Summary
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour générer des cultures hautement enrichies d’astrocytes dérivés de différentes régions du système nerveux central de souris postnatales et leur conversion directe en neurones fonctionnels par l’expression forcée de facteurs de transcription.
Abstract
La reprogrammation neuronale directe est une approche puissante pour générer des neurones fonctionnels à partir de différentes populations de cellules de départ sans passer par des intermédiaires multipotents. Cette technique est non seulement très prometteuse dans le domaine de la modélisation des maladies, car elle permet de convertir, par exemple, les fibroblastes pour les patients souffrant de maladies neurodégénératives en neurones, mais représente également une alternative prometteuse pour les thérapies de remplacement cellulaires. Dans ce contexte, une percée scientifique majeure a été la démonstration que des cellules non neurales différenciées dans le système nerveux central, telles que les astrocytes, pouvaient être converties en neurones fonctionnels in vitro. Depuis lors, la reprogrammation directe in vitro des astrocytes en neurones a fourni des informations substantielles sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la conversion forcée de l’identité et les obstacles qui empêchent une reprogrammation efficace. Cependant, les résultats d’expériences in vitro réalisées dans différents laboratoires sont difficiles à comparer en raison des différences dans les méthodes utilisées pour isoler, cultiver et reprogrammer les astrocytes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler et cultiver de manière fiable des astrocytes de haute pureté provenant de différentes régions du système nerveux central de souris à des âges postnatals via le tri de cellules magnétiques. De plus, nous fournissons des protocoles pour reprogrammer les astrocytes cultivés en neurones par transduction virale ou transfection de l’ADN. Ce protocole rationalisé et standardisé peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au maintien de l’identité cellulaire, à l’établissement d’une nouvelle identité neuronale, ainsi qu’à la génération de sous-types neuronaux spécifiques et à leurs propriétés fonctionnelles.
Introduction
Le système nerveux central (SNC) des mammifères est très complexe, composé de centaines de types cellulaires différents, y compris un grand nombre de sous-types neuronaux différents 1,2,3,4,5,6. Contrairement à d’autres organes ou tissus 7,8,9, le SNC des mammifères a une capacité de régénération très limitée; La perte neuronale à la suite d’un traumatisme crânien ou d’une neurodégénérescence est irréversible et entraîne souvent des déficits moteurs et cognitifs10. Visant à sauver les fonctions cérébrales, différentes stratégies pour remplacer les neurones perdus font l’objet d’une enquête intense11. Parmi eux, la reprogrammation directe des cellules somatiques en neurones fonctionnels émerge comme une approche thérapeutique prometteuse12. La reprogrammation directe, ou transdifférenciation, est le processus de conversion d’un type de cellule différencié en une nouvelle identité sans passer par un état prolifératif ou pluripotent intermédiaire 13,14,15,16. Pionnière par l’identification de MyoD1 comme facteur suffisant pour convertir les fibroblastes en cellules musculaires17,18, cette méthode a été appliquée avec succès pour reprogrammer plusieurs types de cellules en neurones fonctionnels 19,20,21.
Les astrocytes, la macroglie la plus abondante du SNC22,23, sont un type cellulaire particulièrement prometteur pour la reprogrammation neuronale directe pour plusieurs raisons. Tout d’abord, ils sont largement et uniformément répartis dans le SNC, fournissant une source abondante en loco pour de nouveaux neurones. Deuxièmement, les astrocytes et les neurones sont étroitement liés sur le plan du développement, car ils partagent un ancêtre commun au cours du développement embryonnaire, les cellules gliales radiales24. L’origine embryonnaire commune des deux types de cellules semble faciliter la conversion neuronale par rapport à la reprogrammation des cellules de différentes couches germinales 19,21. En outre, les informations de modelage héritées par les astrocytes à travers leur origine gliale radiale sont également maintenues dans les astrocytes adultes 25,26,27, et semblent contribuer à la génération de sous-types neuronaux 28,29,30 appropriés à la région. Par conséquent, l’étude et la compréhension de la conversion des astrocytes en neurones sont un élément important pour atteindre le plein potentiel de cette technique pour les stratégies de remplacement cellulaires.
La conversion d’astrocytes cultivés in vitro en neurones a conduit à plusieurs percées dans le domaine de la reprogrammation neuronale directe, notamment : i) l’identification de facteurs de transcription suffisants pour générer des neurones à partir d’astrocytes 15,19,31, ii) le démêlage des mécanismes moléculaires déclenchés par différents facteurs de reprogrammation dans le même contexte cellulaire 32 , et iii) mettre en évidence l’impact de l’origine développementale des astrocytes sur l’induction de différents sous-types neuronaux 28,29,33. En outre, la conversion directe in vitro des astrocytes a permis de surmonter plusieurs obstacles majeurs qui limitent la reprogrammation neuronale directe34,35, tels que l’augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)34 et les différences entre le protéome mitochondrial des astrocytes et des neurones35. Par conséquent, ces observations soutiennent fortement l’utilisation de cultures primaires d’astrocytes comme modèle de reprogrammation neuronale directe pour étudier plusieurs questions fondamentales en biologie12, liées au maintien de l’identité cellulaire, aux obstacles empêchant les changements de destin cellulaire, ainsi qu’au rôle du métabolisme dans la reprogrammation.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour isoler les astrocytes de souris à l’âge postnatal (P) avec une très grande pureté, comme démontré en isolant les astrocytes de la moelle épinière murine29. Nous fournissons également des protocoles pour reprogrammer les astrocytes en neurones par transduction virale ou transfection de plasmides d’ADN. Les cellules reprogrammées peuvent être analysées 7 jours après la transduction (7 DPT) pour évaluer divers aspects, tels que l’efficacité de la reprogrammation et la morphologie neuronale, ou peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs semaines, pour évaluer leur maturation au fil du temps. Il est important de noter que ce protocole n’est pas spécifique aux astrocytes de la moelle épinière et peut être facilement appliqué pour isoler les astrocytes de diverses autres régions du cerveau, y compris la matière grise corticale, le mésencéphale et le cervelet.
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Protocol
La procédure suivante suit les directives de soins aux animaux du Helmholtz Zentrum Munich conformément à la directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Veuillez vous assurer de vous conformer aux directives de soins aux animaux de l’établissement où la dissection est effectuée.
1. Préparation du matériel de dissection, de dissociation et de culture
REMARQUE: Préparez tous les réactifs de culture dans une armoire de sécurité biologique et travaillez en utilisant uniquement de l’équipement autoclavé ou stérile. Les réactifs de dissection et de dissociation peuvent être préparés à l’extérieur d’une armoire de sécurité biologique.
- Préparer les flacons de culture en enduisant une fiole de culture T25 de poly-D-lysine (stock 1 mg/mL; solution de travail 20 μg/mL) dans H2O pendant au moins 2 h. Ensuite, rincez 3x avec H2O et séchez à l’air.
- Préparer le tampon de dissection en ajoutant 5 mL de solution tampon HEPES de 1 M à 500 mL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hank.
- Préparez un tube C (voir Tableau des matériaux) par six moelles épinières en ajoutant 1950 μL de tampon X à partir du kit de dissociation du tissu neural (voir Tableau des matériaux). Conserver sur la glace pendant la dissection. Préparer le mélange maître de digestion enzymatique en ajoutant 20 μL de tampon Y et 10 μL de tampon A par tube C (partie du kit de dissociation du tissu neural; voir Tableau des matériaux). Bien mélanger et conserver à 4 °C jusqu’à ce que nécessaire.
- Préparez 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) avec du calcium et du magnésium et placez-la sur de la glace. Préparer le milieu de culture de base en ajoutant 5 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale, 100 U/mL), 5 mL de D-glucose à 45 % et 5 mL de supplément de glutamine (concentration finale de 2 mM; voir tableau des matériaux) à 485 mL de DMEM/F12. Le milieu de base est stable à 4 °C pendant 4 semaines.
- Préparer le milieu de culture des astrocytes en ajoutant 1 mL de supplément de B27 et 5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) à 44 mL de milieu de culture de base. Complétez le milieu avec du facteur de croissance épidermique (EGF) et un facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) (10 ng / mL chacun). Ajouter EGF et bFGF juste avant utilisation à la quantité appropriée de support.
- Pour la dissection du tissu de la moelle épinière, utilisez une paire de grosses pinces avec pointe pliée, une paire de petites pinces avec pointe pliée, une paire de petites pinces, une paire de petits ciseaux et une petite spatule.
2. Isolement des astrocytes
- Isoler les astrocytes de la moelle épinière de souris postnatales pour effectuer leur reprogrammation directe en neurones fonctionnels (Figure 1A). Pour ce protocole, prélevez le tissu de la moelle épinière de souris au jour 2-3 après la naissance. Prélever six à huit moelles épinières pour l’isolement des astrocytes. Utilisez ce même protocole pour isoler les astrocytes d’autres régions du système nerveux, telles que le cortex, le mésencéphale et le cervelet. Pour ces régions, obtenez des cellules cinq à sept jours après la naissance.
REMARQUE: Lorsque vous visez à isoler des astrocytes de régions qui ne sont pas mentionnées dans ce protocole, l’âge et le matériel d’entrée doivent être déterminés expérimentalement.
3. Dissection du tissu de la moelle épinière
REMARQUE: La dissection des tissus peut être effectuée à l’extérieur d’une armoire de sécurité biologique.
- Sacrifier des souris à P2-P3 par décapitation sans anesthésier l’animal. Placez le torse dans une boîte de Petri de 35 mm et conservez-le sur la glace.
- Ouvrez la peau avec des ciseaux, retirez les vertèbres avec de petits ciseaux, extrayez la moelle épinière et placez-la dans un tampon de dissection sur de la glace. Sous un microscope à dissection stéréotaxique avec un grossissement 2x, retirez les méninges de la moelle épinière isolée à l’aide d’une pince et transférez le tissu de la moelle épinière disséqué et nettoyé dans un tube C.
4. Tri des cellules activées magnétiquement (MACS)
- Ajouter 50 μL d’enzyme P du kit de dissociation du tissu neural (voir tableau des matériaux) et 30 μL de mélange d’enzymes préalablement préparé à chaque tube C. Inverser les tubes C et les placer sur un dissociateur chauffé (voir Tableau des matériaux), en vous assurant que tout le tissu est recueilli dans le couvercle du tube.
- Exécutez le programme de dissociation 37_NTDK_1 d’une durée d’exécution d’environ 22 min. Peu avant la fin du programme, placez une passoire de 70 μm (voir tableau des matériaux) sur un nombre de tubes de 15 mL égal au nombre de tubes C utilisés et pré-mouillez la crépine avec 2 mL de PBS glacé. Conservez 1x PBS sur de la glace pendant toute la procédure MACS.
- Une fois le programme terminé, retirez les tubes C et centrifugez-les brièvement pour prélever le tissu au fond des tubes. Transférer le tissu dissocié des tubes C dans les tubes de 15 mL préparés en le faisant passer à travers la crépine. Laissez la passoire sur des tubes de 15 mL.
- Rincez le tube C avec 10 mL de 1x PBS pour recueillir les restes de tissu et collectez-les dans le même tube de 15 mL en passant à travers la passoire une fois de plus. Centrifuger les tubes de 15 mL contenant du tissu dissocié à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
REMARQUE: Refroidissez la centrifugeuse à 4 ° C après cette étape. - Retirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire avant de les remettre en suspension dans 80 μL de 1x PBS; ajouter 10 μL de réactif bloquant du kit MicroBead anti-ACSA-2 de la souris (voir tableau des matériaux). Mélanger doucement par pipetage.
- Incuber à 4 °C pendant 10 min dans l’obscurité (réfrigérateur). Ajouter 10 μL de microbilles couplées à l’antigène 2 de la surface des cellules anti-astrocytes (voir tableau des matériaux) et mélanger doucement par pipetage. Incuber pendant 15 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Lavez les cellules en ajoutant 3 mL de 1x PBS et centrifugez à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Pendant la centrifugation, assemblez un séparateur magnétique (voir Tableau des matériaux) en plaçant le nombre approprié de colonnes de tri magnétique (voir Tableau des matériaux) sur le séparateur avec un tube de collecte de 15 mL en dessous. Rincez les colonnes avec 500 μL de 1x PBS.
- Retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans 500 μL de 1x PBS avant de transférer les suspensions cellulaires dans les colonnes magnétiques. Laisser égoutter par gravité. Lavez les tubes de 15 mL avec 500 μL de 1x PBS et appliquez sur la colonne. Lavez les colonnes avec 500 μL de 1x PBS pour deux lavages supplémentaires.
- Éluez les cellules en retirant la colonne du séparateur, en ajoutant 800 μL de milieu de culture d’astrocytes et en poussant les cellules hors de la colonne avec le piston inclus.
- Cellules plaques dans les flacons de culture préalablement préparés en ajoutant 4,2 mL de milieu de culture d’astrocytes complété par EGF et bFGF et culture à 37 °C et 5% de CO2.
REMARQUE: L’enrobage des flacons de culture n’est pas nécessaire pour les astrocytes isolés d’autres régions du cerveau, mais fournit un meilleur substrat pour les astrocytes isolés de la moelle épinière. - Cellules de culture pendant environ 7 jours jusqu’à la confluence (80% -90%). Si les cellules ne sont pas confluentes après 7 jours, attendez jusqu’à 10 jours avant de les plaquer. Après 10 jours, les cellules ne prolifèrent plus et l’efficacité de la reprogrammation diminue.
5. Ensemencement des astrocytes pour la reprogrammation
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une armoire de sécurité biologique avec un niveau de sécurité 1 (SL1).
- Préparez des plaques de 24 puits avec des couvercles en verre enduit de poly-D-lysine de la même manière que les flacons de culture ont été préparés auparavant. Pour déterminer le nombre de plaques nécessaires, considérez que les astrocytes sont plaqués à une densité de 5-5,5 x 104 cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Habituellement, l’isolement de six moelles épinières de souris P2 donne environ 1 x 106 cellules.
- Aspirer les milieux des flacons de culture T25 contenant les astrocytes cultivés et laver une fois avec 1x PBS. Détacher les astrocytes de la fiole de culture en ajoutant 0,5 mL de Trypsine/EDTA à 0,05 % et incuber à 37 °C pendant 5 min. Tapotez doucement le côté de la fiole pour libérer les cellules de la surface de la fiole de culture et vérifiez le détachement sous un microscope à fond clair à l’aide d’un grossissement 10X.
- Arrêter la trypsinisation avec 2,5 mL de milieu de culture d’astrocytes et prélever la suspension cellulaire dans des tubes de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de culture d’astrocytes. Calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un système automatisé de comptage cellulaire.
- En fonction du nombre de cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu astrocytaire frais pour obtenir une solution de 1-1,1 x 105 cellules par mL. Complétez le milieu avec de l’EGF et du bFGF à 10 ng/mL par facteur. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire, équivalant à 5-5,5 x 104 cellules, à chaque puits des plaques de 24 puits et des cellules de culture préalablement préparées à 37 °C et 5 % de CO2.
6. Expression forcée des facteurs de transcription
REMARQUE: Avant de procéder au protocole, il est essentiel de bien concevoir l’expérience. En particulier, il est important de toujours inclure un contrôle négatif pour la reprogrammation, à savoir une condition où aucun facteur de reprogrammation n’est exprimé. Par exemple, lors de l’utilisation de vecteurs portant l’ADNc pour le facteur de reprogrammation et d’un rapporteur (par exemple, la protéine fluorescente verte (GFP), DsRed), le contrôle négatif est représenté par le même vecteur portant uniquement le rapporteur. Lors de l’expression de plusieurs facteurs portant différents rapporteurs, le contrôle négatif doit être ajusté en conséquence.
- Le lendemain du placage, inspectez les plaques de 24 puits pour vous assurer que les cellules ont adhéré aux couvercles.
- Sur la base de l’objectif expérimental et des ressources disponibles, l’expression forcée des facteurs de reprogrammation peut être obtenue par transduction virale (voir étape 6.3) ou transfection d’ADN (voir étape 6.4).
REMARQUE: L’utilisation de rétrovirus ou de lentivirus nécessite l’approbation des autorités gouvernementales et doit être effectuée sous une armoire de sécurité biologique au sein d’un laboratoire de niveau de sécurité 2 (SL2). - Reprogrammer les astrocytes en transduisant les cellules avec le rétrovirus ou le lentivirus porteur de l’information génétique pour exprimer le(s) facteur(s) de reprogrammation d’intérêt comme décrit ci-dessous.
- Transduire les cellules avec un titre viral élevé de 1 x 1010-1 x 1012 particules/mL en ajoutant 1 μL de la suspension cellulaire directement dans le milieu astrocytaire. Cela garantit un taux d’infection élevé. Cultiver les cellules avec le milieu astrocytaire contenant des particules virales à 37 °C pendant 24-36 h avant de procéder à la section 7 ou à la section 8, selon le but de l’expérience.
REMARQUE: Différents promoteurs peuvent être utilisés pour conduire l’expression des transgènes (voir aussi Résultats représentatifs). Les promoteurs constitutifs (p. ex. CMV, CAG) induisent l’expression du transgène plus tôt que les promoteurs inductibles; cependant, les deux types de types de promoteurs ont été utilisés avec succès pour reprogrammer les cellules en neurones.
- Transduire les cellules avec un titre viral élevé de 1 x 1010-1 x 1012 particules/mL en ajoutant 1 μL de la suspension cellulaire directement dans le milieu astrocytaire. Cela garantit un taux d’infection élevé. Cultiver les cellules avec le milieu astrocytaire contenant des particules virales à 37 °C pendant 24-36 h avant de procéder à la section 7 ou à la section 8, selon le but de l’expérience.
- Les plasmides d’ADN peuvent également être introduits dans les astrocytes par transfection d’ADN comme décrit ci-dessous.
REMARQUE: Cela peut être fait sous une armoire de sécurité biologique approuvée pour SL1.- Avant la transfection, procurez-vous le réactif de transfection, un ADN plasmidique des constructions souhaitées, un milieu astrocytaire frais et un milieu réduit en sérum (voir tableau des matériaux). Calculer la quantité requise de milieu réduit en sérum (voir tableau des matériaux) en considérant que chaque puits d’une plaque de 24 puits nécessite 300 μL de milieu réduit en sérum. Ajouter la quantité appropriée de milieu réduit au sérum dans un tube de 50 mL et le réchauffer à 37 °C.
- Lorsque le milieu réduit en sérum est chaud, aspirez le milieu astrocytaire de tous les puits et recueillez-le dans un tube de 50 mL. Filtrer le milieu astrocytaire collecté avec un filtre à seringue de 0,45 μM pour éliminer les cellules détachées.
- Ajouter un volume égal de milieu astrocytaire frais au milieu filtré pour obtenir une solution suffisante pour ajouter 1 mL de milieu astrocytaire par puits. Maintenir le milieu conditionné par les astrocytes dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à l’utilisation (étape 6.4.9).
REMARQUE: Le milieu de culture est réutilisé car il contient plusieurs facteurs sécrétés qui soutiennent la viabilité de la culture. - Ajouter 300 μL de milieu préchauffé réduit au sérum à chaque puits et replacer la plaque de 24 puits dans l’incubateur.
- Préparer la solution A, composée d’ADN et de milieu réduit en sérum. Pour chaque puits, utilisez un total de 0,6 μg d’ADN et ajoutez-le à 50 μL de milieu réduit en sérum. Conserver la solution A à température ambiante jusqu’à utilisation.
REMARQUE: En règle générale, un triple technique par condition est considéré. Par conséquent, un mélange suffisant pour une réaction de 3,5 est préparé (p. ex., 2,1 μg d’ADN total dilué dans 175 μL de milieu réduit en sérum) pour assurer suffisamment de matière pour transfecter trois puits d’une plaque de 24 puits. - Préparer la solution B, composée du réactif de transfection et du milieu réduit en sérum. Pour chaque puits, ajouter 0,75 μL de réactif de transfection à 50 μL de milieu réduit en sérum. Comme cette solution est commune à toutes les conditions de transfection, préparez-la en vrac pour réduire la variabilité entre les transfections.
- Incuber la solution B à température ambiante pendant 5 min. Ajouter la solution B à la solution A goutte à goutte à un rapport de 1:1 et mélanger doucement. Ne pas vortex. Incuber la solution A + B pendant 20-30 min à température ambiante sous le capot.
- Répétez les étapes 6.4.5 à 6.4.7 pour toutes les conditions de transfection. Après 20-30 min, ajouter la solution A+B à chaque puits goutte à goutte pour un volume final de 100 μL. Agiter doucement la plaque et remettre les cellules dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 h.
- Après 4 h, retirer le milieu de transfection et ajouter 1 mL du milieu conditionné astrocytaire préchauffé préparé à l’étape 6.4.3. Maintenir les cellules pendant 36 à 48 h avant de procéder à la section 7 ou à la section 8, selon le but de l’expérience.
7. Reprogrammation des astrocytes (analyse de 7 jours)
- Préparer le milieu de différenciation neuronale en ajoutant 1 mL de supplément de B27 à 49 mL de milieu de culture de base (voir étape 1.4). Après 24-48 h, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées (voir les étapes 6.3 et 6.4, respectivement), remplacer le milieu astrocytaire par 1 mL de milieu de différenciation neuronale par puits et les cellules de culture à 37 °C et 9% de CO2.
REMARQUE: Les cellules peuvent également être maintenues à 5% de CO2 si aucun incubateur de CO2 à 9% n’est disponible. Cependant, la reprogrammation neuronale est plus efficace dans ces conditions. - Facultatif: Pour augmenter l’efficacité de la reprogrammation, complétez le milieu de différenciation neuronale avec de la forskoline (concentration finale de 30 μM) et de la dorsomorphine (concentration finale de 1 μM) lors du remplacement du milieu astrocytaire au milieu de différenciation. Lorsque vous choisissez de traiter des cellules avec de la forskoline et de la dorsomorphine, fournissez une deuxième dose de dorsomorphine 2 jours après le traitement initial. Ajouter ce deuxième traitement directement au milieu de culture.
- La reprogrammation directe des astrocytes murins en cellules neuronales se produit normalement dans les 7 jours suivant le changement de milieu. Par conséquent, 7 jours après le début de la reprogrammation neuronale, fixez ou collectez des cellules pour une analyse en aval.
8. Reprogrammation des astrocytes en neurones matures (cultures à long terme)
- Préparer le milieu de différenciation neuronale en ajoutant 1 mL de supplément de B27 à 49 mL de milieu de culture de base (voir étape 1.4). Après 24-48 h, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées (voir les étapes 6.3 et 6.4, respectivement), remplacer le milieu astrocytaire par 1 mL de milieu de différenciation neuronale complété par de la forskoline (concentration finale de 30 μM) et de la dorsomorphine (concentration finale de 1 μM) par puits et des cellules de culture à 37 °C et 9 % de CO2.
REMARQUE: Les cellules peuvent également être maintenues à 5% de CO2 si aucun incubateur de CO2 à 9% n’est disponible. Cependant, la reprogrammation neuronale est plus efficace dans ces conditions. - Répétez le traitement à la dorsomorphine 2 jours après le traitement initial en l’ajoutant directement au milieu de différenciation neuronale.
- Après 7 jours à compter du début de la reprogrammation neuronale, préparer le milieu de maturation en ajoutant 6 μL de N2, 1,2 μL de NT3 (stock 20 μg/mL), 1,2 μL de BDNF (stock 20 μg/mL), 1,2 μL de GDNF (stock 20 μg/mL), et 1,2 μL d’AMPc (stock 100 mM) à 189,2 μL de milieu de différenciation neuronale. Compléter le milieu de différenciation neuronale présent dans chaque puits avec 200 μL de milieu de maturation.
REMARQUE: Le milieu de maturation n’est complété que pour le premier traitement. Tous les traitements ultérieurs sont effectués en remplaçant partiellement le milieu de différenciation neuronale comme décrit ci-dessous. - Répétez le traitement avec de petites molécules en retirant 200 μL de milieu de différenciation neuronale et en ajoutant 200 μL de milieu de maturation frais deux fois par semaine pendant 6 semaines. Pendant la maturation, utilisez des cellules pour des expériences électrophysiologiques (généralement, au jour 21 ou plus tard) ou fixez-les pour l’analyse en aval (par exemple, immunofluorescence).
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Representative Results
Les cultures primaires d’astrocytes atteignent généralement une confluence de 80 % à 90 % entre 7 et 10 jours après le tri et le placage de la MAC (figure 1B). Généralement, une seule fiole de culture T25 donne environ 1-1,5 x 106 cellules, ce qui est suffisant pour 20-30 couvertures lors de l’ensemencement de cellules à une densité de 5-5,5 x 104 cellules par puits. Le lendemain du placage, les cellules couvrent généralement 50 % à 60 % de la surface du couvercle (Figure 1C). À ce stade, les cultures sont constituées presque exclusivement d’astrocytes, tandis que d’autres types de cellules, tels que les neuroblastes, sont pratiquement absents (Figure 1D)29.
Les facteurs de reprogrammation peuvent être administrés aux astrocytes soit par transduction rétrovirale ou lentivirale, soit par transfection de plasmides d’ADN. Habituellement, la transduction virale infecte plus de cellules que la transfection. Comme la conversion neuronale directe provoque une quantité substantielle de mort cellulaire34,35, la transduction rétrovirale ou lentivirale est préférée pour maximiser le nombre de cellules à analyser. Différents promoteurs peuvent être utilisés pour contrôler l’expression des facteurs de reprogrammation : constitutifs (p. ex., CMV, CAG)15,32, inductibles (p. ex., éléments sensibles au Tet, Tet-ON)21 ou spécifiques au type de cellule (p. ex., promoteur gfAP)36,37. Lors de l’utilisation de promoteurs constitutifs ou spécifiques au type cellulaire, les astrocytes commencent à exprimer des niveaux détectables des transgènes, évalués par expression de rapporteur fluorescent (par exemple, GFP, DsRed), dans les 24 heures suivant la livraison du gène, chaque cellule étant indépendante des autres. Inversement, les promoteurs inductibles permettent de synchroniser l’expression des transgènes à travers les cellules transduites, car ils sont activés suite à l’ajout d’une petite molécule (par exemple, la doxycycline) au milieu de culture. Les niveaux détectables des facteurs de transcription sont généralement atteints 18-20 h après l’activation du promoteur. Dans la plupart des cas, le pic d’expression du facteur de reprogrammation est atteint vers 48 h, l’expression médiée par le lentivirus prenant un peu plus de temps.
Alors que les changements transcriptionnels suivant l’expression des facteurs de reprogrammation peuvent être détectés dès 4 h32, des changements robustes se produisent après 24 h et plus tard29,32. Les changements morphologiques suivent les changements transcriptionnels, et les premiers signes de conversion peuvent être observés environ 3 jours après la transduction/transfection (3 DPT). À 7 DPT, les cellules neuronales induites se distinguent clairement des astrocytes : leur soma est plus petit que les astrocytes témoins ou non reprogrammés, ils ont de longs processus, et ils sont positifs pour le marqueur neuronal βIII-tub et sont négatifs pour le marqueur astrocytaire GFAP (Figure 1E). Cependant, il convient de noter que certaines cellules peuvent être soit positives pour gfAP et βIII-tub, suggérant que le programme neuronal a été induit mais que l’identité astrocytaire n’a pas été inhibée, soit négative pour les deux marqueurs, indiquant la répression de l’identité astrocytaire mais l’absence d’induction de la cascade neuronale. Dans les deux cas, les cellules maintiennent généralement une morphologie astrocytaire.
Pour les analyses plus fonctionnelles, telles que l’électrophysiologie ou l’évaluation des sous-types neuronaux générés, les cultures sont généralement maintenues pour un minimum de 21 DPT et traitées avec un milieu de maturation. À 21 DPT, de nombreux neurones induits sont capables de déclencher des potentiels d’action et sont positifs pour le marqueur neuronal mature NeuN ainsi que pour la protéine pansyaptique Synaptophysine29 (Figure 1F).
Figure 1 : Vue d’ensemble de la culture et de la reprogrammation des astrocytes. (A)Chronologie de la conversion directe des astrocytes en neurones. Chaque ligne noire représente une étape importante du protocole. (B) Images représentatives en champ clair d’astrocytes dérivés de la moelle épinière en culture après 7 jours de culture. Les photos ont été prises à l’aide d’un microscope à fond clair et d’un objectif 10x. La barre d’échelle représente 100 μm. (C) Images représentatives en champ clair des astrocytes de la moelle épinière 1 jour après le replaçage à une densité de 5,5 x 104 cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à fond clair et d’un objectif 10x. La barre d’échelle représente 100 μm. (D) Image d’immunofluorescence d’une triple coloration βIII-tub, Sox9, GFAP sur des astrocytes fixés 1 jour après le placage pour démontrer la pureté de la culture. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min et lavées deux fois avec 1x PBS. Les cellules ont été bloquées à l’aide d’une solution de 3 % de BSA et de Triton-X 100 à 0,5 % dans une solution de PBS à 1x. Les anticorps primaires ont été dilués à la bonne concentration (p. ex., anti-GFAP 1:250; bac anti-βIII 1:250; anti-Syp1 1:500) en solution bloquante et incubés pendant 2 h à température ambiante. Les cellules ont été lavées trois fois avec 1x PBS et incubées avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore pendant 1 h à température ambiante. Les couvercles ont été lavés trois fois avec 1x PBS avant d’être montés avec Aqua Poly / Mount. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un objectif 40x. La barre d’échelle représente 20 μm. (E) Image d’immunofluorescence d’une double coloration d’une baignoire βIII, DsRed pour démontrer la conversion des astrocytes en neurones avec Ascl1 après 7 DPT. Le protocole d’immunofluorescence et d’acquisition d’images était tel que décrit ci-dessus. La barre d’échelle représente 20 μm. (F) Images d’immunofluorescence d’une triple coloration de la βIII-tub, DsRed, synaptophysine 1 (Syp1) pour démontrer la maturité neuronale après 21 DPT de reprogrammation avec Ascl1. Le protocole d’immunofluorescence et d’acquisition d’images était tel que décrit ci-dessus. La barre d’échelle représente 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les cultures primaires d’astrocytes murins sont un système modèle in vitro remarquable pour étudier la reprogrammation neuronale directe. En fait, bien qu’isolées à un stade postnatal, les cellules expriment des marqueurs astrocytaires typiques29, conservent l’expression des gènes de motif 28,29 et maintiennent la capacité de proliférer, semblable aux astrocytes in vivo à un âge comparablede 38 ans. Après l’isolement médié par macs, les cellules adhèrent d’abord à la fiole, puis commencent à proliférer, donnant lieu à des cultures d’astrocytes hautement enrichies29. Il est important de noter que les astrocytes cultivés ne se dédifférencient pas dans un état cellulaire multipotent ni ne sont immortalisés. De plus, ils ne génèrent pas spontanément de neurones suite à l’expression d’une protéine rapporteure (par exemple, DsRed ou GFP), mais maintiennent une identité astrocytaire. En outre, ils ne prolifèrent pas indéfiniment, mais ralentissent plutôt leur prolifération et leur transition vers un stade plus mature, ce qui réduit leur potentiel de reprogrammation neuronale directe32,39.
Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole: tout d’abord, il est essentiel d’isoler soigneusement la région d’intérêt et d’éliminer tout tissu contaminant. Par exemple, pour préparer les astrocytes de la moelle épinière, la moelle épinière est extraite des vertèbres et les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont soigneusement enlevés. Deuxièmement, les cellules en conversion subissent une mort cellulaire importante34, ce qui a un impact négatif sur les cellules transduites et la culture globale, en raison de la stimulation de la phagocytose par les astrocytes environnants ainsi que de l’osmolarité du milieu altéré. Par conséquent, il est important de remplacer le milieu astrocytaire par un volume adéquat de milieu de différenciation (généralement 1 mL / puits d’une plaque de 24 puits). De plus, la transfection de l’ADN plasmidique est une approche facile et plus accessible par rapport à la transduction virale, qui nécessite une salle de culture cellulaire approuvée de niveau de sécurité 2. Cependant, le taux de transfection et l’efficacité de reprogrammation sont inférieurs à ceux de l’administration virale des facteurs de reprogrammation. Par conséquent, la transfection peut être utilisée comme méthode rapide pour tester le potentiel de reprogrammation de nouveaux facteurs de reprogrammation candidats ou pour filtrer des pools de facteurs. En ce qui concerne la maturation neuronale, les cellules reprogrammées deviennent généralement électrophysiologiquement actives vers 3 semaines. Bien que cela ne soit pas nécessaire, le traitement des cellules avec de petites molécules augmente à la fois la survie et la maturation des cellules reprogrammées, ce qui conduit à une densité plus élevée de neurones induits et à une morphologie plus mature.
Bien que la méthode décrite pour isoler et mettre en culture des astrocytes soit robuste et fiable, quelques aspects doivent être pris en compte. Tout d’abord, alors que les méthodes conventionnelles basées sur la dissociation mécanique des tissus donnent un nombre globalement plus élevé de cellules en culture par tissu disséqué40, une approche triée MAC nécessite la dissection de tissu de six à huit petits pour isoler un nombre adéquat de cellules pour des expériences ultérieures. De plus, l’isolement des astrocytes est basé sur l’expression de la sous-unité de transport ATPase Na+/K+ de la protéine Beta2 (Atp1b2), reconnue par l’anticorps ACSA-241. En principe, les astrocytes n’exprimant pas Atp1b2 seraient perdus dans la préparation, provoquant ainsi un biais dans la préparation. Bien que nous ne puissions pas exclure que ce soit le cas, notre analyse du flux MACS a révélé que peu de cellules de la fraction négative étaient immunoréactives pour les marqueurs astroglies Sox9, suggérant la grande efficacité du protocole de tri MAC. Une deuxième mise en garde concernant Atp1b2 est liée à son expression. L’Atp1b2 est spécifiquement exprimée par les astrocytes au stade postnatal, tandis que dans le cerveau adulte de la souris, d’autres types de cellules l’expriment, en particulier les oligodendrocytes myélinisants et les cellules épendymaires27. Par conséquent, une dissection minutieuse de la zone d’intérêt et une étape d’élimination de la myéline sont nécessaires pour isoler les astrocytes du cerveau adulte.
Par rapport à d’autres méthodes d’isolement des astrocytes, l’approche basée sur MACS assure une grande pureté des cultures (>90% des cellules Sox9+) et fournit une procédure standardisée pour isoler les astrocytes de différentes régions du SNC. Ceci est particulièrement important lors de la comparaison de cultures de différentes régions du SNC, car la pureté de culture obtenue par dissociation mécanique classique peut varier considérablement (>80% GFAP + / DAPI de la matière grise corticale, ~ 50% GFAP + / DAPI de la moelle épinière)15,29. Un protocole standardisé réduit cette variabilité et fournit un point de départ commun pour les expériences de reprogrammation in vitro. Cela permet, par exemple, de comparer systématiquement l’identité moléculaire des astrocytes de différentes régions28,29 et d’étudier l’impact de l’origine développementale sur l’efficacité de la reprogrammation et l’identité du sous-type des neurones induits.
En résumé, la reprogrammation neuronale directe in vitro de cultures optimisées d’astrocytes est une approche très puissante pour démêler les mécanismes moléculaires universels et spécifiques à la région de la conversion astrocyte-neurone, fournissant des informations essentielles pour concevoir des stratégies meilleures et plus efficaces pour la conversion directe in vivo des astrocytes résidents du SNC.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Ines Mühlhahn pour le clonage des constructions pour la reprogrammation, Paulina Chlebik pour la production virale, et Magdalena Götz et Judith Fischer-Sternjak pour les commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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