Summary
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at generere højt berigede kulturer af astrocytter afledt af forskellige regioner i centralnervesystemet hos postnatale mus og deres direkte omdannelse til funktionelle neuroner ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer.
Abstract
Direkte neuronal omprogrammering er en kraftfuld tilgang til at generere funktionelle neuroner fra forskellige startcellepopulationer uden at passere gennem multipotente mellemprodukter. Denne teknik har ikke kun store løfter inden for sygdomsmodellering, da den gør det muligt at konvertere for eksempel fibroblaster til patienter, der lider af neurodegenerative sygdomme til neuroner, men repræsenterer også et lovende alternativ til cellebaserede erstatningsterapier. I denne sammenhæng var et stort videnskabeligt gennembrud demonstrationen af, at differentierede ikke-neurale celler i centralnervesystemet, såsom astrocytter, kunne omdannes til funktionelle neuroner in vitro. Siden da har in vitro direkte omprogrammering af astrocytter til neuroner givet betydelig indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for tvungen identitetskonvertering og de forhindringer, der forhindrer effektiv omprogrammering. Resultater fra in vitro-forsøg udført i forskellige laboratorier er imidlertid vanskelige at sammenligne på grund af forskelle i de metoder, der anvendes til at isolere, dyrke og omprogrammere astrocytter. Her beskriver vi en detaljeret protokol til pålidelig isolering og dyrkning af astrocytter med høj renhed fra forskellige regioner i musens centralnervesystem i postnatale aldre via magnetisk cellesortering. Desuden leverer vi protokoller til omprogrammering af dyrkede astrocytter til neuroner via viral transduktion eller DNA-transfektion. Denne strømlinede og standardiserede protokol kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for vedligeholdelse af celleidentitet, etablering af en ny neuronal identitet samt generering af specifikke neuronale undertyper og deres funktionelle egenskaber.
Introduction
Pattedyrs centralnervesystem (CNS) er meget komplekst og består af hundredvis af forskellige celletyper, herunder et stort antal forskellige neuronale undertyper 1,2,3,4,5,6. I modsætning til andre organer eller væv 7,8,9 har pattedyrets CNS en meget begrænset regenerativ kapacitet; neuronalt tab efter traumatisk hjerneskade eller neurodegeneration er irreversibel og resulterer ofte i motoriske og kognitive underskud10. Med det formål at redde hjernefunktioner er forskellige strategier til erstatning af tabte neuroner under intens undersøgelse11. Blandt dem fremstår direkte omprogrammering af somatiske celler til funktionelle neuroner som en lovende terapeutisk tilgang12. Direkte omprogrammering eller transdifferentiering er processen med at konvertere en differentieret celletype til en ny identitet uden at passere gennem en mellemliggende proliferativ eller pluripotent tilstand 13,14,15,16. Banebrydende ved identifikation af MyoD1 som en faktor, der er tilstrækkelig til at omdanne fibroblaster til muskelceller17,18, er denne metode med succes blevet anvendt til at omprogrammere flere celletyper til funktionelle neuroner 19,20,21.
Astrocytter, den mest rigelige makroglia i CNS 22,23, er en særlig lovende celletype til direkte neuronal omprogrammering af flere grunde. For det første er de bredt og jævnt fordelt over CNS, hvilket giver en rigelig i loco kilde til nye neuroner. For det andet er astrocytter og neuroner udviklingsmæssigt nært beslægtede, da de deler en fælles forfader under embryonal udvikling, de radiale gliaceller24. Den fælles embryonale oprindelse af de to celletyper synes at lette neuronal konvertering sammenlignet med omprogrammering af celler fra forskellige kimlag19,21. Desuden opretholdes mønsterinformation arvet af astrocytter gennem deres radiale glia-oprindelse også i voksne astrocytter 25,26,27 og synes at bidrage til dannelsen af regionalt passende neuronale subtyper 28,29,30. Derfor er undersøgelse og forståelse af omdannelsen af astrocytter til neuroner en vigtig del af at opnå det fulde potentiale af denne teknik til cellebaserede udskiftningsstrategier.
Omdannelsen af in vitro-dyrkede astrocytter til neuroner har ført til flere gennembrud inden for direkte neuronal omprogrammering, herunder: i) identifikation af transkriptionsfaktorer, der er tilstrækkelige til at generere neuroner fra astrocytter 15,19,31, ii) optrævling af molekylære mekanismer udløst af forskellige omprogrammeringsfaktorer i samme cellulære kontekst32 , og iii) fremhæve virkningen af astrocytternes udviklingsmæssige oprindelse på inducering af forskellige neuronale undertyper 28,29,33. Desuden afslørede in vitro direkte omdannelse af astrocytter flere store forhindringer, der begrænser direkte neuronal omprogrammering34,35, såsom øget reaktiv iltart (ROS) produktion34 og forskelle mellem mitokondrieproteomet af astrocytter og neuroner35. Derfor understøtter disse observationer stærkt brugen af primære kulturer af astrocytter som en model for direkte neuronal omprogrammering for at undersøge flere grundlæggende spørgsmål i biologi12, relateret til vedligeholdelse af celleidentitet, vejspærringer, der forhindrer celleskæbneændringer, samt metabolismens rolle i omprogrammering.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering af astrocytter fra mus i postnatal (P) alder med meget høj renhed, som demonstreret ved at isolere astrocytter fra murin rygmarven29. Vi leverer også protokoller til omprogrammering af astrocytter til neuroner via viral transduktion eller DNA-plasmidtransfektion. Omprogrammerede celler kan analyseres 7 dage efter transduktion (7 DPT) for at vurdere forskellige aspekter, såsom omprogrammeringseffektivitet og neuronal morfologi, eller kan opretholdes i kultur i flere uger for at vurdere deres modning over tid. Det er vigtigt, at denne protokol ikke er specifik for rygmarvsastrocytter og let kan anvendes til at isolere astrocytter fra forskellige andre hjerneområder, herunder kortikale grå substans, mellemhjerne og cerebellum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedure følger retningslinjerne for dyrepleje fra Helmholtz Zentrum München i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Sørg for at overholde retningslinjerne for dyrepleje i den institution, hvor dissektionen udføres.
1. Forberedelse af dissektions-, dissociations- og kulturmaterialer
BEMÆRK: Forbered alle kulturreagenser i et biologisk sikkerhedsskab, og arbejd kun ved hjælp af autoklaveret eller sterilt udstyr. Dissektions- og dissociationsreagenser kan fremstilles uden for et biologisk sikkerhedsskab.
- Der fremstilles kulturkolber ved overtræk af en T25-kulturkolbe med poly-D-lysin (lager 1 mg/ml; arbejdsløsning 20 μg/ml) iH2O i mindst 2 timer. Skyl derefter 3x med H2O og lufttørres.
- Forbered dissektionsbuffer ved at tilsætte 5 ml 1 M HEPES-bufferopløsning til 500 ml Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS).
- Forbered et C-rør (se materialetabel) pr. seks rygmarv ved at tilføje 1950 μL buffer X fra neuralvævsdissociationssættet (se materialetabel). Opbevares på is under dissektion. Forbered enzymatisk fordøjelsesmasterblanding ved at tilsætte 20 μL buffer Y og 10 μL buffer A pr. C-rør (en del af neuralvævsdissociationssættet; se materialetabel). Bland godt og opbevar ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
- Forbered 1x fosfatbufferet saltvand (1x PBS) med calcium og magnesium og læg det på is. Forbered basisk kulturmedium ved at tilsætte 5 ml penicillin-streptomycin (slutkoncentration, 100 U / ml), 5 ml 45% D-glucose og 5 ml glutamintilskud (slutkoncentration 2 mM; se materialetabel) til 485 ml DMEM / F12. Basismediet er stabilt ved 4 °C i 4 uger.
- Forbered astrocytkulturmedium ved at tilsætte 1 ml B27-supplement og 5 ml føtalt bovint serum (FBS) til 44 ml basisk kulturmedium. Suppler medium med epidermal vækstfaktor (EGF) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (10 ng / ml hver). Tilsæt EGF og bFGF lige før brug til den passende mængde medium.
- Til dissektion af rygmarvsvæv skal du bruge et par store tang med bøjet spids, et par små tang med bøjet spids, et par små tang, et par små sakse og en lille spatel.
2. Astrocytisolering
- Isoler astrocytter fra rygmarven hos postnatale mus til udførelse af deres direkte omprogrammering til funktionelle neuroner (figur 1A). Til denne protokol skal du indsamle rygmarvsvæv fra mus på dag 2-3 efter fødslen. Saml seks til otte rygmarv til astrocytisolering. Brug den samme protokol til at isolere astrocytter fra andre regioner i nervesystemet, såsom cortex, mellemhjerne og cerebellum. For disse regioner skal du få celler fem til syv dage efter fødslen.
BEMÆRK: Når man sigter mod at isolere astrocytter fra regioner, der ikke er nævnt i denne protokol, skal alder og inputmateriale bestemmes eksperimentelt.
3. Dissektion af rygmarvsvæv
BEMÆRK: Dissektion af væv kan udføres uden for et biologisk sikkerhedsskab.
- Ofre mus ved P2-P3 ved halshugning uden bedøvelse af dyret. Læg torsoen i en 35 mm petriskål og opbevar den på is.
- Åbn huden med en saks, fjern ryghvirvlen med en lille saks, træk rygmarven ud og læg den i dissektionsbuffer på is. Under et stereotaktisk dissektionsmikroskop med 2x forstørrelse skal du fjerne hjernehinderne fra de isolerede rygmarv ved hjælp af tang og overføre dissekeret og renset rygmarvsvæv til et C-rør.
4. Magnetisk aktiveret cellesortering (MACS)
- Der tilsættes 50 μL enzym P fra neuralvævsdissociationssættet (se materialetabel) og 30 μL tidligere fremstillet enzymblanding til hvert C-rør. Vend C-rørene om, og anbring dem på en opvarmet dissociator (se Materialetabel), og sørg for, at alt væv opsamles i rørets låg.
- Kør 37_NTDK_1 dissociationsprogrammet med en køretid på ca. 22 min. Kort før programmets afslutning anbringes en 70 μm si (se materialetabel) på et antal 15 ml rør svarende til antallet af anvendte C-rør og forfugter sien med 2 ml iskold PBS. Opbevar 1x PBS på is under hele MACS-proceduren.
- Efter afslutningen af programmet skal du fjerne C-rør og kort centrifugere dem for at samle vævet i bunden af rørene. Det dissocierede væv overføres fra C-rørene til de 15 ml rør, der er fremstillet ved at føre det gennem sien. Lad sien stå på 15 ml rør.
- Skyl C-røret med 10 ml 1x PBS for at opsamle resterende væv og samle det i det samme 15 ml rør ved at passere gennem silen igen. 15 ml rør indeholdende dissocieret væv centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Centrifugen afkøles til 4 °C efter dette trin. - Supernatanten fjernes uden at forstyrre cellepillen, før cellerne genoplives i 80 μL 1x PBS. Tilsæt 10 μL blokerende reagens fra musens anti-ACSA-2 MicroBead kit (se Materialetabel). Bland forsigtigt ved pipettering.
- Inkuberes ved 4 °C i 10 minutter i mørke (køleskab). Der tilsættes 10 μL anti-astrocytcelleoverfladeantigen-2-koblede mikroperler (se Materialetabel) og blandes forsigtigt ved pipettering. Inkuberes i 15 minutter ved 4 °C i mørke.
- Cellerne vaskes ved tilsætning af 3 ml 1x PBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Under centrifugering samles en magnetisk separator (se Materialetabel) ved at placere det passende antal magnetiske sorteringskolonner (se Materialetabel) på separatoren med et 15 ml opsamlingsrør nedenunder. Kolonnerne skylles med 500 μL 1x PBS.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 500 μL 1x PBS, før cellesuspensionerne overføres til de magnetiske søjler. Lad dræne ved tyngdekraften. 15 ml rørene vaskes med 500 μL 1x PBS og påføres søjlen. Kolonnerne vaskes med 500 μL 1x PBS for yderligere to vaske.
- Elute celler ved at fjerne søjlen fra separatoren, tilføje 800 μL astrocytkulturmedium og skubbe celler ud af søjlen med det medfølgende stempel.
- Pladeceller i de tidligere fremstillede kulturkolber ved tilsætning af 4,2 ml astrocytkulturmedium suppleret med EGF og bFGF og dyrkning ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Belægningskulturkolber er ikke nødvendige for astrocytter isoleret fra andre hjerneområder, men giver et bedre substrat for astrocytter isoleret fra rygmarven. - Kulturceller i ca. 7 dage indtil sammenløb (80% -90%). Hvis cellerne ikke er sammenløbende efter 7 dage, skal du vente indtil 10 dage, før de pletteres. Efter 10 dage spredes celler ikke længere, og omprogrammeringseffektiviteten falder.
5. Såning af astrocytter til omprogrammering
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres under et biologisk sikkerhedsskab med et sikkerhedsniveau 1 (SL1).
- Forbered 24-brønds plader med poly-D-lysinbelagte glasdæksler på samme måde som kulturkolber blev fremstillet tidligere. For at bestemme antallet af plader, der er nødvendige, skal du overveje, at astrocytter er belagt med en densitet på 5-5,5 x 104 celler pr. Brønd i en 24-brøndplade. Normalt giver isolering af seks rygmarv fra P2-mus omkring 1 x 106 celler.
- Aspireremedier fra T25-kulturkolber indeholdende de dyrkede astrocytter vaskes én gang med 1x PBS. Astrocytterne fjernes fra kulturkolben ved tilsætning af 0,5 ml Trypsin/EDTA, og der inkuberes ved 37 °C i 5 minutter. Tryk forsigtigt på siden af kolben for at frigøre celler fra kulturkolbens overflade, og kontroller løsrivelsen under et brightfieldmikroskop ved hjælp af en 10X forstørrelse.
- Stop trypsinisering med 2,5 ml astrocytkulturmedium og saml cellesuspension i 15 ml rør. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter, aspirat supernatant og resuspend celler i 1 ml astrocytkulturmedium. Cellekoncentrationen beregnes ved hjælp af et hæmocytometer eller et automatiseret celletællingssystem.
- Baseret på antallet af celler fortyndes cellesuspensionen med frisk astrocytmedium for at opnå en opløsning på 1-1,1 x 105 celler pr. Ml. Suppler mediet med EGF og bFGF ved 10 ng/ml pr. faktor. Der tilsættes 500 μL cellesuspension, svarende til 5-5,5 x 104 celler, til hver brønd af de tidligere fremstillede 24-brønds plader og kulturceller ved 37 °C og 5 % CO2.
6. Tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer
BEMÆRK: Før du fortsætter med protokollen, er det vigtigt at designe eksperimentet korrekt. Det er især vigtigt altid at medtage en negativ kontrol for omprogrammeringen, nemlig en betingelse, hvor der ikke udtrykkes nogen omprogrammeringsfaktor. For eksempel, når der anvendes vektorer, der bærer cDNA til omprogrammeringsfaktoren og en reporter (f.eks. Grønt fluorescerende protein (GFP), DsRed), repræsenteres den negative kontrol af den samme vektor, der kun bærer reporteren. Når der udtrykkes flere faktorer, der bærer forskellige indberettere, bør den negative kontrol justeres i overensstemmelse hermed.
- Dagen efter plettering skal du inspicere pladerne med 24 brønde for at sikre, at cellerne har klæbet til dækslerne.
- Baseret på det eksperimentelle mål og tilgængelige ressourcer kan den tvungne ekspression af omprogrammeringsfaktorer opnås ved viral transduktion (se trin 6.3) eller DNA-transfektion (se trin 6.4).
BEMÆRK: Brug af retrovirus eller lentivirus kræver godkendelse fra offentlige myndigheder og skal udføres under et biologisk sikkerhedsskab i et laboratorium med sikkerhedsniveau 2 (SL2). - Omprogrammer astrocytterne ved at transducere cellerne med retrovirus eller lentivirus, der bærer den genetiske information for at udtrykke den eller de omprogrammeringsfaktorer, der er af interesse som beskrevet nedenfor.
- Transducer celler med en høj virustitre på 1 x 1010-1 x 1012 partikler /ml ved at tilsætte 1 μL af cellesuspensionen direkte til astrocytmediet. Dette sikrer en høj infektionsrate. Cellerne med astrocytmediet indeholdende viruspartikler dyrkes ved 37 °C i 24-36 timer, før de fortsætter med punkt 7 eller afsnit 8, afhængigt af formålet med forsøget.
BEMÆRK: Forskellige promotorer kan bruges til at drive transgenes udtryk (se også Repræsentative resultater). Konstitutive promotorer (f.eks. CMV, CAG) inducerer ekspressionen af transgenet tidligere end inducerbare promotorer; imidlertid er begge typer promotortyper med succes blevet brugt til at omprogrammere celler til neuroner.
- Transducer celler med en høj virustitre på 1 x 1010-1 x 1012 partikler /ml ved at tilsætte 1 μL af cellesuspensionen direkte til astrocytmediet. Dette sikrer en høj infektionsrate. Cellerne med astrocytmediet indeholdende viruspartikler dyrkes ved 37 °C i 24-36 timer, før de fortsætter med punkt 7 eller afsnit 8, afhængigt af formålet med forsøget.
- DNA-plasmider kan også indføres i astrocytter via DNA-transfektion som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Dette kan gøres under et biologisk sikkerhedsskab, der er godkendt til SL1.- Før transfektion opnås transfektionsreagenset, et plasmid-DNA af de ønskede konstruktioner, frisk astrocytmedium og serumreduceret medium (se Materialetabel). Beregn den krævede mængde serumreduceret medium (se materialetabel) ved at overveje, at hver brønd i en 24-brøndplade kræver 300 μL serumreduceret medium. Der tilsættes en passende mængde serumreduceret medium til et 50 ml rør, og det opvarmes til 37 °C.
- Når det serumreducerede medium er varmt, aspireres astrocytmedium fra alle brønde og opsamles i et 50 ml rør. Det opsamlede astrocytmedium filtreres med et sprøjtefilter på 0,45 μM for at fjerne løsrevne celler.
- Der tilsættes et lige stort volumen frisk astrocytmedium til det filtrerede medium for at opnå en opløsning, der er tilstrækkelig til at tilsætte 1 ml astrocytmedium pr. Brønd. Det astrocytkonditionerede substrat i inkubatoren fastholdes ved 37 °C indtil brug (trin 6.4.9).
BEMÆRK: Kulturmediet genbruges, da det indeholder flere udskillede faktorer, der understøtter kulturens levedygtighed. - Tilsæt 300 μL forvarmet serumreduceret medium til hver brønd og læg 24-brøndpladen tilbage til inkubatoren.
- Forbered opløsning A, der består af DNA og serumreduceret medium. For hver brønd skal du bruge i alt 0,6 μg DNA og tilføje det til 50 μL serumreduceret medium. Opbevar opløsning A ved stuetemperatur indtil brug.
BEMÆRK: Typisk overvejes en teknisk tredobling pr. tilstand. Derfor fremstilles en blanding, der er tilstrækkelig til 3,5 reaktion (f.eks. 2,1 μg totalt DNA fortyndet i 175 μL serumreduceret medium) for at sikre tilstrækkeligt materiale til at transfektere tre brønde af en 24-brøndplade. - Der fremstilles opløsning B, der består af transfektionsreagenset og det serumreducerede medium. For hver brønd tilsættes 0,75 μL transfektionsreagens til 50 μL serumreduceret medium. Da denne løsning er fælles for alle transfektionsbetingelser, skal du forberede den i bulk for at reducere variabiliteten på tværs af transfektioner.
- Inkubere opløsning B ved stuetemperatur i 5 min. Der tilsættes opløsning B til opløsning A dråbe for dråbe i forholdet 1:1, og bland forsigtigt. Må ikke hvirvle. Inkubere opløsning A+B i 20-30 min ved stuetemperatur under emhætten.
- Trin 6.4.5-6.4.7 gentages for alle transfektionsbetingelser. Efter 20-30 minutter tilsættes opløsning A + B til hver brønd dråbe for dråbe for et endeligt volumen på 100 μL. Ryst forsigtigt pladen og læg cellerne tilbage i inkubatoren ved 37 ° C i 4 timer.
- Efter 4 timer fjernes transfektionsmediet, og der tilsættes 1 ml af det forvarmede astrocytkonditionerede medium, der er fremstillet i trin 6.4.3. Vedligehold celler i 36-48 timer, før du fortsætter med afsnit 7 eller afsnit 8, afhængigt af formålet med eksperimentet.
7. Omprogrammering af astrocytter (7 dages analyse)
- Forbered neuronal differentieringsmedium ved at tilføje 1 ml B27-supplement til 49 ml basiskulturmedium (se trin 1.4). Efter 24-48 timer, afhængigt af om celler er blevet transduceret eller transficeret (se henholdsvis trin 6.3 og 6.4), erstattes astrocytmedium med 1 ml neuronalt differentieringsmedium pr. brønd og kulturceller ved 37 ° C og 9% CO2.
BEMÆRK: Celler kan også opbevares på 5% CO2 , hvis der ikke er nogen 9% CO2-inkubator til rådighed. Neuronal omprogrammering er imidlertid mere effektiv under disse forhold. - Valgfrit: For at øge omprogrammeringseffektiviteten skal du supplere neuronal differentieringsmedium med Forskolin (slutkoncentration på 30 μM) og Dorsomorphin (slutkoncentration på 1 μM), når astrocytmediet erstattes til differentieringsmedium. Når du vælger at behandle celler med Forskolin og Dorsomorphin, skal du give en anden dosis Dorsomorphin 2 dage efter den indledende behandling. Tilsæt denne anden behandling direkte til kulturmediet.
- Direkte omprogrammering af murin astrocytter til neuronale celler forekommer normalt inden for 7 dage efter ændring af mediet. Derfor, 7 dage efter initiering af neuronal omprogrammering, fix eller indsamling af celler til downstream analyse.
8. Omprogrammering af astrocytter til modne neuroner (langsigtede kulturer)
- Forbered neuronal differentieringsmedium ved at tilføje 1 ml B27-supplement til 49 ml basiskulturmedium (se trin 1.4). Efter 24-48 timer, afhængigt af om cellerne er transduceret eller transficeret (se henholdsvis trin 6.3 og 6.4), erstattes astrocytmedium med 1 ml neuronalt differentieringsmedium suppleret med Forskolin (slutkoncentration på 30 μM) og Dorsomorphin (slutkoncentration på 1 μM) pr. brønd og kulturceller ved 37 °C og 9 % CO2.
BEMÆRK: Celler kan også opbevares på 5% CO2 , hvis der ikke er nogen 9% CO2-inkubator til rådighed. Neuronal omprogrammering er imidlertid mere effektiv under disse forhold. - Dorsomorphin-behandlingen gentages 2 dage efter den indledende behandling ved at tilføje den direkte til det neuronale differentieringsmedium.
- Efter 7 dage fra starten af neuronal omprogrammering fremstilles modningsmedium ved tilsætning af 6 μL N2, 1,2 μL NT3 (lager 20 μg/ ml), 1,2 μL BDNF (lager 20 μg / ml), 1,2 μL GDNF (lager 20 μg / ml) og 1,2 μL cAMP (lager 100 mM) til 189,2 μL neuronal differentieringsmedium. Suppler neuronal differentieringsmedium til stede i hver brønd med 200 μL modningsmedium.
BEMÆRK: Modningsmedium suppleres kun til den første behandling. Alle efterfølgende behandlinger udføres ved delvist at erstatte det neuronale differentieringsmedium som beskrevet nedenfor. - Gentag behandlingen med små molekyler ved at fjerne 200 μL neuronalt differentieringsmedium og tilsætte 200 μL frisk modningsmedium to gange om ugen i op til 6 uger. Under modningen skal du bruge celler til elektrofysiologiske eksperimenter (typisk på dag 21 eller senere) eller fix til downstream-analyse (f.eks. Immunfluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære kulturer af astrocytter når typisk 80% -90% sammenløb mellem 7 og 10 dage efter MAC-sortering og plettering (figur 1B). Generelt giver en enkelt T25-kulturkolbe omkring 1-1,5 x 106 celler, hvilket er tilstrækkeligt til 20-30 dækslips, når der podes celler med en densitet på 5-5,5 x 104 celler pr. Brønd. Dagen efter plettering dækker celler typisk 50% -60% af dækslipoverfladen (figur 1C). På dette stadium består kulturer næsten udelukkende af astrocytter, mens andre celletyper, såsom neuroblaster, er næsten fraværende (figur 1D)29.
Omprogrammeringsfaktorer kan leveres til astrocytter enten via retroviral eller lentiviral transduktion eller gennem transfektion af DNA-plasmider. Normalt inficerer viral transduktion flere celler sammenlignet med transfektion. Da direkte neuronal konvertering forårsager en betydelig mængde celledød34,35, foretrækkes retroviral eller lentiviral transduktion for at maksimere antallet af celler til analyse. Forskellige promotorer kan bruges til at kontrollere ekspressionen af omprogrammeringsfaktorerne: konstitutive (f.eks. CMV, CAG)15,32, inducerbare (f.eks. Tet-responsive elementer, Tet-ON)21 eller celletypespecifikke (f.eks. GFAP-promotor)36,37. Ved anvendelse af konstitutive eller celletypespecifikke promotorer begynder astrocytter at udtrykke påviselige niveauer af transgenene, vurderet ved fluorescerende reporterekspression (f.eks. GFP, DsRed), inden for 24 timer efter genafgivelsen, hvor hver celle er uafhængig af de andre. Omvendt tillader inducerbare promotorer at synkronisere ekspressionen af transgenene på tværs af de transducerede celler, da de aktiveres efter tilsætning af et lille molekyle (f.eks. doxycyclin) til kulturmediet. Detekterbare niveauer af transkriptionsfaktorerne nås normalt 18-20 timer efter aktiveringen af promotoren. I de fleste tilfælde nås toppen af omprogrammeringsfaktorekspressionen omkring 48 timer, hvor lentivirusmedieret ekspression tager lidt længere tid.
Mens transkriptionelle ændringer efter omprogrammeringsfaktorers ekspression kan detekteres så tidligt som 4 h32, forekommer robuste ændringer efter 24 timer og senere29,32. Morfologiske ændringer følger transkriptionelle ændringer, og første tegn på konvertering kan observeres omkring 3 dage efter transduktion / transfektion (3 DPT). Ved 7 DPT skelnes inducerede neuronale celler tydeligt fra astrocytter: deres soma er mindre end kontrol- eller uprogrammerede astrocytter, de har lange processer, og de er positive for neuronal markør βIII-kar og er negative for astrocytmarkør GFAP (figur 1E). Det er dog værd at bemærke, at nogle celler enten kan være positive for både GFAP og βIII-kar, hvilket tyder på, at neuronalprogrammet er blevet induceret, men astrocytidentiteten er ikke blevet hæmmet eller negativ for begge markører, hvilket indikerer undertrykkelsen af astrocytidentiteten, men fraværet af induktion af den neuronale kaskade. I begge tilfælde opretholder cellerne normalt en astrocytmorfologi.
For mere funktionelle analyser, såsom elektrofysiologi eller evaluering af de genererede neuronale undertyper, opretholdes kulturer generelt i mindst 21 DPT og behandles med modningsmedium. Ved 21 DPT er mange inducerede neuroner i stand til at affyre handlingspotentialer og er positive for den modne neuronale markør NeuN såvel som for det pansynaptiske protein Synaptophysin29 (figur 1F).
Figur 1: Oversigt over astrocytkultur og omprogrammering. (A)Tidslinje for direkte konvertering af astrocyt til neuron. Hver sort linje repræsenterer et vigtigt trin i protokollen. (B) Repræsentative brightfieldbilleder af dyrkede rygmarvsafledte astrocytter efter 7 dage i kultur. Billeder blev taget ved hjælp af et brightfield mikroskop og 10x mål. Skalabjælke repræsenterer 100 μm. (C) Repræsentative brightfieldbilleder af rygmarvsastrocytter 1 dag efter re-plating ved en densitet på 5,5 x 104 celler pr. Brønd i en 24-brøndplade. Billederne blev taget ved hjælp af et brightfield mikroskop og et 10x mål. Skalabjælke repræsenterer 100 μm. (D) Immunofluorescensbillede af et βIII-kar, Sox9, GFAP tredobbelt farvning på astrocytter fastgjort 1 dag efter plettering for at demonstrere kulturrenhed. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og vasket to gange med 1x PBS. Celler blev blokeret ved hjælp af en 3% BSA, 0,5% Triton-X 100 i 1x PBS-opløsning. Primære antistoffer blev fortyndet i den korrekte koncentration (f.eks. anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) i blokerende opløsning og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Celler blev vasket tre gange med 1x PBS og inkuberet med fluoroforkonjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Dækslips blev vasket tre gange med 1x PBS, før de blev monteret med Aqua Poly/Mount. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et epifluorescensmikroskop og et 40x mål. Skalabjælke repræsenterer 20 μm. (E) Immunofluorescensbillede af et βIII-kar, DsRed dobbeltfarvning for at demonstrere astrocyt til neuronkonvertering med Ascl1 efter 7 DPT. Protokol for immunfluorescens og billedoptagelse var som beskrevet ovenfor. Skalabjælke repræsenterer 20 μm. (F) Immunofluorescensbilleder af et βIII-kar, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) tredobbelt farvning for at demonstrere neuronal modenhed efter 21 DPT omprogrammering med Ascl1. Protokol for immunfluorescens og billedoptagelse var som beskrevet ovenfor. Skalabjælke repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære kulturer af murin astrocytter er et bemærkelsesværdigt in vitro-modelsystem til at studere direkte neuronal omprogrammering. På trods af at de er isoleret på et postnatalt stadium, udtrykker celler faktisk typiske astrocytmarkører29, bevarer ekspressionen af mønstrende gener28,29 og opretholder evnen til at proliferere, svarende til in vivo astrocytter i en sammenlignelig alder38. Efter MACS-medieret isolering klæber celler først til kolben og begynder derefter at sprede sig, hvilket giver anledning til højt berigede astrocytkulturer29. Det er vigtigt, at dyrkede astrocytter ikke dedifferentierer i en multipotent celletilstand eller bliver udødeliggjort. Desuden genererer de ikke spontant neuroner efter ekspressionen af et reporterprotein (f.eks. DsRed eller GFP), men opretholder en astrocytidentitet. De formerer sig heller ikke på ubestemt tid, men bremser snarere deres spredning og overgang til et mere modent stadium, hvilket reducerer deres direkte neuronale omprogrammeringspotentiale32,39.
Der er flere kritiske trin i denne protokol: For det første er det vigtigt at omhyggeligt isolere interesseområdet og fjerne eventuelle forurenende væv. For eksempel for at forberede rygmarvsastrocytter ekstraheres rygmarven fra hvirvlerne, og de dorsale rodganglier (DRG) fjernes omhyggeligt. For det andet gennemgår konverterende celler signifikant celledød34, hvilket har en negativ indvirkning på de transducerede celler og den samlede kultur på grund af stimulering af fagocytose af omgivende astrocytter såvel som ændret media osmolaritet. Derfor er det vigtigt at udskifte astrocytmediet med et passende volumen differentieringsmedium (normalt 1 ml / brønd af en 24-brøndplade). Derudover er transfektion af plasmid-DNA en let og mere tilgængelig tilgang sammenlignet med viral transduktion, hvilket kræver et godkendt cellekulturrum på sikkerhedsniveau 2. Transfektionshastigheden og omprogrammeringseffektiviteten er imidlertid lavere sammenlignet med viralmedieret levering af omprogrammeringsfaktorerne. Derfor kan transfektion bruges som en hurtig metode til at teste omprogrammeringspotentialet for nye kandidatomprogrammeringsfaktorer eller til at screene puljer af faktorer. Med hensyn til neuronal modning bliver omprogrammerede celler normalt elektrofysiologisk aktive omkring 3 uger. Selvom det ikke er nødvendigt, øger behandling af cellerne med små molekyler både overlevelse såvel som modning af de omprogrammerede celler, hvilket fører til en højere tæthed af inducerede neuroner og en mere moden morfologi.
Selvom den beskrevne metode til at isolere og dyrke astrocytter er robust og pålidelig, skal nogle få aspekter overvejes. For det første, mens konventionelle metoder baseret på mekanisk dissociation af væv giver et samlet højere antal celler i kultur pr. væv dissekeret40, kræver en MAC-sorteret tilgang dissektion af væv fra seks til otte hvalpe for at isolere et tilstrækkeligt antal celler til efterfølgende forsøg. Desuden er isoleringen af astrocytter baseret på ekspressionen af ATPase Na +/K+ transporterende underenhed Beta2-protein (Atp1b2), genkendt af antistoffet ACSA-241. I princippet ville astrocytter, der ikke udtrykker Atp1b2, gå tabt i præparatet og derfor forårsage en bias i præparatet. Selvom vi ikke kan udelukke, at dette er tilfældet, afslørede vores analyse af MACS-gennemstrømning, at få celler i den negative fraktion var immunreaktive for astrogliamarkørerne Sox9, hvilket tyder på den høje effektivitet af MAC-sorteringsprotokollen. En anden advarsel vedrørende Atp1b2 er relateret til dens udtryk. Atp1b2 udtrykkes specifikt af astrocytter på postnatal fase, mens andre celletyper i musens voksne hjerne udtrykker det, især myeliniserende oligodendrocytter og ependymale celler27. Derfor kræves en omhyggelig dissektion af interesseområdet og et myelinfjernelsestrin for at isolere astrocytter fra voksne hjerner.
Sammenlignet med andre metoder til isolering af astrocytter sikrer den MACS-baserede tilgang høj renhed af kulturerne (>90% af Sox9+ celler) og giver en standardiseret procedure til isolering af astrocytter fra forskellige regioner i CNS. Dette er især vigtigt, når man sammenligner kulturer fra forskellige CNS-regioner, da kulturens renhed opnået ved klassisk mekanisk dissociation kan variere bemærkelsesværdigt (>80% GFAP + / DAPI fra kortikalt gråt stof, ~ 50% GFAP + / DAPI fra rygmarv) 15,29. En standardiseret protokol reducerer en sådan variabilitet og giver et fælles udgangspunkt for in vitro-omprogrammeringsforsøg. Dette giver for eksempel mulighed for systematisk at sammenligne den molekylære identitet af astrocytter fra forskellige regioner28,29 og at undersøge virkningen af udviklingsoprindelsen på omprogrammeringseffektiviteten og subtypeidentiteten af de inducerede neuroner.
Sammenfattende er in vitro direkte neuronal omprogrammering af optimerede kulturer af astrocytter en meget kraftfuld tilgang til at opklare universelle såvel som regionsspecifikke molekylære mekanismer for astrocyt-til-neuron-konvertering, hvilket giver vigtig information til at designe bedre og mere effektive strategier til in vivo direkte konvertering af residente CNS-astrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Ines Mühlhahn for kloning af konstruktionerne til omprogrammering, Paulina Chlebik for viral produktion og Magdalena Götz og Judith Fischer-Sternjak for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
