Summary
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.
Abstract
A reprogramação neuronal direta é uma abordagem poderosa para gerar neurônios funcionais de diferentes populações de células iniciantes sem passar por intermediários multipotentes. Essa técnica não só mantém grandes promessas no campo da modelagem da doença, como permite converter, por exemplo, fibroblastos para pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas em neurônios, mas também representa uma alternativa promissora para terapias de substituição baseadas em células. Nesse contexto, um grande avanço científico foi a demonstração de que células não neurais diferenciadas dentro do sistema nervoso central, como os astrócitos, poderiam ser convertidas em neurônios funcionais in vitro. Desde então, a reprogramação direta in vitro de astrócitos em neurônios forneceu insights substanciais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à conversão de identidade forçada e os obstáculos que impedem a reprogramação eficiente. No entanto, os resultados de experimentos in vitro realizados em diferentes laboratórios são difíceis de comparar devido a diferenças nos métodos utilizados para isolar, cultura e reprogramar astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultivar astrócitos com alta pureza de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos em idades pós-natal através da triagem de células magnéticas. Além disso, fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos cultivados em neurônios via transdução viral ou transfecção de DNA. Este protocolo simplificado e padronizado pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à manutenção da identidade celular, o estabelecimento de uma nova identidade neuronal, bem como a geração de subtipos neuronais específicos e suas propriedades funcionais.
Introduction
O sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) é altamente complexo, consistindo de centenas de tipos de células diferentes, incluindo um grande número de diferentes subtipos neuronais 1,2,3,4,5,6. Ao contrário de outros órgãos ou tecidos 7,8,9, o CNS mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada; a perda neuronal após lesão cerebral traumática ou neurodegeneração é irreversível e muitas vezes resulta em déficits motores e cognitivos10. Com o objetivo de resgatar funções cerebrais, diferentes estratégias para substituir neurônios perdidos estão sob intensa investigação11. Entre eles, a reprogramação direta de células somáticas em neurônios funcionais está emergindo como uma abordagem terapêutica promissora12. Reprogramação direta, ou transdiferenciação, é o processo de conversão de um tipo de célula diferenciada em uma nova identidade sem passar por um estado de proliferação intermediária ou pluripotente 13,14,15,16. Pioneiro pela identificação do MyoD1 como fator suficiente para converter fibroblastos em células musculares17,18, este método foi aplicado com sucesso para reprogramar vários tipos celulares em neurônios funcionais 19,20,21.
Os astrócitos, a macroglia mais abundante no CNS22,23, são um tipo celular particularmente promissor para reprogramação neuronal direta por várias razões. Em primeiro lugar, eles são amplamente e uniformemente distribuídos através do CNS, fornecendo uma abundante fonte in loco para novos neurônios. Em segundo lugar, os astrócitos e os neurônios estão intimamente relacionados, pois compartilham um ancestral comum durante o desenvolvimento embrionário, as células gliaisradiais 24. A origem embrionária comum dos dois tipos de células parece facilitar a conversão neuronal em comparação com a reprogramação de células de diferentes camadas germinativas19,21. Além disso, a padronização das informações herdadas pelos astrócitos através de sua origem radial glia também é mantida em astrócitos adultos 25,26,27, e parece contribuir para a geração de subtipos neuronais regionalmente apropriados 28,29,30. Assim, investigar e entender a conversão de astrócitos em neurônios é uma parte importante para alcançar todo o potencial dessa técnica para estratégias de substituição baseadas em células.
A conversão de astrócitos in vitro cultivados em neurônios levou a vários avanços no campo da reprogramação neuronal direta, incluindo: i) a identificação de fatores de transcrição suficientes para gerar neurônios a partir de astrócitos 15,19,31, ii) o desenrolar de mecanismos moleculares desencadeados por diferentes fatores de reprogramação no mesmo contexto celular 32 , e iii) destacando o impacto da origem do desenvolvimento dos astrócitos na indução de diferentes subtipos neuronais 28,29,33. Além disso, a conversão direta in vitro de astrócitos desvendou vários obstáculos importantes que limitam a reprogramação neuronal direta34,35, como o aumento da produção de oxigênio reativo (ROS)34 e diferenças entre o proteome mitocondrial de astrócitos e neurônios35. Assim, essas observações apoiam fortemente o uso de culturas primárias de astrócitos como modelo de reprogramação neuronal direta para investigar várias questões fundamentais na biologia12, relacionadas à manutenção da identidade celular, bloqueios nas estradas que impedem mudanças no destino celular, bem como o papel do metabolismo na reprogramação.
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para isolar os astrócitos de camundongos na idade pós-natal (P) com pureza muito alta, como demonstrado pela isolação de astrócitos da medula espinhal murina29. Também fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos em neurônios via transdução viral ou transfecção plasmida de DNA. As células reprogramadas podem ser analisadas em 7 dias após a transdução (7 DPT) para avaliar vários aspectos, como eficiência de reprogramação e morfologia neuronal, ou podem ser mantidas na cultura por várias semanas, para avaliar seu amadurecimento ao longo do tempo. É importante ressaltar que este protocolo não é específico para astrócitos da medula espinhal e pode ser facilmente aplicado para isolar astrócitos de várias outras regiões cerebrais, incluindo a matéria cinzenta cortical, o cérebro médio e o cerebelo.
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Protocol
O procedimento a seguir segue as diretrizes de cuidados com animais do Helmholtz Zentrum Munique de acordo com a diretiva 2010/63/UE sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos. Certifique-se de cumprir as diretrizes de cuidado animal da instituição onde a dissecação é realizada.
1. Preparação de dissecção, dissociação e materiais culturais
NOTA: Prepare todos os reagentes de cultura dentro de um armário de segurança biológica e trabalhe usando apenas equipamentos autoclavados ou estéreis. Reagentes de dissecção e dissociação podem ser preparados fora de um gabinete de segurança biológica.
- Prepare frascos de cultura revestindo um frasco de cultura T25 com poli-D-lysine (estoque 1 mg/mL; solução de trabalho 20 μg/mL) em H2O por um mínimo de 2h. Depois, enxágue 3x com H2O e ar seco.
- Prepare o buffer de dissecção adicionando 5 mL de solução tampão HEPES de 1 M HEPES a 500 mL da solução de sal balanceada (HBSS) da Hank.
- Prepare um tubo C (ver Tabela de Materiais) por seis medulas espinhais adicionando 1950 μL de tampão X do kit de dissociação do tecido neural (ver Tabela de Materiais). Guarde gelo durante a dissecção. Prepare a mistura mestre de digestão enzimática adicionando 20 μL de tampão Y e 10 μL de tampão A por tubo C (parte do kit de dissociação do tecido neural; ver Tabela de Materiais). Misture bem e armazene a 4 °C até que seja necessário.
- Prepare 1x salina tamponada de fosfato (1x PBS) com cálcio e magnésio e coloque no gelo. Prepare o meio de cultura básica adicionando 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final, 100 U/mL), 5 mL de 45% D-glicose e 5 mL de suplemento de glutamina (concentração final 2 mM; ver Tabela de Materiais) a 485 mL de DMEM/F12. O meio básico fica estável a 4 °C durante 4 semanas.
- Prepare o meio de cultura astrócito adicionando 1 mL de suplemento B27 e 5 mL de soro bovino fetal (FBS) a 44 mL de meio de cultura básica. Suplemento médio com fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) (10 ng/mL cada). Adicione EGF e bFGF pouco antes de usar na quantidade adequada de meio.
- Para a dissecção do tecido da medula espinhal, use um par de fórceps grandes com ponta dobrada, um par de fórceps pequenos com ponta dobrada, um par de fórceps pequenos, um par de tesouras pequenas e uma pequena espátula.
2. Isolamento de astrócito
- Isolar astrócitos da medula espinhal de camundongos pós-natais para realizar sua reprogramação direta em neurônios funcionais (Figura 1A). Para este protocolo, colete tecido medular de camundongos no dia 2-3 após o nascimento. Colete de seis a oito medulas espinhais para isolamento de astrócitos. Use este mesmo protocolo para isolar astrócitos de outras regiões do sistema nervoso, como o córtex, o cérebro médio e o cerebelo. Para essas regiões, obtenha células de cinco a sete dias após o nascimento.
NOTA: Ao se ter como objetivo isolar os astrócitos de regiões que não são mencionadas neste protocolo, a idade e o material de entrada devem ser determinados experimentalmente.
3. Dissecção do tecido medular
NOTA: A dissecação do tecido pode ser realizada fora de um armário de segurança biológica.
- Sacrificar ratos em P2-P3 por decapitação sem anestesiar o animal. Coloque o tronco em uma placa de Petri de 35 mm e mantenha no gelo.
- Abra a pele com uma tesoura, remova a vértebra com uma tesoura pequena, extraia a medula espinhal e coloque-a no tampão de dissecção no gelo. Sob um microscópio de dissecção estereotática com ampliação de 2x, remova as meninges das medulas espinhais isoladas usando fórceps e transfira tecido medular dissecado e limpo para um tubo C.
4. Classificação celular ativada magnética (MACS)
- Adicione 50 μL de enzima P do kit de dissociação do tecido neural (ver Tabela de Materiais) e 30 μL de mistura de enzima previamente preparada a cada tubo C. Inverta os tubos C e coloque-os em um dissociador aquecido (ver Tabela de Materiais), certificando-se de que todo o tecido seja coletado na tampa do tubo.
- Execute o programa de dissociação 37_NTDK_1 com um tempo de execução de aproximadamente 22 min. Pouco antes do final do programa, coloque um coador de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um número de tubos de 15 mL iguais ao número de tubos C usados e pré-molhado o coador com 2 mL de PBS gelado. Armazene 1x PBS no gelo durante todo o procedimento macs.
- Após a conclusão do programa, remova os tubos C e centrifuá-los brevemente para coletar o tecido na parte inferior dos tubos. Transfira o tecido dissociado dos tubos C para os tubos de 15 mL preparados passando-o pelo coador. Deixe o filtro em tubos de 15 mL.
- Enxágüe o tubo C com 10 mL de 1x PBS para coletar restos de tecido e colecioná-lo no mesmo tubo de 15 mL passando pelo coador mais uma vez. Centrifugar os tubos de 15 mL contendo tecido dissociado a 300 x g por 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Esfrie a centrífuga até 4 °C após esta etapa. - Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular antes de reutilizar as células em 80 μL de 1x PBS; adicionar 10 μL de reagente de bloqueio do kit de microesfera anti-ACSA-2 do mouse (ver Tabela de Materiais). Misture suavemente por pipetação.
- Incubar a 4 °C por 10 min no escuro (geladeira). Adicione 10 μL de antígenos de superfície anti-astrócitos de superfície de células 2 acoplados (ver Tabela de Materiais) e misture suavemente por pipetação. Incubar por 15 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células adicionando 3 mL de 1x PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C. Enquanto centrifuga, monte um separador magnético (ver Tabela de Materiais) colocando o número apropriado de colunas de triagem magnética (ver Tabela de Materiais) no separador com um tubo de coleta de 15 mL por baixo. Enxágüe as colunas com 500 μL de 1x PBS.
- Remova o supernasciente e resuspense as células em 500 μL de 1x PBS antes de transferir as suspensões celulares para as colunas magnéticas. Deixe drenar pela gravidade. Lave os tubos de 15 mL com 500 μL de PBS 1x e aplique na coluna. Lave as colunas com 500 μL de 1x PBS para mais duas lavagens.
- Células elutes removendo a coluna do separador, adicionando 800 μL de meio de cultura astrócito e empurrando células para fora da coluna com o êmbolo incluído.
- Células de placa nos frascos de cultura previamente preparados adicionando 4,2 mL de cultura de astrócitos complementadas com EGF e bFGF e cultura a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Os frascos de cultura de revestimento não são necessários para astrócitos isolados de outras regiões cerebrais, mas fornecem um melhor substrato para astrócitos isolados da medula espinhal. - Células de cultura por aproximadamente 7 dias até a confluência (80%-90%). Se as células não estiverem confluentes após 7 dias, espere até 10 dias antes de emplacá-las. Após 10 dias, as células não proliferam mais, e a eficiência de reprogramação diminui.
5. Semeadura de astrócitos para reprogramação
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas sob um gabinete de segurança biológica com nível de segurança 1 (SL1).
- Prepare placas de 24 poços com tampas de vidro revestidas de poli-D-lisina da mesma forma que os frascos de cultura foram preparados anteriormente. Para determinar o número de placas necessárias, considere que os astrócitos são banhados a uma densidade de 5-5,5 x 104 células por poço em uma placa de 24 poços. Normalmente, isolar seis medulas espinhais de camundongos P2 produz em torno de 1 x 106 células.
- Aspirar mídia dos frascos da cultura T25 contendo os astrócitos cultivados e lavar uma vez com 1x PBS. Retire os astrócitos do frasco de cultura adicionando 0,5 mL de 0,05% Trypsin/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min. Toque suavemente na lateral do frasco para liberar células da superfície do frasco de cultura e verifique o desprendimento sob um microscópio de campo brilhante usando uma ampliação de 10X.
- Pare a trippsinização com 2,5 mL de cultura astrócito média e colete suspensão celular em tubos de 15 mL. Centrifugar a 300 x g por 5 min, aspirar supernasce, e células resuspend em 1 mL de meio de cultura de astrócito. Calcule a concentração celular usando um hemoocítômetro ou um sistema automatizado de contagem de células.
- Com base no número de células, diluir a suspensão celular com meio de astrócito fresco para obter uma solução de 1-1,1 x 105 células por mL. Suplementar o meio com EGF e bFGF a 10 ng/mL por fator. Adicione 500 μL de suspensão celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada poço das placas de 24 poços previamente preparadas e células de cultura a 37 °C e 5% de CO2.
6. Expressão forçada de fatores de transcrição
NOTA: Antes de prosseguir com o protocolo, é essencial projetar adequadamente o experimento. Em particular, é importante sempre incluir um controle negativo para a reprogramação, ou seja, uma condição em que nenhum fator de reprogramação é expresso. Por exemplo, ao usar vetores que carregam o cDNA para o fator de reprogramação e um repórter (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed), o controle negativo é representado pelo mesmo vetor que carrega apenas o repórter. Ao expressar múltiplos fatores que carregam diferentes repórteres, o controle negativo deve ser ajustado em conformidade.
- No dia seguinte ao revestimento, inspecione as placas de 24 poços para garantir que as células tenham aderido às tampas.
- Com base no objetivo experimental e nos recursos disponíveis, a expressão forçada de fatores de reprogramação pode ser alcançada por transdução viral (ver passo 6.3) ou transfecção de DNA (ver passo 6.4).
NOTA: O uso de retrovírus ou lentivírus requer a aprovação das autoridades governamentais e deve ser realizado sob um gabinete de segurança biológica dentro de um laboratório com nível de segurança 2 (SL2). - Reprograme os astrócitos transduzindo as células com o retrovírus ou lentivírus carregando as informações genéticas para expressar o fator de reprogramação de interesse conforme descrito abaixo.
- Transdutor células com um alto titulante do vírus de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/mL adicionando 1 μL da suspensão celular diretamente ao meio de astrócito. Isso garante uma alta taxa de infecção. Cultue as células com o meio astrócito contendo partículas virais a 37 °C por 24-36 h antes de prosseguir com a seção 7 ou seção 8, dependendo da finalidade do experimento.
NOTA: Diferentes promotores podem ser usados para impulsionar a expressão dos transgenes (ver também Resultados Representativos). Promotores constitutivos (por exemplo, CMV, CAG) induzem a expressão do transgene mais cedo do que os promotores indutíveis; no entanto, ambos os tipos de promotores têm sido usados com sucesso para reprogramar células em neurônios.
- Transdutor células com um alto titulante do vírus de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/mL adicionando 1 μL da suspensão celular diretamente ao meio de astrócito. Isso garante uma alta taxa de infecção. Cultue as células com o meio astrócito contendo partículas virais a 37 °C por 24-36 h antes de prosseguir com a seção 7 ou seção 8, dependendo da finalidade do experimento.
- Plasmídeos de DNA também podem ser introduzidos em astrócitos através de transfecção de DNA como descrito abaixo.
NOTA: Isso pode ser feito sob um gabinete de segurança biológica aprovado para SL1.- Antes da transfecção, obtenha o reagente de transfecção, um DNA plasmídeo dos construtos desejados, meio astrócito fresco e meio reduzido por soro (ver Tabela de Materiais). Calcule a quantidade necessária de meio reduzido por soro (ver Tabela de Materiais) considerando que cada poço de uma placa de 24 poços requer 300 μL de meio reduzido por soro. Adicione a quantidade apropriada de meio reduzido de soro a um tubo de 50 mL e aqueça-o a 37 °C.
- Quando o meio de soro reduzido estiver quente, aspire meio astrócito de todos os poços e colete-o em um tubo de 50 mL. Filtre o meio astrócito coletado com um filtro de seringa de 0,45 μM para remover células separadas.
- Adicione um volume igual de meio de astrócito fresco ao meio filtrado para obter uma solução suficiente para adicionar 1 mL de meio de astrócito por poço. Mantenha o meio condicionado ao astrócito na incubadora a 37 °C até o uso (etapa 6.4.9).
NOTA: O meio de cultura é reutilizado, pois contém vários fatores secretados que suportam a viabilidade da cultura. - Adicione 300 μL de meio pré-aquecido reduzido de soro para cada poço e coloque a placa de 24 poços de volta à incubadora.
- Prepare a solução A, consistindo em DNA e meio reduzido por soro. Para cada poço, use um total de 0,6 μg de DNA e adicione-o a 50 μL de meio reduzido por soro. Armazene a solução A à temperatura ambiente até o uso.
NOTA: Normalmente, considera-se um triplicado técnico por condição. Portanto, é preparado um mix suficiente para a reação de 3,5 (por exemplo, 2,1 μg de DNA total diluído em 175 μL de meio reduzido por soro) para garantir material suficiente para transfectar três poços de uma placa de 24 poços. - Preparar a solução B, composta pelo reagente de transfecção e meio reduzido por soro. Para cada poço, adicione 0,75 μL de reagente de transfecção a 50 μL de meio reduzido por soro. Como esta solução é comum a todas as condições de transfecção, prepare-a a granel para reduzir a variabilidade entre as transfecções.
- Incubar a solução B em temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione a solução B à solução Uma gota a gota a uma proporção de 1:1 e misture suavemente. Não vórtice. Incubar a solução A+B por 20-30 min em temperatura ambiente sob o capô.
- Repita o passo 6.4.5-6.4.7 para todas as condições de transfecção. Depois de 20-30 min, adicione a solução A+B a cada poço gota a gota para um volume final de 100 μL. Agite suavemente a placa e coloque as células de volta na incubadora a 37 °C por 4h.
- Após 4h, retire o meio de transfecção e adicione 1 mL do meio condicionado pré-aquecido preparado na etapa 6.4.3. Mantenha as células por 36-48 h antes de prosseguir com a seção 7 ou seção 8, dependendo da finalidade do experimento.
7. Reprogramação de astrócitos (7 dias de análise)
- Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando 1 mL de suplemento B27 a 49 mL de meio de cultura básica (ver passo 1.4). Após 24-48 h, dependendo se as células foram transduzidas ou transfectadas (ver etapas 6.3 e 6.4, respectivamente), substituir o meio astrócito por 1 mL de meio de diferenciação neuronal por poço e células de cultura a 37 °C e 9% de CO2.
NOTA: As células também podem ser mantidas a 5% de CO2 se não houver incubadora de CO2 de 9%. No entanto, a reprogramação neuronal é mais eficiente nessas condições. - Opcional: Para aumentar a eficiência de reprogramação, suplementar o meio de diferenciação neuronal com Forskolin (concentração final de 30 μM) e Dorsomorphin (concentração final de 1 μM) ao substituir o meio de astrócito para o meio de diferenciação. Ao optar por tratar células com Forskolin e Dorsomorphin, forneça uma segunda dose de Dorsomorphin 2 dias após o tratamento inicial. Adicione este segundo tratamento diretamente ao meio da cultura.
- A reprogramação direta de astrócitos murinos em células neuronais normalmente ocorre dentro de 7 dias após a mudança do meio. Assim, 7 dias após o início da reprogramação neuronal, fixar ou coletar células para análise a jusante.
8. Reprogramação de astrócitos em neurônios maduros (culturas de longo prazo)
- Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando 1 mL de suplemento B27 a 49 mL de meio de cultura básica (ver passo 1.4). Depois das 24-48 h, dependendo se as células foram transduzidas ou transfeinadas (ver etapas 6.3 e 6.4, respectivamente), substituir o meio astrócito por 1 mL de diferenciação neuronal complementada com Forskolin (concentração final de 30 μM) e Dorsomorphin (concentração final de 1 μM) por bem e células de cultura a 37 °C e 9% CO2.
NOTA: As células também podem ser mantidas a 5% de CO2 se não houver incubadora de CO2 de 9%. No entanto, a reprogramação neuronal é mais eficiente nessas condições. - Repita o tratamento de Dorsomorphin 2 dias após o tratamento inicial adicionando-o diretamente ao meio de diferenciação neuronal.
- Após 7 dias do início da reprogramação neuronal, prepare o meio de maturação adicionando 6 μL de N2, 1,2 μL de NT3 (estoque 20 μg/mL), 1,2 μL de BDNF (estoque 20 μg/mL), 1,2 μL de GDNF (estoque de 20 μg/mL) e 1,2 μL de cAMP (estoque de 100 mM) a 189,2 μL de meio de diferenciação neuronal. Suplemento de diferenciação neuronal médio presente em cada poço com 200 μL de meio de maturação.
NOTA: O meio de maturação é suplementado apenas para o primeiro tratamento. Todos os tratamentos subsequentes são feitos substituindo parcialmente o meio de diferenciação neuronal conforme descrito abaixo. - Repita o tratamento com pequenas moléculas removendo 200 μL de meio de diferenciação neuronal e adicionando 200 μL de maturação fresca média duas vezes por semana por até 6 semanas. Durante a maturação, use células para experimentos eletrofisiológicos (tipicamente, no dia 21 ou posterior) ou fixação para análise a jusante (por exemplo, imunofluorescência).
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Representative Results
As culturas primárias dos astrócitos normalmente atingem 80%-90% de confluência entre 7 e 10 dias após a classificação e o revestimento mac (Figura 1B). Geralmente, um único frasco de cultura T25 produz em torno de 1-1,5 x 106 células, o que é suficiente para 20-30 tampas quando as células de semeadura a uma densidade de 5-5,5 x 104 células por poço. No dia seguinte ao revestimento, as células normalmente cobrem 50%-60% da superfície de deslizamento de cobertura (Figura 1C). Nesta fase, as culturas consistem quase exclusivamente de astrócitos, enquanto outros tipos de células, como neuroblastos, estão praticamente ausentes (Figura 1D)29.
Fatores de reprogramação podem ser entregues a astrócitos via transdução retroviral ou lentiviral ou através de transfecção de plasmídeos de DNA. Normalmente, a transdução viral infecta mais células em comparação com a transfecção. Como a conversão neuronal direta causa uma quantidade substancial de morte celular34,35, a transdução retroviral ou lentiviral é preferível maximizar o número de células para análise. Diferentes promotores podem ser usados para controlar a expressão dos fatores de reprogramação: constitutivo (por exemplo, CMV, CAG)15,32, indutível (por exemplo, elementos responsivos de Tet, Tet-ON)21 ou tipo celular específico (por exemplo, promotor GFAP)36,37. Ao usar promotores específicos do tipo constitutivo ou celular, os astrócitos passam a expressar níveis detectáveis dos transgenes, avaliados pela expressão de repórter fluorescente (por exemplo, GFP, DsRed), dentro de 24 horas após a entrega do gene, com cada célula independente das outras. Por outro lado, os promotores indutíveis permitem sincronizar a expressão dos transgênicos através das células transduzidas, pois são ativados após a adição de uma pequena molécula (por exemplo, doxiciclina) ao meio da cultura. Os níveis detectáveis dos fatores de transcrição geralmente são atingidos de 18 a 20 h após a ativação do promotor. Na maioria dos casos, o pico da expressão do fator de reprogramação é alcançado em torno de 48 h, com a expressão mediada por lentivírus demorando um pouco mais.
Enquanto alterações transcricionais após a expressão de fatores de reprogramação podem ser detectadas já em4h32, mudanças robustas ocorrem após 24h eposteriores 29,32. Alterações morfológicas seguem alterações transcricionais, e os primeiros sinais de conversão podem ser observados em torno de 3 dias após a transdução/transfecção (3 DPT). Em 7 DPT, as células neuronais induzidas são claramente distinguíveis dos astrócitos: sua soma é menor que o controle ou os astrócitos não reprogramados, têm processos longos, e são positivas para o marcador neuronal βIII-tub e são negativas para o marcador de astrócito GFAP (Figura 1E). No entanto, vale a pena notar que algumas células podem ser positivas tanto para gfap quanto para βIII-tub, sugerindo que o programa neuronal foi induzido, mas a identidade astrócito não foi inibida, ou negativa para ambos os marcadores, indicando a repressão da identidade astrócito, mas a ausência de indução da cascata neuronal. Em ambos os casos, as células geralmente mantêm uma morfologia astrócito.
Para análises mais funcionais, como eletrofisiologia ou avaliação dos subtipos neuronais gerados, as culturas são geralmente mantidas para um mínimo de 21 DPT e tratadas com meio de maturação. Aos 21 DPT, muitos neurônios induzidos são capazes de disparar potenciais de ação e são positivos para o marcador neuronal maduro NeuN, bem como para a proteína pan-sináptica Sinaptophysin29 (Figura 1F).
Figura 1: Visão geral da cultura astrócito e reprogramação. (A)Linha do tempo de conversão direta de astrócito-neurônio. Cada linha preta representa um passo importante no protocolo. (B) Imagens representativas de brightfield de astrócitos cultivados derivados da medula espinhal após 7 dias na cultura. Fotos foram tiradas usando um microscópio brightfield e objetivo de 10x. Barra de escala representa 100 μm. (C) Imagens representativas de brightfield de astrócitos da medula espinhal 1 dia após replanagem a uma densidade de 5,5 x 104 células por poço em uma placa de 24 poços. As imagens foram tiradas usando um microscópio brightfield e um objetivo de 10x. A barra de escala representa 100 μm. (D) Imagem de imunofluorescência de uma banheira βIII- tub, Sox9, GFAP de coloração tripla em astrócitos fixadas 1 dia após o revestimento para demonstrar pureza cultural. As células foram fixadas em 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lavadas duas vezes com 1x PBS. As células foram bloqueadas utilizando uma solução BSA de 3%, 0,5% Triton-X 100 em 1x PBS. Os anticorpos primários foram diluídos na concentração adequada (por exemplo, anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) na solução de bloqueio e incubados por 2h à temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes com 1x PBS e incubadas com anticorpos secundários conjugados por fluorofora por 1 h à temperatura ambiente. As tampas foram lavadas três vezes com 1x PBS antes da montagem com Aqua Poly/Mount. As imagens foram adquiridas por meio de um microscópio de epifluorescência e um objetivo de 40x. A barra de escala representa 20 μm. (E) Imagem de imunofluorescência de uma banheira βIII, mancha dupla DsRed para demonstrar a conversão de astrócito para neurônio com Ascl1 após 7 DPT. Protocolo de imunofluorescência e aquisição de imagem foi descrito acima. A barra de escala representa 20 μm. (F) Imagens de imunofluorescência de uma banheira βIII, DsRed, Sinaptophysin 1 (Syp1) de coloração tripla para demonstrar a maturidade neuronal após 21 DPT de reprogramação com Ascl1. O protocolo de imunofluorescência e aquisição de imagens foi descrito acima. A barra de escala representa 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Culturas primárias de astrócitos murinos são um notável sistema de modelo in vitro para estudar a reprogramação neuronal direta. De fato, apesar de estarem isoladas em um estágio pós-natal, as células expressam marcadores astrócitos típicos29, retêm a expressão de genes padronizados28,29 e mantêm a capacidade de proliferação, semelhante aos astrócitos in vivo aos38 anos. Após o isolamento mediado pelo MACS, as células primeiro aderem ao frasco e, em seguida, começam a proliferar, dando origem a culturas de astrócito altamente enriquecidas29. É importante ressaltar que os astrócitos cultos não se desdiferem em um estado celular multipotente nem são imortalizados. Além disso, eles não geram neurônios espontaneamente seguindo a expressão de uma proteína repórter (por exemplo, DsRed ou GFP), mas mantêm uma identidade astrócito. Além disso, eles não proliferam indefinidamente, mas retardam sua proliferação e transição para um estágio mais maduro, o que reduz seu potencial de reprogramação neuronal direta 32,39.
Há várias etapas críticas neste protocolo: primeiro, é essencial isolar cuidadosamente a região de interesse e remover quaisquer tecidos contaminantes. Por exemplo, para preparar astrócitos da medula espinhal, a medula espinhal é extraída das vértebras e as gânglios da raiz dorsal (DRG) são cuidadosamente removidas. Em segundo lugar, as células conversores sofrem uma morte celular significativa34, o que tem um impacto negativo sobre as células transduzidas e a cultura geral, devido à estimulação da fagocitose por astrócitos circundantes, bem como a alterou a osmolaridade da mídia. Por isso, é importante substituir o meio astrócito por um volume adequado de meio de diferenciação (geralmente 1 mL/poço de uma placa de 24 poços). Além disso, a transfecção do DNA plasmídeo é uma abordagem fácil e mais acessível em comparação com a transdução viral, que requer uma sala de cultura celular de nível 2 de segurança aprovada. No entanto, a taxa de transfecção e a eficiência de reprogramação são menores em comparação com a entrega viral dos fatores de reprogramação. Portanto, a transfecção pode ser usada como um método rápido para testar o potencial de reprogramação de novos fatores de reprogramação de candidatos ou para tela de pools de fatores. Em relação à maturação neuronal, as células reprogramadas geralmente se tornam eletrofisiológicas ativas em cerca de 3 semanas. Embora não seja necessário, tratar as células com pequenas moléculas aumenta tanto a sobrevivência quanto a maturação das células reprogramadas, levando a uma maior densidade de neurônios induzidos e uma morfologia mais madura.
Embora o método descrito para isolar e cultura astrócitos seja robusto e confiável, alguns aspectos precisam ser considerados. Primeiro, enquanto os métodos convencionais baseados na dissociação mecânica do tecido produzem um número global maior de células na cultura por tecido dissecado40, uma abordagem classificada em MAC requer a dissecção do tecido de seis a oito filhotes para isolar um número adequado de células para experimentos subsequentes. Além disso, o isolamento dos astrócitos baseia-se na expressão da proteína atpase na+/K+ de transporte beta2 (Atp1b2), reconhecida pelo anticorpo ACSA-241. Em princípio, os astrócitos que não expressam ATP1b2 se perderiam na preparação, causando, portanto, um viés na preparação. Embora não possamos excluir que este seja o caso, nossa análise do fluxo MACS revelou que poucas células na fração negativa eram imunoreativas para os marcadores de astroglia Sox9, sugerindo a alta eficiência do protocolo de classificação MAC. Uma segunda ressalva em relação ao ATP1b2 está relacionada à sua expressão. O ATP1b2 é expresso especificamente por astrócitos no estágio pós-natal, enquanto no cérebro adulto do camundongo outros tipos de células expressam isso, em particular oligodendrocitos myeliando e células ependísicas27. Portanto, uma dissecção cuidadosa da área de interesse e uma etapa de remoção de mielina é necessária para isolar astrócitos de cérebros adultos.
Em comparação com outros métodos para isolar astrócitos, a abordagem baseada em MACS garante alta pureza das culturas (>90% das células Sox9+) e fornece um procedimento padronizado para isolar astrócitos de diferentes regiões do CNS. Isso é particularmente importante quando se compara culturas de diferentes regiões do CNS, pois a pureza cultural obtida pela dissociação mecânica clássica pode variar notavelmente (>80% GFAP+/DAPI de matéria cinzenta cortical, ~50% GFAP+/DAPI da medula espinhal)15,29. Um protocolo padronizado reduz essa variabilidade e fornece um ponto de partida comum para experimentos de reprogramação in vitro. Isso permite, por exemplo, comparar sistematicamente a identidade molecular dos astrócitos de diferentes regiões28,29 e investigar o impacto da origem do desenvolvimento na eficiência de reprogramação e na identidade do subtipo dos neurônios induzidos.
Em resumo, a reprogramação neuronal direta in vitro de culturas otimizadas de astrócitos é uma abordagem muito poderosa para desvendar mecanismos moleculares universais, bem como mecanismos moleculares específicos da região de conversão de astrócito-neurônio, fornecendo informações essenciais para projetar estratégias melhores e mais eficazes para a conversão direta in vivo de astrócitos residentes do CNS.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Ines Mühlhahn pela clonagem das construções para reprogramação, Paulina Chlebik pela produção viral, e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak pelos comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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