रामिंग दक्षता रिप्रोग्रामिंग कारकों के वायरल-मध्यस्थता वितरण की तुलना में कम है। इसलिए, अभिकर्मक का उपयोग नए उम्मीदवार रीप्रोग्रामिंग कारकों की रीप्रोग्रामिंग क्षमता का परीक्षण करने या कारकों के पूल को स्क्रीन करने के लिए एक तेज़ विधि के रूप में किया जा सकता है। न्यूरोनल परिपक्वता के बारे में, पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाएं आमतौर पर लगभग 3 सप्ताह में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रूप से सक्रिय हो जाती हैं। यद्यपि आवश्यक नहीं है, छोटे अणुओं के साथ कोशिकाओं का इलाज करने से जीवित रहने के साथ-साथ पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं की परिपक्वता दोनों बढ़ जाती है, जिससे प्रेरित न्यूरॉन्स का उच्च घनत्व और अधिक परिपक्व आकृति विज्ञान होता है।

यद्यपि एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने और संस्कृति करने के लिए वर्णित विधि मजबूत और विश्वसनीय है, लेकिन कुछ पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, जबकि ऊतक के यांत्रिक पृथक्करण के आधार पर पारंपरिक तरीके प्रति ऊतक विच्छेदित40 संस्कृति में कोशिकाओं की एक समग्र उच्च संख्या पैदा करते हैं, एक मैक-सॉर्ट किए गए दृष्टिकोण को बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को अलग करने के लिए छह से आठ पिल्ले तक ऊतक के विच्छेदन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स का अलगाव एंटीबॉडी एसीएसए -241 द्वारा मान्यता प्राप्त एटीपेस ना +/के + ट्रांसपोर्टिंग सबयूनिट बीटा 2 प्रोटीन (एटीपी 1 बी 2) की अभिव्यक्ति पर आधारित है। सिद्धांत रूप में, एटीपी 1 बी 2 को व्यक्त नहीं करने वाले एस्ट्रोसाइट्स तैयारी में खो जाएंगे, इसलिए तैयारी में पूर्वाग्रह पैदा होगा। यद्यपि हम बाहर नहीं कर सकते कि यह मामला है, एमएसीएस प्रवाह-थ्रू के हमारे विश्लेषण से पता चला है कि नकारात्मक अंश में कुछ कोशिकाएं एस्ट्रोग्लिया मार्कर सोक्स 9 के लिए प्रतिरक्षात्मक थीं, जो मैक-सॉर्टिंग प्रोटोकॉल की उच्च दक्षता का सुझाव देती हैं। एटीपी 1 बी 2 के बारे में एक दूसरी चेतावनी इसकी अभिव्यक्ति से संबंधित है। एटीपी 1 बी 2 विशेष रूप से प्रसवोत्तर चरण में एस्ट्रोसाइट्स द्वारा व्यक्त किया जाता है, जबकि माउस वयस्क मस्तिष्क में अन्य कोशिका प्रकार इसे व्यक्त करते हैं, विशेष रूप से माइलिनेटिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और एपेंडिमल कोशिकाएं27. इसलिए, वयस्क दिमाग से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए ब्याज के क्षेत्र और माइलिन हटाने के कदम का सावधानीपूर्वक विच्छेदन आवश्यक है।

एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, एमएसीएस-आधारित दृष्टिकोण संस्कृतियों की उच्च शुद्धता (सोक्स 9 + कोशिकाओं का >90%) सुनिश्चित करता है और सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों से एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करता है। विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों से संस्कृतियों की तुलना करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि शास्त्रीय यांत्रिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त संस्कृति शुद्धता उल्लेखनीय रूप से भिन्न हो सकती है (>80% जीएफएपी +/ डीएपीआई कॉर्टिकल ग्रे पदार्थ से, ~ 50% जीएफएपी +/ एक मानकीकृत प्रोटोकॉल इस तरह की परिवर्तनशीलता को कम करता है और इन विट्रो रिप्रोग्रामिंग प्रयोगों के लिए एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, यह विभिन्न क्षेत्रों28,29 से एस्ट्रोसाइट्स की आणविक पहचान की व्यवस्थित रूप से तुलना करने और रिप्रोग्रामिंग दक्षता और प्रेरित न्यूरॉन्स की उपप्रकार पहचान पर विकासात्मक उत्पत्ति के प्रभाव की जांच करने की अनुमति देता है।

संक्षेप में, एस्ट्रोसाइट्स की अनुकूलित संस्कृतियों के इन विट्रो डायरेक्ट न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग एस्ट्रोसाइट-टू-न्यूरॉन रूपांतरण के सार्वभौमिक और क्षेत्र-विशिष्ट आणविक तंत्र को उजागर करने के लिए एक बहुत ही शक्तिशाली दृष्टिकोण है, जो निवासी सीएनएस एस्ट्रोसाइट्स के विवो प्रत्यक्ष रूपांतरण के लिए बेहतर और अधिक प्रभावी रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम रिप्रोग्रामिंग के लिए निर्माणों की क्लोनिंग के लिए इनेस मुहल्हान, वायरल उत्पादन के लिए पॉलिना क्लेबिक और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए मैग्डेलेना गोट्ज़ और जूडिथ फिशर-स्टर्नजैक को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300054
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) Sigma-Aldrich D9564
anti-mouse IgG1 Alexa 647 Thermo Fisher A21240
anti-Mouse IgG1 Biotin Southernbiotech Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-mouse IgG2b Alexa 488 Thermo Fisher A21121
anti-rabbit Alexa 546 Thermo Fisher A11010
Aqua Poly/Mount Polysciences Cat# 18606-20
B27 Supplement Life Technologies 17504044
BDNF Peprotech 450-02
bFGF Life Technologies 13256029
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich Cat# A9418
cAMP Sigma Aldrich D0260
C-Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
DMEM/F12 Life Technologies 21331020
Dorsomorphin Sigma Aldrich P5499
EGF Life Technologies PHG0311
Fetal Bovine Serum PAN Biotech P30-3302
Forskolin Sigma Aldrich F6886
GDNF Peprotech 450-10
gentleMACS Octo Dissociator Miltenyi Biotec 130-096-427
GFAP Dako Cat# Z0334; RRID: AB_100013482
Glucose Sigma Aldrich G8769
GlutaMax Life Technologies 35050038
HBSS Life Technologies 14025050
Hepes Life Technologies 15630056
Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) Thermo Fisher Cat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µm Miltenyi Biotec 130-098-462
MiniMACS Seperator Miltenyi Biotec 130-042-102
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit  Miltenyi Biotec 130-097-678
Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 Synaptic Systems Cat# 101 011 RRID:AB_887824)
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) Sigma Aldrich T8660
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
N2 Supplement Life Technologies 17502048
Neural Tissue Dissociation Kit  Miltenyi Biotec 130-092-628
NT3 Peprotech 450-03
octoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) Thermo Fisher Cat# 51985-026
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P1149
Rabbit anti-RFP Rockland Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Rabbit anti-Sox9 Sigma-Aldrich Cat# AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405 Thermo Fisher Cat# S32351
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T9284

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 185
माउस एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव और प्रत्यक्ष न्यूरोनल रिप्रोग्रामिंग
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Hersbach, B. A., Simon, T.,… More

Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes. J. Vis. Exp. (185), e64175, doi:10.3791/64175 (2022).

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