Summary
여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
직접 뉴런 재 프로그래밍은 다능성 중간체를 통과하지 않고 다른 스타터 세포 집단에서 기능적 뉴런을 생성하는 강력한 접근법입니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환을 앓고있는 환자의 섬유 아세포를 뉴런으로 전환 할 수 있기 때문에 질병 모델링 분야에서 큰 약속을 지닐뿐만 아니라 세포 기반 대체 요법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 이러한 맥락에서, 주요한 과학적 돌파구는 성상세포와 같은 중추신경계 내에서 분화된 비신경세포가 시험관내에서 기능적 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증하는 것이었다. 그 이후로, 성상세포를 뉴런으로 시험관 내에서 직접 재프로그래밍하는 것은 강제 정체성 변환의 기초가 되는 분자 메커니즘과 효율적인 재프로그래밍을 방해하는 장애물에 대한 실질적인 통찰을 제공했다. 그러나, 상이한 실험실에서 수행된 시험관내 실험으로부터의 결과는 성상세포를 분리, 배양 및 재프로그래밍하는데 사용되는 방법의 차이로 인해 비교하기가 어렵다. 여기에서는 자기 세포 분류를 통해 출생 후 생쥐의 중추 신경계의 다른 영역에서 고순도의 성상 세포를 안정적으로 분리하고 배양하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 바이러스 형질도입 또는 DNA 형질감염을 통해 배양된 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공합니다. 이 간소화되고 표준화 된 프로토콜은 세포 동일성 유지의 기초가되는 분자 메커니즘, 새로운 신경 정체성의 확립, 특정 신경 아류형의 생성 및 그 기능적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
Introduction
포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 7,8,9와는 달리, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다10. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다11. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법12로 부상하고 있다. 직접 재프로그래밍 또는 전분화는 하나의 분화된 세포 유형을 중간 증식성 또는 다능성 상태13,14,15,16을 거치지 않고 새로운 동일성으로 전환시키는 과정이다. 섬유아세포를 근육세포(17,18)로 전환시키기에 충분한 인자로서 MyoD1의 확인에 의해 개척된 이 방법은 여러 세포 유형을 기능적 뉴런(19,20,21)으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 적용되었다.
CNS22,23에서 가장 풍부한 거대 아교세포 인 성상 세포는 여러 가지 이유로 직접 신경 재 프로그래밍을위한 특히 유망한 세포 유형입니다. 첫째, 그들은 CNS에 걸쳐 광범위하고 균등하게 분포되어 새로운 뉴런을위한 유전자좌 공급원이 풍부합니다. 둘째, 성상세포와 뉴런은 배아 발달 동안 공통조상인 방사상 신경교세포(24)를 공유하기 때문에 발달적으로 밀접한 관련이 있다. 두 세포 유형의 일반적인 배아 기원은 상이한 배아층19,21로부터의 세포의 재프로그래밍과 비교하여 뉴런 전환을 촉진하는 것으로 보인다. 더욱이, 그들의 방사상 신경교세포 기원을 통해 성상세포에 의해 유전된 패터닝 정보는 성인 성상세포(25,26,27)에서도 유지되며, 지역적으로 적절한 뉴런 아형(28,29,30)의 생성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 성상세포가 뉴런으로 전환되는 것을 조사하고 이해하는 것은 세포 기반 대체 전략에 대한이 기술의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 중요한 부분입니다.
시험관내 배양된 성상세포를 뉴런으로 전환시키는 것은 다음을 포함하는 직접적인 뉴런 리프로그래밍 분야에서 몇 가지 돌파구를 가져왔다: i) 성상세포로부터 뉴런을 생성하기에 충분한 전사 인자의 확인15,19,31, ii) 동일한 세포 맥락에서 상이한 리프로그래밍 인자에 의해 촉발된 분자 메커니즘의 풀림(32) iii) 성상세포의 발달 기원이 상이한 뉴런 아류형을 유도하는 것에 미치는 영향을 강조한다28,29,33. 더욱이, 성상세포의 시험관내 직접 전환은 증가된 반응성 산소 종(ROS) 생산(34) 및 성상세포와 뉴런(35)의 미토콘드리아 프로테옴 사이의 차이와 같은 직접적인 뉴런 재프로그래밍(34,35)을 제한하는 몇 가지 주요 장애물을 풀었다. 따라서 이러한 관찰은 세포 정체성 유지, 세포 운명 변화를 막는 장애물 및 재 프로그래밍에서 신진 대사의 역할과 관련된 생물학12의 몇 가지 근본적인 질문을 조사하기 위해 직접 신경 재 프로그래밍을위한 모델로서 성상 세포의 일차 배양을 사용하는 것을 강력히지지합니다.
여기서 우리는 뮤린 척수29로부터 성상세포를 분리함으로써 입증된 바와 같이, 매우 높은 순도로 출생 후 (P) 나이에 마우스로부터 성상세포를 분리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 바이러스 형질도입 또는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공한다. 재프로그램된 세포는 형질도입 후 7일(7 DPT)에서 분석되어 리프로그래밍 효율 및 뉴런 형태학과 같은 다양한 측면을 평가하거나, 수주 동안 배양물에서 유지될 수 있고, 시간에 따른 성숙을 평가할 수 있다. 중요하게도, 이 프로토콜은 척수 성상세포에 특이적이지 않으며, 피질 회색 물질, 중뇌 및 소뇌를 포함한 다양한 다른 뇌 영역으로부터 성상세포를 분리하는데 용이하게 적용될 수 있다.
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Protocol
다음 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 헬름홀츠 젠트럼 뮌헨의 동물 관리 지침을 따릅니다. 해부가 수행되는 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.
1. 해부, 해리 및 배양 재료의 준비
참고: 생물학적 안전 캐비닛 내의 모든 배양 시약을 준비하고 오토클레이브 또는 멸균 장비만 사용하여 작업하십시오. 해부 및 해리 시약은 생물학적 안전 캐비닛 외부에서 제조될 수 있다.
- T25 배양 플라스크를 H2O에 폴리-D-라이신 (스톡 1 mg/mL; 작업 용액 20 μg/mL)으로 코팅하여 배양 플라스크를 최소2시간 동안 준비한다. 그런 다음H2O로 3x 헹구고 공기 건조하십시오.
- 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 500 mL에 1 M HEPES 완충액 5 mL를 첨가하여 해부 완충액을 준비하십시오.
- 신경 조직 해리 키트로부터 1950 μL의 완충액 X를 첨가하여 여섯 척수 당 하나의 C-튜브 ( 물질 표 참조)를 준비 하십시오 (자료 표 참조). 해부 중에 얼음에 보관하십시오. C-튜브 당 20 μL의 완충액 Y 및 10 μL의 완충액 A를 첨가하여 효소적 소화 마스터 믹스를 제조하였다 (신경 조직 해리 키트의 일부; 물질 표 참조). 잘 섞어서 필요할 때까지 4°C에서 보관한다.
- 칼슘과 마그네슘으로 1x 인산염 완충 식염수 (1x PBS)를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. DMEM/F12 485 mL에 페니실린-스트렙토마이신 5 mL(최종 농도, 100 U/mL), 45% D-글루코스 5 mL, 글루타민 보충제 5 mL(최종 농도 2 mM; 물질표 참조)를 첨가하여 기본 배양 배지를 준비한다. 기본 배지는 4주 동안 4°C에서 안정하다.
- 기본 배양 배지 44 mL에 B27 보충제 1 mL와 소 태아 혈청 (FBS) 5 mL를 첨가하여 성상세포 배양 배지를 준비한다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) (각각 10 ng/mL)를 가진 보충 배지. EGF 및 bFGF를 적절한 양의 배지에 사용하기 직전에 첨가한다.
- 척수 조직의 해부를 위해서는 구부러진 팁이있는 한 쌍의 큰 포셉, 구부러진 팁이있는 작은 포셉 한 쌍, 작은 포셉 한 쌍, 작은 가위 한 쌍 및 작은 주걱을 사용하십시오.
2. 성상세포 분리
- 성상세포를 산후 마우스의 척수로부터 분리하여 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍을 수행한다(그림 1A). 이 프로토콜을 위해, 출생 후 2-3 일째에 마우스로부터 척수 조직을 수집하십시오. 성상세포 분리를 위해 여섯 개에서 여덟 개의 척수를 수집합니다. 이 동일한 프로토콜을 사용하여 성상 세포를 피질, 중뇌 및 소뇌와 같은 신경계의 다른 영역으로부터 분리하십시오. 이 지역의 경우, 출생 후 다섯 일에서 칠일 사이에 세포를 얻으십시오.
참고: 이 프로토콜에서 언급되지 않은 영역에서 성상세포를 분리하는 것을 목표로 할 때, 나이와 투입 물질은 실험적으로 결정되어야 한다.
3. 척수 조직 해부
참고 : 조직의 해부는 생물학적 안전 캐비닛 외부에서 수행 할 수 있습니다.
- 동물을 마취시키지 않고 탈구함으로써 P2-P3에서 마우스를 희생시킨다. 몸통을 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오.
- 가위로 피부를 열고, 작은 가위로 척추를 제거하고, 척수를 추출하고, 얼음 위의 해부 완충액에 넣으십시오. 2x 배율의 입체 박리 현미경으로 포셉을 사용하여 분리 된 척수에서 수막을 제거하고 해부되고 세척 된 척수 조직을 C 튜브로 옮깁니다.
4. 자기 활성화 세포 분류 (MACS)
- 신경 조직 해리 키트(표 표 참조)로부터 50 μL 의 효소 P와 이전에 제조된 30 μL의 효소 믹스를 각 C-튜브에 첨가한다. C 튜브를 뒤집어 가열 된 해리기 ( 재료 표 참조)에 놓고 모든 조직이 튜브의 뚜껑에 수집되었는지 확인하십시오.
- 실행 시간이 약 22분인 37_NTDK_1 해리 프로그램을 실행합니다. 프로그램이 끝나기 직전에 사용된 C-튜브 수와 동일한 15mL 튜브에 70μm 스트레이너( 자료표 참조)를 놓고 스트레이너를 빙냉 PBS 2mL로 미리 적시십시오. 전체 MACS 절차 중에 얼음에 1x PBS를 저장합니다.
- 프로그램 완료 후 C-튜브를 제거하고 간단히 원심분리하여 튜브 하단의 조직을 수집합니다. 해리된 조직을 C-튜브로부터 스트레이너를 통해 통과시켜 준비된 15 mL 튜브로 옮긴다. 스트레이너를 15mL 튜브에 두십시오.
- 1x PBS로 10 mL의 C-튜브를 헹구어 남은 조직을 수집하고, 스트레이너를 한번 더 통과시켜 동일한 15 mL 튜브에 수집한다. 해리된 조직을 함유하는 15 mL 튜브를 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
참고: 이 단계 후에 원심분리기를 4°C까지 냉각하십시오. - 세포를 1x PBS의 80 μL에 재현탁시키기 전에 세포 펠릿을 교란시키지 않고 상청액을 제거하고; 마우스 항-ACSA-2 마이크로비드 키트로부터 10 μL의 블로킹 시약을 첨가 한다(표 참조). 피펫팅으로 부드럽게 섞으십시오.
- 어둠 속에서 10분 동안 4°C에서 인큐베이션한다(냉장고). 10 μL의 항성상세포 세포 표면 항원-2-결합 마이크로비드( 표 참조)를 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합한다. 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 3 mL의 1x PBS를 첨가하고 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 세척하였다. 원심분리하는 동안, 적절한 수의 자기 분류 컬럼(재료 표 참조)을 15 mL 수집 튜브가 있는 세퍼레이터 상에 배치하여 자기 분리기(재료 표 참조)를 조립한다. 컬럼을 500 μL의 1x PBS로 헹구십시오.
- 상청액을 제거하고 세포 현탁액을 자기 컬럼으로 옮기기 전에 세포를 1x PBS의 500 μL에 재현탁시켰다. 중력에 의해 배수하게하십시오. 15 mL 튜브를 500 μL의 1x PBS로 세척하고 컬럼에 적용한다. 컬럼을 추가로 두 번의 세척을 위해 500 μL의 1x PBS로 세척한다.
- 분리기로부터 컬럼을 제거하고, 800 μL의 성상세포 배양 배지를 첨가하고, 포함된 플런저로 컬럼 밖으로 세포를 밀어냄으로써 유체 세포.
- 플레이트 세포를 EGF 및 bFGF가 보충된 성상세포 배양 배지 4.2 mL를 첨가하여 미리 제조된 배양 플라스크에 넣고 37°C 및 5%CO2에서 배양하였다.
참고 : 코팅 배양 플라스크는 다른 뇌 영역에서 분리 된 성상 세포에는 필요하지 않지만 척수에서 분리 된 성상 세포에 대한 더 나은 기질을 제공합니다. - 세포를 컨플루언시까지 약 7일 동안 배양한다(80%-90%). 셀이 7 일 후에 합류하지 않으면 도금하기 전에 10 일까지 기다리십시오. 10 일 후에 세포는 더 이상 증식하지 않으며 재 프로그래밍 효율은 떨어집니다.
5. 재 프로그래밍을위한 성상 세포의 시딩
참고: 다음 단계는 안전 레벨 1(SL1)이 있는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
- 배양 플라스크를 이전에 제조했던 것과 동일한 방법으로 폴리-D-라이신 코팅된 유리 커버슬립으로 24-웰 플레이트를 준비하였다. 필요한 플레이트의 수를 결정하기 위해, 성상세포가24 -웰 플레이트에서 웰당 5-5.5 x 10 4 세포의 밀도로 플레이팅된다는 것을 고려한다. 일반적으로 P2 마우스에서 6 척수를 분리하면 약 1 x 106 세포가 생성됩니다.
- 배양된 성상세포를 함유하는 T25 배양 플라스크로부터의 흡인물 배지를 1x PBS로 1회 세척한다. 0.5 mL의 0.05% 트립신/EDTA를 첨가하여 배양 플라스크로부터 성상세포를 분리하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면으로부터 세포를 방출하고 10X 배율을 사용하여 밝은 현장 현미경으로 박리를 확인합니다.
- 2.5 mL의 성상세포 배양 배지로 트립신화를 중단하고 15 mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하십시오. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 1 mL의 성상세포 배양 배지에 재현탁시킨다. 혈소세포계 또는 자동화된 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다.
- 세포 수에 기초하여, 세포 현탁액을 신선한 성상세포 배지로 희석하여 mL당 1-1.1 x 105 세포의 용액을 얻었다. 배지에 EGF 및 bFGF를 인자당 10ng/mL로 보충하십시오. 5-5.5 x 10 4 세포에 상응하는 500 μL의 세포 현탁액을 미리 제조된24 -웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
6. 전사인자의 강제 발현
참고: 프로토콜을 진행하기 전에 실험을 올바르게 설계하는 것이 중요합니다. 특히, 리프로그래밍에 대한 네거티브 컨트롤, 즉 리프로그래밍 요소가 표현되지 않는 조건을 항상 포함하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 리프로그래밍 인자 및 리포터(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), DsRed)에 대한 cDNA를 운반하는 벡터를 사용하는 경우, 음성 대조군은 리포터만을 운반하는 동일한 벡터로 표시된다. 서로 다른 기자를 운반하는 여러 요인을 표현할 때, 부정적인 통제는 그에 따라 조정되어야합니다.
- 도금 다음 날, 24웰 플레이트를 검사하여 셀이 커버슬립에 부착되었는지 확인합니다.
- 실험 목표 및 이용가능한 자원에 기초하여, 리프로그래밍 인자의 강제 발현은 바이러스 형질도입(단계 6.3 참조) 또는 DNA 형질감염(단계 6.4 참조)에 의해 달성될 수 있다.
참고: 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하려면 정부 당국의 승인이 필요하며 안전 수준 2(SL2)의 실험실 내의 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다. - 세포를 유전 정보를 운반하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 형질도입하여 하기에 기재된 바와 같이 관심있는 리프로그래밍 인자(들)를 발현시킴으로써 성상세포를 재프로그래밍한다.
- 1 x 10 10-1 x 1012 입자 / mL의 높은 바이러스 역가를 가진 세포를 1 μL의 세포 현탁액을 성상 세포 배지에 직접 첨가하여 형질도입하십시오. 이것은 높은 감염률을 보장합니다. 실험의 목적에 따라 섹션 7 또는 섹션 8로 진행하기 전에 24-36 h 동안 바이러스 입자를 함유하는 성상세포 배지로 세포를 배양한다.
참고: 상이한 프로모터가 전이유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다(또한 대표적인 결과 참조). 구성적 프로모터 (예를 들어, CMV, CAG)는 유도성 프로모터보다 일찍 전이유전자의 발현을 유도하고; 그러나, 두 유형의 프로모터 유형 모두 세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 사용되었다.
- 1 x 10 10-1 x 1012 입자 / mL의 높은 바이러스 역가를 가진 세포를 1 μL의 세포 현탁액을 성상 세포 배지에 직접 첨가하여 형질도입하십시오. 이것은 높은 감염률을 보장합니다. 실험의 목적에 따라 섹션 7 또는 섹션 8로 진행하기 전에 24-36 h 동안 바이러스 입자를 함유하는 성상세포 배지로 세포를 배양한다.
- DNA 플라스미드는 또한 하기에 기재된 바와 같이 DNA 형질감염을 통해 성상세포 내로 도입될 수 있다.
참고: 이것은 SL1에 대해 승인된 생물학적 안전 캐비닛에서 수행할 수 있습니다.- 형질감염 전에, 형질감염 시약, 원하는 구축물의 플라스미드 DNA, 신선한 성상세포 배지, 및 혈청-환원 배지를 수득한다( 표 참조). 24-웰 플레이트의 각 웰이 300 μL의 혈청 환원 배지를 필요로 한다는 것을 고려하여 혈청 감소 배지의 필요한 양을 계산한다( 표 문헌 참조). 적절한 양의 혈청 환원 배지를 50 mL 튜브에 첨가하고 이를 37°C로 가온한다.
- 혈청 감소 배지가 따뜻해지면, 모든 웰로부터 성상세포 배지를 흡인하고 이를 50 mL 튜브에 수집한다. 수집된 성상세포 배지를 0.45 μM 시린지 필터로 여과하여 분리된 세포를 제거하였다.
- 여과된 배지에 동일한 부피의 신선한 성상세포 배지를 첨가하여 웰 당 1 mL의 성상세포 배지를 첨가하기에 충분한 용액을 얻었다. 성상세포 컨디셔닝 배지를 사용할 때까지 인큐베이터 내의 37°C로 유지한다(단계 6.4.9).
참고: 배양 배지는 배양물의 생존력을 지원하는 몇 가지 분비 인자를 포함하기 때문에 재사용됩니다. - 300 μL의 예비-가온된 혈청-환원 배지를 각 웰에 첨가하고, 24-웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 놓는다.
- DNA 및 혈청 환원 배지로 구성된 용액 A를 준비한다. 각 웰에 대해 총 0.6 μg의 DNA를 사용하고 50 μL의 혈청 환원 배지에 첨가한다. 용액 A를 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
참고: 일반적으로 조건당 기술적 트리플라이케이트가 고려됩니다. 따라서, 24-웰 플레이트의 3웰을 형질감염시키기에 충분한 물질을 보장하기 위해 3.5 반응에 충분한 혼합 (예를 들어, 혈청 감소 배지의 175 μL에 희석된 총 DNA 2.1 μg)이 제조된다. - 형질감염 시약 및 혈청 환원 배지로 구성된 용액 B를 준비한다. 각 웰에 대해, 0.75 μL의 형질감염 시약을 50 μL의 혈청 환원 배지에 첨가한다. 이 용액은 모든 형질감염 조건에 공통적이므로 형질감염에 걸친 변동성을 줄이기 위해 대량으로 준비하십시오.
- 용액 B를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 용액 A에 용액 B를 1:1 비율로 한 방울씩 떨어뜨리고 부드럽게 섞는다. 소용돌이치지 마십시오. 용액 A + B를 후드 아래의 실온에서 20-30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 모든 형질감염 조건에 대해 6.4.5-6.4.7단계를 반복한다. 20-30분 후, 용액 A+B를 각 웰에 100 μL의 최종 부피 동안 적하하여 떨어뜨린다. 플레이트를 부드럽게 진탕하고 세포를 다시 37°C에서 4시간 동안 인큐베이터에 넣는다.
- 4시간 후, 형질감염 배지를 제거하고 단계 6.4.3에서 제조된 미리 가온된 성상세포 컨디셔닝 배지 1 mL를 첨가한다. 실험의 목적에 따라 섹션 7 또는 섹션 8로 진행하기 전에 36-48 시간 동안 세포를 유지한다.
7. 성상세포의 재프로그래밍 (7일 분석)
- 기본 배지 49 mL에 B27-보충제 1 mL를 첨가하여 뉴런 분화 배지를 제조하였다(단계 1.4 참조). 24-48시간 후, 세포가 형질도입 또는 형질감염되었는지에 따라(각각 단계 6.3 및 6.4 참조), 성상세포 배지를 웰당 1 mL의 뉴런 분화 배지로 교체하고 세포를 37°C 및 9%CO2에서 배양한다.
참고: 9% CO2 인큐베이터가 없는 경우 세포를 5%CO2 로 유지할 수도 있습니다. 그러나 뉴런 재 프로그래밍은 이러한 조건 하에서 더 효율적입니다. - 선택사항: 리프로그래밍 효율을 높이려면 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 신경세포 분화 배지에 포스콜린(최종 농도 30 μM) 및 도르소모르핀(최종 농도 1 μM)을 보충합니다. Forskolin 및 Dorsomorphin으로 세포를 치료하기로 선택할 때 초기 치료 후 2 일 후에 Dorsomorphin의 두 번째 용량을 제공하십시오. 이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 첨가한다.
- 뮤린 성상세포를 뉴런 세포로 직접 재프로그래밍하는 것은 일반적으로 배지를 바꾼 후 7일 이내에 발생합니다. 따라서, 뉴런 재프로그래밍의 개시 후 7 일, 하류 분석을 위해 세포를 수정하거나 수집하십시오.
8. 성상세포를 성숙한 뉴런으로 재프로그래밍 (장기 배양)
- 기본 배지 49 mL에 B27-보충제 1 mL를 첨가하여 뉴런 분화 배지를 제조하였다(단계 1.4 참조). 24-48시간 후, 세포를 형질도입 또는 형질감염시켰는지에 따라(각각 단계 6.3 및 6.4 참조), 성상세포 배지를 웰당 포스콜린(최종 농도 30 μM) 및 도르소모르핀(최종 농도 1 μM)으로 보충된 뉴런 분화 배지 1 mL로 교체하고 세포를 37°C 및 9%CO2에서 배양하였다.
참고: 9% CO2 인큐베이터가 없는 경우 세포를 5%CO2 로 유지할 수도 있습니다. 그러나 뉴런 재 프로그래밍은 이러한 조건 하에서 더 효율적입니다. - 초기 치료 2일 후에 Dorsomorphin 처리를 반복하여 이를 뉴런 분화 배지에 직접 첨가한다.
- 뉴런 리프로그래밍의 시작으로부터 7일 후, 6 μL의 N2, 1.2 μL의 NT3 (스톡 20 μg/mL), 1.2 μL의 BDNF (스톡 20 μg/mL), 1.2 μL의 GDNF (스톡 20 μg/mL), 및 1.2 μL의 cAMP (스톡 100 mM)를 189.2 μL의 신경 분화 배지에 첨가하여 성숙 배지를 제조하였다. 각 웰에 존재하는 뉴런 분화 배지를 200 μL의 성숙 배지로 보충한다.
참고 : 성숙 배지는 첫 번째 치료에만 보충됩니다. 모든 후속 치료는 하기에 기재된 바와 같이 뉴런 분화 배지를 부분적으로 대체함으로써 수행된다. - 200 μL의 뉴런 분화 배지를 제거하고 200 μL의 신선한 성숙 배지를 일주일에 두 번 첨가하여 최대 6 주 동안 소분자로 치료를 반복하십시오. 성숙 동안, 세포를 전기생리학적 실험(전형적으로, 21일째 이상)에 사용하거나, 하류 분석(예를 들어, 면역형광)을 위해 고정시킨다.
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Representative Results
성상세포의 일차 배양은 일반적으로 MAC 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80 % -90 % 합류율에 도달합니다 (그림 1B). 일반적으로, 단일 T25 배양 플라스크는 약 1-1.5 x 106 세포를 산출하며, 이는 웰 당 5-5.5 x 104 세포의 밀도로 세포를 시딩할 때 20-30 커버슬립에 충분하다. 도금 다음 날, 전지는 일반적으로 커버슬립 표면의 50%-60%를 덮는다(그림 1C). 이 단계에서 배양물은 거의 독점적으로 성상세포로 구성되어 있는 반면, 신경아세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 존재하지 않는다(그림 1D)29.
리프로그래밍 인자는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 통해 또는 DNA 플라스미드의 형질감염을 통해 성상세포에 전달될 수 있다. 보통, 바이러스 형질도입은 형질감염에 비해 더 많은 세포를 감염시킨다. 직접적인 뉴런 전환은 상당한 양의 세포 사멸(34,35)을 야기하기 때문에, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입은 분석을 위한 세포의 수를 최대화하기 위해 바람직하다. 상이한 프로모터가 리프로그래밍 인자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다: 구성적 (예를 들어, CMV, CAG)15,32, 유도성 (예를 들어, Tet-반응성 요소, Tet-ON)21, 또는 세포 유형 특이적 (예를 들어, GFAP 프로모터)36,37. 구성적 또는 세포형 특이적 프로모터를 사용하는 경우, 성상세포는 유전자 전달 후 24시간 이내에 형광 리포터 발현(예를 들어, GFP, DsRed)에 의해 평가되고, 각 세포는 다른 세포와 무관하게 전이유전자의 검출가능한 수준을 발현하기 시작한다. 반대로, 유도성 프로모터는 이들이 배양 배지에 소분자(예를 들어, 독시사이클린)를 첨가한 후에 활성화되기 때문에 형질도입된 세포에 걸친 전이유전자의 발현을 동기화하는 것을 허용한다. 전사 인자의 검출가능한 수준은 일반적으로 프로모터의 활성화 후 18-20 h에 도달한다. 대부분의 경우, 리프로그래밍 인자 발현의 피크는 약 48 h에서 도달하며, 렌티바이러스 매개 발현은 약간 더 오래 걸린다.
재프로그래밍 인자 발현에 따른 전사 변화는 4 h 32만큼 일찍 검출 될 수 있지만,강력한 변화는 24 h 및 이후29,32 후에 발생한다. 형태학적 변화는 전사 변화를 따르며, 전환의 첫 징후는 형질도입/형질감염 후 약 3일 후(3DPT) 관찰될 수 있다. 7 DPT에서, 유도 된 신경 세포는 성상 세포와 명확하게 구별 할 수 있습니다 : 그들의 소마는 대조군 또는 재 프로그램되지 않은 성상 세포보다 작고, 긴 과정을 가지고 있으며, 신경 마커 βIII-tub에 대해 양성이며 성상 세포 마커 GFAP에 대해 음성입니다 (그림 1E). 그러나, 일부 세포는 GFAP 및 βIII-tub 둘 다에 대해 양성일 수 있으며, 이는 뉴런 프로그램이 유도되었지만 성상세포 동일성이 억제되지 않았거나, 또는 두 마커 모두에 대해 음성적일 수 있음을 시사하며, 이는 성상세포 정체성의 억제를 나타내지만 뉴런 캐스케이드의 유도의 부재를 나타낸다. 두 경우 모두 세포는 일반적으로 성상 세포 형태를 유지합니다.
전기생리학 또는 생성된 뉴런 아류형의 평가와 같은 보다 기능적 분석을 위해, 배양물은 일반적으로 최소 21 DPT 동안 유지되고 성숙 배지로 처리된다. 21 DPT에서, 많은 유도된 뉴런은 작용 전위를 발사할 수 있고, 성숙한 뉴런 마커 NeuN 뿐만 아니라 범시냅스 단백질 시냅토피신29 에 대해 양성이다(도 1F).
그림 1 : 성상 세포 배양 및 재 프로그래밍의 개요. (A) 성상 세포 대 뉴런 직접 전환의 타임 라인. 각 검은 선은 프로토콜의 중요한 단계를 나타냅니다. (b) 배양 7일 후 배양된 척수 유래 성상세포의 대표적인 브라이트필드 이미지. 사진은 밝은 필드 현미경과 10x 목표를 사용하여 촬영되었습니다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. (C) 24-웰 플레이트에서 웰 당 5.5 x 104 세포의 밀도로 재도금 1일 후 척수 성상세포의 대표적인 브라이트필드 이미지. 이미지는 밝은 필드 현미경과 10x 목표를 사용하여 촬영되었습니다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. (D) 배양 순도를 입증하기 위해 도금 1일 후 고정된 성상세포에 대한 βIII-tub, Sox9, GFAP 삼중 염색의 면역형광 이미지. 세포를 10분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 1x PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 1x PBS 용액 중의 3% BSA, 0.5% 트리톤-X 100을 사용하여 차단하였다. 1차 항체를 적절한 농도로 희석하고(예를 들어, 항-GFAP 1:250; 항-βIII-tub 1:250; 항-Syp1 1:500) 블로킹 용액에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1x PBS로 세 번 세척하고, 실온에서 1시간 동안 형광단-접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 커버슬립은 아쿠아 폴리/마운트로 장착하기 전에 1x PBS로 세 번 세척하였다. 이미지는 후피형광 현미경 및 40x 목표를 사용하여 획득하였다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (E) βIII-tub의 면역형광 이미지, 7 DPT 후 Ascl1로 성상세포 뉴런 전환을 입증하기 위한 DsRed 이중 염색. 면역형광 및 이미지 획득의 프로토콜은 전술한 바와 같았다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (F) Ascl1로 리프로그래밍한 21 DPT 후 뉴런 성숙을 입증하기 위해 βIII-tub, DsRed, Synaptophysin 1(Syp1) 삼중 염색의 면역형광 이미지. 면역형광 및 이미지 획득의 프로토콜은 상기 기재된 바와 같았다. 배율 막대는 20μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
뮤린 성상세포의 일차 배양은 직접적인 뉴런 재프로그래밍을 연구하는 놀라운 시험관내 모델 시스템이다. 실제로, 출생 후 단계에서 단리되었음에도 불구하고, 세포는 전형적인 성상세포 마커(29)를 발현하고, 패터닝 유전자(28,29)의 발현을 유지하며,38세에 생체내 성상세포와 유사하게 증식하는 능력을 유지한다. MACS-매개 단리 후, 세포는 먼저 플라스크에 부착 한 다음 증식하기 시작하여 고도로 농축 된 성상 세포 배양29을 일으킨다. 중요하게도, 배양된 성상세포는 다분화능 세포 상태로 탈분화되거나 불멸화되지 않는다는 것이다. 더욱이, 이들은 리포터 단백질 (예를 들어, DsRed 또는 GFP)의 발현 이후에 자발적으로 뉴런을 생성하지 않지만, 성상세포 동일성을 유지한다. 또한, 그들은 무기한으로 증식하지 않고, 오히려 그들의 증식을 늦추고 더 성숙한 단계로 전환하여 직접적인 신경 재 프로그래밍 잠재력을 감소시킵니다32,39.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 첫째, 관심 영역을 신중하게 분리하고 오염 된 조직을 제거하는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 척수 성상세포를 제조하기 위해, 척수는 척추로부터 추출되고 등쪽 뿌리 신경절(DRG)은 조심스럽게 제거된다. 둘째, 전환 세포는 상당한 세포 사멸(34)을 겪는데, 이는 형질도입된 세포 및 전체 배양에 부정적인 영향을 미치며, 이는 주변 성상세포에 의한 식작용의 자극 및 변경된 배지 삼투압으로 인해 발생한다. 따라서 성상세포 배지를 적절한 부피의 분화 배지(보통 24웰 플레이트의 1mL/웰)로 대체하는 것이 중요합니다. 추가적으로, 플라스미드 DNA의 형질감염은 바이러스 형질도입에 비해 쉽고 접근하기 쉬운 접근법이며, 이는 승인된 안전성 수준 2 세포 배양실을 필요로 한다. 그러나, 형질감염 속도 및 재프로그래밍 효율은 리프로그래밍 인자의 바이러스 매개 전달에 비해 낮다. 따라서, 트랜스펙션은 새로운 후보 리프로그래밍 인자의 재프로그래밍 잠재력을 테스트하거나 인자의 풀을 스크리닝하기 위한 빠른 방법으로 사용될 수 있다. 뉴런 성숙과 관련하여, 재프로그램된 세포는 보통 약 3주에 전기생리학적으로 활성화된다. 필수는 아니지만, 세포를 작은 분자로 처리하면 생존 뿐만 아니라 재프로그램된 세포의 성숙이 증가하여 유도된 뉴런의 밀도가 높아지고 더 성숙한 형태학이 생깁니다.
성상세포를 분리하고 배양하는 기술된 방법이 견고하고 신뢰할 만하지만, 몇 가지 측면이 고려될 필요가 있다. 첫째, 조직의 기계적 해리에 기초한 종래의 방법은 해부된 조직당 배양물(40개)에서 전체적으로 더 많은 수의 세포를 산출하는 반면, MAC 분류 접근법은 후속 실험을 위해 적절한 수의 세포를 분리하기 위해 여섯 마리에서 여덟 마리의 새끼까지 조직을 해부해야 한다. 더욱이, 성상세포의 단리는 항체 ACSA-241에 의해 인식된 ATPase Na+/K+ 수송 서브유닛 베타2 단백질 (Atp1b2)의 발현에 기초한다. 원칙적으로, Atp1b2를 발현하지 않는 성상세포는 제제에서 손실될 것이고, 따라서 제제에 편향을 야기할 것이다. 이것이 사실이라는 것을 배제 할 수는 없지만, MACS 흐름에 대한 우리의 분석은 음성 분획의 세포가 아스트로 글리아 마커 Sox9에 대해 면역 반응성이 거의 없다는 것을 밝혀 MAC 분류 프로토콜의 높은 효율성을 시사합니다. Atp1b2에 관한 두 번째주의 사항은 그 표현과 관련이 있습니다. Atp1b2는 출생 후 단계에서 성상세포에 의해 특이적으로 발현되는 반면, 마우스 성인 뇌에서는 다른 세포 유형, 특히 골수화 올리고덴드로사이트 및 상피 세포27을 발현한다. 따라서 성상세포를 성인 뇌로부터 분리하기 위해서는 관심 영역의 신중한 해부와 미엘린 제거 단계가 필요합니다.
성상 세포를 분리하는 다른 방법과 비교할 때, MACS 기반 접근법은 배양물의 고순도 (Sox9 + 세포의 >90 %)를 보장하고 CNS의 다른 영역에서 성상 세포를 분리하는 표준화 된 절차를 제공합니다. 이것은 고전적인 기계적 해리에 의해 얻어지는 배양 순도가 현저하게 변할 수 있기 때문에 다른 CNS 지역의 배양물을 비교할 때 특히 중요합니다 (피질 회색 물질에서 >80 % GFAP + / DAPI, 척수에서 ~ 50 % GFAP + / DAPI)15,29. 표준화된 프로토콜은 이러한 가변성을 감소시키고 시험관내 재프로그래밍 실험을 위한 공통 출발점을 제공한다. 이것은 예를 들어, 상이한 영역(28,29)으로부터의 성상세포의 분자 동일성을 체계적으로 비교하고, 발달 기원이 유도된 뉴런의 재프로그래밍 효율 및 아형 동일성에 미치는 영향을 조사하는 것을 허용한다.
요약하면, 성상세포의 최적화된 배양물의 시험관내 직접 뉴런 리프로그래밍은 성상세포-뉴런 전환의 보편적인 뿐만 아니라 지역-특이적 분자 메카니즘을 푸는 매우 강력한 접근법이며, 상주 CNS 성상세포의 생체내 직접 전환을 위한 더 효과적이고 효과적인 전략을 설계하는데 필수적인 정보를 제공한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 재 프로그래밍을위한 구조를 복제 한 Ines Mühlhahn, 바이러스 생산을위한 Paulina Chlebik, 원고에 대한 의견에 대한 Magdalena Götz와 Judith Fischer-Sternjak에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
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