Summary
Das vorliegende Protokoll bietet eine effiziente und flexible Methode, um RNA aus nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung kultivierter Zellen zu isolieren und dann mittels qPCR zu validieren. Dies dient effektiv als Ersatz für andere RNA-Präparationskits.
Abstract
Die Trennung intrazellulärer Komponenten ist seit vielen Jahren ein Schlüsselwerkzeug in der Zellbiologie und konnte nützliche Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ihre Lage auf ihre Funktion auswirken kann. Insbesondere die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA ist im Zusammenhang mit Krebszellen und der Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente wichtig geworden. Der Kauf von Kits für die nukleär-zytoplasmatische RNA-Extraktion kann kostspielig sein, wenn viele der benötigten Materialien in einer typischen Laborumgebung gefunden werden können. Mit dem vorliegenden Verfahren, das teurere Kits oder andere zeitaufwändige Prozesse ersetzen kann, werden nur ein hausgemachter Lysepuffer, eine Tischzentrifuge und RNA-Isolationsreinigungssäulen benötigt, um nukleare und zytoplasmatische RNA zu isolieren. Lysepuffer wird verwendet, um die äußere Membran der Zelle sanft zu lysieren, ohne die Integrität der Kernhülle zu beeinträchtigen, wodurch ihre intrazellulären Komponenten freigesetzt werden können. Dann können die Kerne durch einen einfachen Zentrifugationsschritt isoliert werden, da sie eine höhere Dichte als die Lyselösung besitzen. Zentrifugation wird verwendet, um diese Bereiche basierend auf ihren Dichteunterschieden zu trennen, um subzelluläre Elemente im Zellkern von denen im Zytoplasma zu isolieren. Sobald die Zentrifugation die verschiedenen Komponenten isoliert hat, wird ein RNA-Clean-up-Kit verwendet, um den RNA-Gehalt zu reinigen, und es wird eine qPCR durchgeführt, um die Trennqualität zu validieren, die durch die Menge an nukleärer und zytoplasmatischer RNA in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert wird. Es wurden statistisch signifikante Trennungsgrade erreicht, was die Wirksamkeit des Protokolls verdeutlicht. Darüber hinaus kann dieses System für die Isolierung verschiedener RNA-Typen (Gesamt-, Klein-RNA usw.) angepasst werden, was eine gezielte Untersuchung von Zytoplasma-Kern-Wechselwirkungen ermöglicht und zum Verständnis der Unterschiede in der Funktion von RNA beiträgt, die sich im Zellkern und im Zytoplasma befindet.
Introduction
Die zelluläre Fraktionierung in subzelluläre Komponenten ermöglicht die Isolierung und Untersuchung definierter biochemischer Domänen und hilft bei der Bestimmung der Lokalisierung spezifischer zellulärer Prozesse und wie sich dies auf ihre Funktion auswirken kann1. Die Isolierung von RNA an verschiedenen intrazellulären Stellen kann eine verbesserte Genauigkeit der genetischen und biochemischen Analyse von Ereignissen auf Transkriptionsebene und anderen Wechselwirkungen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma ermöglichen, was als Hauptzweck des aktuellen Protokolls2 dient. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Isolierung von zytoplasmatischen und nukleären RNAs sicherzustellen, um ihre jeweilige Rolle beim Kernexport zu bestimmen und zu verstehen, wie die subzelluläre Lokalisation von RNAs im Zellkern und im Zytoplasma ihre Funktion in zellulären Prozessen beeinflussen kann. Durch die Verwendung von Materialien aus einer typischen Laborumgebung war es möglich, eine nukleare und zytoplasmatische Fraktionierung effektiver und kostengünstiger als bisher etablierte Protokolle zu erreichen, ohne die Qualität der Ergebnisse zu gefährden3.
Darüber hinaus kann der Austausch von Molekülen zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern direkt untersucht werden, indem diese Regionen getrennt werden. Genauer gesagt ist das Verständnis des Transkriptoms für das Verständnis von Entwicklung und Krankheit unerlässlich. RNAs können sich jedoch zu einem bestimmten Zeitpunkt in unterschiedlichen Reifegraden befinden und die nachgelagerte Analyse erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von RNA aus nukleären und zytoplasmatischen subzellulären Fraktionen, was bei RNA-Studien hilfreich sein und ein besseres Verständnis einer bestimmten RNA von Interesse ermöglichen kann, wie z. B. die Lokalisierung nicht-kodierender RNAs oder die Analyse von Spleißverbindungen innerhalb des Zellkerns.
Dieses Protokoll wurde für die Isolierung zytoplasmatischer und nukleärer langer RNAs, einschließlich mRNAs, rRNAs und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), aufgrund der Größenselektivität der verwendeten RNA-Aufreinigungssäule optimiert, die modifiziert werden kann, um andere RNAs von Interesse zu isolieren. Bisher hing die Funktion langer RNAs, wie mRNAs und lncRNAs, stark von ihrer jeweiligen Lokalisation innerhalb der Zelleab 4,5. Daher ist die Untersuchung des Exports vom Zellkern in subzelluläre Domänen gezielter geworden, um die Rolle zu verstehen, die der Export von RNA oder anderen zellulären Komponenten auf die Zelle haben kann. lncRNAs dienen als Paradebeispiel dafür, da ihre Translation und ihre nachfolgenden Effekte weitgehend von der Nähe und den Wechselwirkungen mit anderen Formen von RNA6 abhängen. Darüber hinaus ist der Austausch zellulärer Elemente zwischen nukleären und zytoplasmatischen Regionen mit Resistenzmechanismen gegen verschiedene Krebsbehandlungen verbunden7. Die Isolierung intrazellulärer Kompartimente hat die Entwicklung von Kernexportinhibitoren ermöglicht, was die Auswirkungen von Resistenzmechanismen gegen verschiedene Therapien verringert hat8.
Nach der Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA werden Schritte durchgeführt, um die interessierende RNA zu reinigen. Da RNA-Aufreinigungskits häufig in Laboratorien zu finden sind und lange RNAs reinigen und isolieren, erfüllen sie den Zweck dieses Protokolls gut. Für die RNA-Aufreinigung ist die Erzeugung eines Verhältnisses von 260:280 von mehr als 1,8 entscheidend, um die Qualität der Proben für die RNA-Sequenzierung oder andere ähnliche Verfahren zu gewährleisten, die ein hohes Maß an Reinheit und Isolierung erfordern. Unregelmäßige Werte von 260:280 deuten auf eine Phenolkontamination hin, was auf eine schlechte Isolierung hinweist und zu ungenauen Ergebnissen führt9.
Sobald die RNA-Aufreinigung abgeschlossen ist und bestätigt wurde, dass die 260:280-Werte über einem akzeptablen Bereich liegen, wurde die qPCR verwendet, um die Isolationsergebnisse von Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In diesem Protokoll wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Marker verwendet10. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis einer hohen Kernfraktionierung mit MALAT1, während eine zytoplasmatische Fraktionierung voraussichtlich gering ist. Umgekehrt wird bei Verwendung von TUG1 erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus.
Mit Hilfe dieses Protokolls war es möglich, RNAs basierend auf ihrer Wirkungsposition innerhalb der Zelle zu isolieren. Aufgrund des weit verbreiteten Zugangs zu vielen Materialien und der Verwendung von nur Lysepuffer- und dichtebasierten Zentrifugationstechniken während dieses Experiments ist die Anwendbarkeit auf andere RNA-Typen und andere zelluläre Komponenten weit verbreitet. Dies kann wichtige Informationen liefern, indem standortspezifische Ausdrucksereignisse beleuchtet werden, die sonst ohne Trennung nicht zu unterscheiden wären.
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Protocol
Für die vorliegende Studie werden K562-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde für 1 x 10,6-5 x 10,6 Millionen Zellen optimiert. Das Verfahren kann jedoch für größere Zellmengen skaliert werden, indem die Volumina entsprechend erhöht werden.
1. Herstellung des 0,25-fachen Lysepuffers
- Bereiten Sie 0,25-fachen Lysepuffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 1A mischen.
HINWEIS: Für die Proben werden ca. 300 μl 0,25-facher Lysepuffer benötigt. Empfohlenes Volumen = Anzahl der Proben x 300 μl.
2. Trennung von Kern- und Zytoplasmafraktionen
- Pelletieren Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen durch Zentrifugation für 5 min bei 2000 x g (Raumtemperatur). Entsorgen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette.
HINWEIS: Während dieses Protokolls wurden K562-Zellen verwendet. Das Protokoll kann jedoch an verschiedene Zelllinien angepasst werden. - Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl eiskaltem 0,25-fachem Lysepuffer.
HINWEIS: Halten Sie es 2 Minuten lang auf Eis und drehen Sie das Röhrchen alle 45 s, um eine ordnungsgemäße Lyse der Zellen zu gewährleisten. - Schleudern Sie die Röhrchen mit der höchsten Drehzahl (12.000 x g) bei 4 °C für 2 min.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Dies wird die zytoplasmatische Fraktion sein. Ungefähr 300 μl der zytoplasmatischen Fraktion werden erreicht.
- Das verbleibende Pellet ist die Kernfraktion. 500 μl eiskaltes PBS in das Pellet geben und bei 2.000 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
HINWEIS: Während dieses Schritts wird überschüssige DNA entfernt.
3. RNA-Aufreinigung mit einem RNA-Aufreinigungskit
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RNA-Aufreinigungskits erreicht (siehe Materialtabelle).
- Trennen Sie die zytoplasmatischen RNA-Proben und die zytoplasmatischen Kernproben (da die Fraktionierungsschritte zwischen ihnen variieren).
- Um die zytoplasmatische Fraktion zu trennen, geben Sie 1.050 μl 3,5-fachen RLT-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) und Wirbel kurz zu. Fügen Sie dann 750 μl 90% Ethanol hinzu und laden Sie es aus dem RNA-Reinigungskit auf die Säule.
HINWEIS: Die Lösung muss vor dem Laden auf die Säule gut gemischt werden. - Um die Kernfraktion zu trennen, fügen Sie 600 μl 3,5-fachen Lysepuffer und Wirbel hinzu. Fügen Sie dann 600 μl 70% Ethanol hinzu.
- Um die zytoplasmatische Fraktion zu trennen, geben Sie 1.050 μl 3,5-fachen RLT-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) und Wirbel kurz zu. Fügen Sie dann 750 μl 90% Ethanol hinzu und laden Sie es aus dem RNA-Reinigungskit auf die Säule.
- Laden Sie sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Fraktionen auf RNA-Säulen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Für den Rest von Schritt 3 folgen sowohl die zytoplasmatischen als auch die nuklearen Proben dem gleichen Verfahren. Stellen Sie jedoch sicher, dass diese Proben unabhängig voneinander bleiben.- Laden Sie sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Fraktionen auf RNA-Säulen und schleudern Sie 30 s lang bei 8.000 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den überschüssigen Durchfluss.
- Fügen Sie 350 μl Waschpuffer aus einem handelsüblichen Reinigungskit (RW1-Puffer, siehe Materialtabelle) hinzu, schleudern Sie erneut und entsorgen Sie den Durchfluss.
- DNAse-Lösung (1U/ul) für 15 min bei Raumtemperatur zugeben. Fügen Sie dann 350 μl Waschpuffer hinzu, schleudern Sie erneut und verwerfen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie 500 μl milden Waschpuffer (RPE, siehe Materialtabelle) hinzu, schleudern Sie erneut und verwerfen Sie den Durchfluss. 500 μl milden Waschpuffer zugeben, erneut schleudern, aber nur für 2 min.
- Bewegen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 30 μl Wasser in die Spin-Säule. Lassen Sie die Säule 1 Minute ruhen, bevor Sie sie herunterschleudern.
4. Validierung der nuklear-zytoplasmatischen Trennung
- cDNA-Synthese durchführen
- Sobald die subzellulären Kompartimente der RNA extrahiert und gereinigt wurden, bestätigen Sie die Trennung der Kompartimente mittels qPCR. Dazu wandeln Sie zunächst die RNA mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA um (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie den Reverse-Transkriptase-Mastermix vor. Fügen Sie Template-RNA hinzu. Inkubationsreaktionen in einem Thermocycler.
ANMERKUNG: Für zufällige Hexamere sind die verwendeten Zyklusparameter in Tabelle 2A angegeben. Verwenden Sie die Reverse-Transkriptase-Reaktion sofort oder lagern Sie sie bei -20 °C (Tabelle 1B).
- Führen Sie die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Analyse durch.
- Verdünnen Sie die cDNA-Synthese mit DEPC-Wasser (siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 20 ng/ml zu erreichen.
- Bereiten Sie mit einem PCR-Mastermix die Reaktion für jede Probe vor, indem Sie die unten aufgeführten manuellen Anweisungen verwenden.
- Erwerben Sie kommerzielle Sonden, die zum Nachweis der zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionierung erforderlich sind. Verwenden Sie MALAT1 als Kernmarker und TUG1 als zytoplasmatischen Marker (siehe Materialtabelle).
ANMERKUNG: Die Sequenzen für MALAT1 und TUG1 sind in Tabelle 3 aufgeführt. - Berechnen Sie das Volumen jeder Komponente, indem Sie jede Komponente für jedes der technischen Replikate für die einzelne Probe mit 3 multiplizieren.
- Erfassen Sie für jede Kern- und Zytoplasmaprobe die folgenden Mischungen: (a) Kernfraktion mit MALAT1, (b) Zytoplasmatische Fraktion mit MALAT1, (c) Kernfraktion mit TUG1 und (d) Zytoplasmatische Fraktion mit TUG1 (Tabelle 1C).
- Vortex, um Lösungen kurz zu mischen und 20 μl der Mischung in jede Vertiefung einer optischen Reaktionsplatte zu überführen (siehe Materialtabelle).
- Decken Sie die Platte mit einem durchsichtigen Klebefilm ab, der für die qPCR verwendet wird (siehe Materialtabelle), zentrifugieren Sie die Platte kurz, um Luftblasen zu entfernen, und schleudern Sie die Probe dann bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter.
- Wählen Sie mit Hilfe der Konstruktions- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle) die Standardkurve für die Zyklusparameter aus (Tabelle 2B).
- Wählen Sie mit der qPCR-Software die Option Lauf einrichten aus (Ergänzende Abbildung 1).
- Wählen Sie auf der Seite Eigenschaften der Datendatei die Option Methode und Eingabezyklusparameter aus Tabelle 2B aus (ergänzende Abbildung 2).
- Wählen Sie nach der Eingabe der Zyklusparameter die Registerkarte Platte und geben Sie die auszuführenden Proben ein (ergänzende Abbildung 3). Wählen Sie Start Run aus.
HINWEIS: Die beschriebenen Schritte wurden in einer qPCR-Maschine unter Verwendung eines handelsüblichen Mastermixes durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine Datenanalyse durch
- Erstellen Sie nach Abschluss des Laufs eine Datentabelle mit dem Probennamen, dem Zielnamen und dem Quantifizierungszyklus (Cq) (Ergänzende Tabelle 1).
- Beginnen Sie mit den MALAT1-Proben, um den Kernanteil zu berechnen. Subtrahieren Sie die zytoplasmatische MALAT1-Fraktion von der MALAT1-Kernfraktion (Tabelle 4).
- Berechnen Sie dann den ΔCq (2^(-Wert)) (Tabelle 5).
- Fahren Sie mit den MALAT1-Proben fort, um den zytoplasmatischen Anteil zu berechnen, subtrahieren Sie den MALAT1-Kernanteil von der zytoplasmatischen MALAT1-Fraktion und berechnen Sie dann den ΔCq (2^(-Wert)) (Tabelle 6).
HINWEIS: Betrachtet man die ΔCq, so wird beobachtet, dass die Kern-MALAT1-Fraktion (grüne Hervorhebung) einen größeren MALAT1-Marker aufweist als das Zytoplasma (rote Hervorhebung), aber jetzt ist eine Bestätigung erforderlich, um sicherzustellen, dass die zytoplasmatische Fraktion überwiegend Zytoplasma ist und dass die Kernfraktion keine zytoplasmatische Kontamination enthält. - Führen Sie bei TUG1-Stichproben die gleiche Berechnung wie oben durch (Schritte 4.3.2-4.3.4) (Tabelle 7).
HINWEIS: Betrachtet man den ΔCq, so wird beobachtet, dass die zytoplasmatische TUG1-Fraktion (grüne Hervorhebung) einen größeren TUG1-Marker aufweist als die Kernfraktion (rote Hervorhebung), was eine gute Trennung von zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen bestätigt (Tabelle 8, Abbildung 1).
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Representative Results
Um sicherzustellen, dass eine nukleare und zytoplasmatische Isolierung erreicht wurde, wurde eine qPCR durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In dieser Studie wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Primer verwendet. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis eines hohen Niveaus der Kernfraktionierung mit MALAT1 als Positivkontrolle für Kernelemente, während die zytoplasmatische Fraktionierung voraussichtlich gering ist. Umgekehrt wird erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus, wenn TUG1 als Positivkontrolle für zytoplasmatische Elemente vorhanden ist. Dies ist in Abbildung 2 zu sehen, einem Beispiel für ein positives Ergebnis, das die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA bestätigt.
Ein negatives Ergebnis ist in Abbildung 3 zu sehen, in der eine zytoplasmatische Fraktionierung in der Probe mit MALAT1 beobachtet wird. Dies deutet auf eine Kontamination von RNA hin, die aus der Kernfraktion isoliert wurde, möglicherweise aufgrund zu niedriger oder zu hoher Lysekonzentrationen. In dieser Studie wurden auch andere Primer getestet, aber MALAT1 und TUG1 zeigten die höchste Korrelation mit der nuklearen und zytoplasmatischen Trennung, was durch einen Western-Blot und eine RNA-Elektrophorese bestätigt wurde, die die Reinheit und Qualität der Proben bestätigte (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Zusätzlich kann die Reinheit von Kern- und Zytoplasmaextrakten durch einen Western Blot unter Verwendung von Lamin als Marker für die Kernfraktion und Alpha-Tubulin als positivem Marker für die zytoplasmatische Fraktion10 nachgewiesen werden, wie in Abbildung 4 gezeigt. Es gibt eine klare Expression von Lamin nur innerhalb der Kernfraktion, mit einer klaren Expression von Alpha-Tubulin innerhalb der zytoplasmatischen Fraktion, was auf eine relative Reinheit innerhalb jeder Probe hinweist.
Aufgrund der Tendenz der RNA, sich während des qPCR-Prozesses abzubauen, ist es notwendig, die Qualität der RNA-Ausbeute mittels RNA-Elektrophorese zu bestätigen. Die RNA-Elektrophorese wurde durchgeführt und zeigte eine hohe Qualität der RNA aufgrund des Vorhandenseins eines Peaks an der 32S-rRNA-Untereinheit, was ein Merkmal ist, das nur in Kernfraktionen vorhanden ist. Das Vorhandensein dieses Peaks weist auf nukleare Reinheit und ausreichende Fraktionierung hin. Umgekehrt wurde kein Peak in der zytoplasmatischen RNA-Elektrophorese beobachtet, was eine hohe Qualität und eine geringe oder keine Kontamination in der zytoplasmatischen RNA-Probe11 zeigte (Abbildung 5).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Protokollschritte. Nachdem die Zellen behandelt wurden, werden sie zur Isolierung lysiert und zentrifugiert. Als nächstes wird eine RNA-Isolierung durchgeführt und cDNA wird vor der Validierung der Isolierung mittels qPCR erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Positive Ergebnisdaten. Die Abbildung zeigt den Erfolg des Protokolls, der sich durch ein hohes Maß an Trennung von nukleären und zytoplasmatischen Komponenten zeigt. MALAT1, ein nukleärer RNA-Primer, zeigte statistisch signifikant höhere Konzentrationen der Kernfraktion. In TUG1, einem zytoplasmatischen RNA-Primer, wurden statistisch signifikant höhere Konzentrationen der zytoplasmatischen Fraktion beobachtet. Eine hohe statistische Signifikanz wurde in beiden Proben mittels t-Test beobachtet. p < 0,0001. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Negative Ergebnisdaten. Die Abbildung zeigt ein Beispiel für negative Ergebnisse unter Verwendung des Protokolls, das durch eine hohe Trennung von Kern- und Zytoplasmakomponenten gekennzeichnet ist. MALAT1, ein nukleärer RNA-Primer, wies zytoplasmatische Fraktionskonzentrationen auf, die durch nukleare Kontamination verursacht wurden. Es werden keine Unterschiede in der statistischen Signifikanz zwischen den Fraktionen mittels t-Test beobachtet. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Western Blot, der die Reinheit von zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen demonstriert. Die Abbildung zeigt einen Western Blot der nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen. Lamin wurde verwendet, um die Reinheit der Kernprobe zu überprüfen, während Alpha-Tubulin verwendet wurde, um die Reinheit der zytoplasmatischen Fraktion nachzuweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bestätigung der RNA-Reinheit von zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen mittels RNA-Elektrophorese. (A) RNA-Elektrophorese der Kernfraktion. Arrow demonstriert 32S-rRNA, die nur in Kernfraktionen beobachtet wird. (B) RNA-Elektrophorese der zytoplasmatischen Fraktion. Das Fehlen eines 32S-Peaks weist auf die RNA-Reinheit der zytoplasmatischen Fraktion hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Zusammensetzung von Lysepuffer, Reaktionsgemischen und Proben. (A) Zusammensetzung des 0,25-fachen Lysepuffers. (B) Zusammensetzung der reversen Transkriptase-Mischung, die während der Transkription von RNA in cDNA verwendet wird. (C) Zusammensetzung von nukleären und zytoplasmatischen Proben unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Kits. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Zyklische Parameter. (A) Die Zyklusparameter für Thermocycler. Diese Parameter wurden während der qPCR zur Amplifikation der Zielsequenz verwendet. (B) Die Zyklusparameter für nukleare und zytoplasmatische Proben. Diese Parameter wurden während der qPCR zur Amplifikation der Zielsequenz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Sequenzen von nukleären und zytoplasmatischen Markern. Die Tabelle enthält die Sequenzen der Marker, die zur Bestätigung der nuklearen und zytoplasmatischen Trennung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Verfahren zur Subtraktion von MALAT1-Kern- und Zytoplasma-Fraktionen. Ein Beispiel für ein Datenblatt, das verwendet wird, um die MALAT1-Kernfraktion zu subtrahieren - MALAT1 zytoplasmatische Fraktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: Verfahren zur Berechnung von ΔCq (2^(-Wert). Ein Beispiel für das Datenblatt, das zur Berechnung des ΔCq (2^(-Wert)) verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 6: Verfahren zur Berechnung der zytoplasmatischen Fraktion. Ein Beispiel für das Datenblatt, das zur Berechnung des zytoplasmatischen Anteils verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 7: Verfahren zur Berechnung des Kernanteils. Ein Beispiel für das Datenblatt, das zur Berechnung des Kernanteils verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 8: Verfahren zur Bestätigung des erfolgreichen Fraktionierungsergebnisses. Ein Beispiel für ein Datenblatt, das verwendet wird, um eine erfolgreiche Fraktionierung zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Abbildung der Design- und Analysesoftware der qPCR-Maschine. Ein Bild, das den Betrieb der qPCR-Maschine demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Abbildung der qPCR "Eigenschaften der Datendatei". Ein Bild, das das Verfahren zum Einrichten von Parametern für den qPCR-Lauf demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Bild des Ladens von Proben in die qPCR-Maschine. Ein Bild, das das Verfahren zum Hinzufügen von Proben zur qPCR-Software zur Analyse demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Datenblatt mit dem Namen des Beispiels. Ein Beispiel für ein Datenblatt mit dem Beispielnamen, dem Zielnamen und dem Cq-Wert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Während des gesamten Protokolls wurden einige Schritte unternommen, um die Elemente so zu optimieren, dass sie für die interessierende Zelllinie am effektivsten sind. Während die Schritte innerhalb des Protokolls relativ einfach sind, können Analysen und kleinere Anpassungen bei kritischen Aspekten des Protokolls erforderlich sein. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern, die auf der interessierenden Zelllinie und dem zellulären Ziel basiert. Da die Verwendung von Lysepuffer weitgehend vom Aufschluss der Zellmembranen abhängt, gibt es eine natürliche Varianz in der Wirksamkeit des Lysepuffers auf verschiedenen Zelllinien, da es geringfügige Unterschiede in der Zellfragilität und Membranpermeabilität zwischen verschiedenen Zelllinien gibt12. Ausgehend von einer Baseline von 1x Lysepuffer wurden die Schritte im Protokoll durchgeführt, während die Konzentration des Lysepuffers allmählich auf 0,25x verringert wurde, was effektivere Ergebnisse garantierte. Da das Experiment darauf abzielt, letztendlich eine große Anzahl subzellulärer Komponenten zu isolieren, ist es entscheidend, sicherzustellen, dass die Konzentration des Lysepuffers für die interessierende Zelllinie optimiert ist, um die höchste Ausbeute und die besten Ergebnisse zu erzielen.
Neben der Anpassung der Lysepufferkonzentrationen ist es wichtig, die Zerbrechlichkeit der RNA zu beachten und bei der Isolierung von RNA Vorsicht walten zu lassen. RNA ist anfälliger für den Abbau als DNA und viele andere zelluläre Elemente, da ihre 2'-Hydroxylgruppe als Bindungspunkt für RNasen dienen kann, eine Familie von Enzymen, die RNA abbauen und zu schlechten Ergebnissen führen können. RNasen sind in hohem Maße in der Lage, RNA abzubauen, selbst wenn sie in geringen Mengen vorliegen13. Da RNasen während und nach Lyseschritten aus den Zellen freigesetzt werden, ist Vorsicht geboten, um eine Kontamination zu vermeiden, die zu einem unerwünschten RNA-Abbau führen kann14. Die Schritte umfassen das Tragen von Handschuhen während des Experiments und das häufige Wechseln dieser Handschuhe, um zu vermeiden, dass RNasen aus der Umgebung oder von Oberflächen auf Proben übertragen werden. Darüber hinaus sollten RNase-freie Lösungen verwendet werden, und beim Umgang mit RNA sollte ein separater Arbeitsbereich verwendet werden. Da RNase sehr resistent gegen Lysepuffer und Denaturierung sein kann, können RNase-Inhibitoren verwendet werden, um ihre negativen Auswirkungen auf die RNA-Isolierung zu mildern15.
Während die Schritte während des Protokolls sehr erfolgreiche Ergebnisse lieferten, gibt es einige Einschränkungen. Zunächst einmal können RNA und zytoplasmatische Komponenten zwar weitgehend voneinander isoliert werden, die beiden können jedoch nicht vollständig getrennt werden, ohne die Qualität der zu untersuchenden RNA zu gefährden. Aus diesem Grund kann jede Schlussfolgerung, die auf Unterschieden in der Aktivität oder Funktion von Molekülen aus diesen getrennten Regionen basiert, durch die Unfähigkeit, vollständig isolierte Proben abzuleiten, leicht verzerrt werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass, wenn das Protokoll an andere Zellmoleküle, wie z. B. Proteine, angepasst wird, einige Proteine oder andere zelluläre Elemente während der Trennung von Kernextrakten abgebaut werden können, was zu einem Aktivitätsverlust führt und die Ergebnisse beeinträchtigt16. Es ist auch wichtig zu beachten, dass während dieses Protokolls die qPCR der nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung von MALAT1 und TUG1 einfach als Validierung der Reinheit und Qualität der Proben durchgeführt wurde. Um diese Idee zu erweitern, wurden die relativen Anteile von nukleärer und zytoplasmatischer RNA während dieses Protokolls nicht analysiert oder verglichen, da es ausschließlich zum Zwecke der Validierung verwendet wurde. Dieses Protokoll kann jedoch an andere Verwendungszwecke angepasst werden, wie z. B. den Vergleich der relativen Anteile von Kern- und Zytoplasmafraktionen, aber diese Werte müssen für eine genaue Analyse oder einen genauen Vergleich auf die Menge der Gesamt-RNA normiert werden. Die Schritte zur Normalisierung der zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen auf Gesamt-RNA-Spiegel wurden bereits in anderen Protokollenbeschrieben 11.
Wie bereits erwähnt, verwendet diese Methode jedoch gängige Labormaterialien, um kostengünstig hochwertige RNA-Extrakte zu erzeugen. Auch diese Methode zur Untersuchung von nukleären und zytoplasmatischen Wechselwirkungen erweist sich als eines der zeiteffektivsten Verfahren. Die Verwendung von RNA-Reinheitskits führt zu einer sehr effektiven RNA-Aufreinigung und trägt dazu bei, ein hohes Maß an RNA-Isolierung aus verschiedenen Zellregionen sicherzustellen, was zu effektiveren Proben für die Untersuchung führt. Schließlich stellt sich die Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls als ein entscheidender Vorteil dar, da die Modifikation der Lysepufferkonzentration den Zugang zur Untersuchung vieler verschiedener Zelllinien ermöglichen kann und eine Dichtetrennungstechnik wie die Zentrifugation zur Isolierung mehrerer verschiedener zellulärer Elemente führen kann. Mit zunehmender Verbreitung von Studien zu zytoplasmatischen und nukleären Wechselwirkungen können die Auswirkungen der Lokalisierung auf zelluläre Komponenten besser verstanden werden. Der Austausch zwischen Zytoplasma und Zellkern kann analysiert werden, was darauf hinweist, ob bestimmte Moleküle während dieses Austauschs zur Krebsentstehung führen können, wie Studien an Kernproteinen wie XPO1 gezeigt haben17.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Unterstützt durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Robert Wood Johnson Foundation, der Doris Duke Charitable Foundation, der Edward P. Evans Foundation und des National Cancer Institute (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
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