Summary
在这里，我们描述了一个详细的方案，以产生来自产后小鼠中枢神经系统不同区域的星形胶质细胞的高度富集培养物，并通过强迫转录因子将其转化为功能性神经元。
Abstract
直接神经元重编程是一种强大的方法，可以从不同的起始细胞群中产生功能性神经元，而无需通过多能中间体。这项技术不仅在疾病建模领域有很大的希望，因为它允许将例如患有神经退行性疾病的患者的成纤维细胞转化为神经元，而且还代表了基于细胞的替代疗法的有希望的替代方案。在这种情况下，一个重大的科学突破是证明中枢神经系统内分化的非神经细胞，如星形胶质细胞，可以在 体外转化为功能性神经元。从那时起， 在体外 直接将星形胶质细胞重编程为神经元提供了对强制身份转换背后的分子机制以及阻止有效重编程的障碍的实质性见解。然而，由于用于分离，培养和重编程星形胶质细胞的方法不同，因此很难比较在不同实验室进行的 体外实验的结果。在这里，我们描述了一个详细的方案，通过磁细胞分选 从 出生后小鼠中枢神经系统的不同区域可靠地分离和培养具有高纯度的星形胶质细胞。此外，我们还提供 通过 病毒转导或DNA转染将培养的星形胶质细胞重新编程为神经元的方案。这种简化和标准化的方案可用于研究细胞身份维持的分子机制，新神经元身份的建立，以及特定神经元亚型及其功能特性的产生。
Introduction
哺乳动物中枢神经系统（CNS）高度复杂，由数百种不同的细胞类型组成，包括大量不同的神经元亚型1，2，3，4，5，6。与其他器官或组织7，8，9不同，哺乳动物CNS的再生能力非常有限;创伤性脑损伤或神经变性后的神经元丢失是不可逆的，通常会导致运动和认知缺陷10.为了挽救大脑功能，替换丢失神经元的不同策略正在进行密集研究11.其中，将体细胞直接重编程为功能性神经元正在成为一种有前途的治疗方法12。直接重编程或转分化是将一种分化的细胞类型转化为新身份而不通过中间增殖或多能状态13，14，15，16的过程。该方法通过鉴定MyoD1作为足以将成纤维细胞转化为肌肉细胞17，18的因子而开创，该方法已成功应用于将几种细胞类型重新编程为功能神经元19，20，21。
星形胶质细胞是CNS22，23中最丰富的大胶质细胞，由于多种原因，它是一种特别有希望的直接神经元重编程的细胞类型。首先，它们广泛而均匀地分布在CNS中，为新神经元提供了丰富的 定位 源。其次，星形胶质细胞和神经元在发育上密切相关，因为它们在胚胎发育过程中共享一个共同的祖先，即桡骨神经胶质细胞24。与来自不同胚层的细胞重编程相比，两种细胞类型的共同胚胎起源似乎有助于神经元转换19，21。此外，星形胶质细胞通过其桡神经胶质细胞起源遗传的模式信息也保留在成年星形胶质细胞25，26，27中，并且似乎有助于产生区域上合适的神经元亚型28，29，30。因此，研究和了解星形胶质细胞转化为神经元是实现该技术在基于细胞的替换策略中的全部潜力的重要组成部分。
体外培养的星形胶质细胞转化为神经元在直接神经元重编程领域取得了几项突破，包括：i）鉴定足以从星形胶质细胞中产生神经元的转录因子15，19，31，ii）在同一细胞背景下由不同重编程因子触发的分子机制的解开32，iii）强调星形胶质细胞的发育起源对诱导不同神经元亚型的影响28，29，33。此外，星形胶质细胞的体外直接转化解开了限制神经元直接重编程34，35的几个主要障碍，例如活性氧（ROS）产生增加34以及星形胶质细胞的线粒体蛋白质组和神经元35之间的差异。因此，这些观察结果强烈支持使用星形胶质细胞的原代培养物作为直接神经元重编程的模型，以研究生物学12中的几个基本问题，这些问题与细胞身份维持，防止细胞命运变化的障碍以及代谢在重编程中的作用有关。
在这里，我们提出了一个详细的方案，以非常高的纯度从出生后（P）年龄的小鼠中分离星形胶质细胞，如从小鼠脊髓29中分离星形胶质细胞所证明的那样。我们还提供 通过 病毒转导或DNA质粒转染将星形胶质细胞重新编程为神经元的方案。重编程的细胞可以在转导后7天（7 DPT）进行分析，以评估各个方面，例如重编程效率和神经元形态，或者可以在培养物中维持数周，以评估其随时间推移的成熟度。重要的是，该方案不是脊髓星形胶质细胞特异性的，可以很容易地应用于从其他各种大脑区域分离星形胶质细胞，包括皮质灰质，中脑和小脑。
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Protocol
以下程序遵循慕尼黑亥姆霍兹中心关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63 / EU的动物护理指南。请确保遵守进行解剖的机构的动物护理指南。
1. 解剖、解离和培养材料的准备
注意：在生物安全柜内准备所有培养试剂，并仅使用高压灭菌或无菌设备工作。解剖和解离试剂可以在生物安全柜外制备。
- 通过在H 2 O中用聚-D-赖氨酸（储备1mg / mL，工作溶液20μg/ mL）涂覆T25培养瓶来制备培养瓶，至少2小时。然后，用H2O冲洗3x并风干。
- 通过将5 mL 1 M HEPES缓冲溶液加入500 mL汉克平衡盐溶液（HBSS）来制备解剖缓冲液。
- 通过从神经组织解离试剂盒中加入1950μL缓冲液X，每六个脊髓制备一个C管（参见材料表）。解剖时存放在冰上。通过向每个C管加入20μL缓冲液Y和10μL缓冲液A来制备酶消化预混液（神经组织解离试剂盒的一部分，参见材料表）。充分混合并储存在4°C直至需要。
- 用钙和镁制备1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）并放在冰上。将5 mL青霉素 - 链霉素（终浓度，100 U / mL），5 mL 45%D-葡萄糖和5 mL谷氨酰胺补充剂（终浓度2 mM，见 材料表）加入485 mL DMEM / F12来制备碱性培养基。碱性培养基在4°C下稳定4周。
- 通过在44 mL碱性培养基中加入1 mL B27补充剂和5 mL胎牛血清（FBS）来制备星形胶质细胞培养基。补充具有表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（每个10ng / mL）的培养基。在使用前将EGF和bFGF加入适量的培养基中。
- 对于脊髓组织的解剖，使用一对弯曲尖端的大镊子，一对弯曲尖端的小镊子，一对小镊子，一对小剪刀和一把小铲子。
2. 星形胶质细胞分离
- 从产后小鼠的脊髓中分离星形胶质细胞，以直接重编程为功能性神经元（图1A）。对于该协议，在出生后第2-3天从小鼠收集脊髓组织。收集六到八条脊髓用于星形胶质细胞分离。使用相同的方案从神经系统的其他区域（如皮层，中脑和小脑）分离星形胶质细胞。对于这些区域，在出生后五到七天获得细胞。
注意：当旨在从本方案中未提及的区域分离星形胶质胶质细胞时，应通过实验确定年龄和输入材料。
3. 脊髓组织夹层
注意：组织解剖可以在生物安全柜外进行。
- 在不麻醉动物的情况下，通过斩首在P2-P3处处处死小鼠。将躯干放入35毫米培养皿中，并保持在冰上。
- 用剪刀打开皮肤，用小剪刀取出椎骨，取出脊髓，然后将其置于冰上的解剖缓冲区中。在具有2倍放大倍率的立体定向解剖显微镜下，使用镊子从孤立的脊髓中取出脑膜，并将解剖和清洁的脊髓组织转移到C管中。
4. 磁活化细胞分选
- 从神经组织解离试剂盒中加入50μL酶P（参见 材料表）和30μL先前制备的酶混合物到每个C管中。反转C管并将其放在加热的解离器上（参见 材料表），确保所有组织都收集在管的盖子中。
- 运行37_NTDK_1解离程序，运行时间约为 22 分钟。在计划结束前不久，将70μm过滤器（参见 材料表）放在15 mL管的数量上，等于所使用的C管数量，并用2 mL冰冷的PBS预润湿过滤器。在整个 MACS 过程中，将 1 个 PBS 储存在冰上。
- 程序完成后，取出C管并短暂离心以收集管底部的组织。将解离的组织从C管转移到通过过滤器制备的15mL管中。将过滤器留在15 mL管上。
- 用10 mL 1x PBS冲洗C管以收集剩余的组织，并通过再次通过过滤器将其收集在同一个15 mL管中。在室温下以300× g 离心含有解离组织的15mL管10分钟。
注意：完成此步骤后，将离心机冷却至4°C。 - 在不干扰细胞沉淀的情况下取出上清液，然后将细胞重悬于80μL1x PBS中;从小鼠抗ACSA-2微珠试剂盒中加入10μL封闭试剂（参见 材料表）。通过移液轻轻混合。
- 在黑暗中在4°C下孵育10分钟（冰箱）。加入10μL抗星形胶质细胞表面抗原-2偶联微珠（见 材料表），并通过移液轻轻混合。在黑暗中在4°C下孵育15分钟。
- 通过加入3 mL的1x PBS洗涤细胞，并在4°C下以300× g 离心10分钟。 离心时，通过将适当数量的磁性分选柱（参见 材料表）放在分离器上，下面有一个15 mL收集管，组装一个磁性分离器（参见 材料表）。用500μL1x PBS冲洗色谱柱。
- 取出上清液并将细胞重悬于500μL1x PBS中，然后将细胞悬浮液转移到磁柱中。让重力排出。用500μL1x PBS洗涤15 mL管并涂于色谱柱上。用 500 μL 1x PBS 洗涤色谱柱，再洗涤两次。
- 通过从分离器中取出色谱柱，加入800μL星形胶质细胞培养基并用随附的柱塞将细胞推出色谱柱来洗脱细胞。
- 在先前制备的培养瓶中，通过加入4.2mL补充有EGF和bFGF的星形胶质细胞培养基并在37°C和5%CO2下培养细胞。
注意：对于从其他脑区域分离的星形胶质细胞，不需要包覆培养瓶，但可以为从脊髓分离的星形胶质细胞提供更好的底物。 - 将细胞培养约7天，直到汇合（80%-90%）。如果细胞在7天后没有汇合，请等到10天后再接种。10天后，细胞不再增殖，重编程效率下降。
5. 星形胶质细胞的接种用于重编程
注意：以下步骤必须在安全等级为1（SL1）的生物安全柜下执行。
- 用聚-D-赖氨酸涂层玻璃盖玻片制备24孔板，与先前制备培养瓶的方式相同。为了确定所需的板的数量，考虑在24 孔板中以每孔5-5.5×10 4个细胞的密度接种星形胶质细胞。通常，从P2小鼠中分离出六个脊髓会产生大约1 x 106 个细胞。
- 从含有培养的星形胶质细胞的T25培养瓶中抽吸培养基，并用1x PBS洗涤一次。通过加入0.5mL 0.05%胰蛋白酶/ EDTA将星形胶质细胞从培养瓶中分离出来，并在37°C下孵育5分钟。轻轻敲击烧瓶的侧面以从培养瓶表面释放细胞，并使用10X放大倍率在明场显微镜下检查分离。
- 用2.5 mL星形胶质细胞培养基停止胰蛋白酶消化，并将细胞悬浮液收集在15 mL管中。以300× g 离心5分钟，吸出上清液，并将细胞重悬于1mL星形胶质细胞培养基中。使用血细胞计数器或自动细胞计数系统计算细胞浓度。
- 根据细胞数量，用新鲜的星形胶质细胞培养基稀释细胞悬浮液，得到每mL 1-1.1×10个细胞的 溶液。用每因子 10 纳克/毫升补充培养基中的 EGF 和 bFGF。向先前制备的24 孔板的每个孔中加入500μL细胞悬浮液，相当于5-5.5×10 4个细胞，并在37°C和5%CO2下培养细胞。
6. 转录因子的强制表达
注意：在继续实验方案之前，必须正确设计实验。特别是，重要的是始终包括重编程的阴性对照，即没有表达重编程因子的情况。例如，当使用携带cDNA的载体作为重编程因子和报告基因（例如，绿色荧光蛋白（GFP），DsRed）时，阴性对照由仅携带报告基因的同一载体表示。当表达携带不同报告的多个因素时，应相应地调整阴性对照。
- 接种后的第二天，检查24孔板，以确保细胞粘附在盖玻片上。
- 基于实验目标和可用资源，重编程因子的强制表达可以通过病毒转导（见步骤6.3）或DNA转染（见步骤6.4）来实现。
注意：使用逆转录病毒或慢病毒需要获得政府当局的批准，并且必须在安全等级为2（SL2）的实验室内的生物安全柜下进行。 - 通过用携带遗传信息的逆转录病毒或慢病毒转导细胞来重新编程星形胶质细胞，以表达感兴趣的重编程因子，如下所述。
- 通过将1μL细胞悬浮液直接加入星形胶质细胞培养基中，转导具有1 x 10 10-10 10 12颗粒/mL的高病毒滴度的细胞。这确保了高感染率。根据实验的目的，在进行第7节或第8节之前，用含有病毒颗粒的星形胶质细胞培养基在37°C下培养24-36小时。
注意：可以使用不同的启动子来驱动转基因的表达（另见代表性结果）。本构启动子（例如，CMV，CAG）比诱导启动子更早地诱导转基因的表达;然而，这两种类型的启动子类型都已成功用于将细胞重新编程为神经元。
- 通过将1μL细胞悬浮液直接加入星形胶质细胞培养基中，转导具有1 x 10 10-10 10 12颗粒/mL的高病毒滴度的细胞。这确保了高感染率。根据实验的目的，在进行第7节或第8节之前，用含有病毒颗粒的星形胶质细胞培养基在37°C下培养24-36小时。
- DNA质粒也可以 通过 DNA转染引入星形胶质细胞，如下所述。
注意：这可以在SL1批准的生物安全柜下完成。- 在转染之前，获得转染试剂、所需构建体的质粒DNA、新鲜星形胶质细胞培养基和血清还原培养基（参见 材料表）。通过考虑24孔板的每个孔需要300μL血清还原培养基，计算所需的血清还原培养基量（参见 材料表）。将适量的血清还原培养基加入50mL管中，并将其加热至37°C。
- 当血清还原培养基温暖时，从所有孔中吸出星形胶质细胞培养基并将其收集在50 mL管中。用0.45μM注射器过滤器过滤收集的星形胶质细胞培养基以除去分离的细胞。
- 向过滤的培养基中加入等体积的新鲜星形胶质细胞培养基，以获得足以每孔加入1mL星形胶质细胞培养基的溶液。将星形胶质细胞调节培养基在培养箱中保持在37°C直至使用（步骤6.4.9）。
注意：培养基被重复使用，因为它包含几个支持培养物可行性的分泌因子。 - 向每个孔中加入300μL预热的血清还原培养基，并将24孔板放回培养箱中。
- 制备由DNA和血清还原培养基组成的溶液A。对于每个孔，总共使用0.6μgDNA并将其加入50μL血清还原培养基中。将溶液A在室温下储存直至使用。
注意：通常，每个条件考虑技术三份。因此，制备足以进行3.5反应的混合物（例如，在175μL血清还原培养基中稀释2.1μg总DNA）以确保足够的材料转染24孔板的三个孔。 - 制备溶液B，由转染试剂和血清还原培养基组成。对于每个孔，将0.75μL转染试剂加入50μL血清还原培养基中。由于该溶液适用于所有转染条件，因此请批量制备，以减少转染过程中的变异性。
- 将溶液B在室温下孵育5分钟。将溶液B以1：1的比例逐滴加入溶液A中，然后轻轻混合。不要涡旋。将溶液A + B在室温下在罩下孵育20-30分钟。
- 对所有转染条件重复步骤6.4.5-6.4.7。20-30分钟后，逐滴向每个孔中加入溶液A + B，最终体积为100μL。轻轻摇动板并将细胞放回37°C的培养箱中4小时。
- 4小时后，取出转染介质，加入步骤6.4.3制备的预热星形胶质细胞条件培养基1mL。根据实验目的，在进行第7节或第8节之前，将细胞保持36-48小时。
7. 星形胶质细胞重编程（7天分析）
- 通过将1mL B27补充剂加入49mL碱性培养基来制备神经元分化培养基（参见步骤1.4）。24-48小时后，根据细胞是否被转导或转染（分别参见步骤6.3和6.4），用每孔1mL神经元分化培养基替换星形胶质细胞培养基，并在37°C和9%CO2下培养细胞。
注意：如果没有9%CO2 培养箱，细胞也可以保持在5%CO2 。然而，在这些条件下，神经元重编程更有效。 - 可选：为了提高重编程效率，在将星形胶质细胞培养基替换为分化培养基时，用毛喉素（终浓度为30μM）和背反啡（终浓度为1μM）补充神经元分化培养基。当选择用毛喉素和背啡治疗细胞时，在初始治疗后2天提供第二剂背反啡。将第二种处理直接添加到培养基中。
- 小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元细胞通常发生在更换培养基后7天内。因此，在神经元重编程开始7天后，固定或收集细胞进行下游分析。
8. 将星形胶质细胞重编程为成熟神经元（长期培养）
- 通过将1mL B27补充剂加入49mL碱性培养基来制备神经元分化培养基（参见步骤1.4）。24-48小时后，根据细胞是否转导或转染（分别参见步骤6.3和6.4），用1mL神经元分化培养基替换星形胶质培养基，其中每孔补充有毛喉素（终浓度为30μM）和背反啡（最终浓度为1μM），并在37°C和9%CO2下培养细胞。
注意：如果没有9%CO2 培养箱，细胞也可以保持在5%CO2 。然而，在这些条件下，神经元重编程更有效。 - 在初始治疗后2天重复背吗啡治疗，直接将其添加到神经元分化培养基中。
- 从神经元重编程开始7天后，通过加入6μLN 2，1.2μLNT3（储备20μg/ mL），1.2μLBDNF（储备20μg/ mL），1.2μLGDNF（储备20μg/ mL）和1.2μLcAMP（储备100mM）到189.2μL神经元分化培养基来制备成熟培养基。用200μL成熟培养基补充存在于每个孔中的神经元分化培养基。
注意：成熟培养基仅在第一次治疗时补充。所有后续治疗都是通过部分替换神经元分化培养基来完成的，如下所述。 - 通过除去200μL神经元分化培养基并每周两次加入200μL新鲜成熟培养基，重复小分子治疗，最长可达6周。在成熟过程中，使用细胞进行电生理学实验（通常在第21天或更晚）或固定以进行下游分析（例如，免疫荧光）。
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Representative Results
星形胶质细胞的原代培养通常在MAC分选和接种后7至10天内达到80%-90%的汇合度（图1B）。通常，单个T25培养瓶产生约1-1.5×106个细胞，当以每孔5-5.5×10个细胞的密度接种细胞时，这足以容纳20-30个盖玻片。接种后的第二天，细胞通常覆盖盖玻片表面的50%-60%（图1C）。在这个阶段，培养几乎完全由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型，如神经母细胞，几乎不存在（图1D）29。
重编程因子 可以通过逆转录 病毒或慢病毒转导或通过DNA质粒的转染传递给星形胶质细胞。通常，与转染相比，病毒转导感染更多的细胞。由于直接神经元转化导致大量细胞死亡34、35，逆转录病毒或慢病毒转导优选为最大化用于分析的细胞数量。可以使用不同的启动子来控制重编程因子的表达：组成性（例如，CMV，CAG）15，32，诱导（例如，Tet响应性元素，Tet-ON）21，或细胞类型特异性（例如，GFAP启动子）36，37。当使用组成性或细胞类型特异性启动子时，星形胶质细胞开始表达转基因的可检测水平，在基因递送后24小时内通过荧光报告基因表达（例如GFP，DsRed）评估，每个细胞独立于其他细胞。相反，诱导启动子允许转基因在转导的细胞之间同步表达，因为它们在向培养基中加入小分子（例如多西环素）后被激活。转录因子的可检测水平通常在启动子激活后18-20小时达到。在大多数情况下，重编程因子表达的峰值在48小时左右达到，慢病毒介导的表达需要稍长的时间。
虽然重编程因子表达后的转录变化最早可以在4小时32小时检测到，但在24小时后和29，32之后会发生稳健的变化。转录变化后发生形态学变化，转导/转染（3 DPT）后约3天可观察到转化的最初迹象。在7 DPT处，诱导的神经元细胞与星形胶质细胞明显不同：它们的体质小于对照或未重编程的星形胶质细胞，它们具有较长的过程，并且它们对神经元标志物βIII-tub呈阳性，对星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性（图1E）。然而，值得注意的是，一些细胞对于GFAP和βIII-tub可以是阳性的，这表明神经元程序已被诱导但星形胶质细胞身份尚未被抑制，或者对于这两种标记物都是阴性的，表明星形胶质细胞身份的抑制但神经元级联反应的诱导不存在。在任何一种情况下，细胞通常保持星形胶质细胞形态。
对于更多的功能分析，例如电生理学或生成的神经元亚型的评估，培养物通常维持至少21 DPT并用成熟培养基处理。在21 DPT处，许多诱导的神经元能够发射动作电位，并且对成熟的神经元标志物NeuN以及泛突触蛋白突触生链29 呈阳性（图1F）。
图1：星形胶质细胞培养和重编程概述 （A）星形胶质细胞到神经元直接转换的时间轴。每条黑线代表协议中的一个重要步骤。（B）培养7天后培养的脊髓源性星形胶质细胞的代表性明场图像。使用明场显微镜和10倍物镜拍摄照片。比例尺代表100μm（C）在24 孔板中以每孔5.5×10 4个细胞的密度重新电镀1天后脊髓星形胶质细胞的代表性明场图像。使用明场显微镜和10x物镜拍摄图像。比例尺表示100μm.（D）βIII-浴缸，Sox9，GFAP在星形胶质细胞上进行三重染色的免疫荧光图像，在接种后1天固定以证明培养纯度。将细胞固定在4%多聚甲醛中10分钟，并用1x PBS洗涤两次。在1x PBS溶液中使用3%BSA，0.5%曲子-X 100阻断细胞。将一抗以适当的浓度（例如，抗GFAP 1：250，抗βIII-浴缸1：250，抗Syp1 1：500）在封闭溶液中稀释，并在室温下孵育2小时。用1x PBS洗涤细胞三次，并在室温下与荧光团偶联的二抗一起孵育1小时。盖玻片用1x PBS清洗三次，然后用Aqua Poly/支架安装。使用落射荧光显微镜和40x物镜获取图像。比例尺代表20μm.（E）βIII-浴缸的免疫荧光图像，DsRed双重染色以证明星形胶质细胞在7 DPT后与Ascl1的转换。比例尺代表20μm.（F）βIII-浴缸，DsRed，突触素1（Syp1）三重染色的免疫荧光图像，以证明在用Ascl1重编程21 DPT后的神经元成熟。免疫荧光和图像采集的方案如上所述。比例尺代表20 μm ，请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
小鼠星形胶质细胞的原代培养是研究直接神经元重编程的卓越体外模型系统。事实上，尽管在出生后阶段分离出，但细胞表达典型的星形胶质细胞标志物29，保留模式基因的表达28，29，并保持增殖能力，类似于38岁时的体内星形胶质细胞。在MACS介导的分离后，细胞首先粘附在烧瓶上，然后开始增殖，产生高度富集的星形胶质细胞培养物29。重要的是，培养的星形胶质细胞不会分化成多能细胞状态，也不会永生化。此外，它们不会在报告蛋白（例如DsRed或GFP）表达后自发产生神经元，而是保持星形胶质细胞的身份。此外，它们不会无限期地增殖，而是减慢它们的增殖并过渡到更成熟的阶段，这降低了它们的直接神经元重编程潜力32，39。
该协议中有几个关键步骤：首先，必须仔细分离感兴趣的区域并去除任何污染组织。例如，为了制备脊髓星形胶质细胞，从椎骨中提取脊髓并小心地去除背根神经节（DRG）。其次，转化细胞经历显着的细胞死亡34，由于周围星形胶质细胞的吞噬作用的刺激以及介质渗透压的改变，这对转导细胞和整个培养物具有负面影响。因此，重要的是用足够体积的分化培养基（通常为1 mL/孔的24孔板）代替星形胶质细胞培养基。此外，与病毒转导相比，质粒DNA的转染是一种简单易行的方法，后者需要一个经批准的安全等级为2的细胞培养室。然而，与病毒介导的重编程因子递送相比，转染率和重编程效率较低。因此，转染可用作测试新候选重编程因子的重编程潜力或筛选因子库的快速方法。关于神经元成熟，重编程的细胞通常在3周左右变得电生理活性。虽然不是必需的，但用小分子处理细胞会增加重编程细胞的存活率和成熟度，从而导致更高密度的诱导神经元和更成熟的形态。
尽管所描述的分离和培养星形胶质细胞的方法是稳健可靠的，但需要考虑几个方面。首先，虽然基于组织机械解离的常规方法在培养物中产生总共更高的细胞数，但解剖40个组织，而MAC分选方法需要从6到8个幼崽中解剖组织，以分离足够数量的细胞用于后续实验。此外，星形胶质细胞的分离基于ATP酶Na + / K +转运亚基β2蛋白（Atp1b2）的表达，该蛋白由抗体ACSA-241识别。原则上，不表达Atp1b2的星形胶质细胞将在制备过程中丢失，从而导致制备中的偏倚。虽然我们不能排除这种情况，但我们对MACS流过的分析显示，阴性部分中的细胞很少对星形标记物Sox9具有免疫反应性，这表明MAC分选方案的效率很高。关于 Atp1b2 的第二个警告与它的表达有关。Atp1b2在出生后阶段由星形胶质细胞特异性表达，而在小鼠成年脑中表达其它细胞类型，特别是有髓鞘少突胶质细胞和室管膜细胞27。因此，需要仔细解剖感兴趣的区域和髓鞘去除步骤，以从成人大脑中分离星形胶质细胞。
与其他分离星形胶质细胞的方法相比，基于MACS的方法可确保培养物的高纯度（>90%的Sox9 +细胞），并提供从CNS的不同区域分离星形胶质细胞的标准化程序。在比较来自不同中枢神经系统区域的培养物时，这一点尤其重要，因为通过经典机械解离获得的培养纯度可能显著变化（来自皮质灰质的>80% GFAP+/DAPI，来自脊髓的约 50% GFAP+/DAPI）15，29。标准化方案减少了这种可变性，并为 体外 重编程实验提供了一个共同的起点。例如，这允许系统地比较来自不同区域28，29 的星形胶质细胞的分子同一性，并研究发育起源对重编程效率和诱导神经元亚型同一性的影响。
总之，星形胶质细胞优化培养物的 体外 直接神经元重编程是一种非常强大的方法，可以揭示星形胶质细胞到神经元转化的普遍和区域特异性分子机制，为在 体内 直接转化常驻CNS星形胶质细胞提供基本信息。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢伊内斯·米尔哈恩克隆了用于重编程的构建体，感谢宝琳娜·克莱比克克隆病毒，感谢马格达莱娜·格茨和朱迪思·费舍尔-斯特恩贾克对手稿的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
