Summary
本协议提供了一种高效灵活的方法，使用培养的细胞从核和细胞质级分中分离RNA，然后使用qPCR进行验证。这有效地替代了其他RNA制备试剂盒。
Abstract
多年来，细胞内成分的分离一直是细胞生物学的关键工具，并且已经能够提供有关其位置如何影响其功能的有用见解。特别是，核和细胞质RNA的分离在癌细胞和寻找药物新靶点的背景下变得很重要。当许多所需材料可以在典型的实验室环境中找到时，购买用于核细胞质RNA提取的试剂盒可能很昂贵。使用本方法可以替代更昂贵的试剂盒或其他耗时的过程，只需自制的裂解缓冲液、台式离心机和RNA分离纯化柱即可分离核和细胞质RNA。裂解缓冲液用于温和地裂解细胞的外膜，而不会影响核包膜的完整性，从而释放其细胞内成分。然后，可以通过简单的离心步骤分离细胞核，因为它们具有比裂解溶液更高的密度。离心用于根据其密度差异分离这些区域，以分离细胞核中的亚细胞元素和细胞质中的亚细胞元素。离心分离出不同组分后，使用RNA净化试剂盒纯化RNA含量，并进行qPCR以验证分离质量，通过不同级分中核和细胞质RNA的量进行定量。实现了统计学上显着的分离水平，说明了该方案的有效性。此外，该系统可以适用于分离不同类型的RNA（总RNA，小RNA等），从而可以有针对性地研究细胞质 - 细胞核相互作用，并有助于了解驻留在细胞核和细胞质中的RNA功能的差异。
Introduction
细胞分离成亚细胞成分允许分离和研究定义的生化结构域，并有助于确定特定细胞过程的定位以及这可能如何影响其功能1。从不同的细胞内位置分离RNA可以提高转录水平事件以及细胞核和细胞质之间其他相互作用的遗传和生化分析的准确性，这是当前方案2的主要目的。该协议的开发旨在确保细胞质和核RNA的分离，以确定它们在核输出中各自的作用，并了解细胞核和细胞质中RNA的亚细胞定位如何影响其在细胞过程中的功能。使用来自典型实验室环境的材料，可以在不损害结果质量的情况下比以前建立的方案更有效、更便宜地实现细胞核和细胞质分离3。
此外，可以通过分离这些区域直接研究细胞质和细胞核之间的分子交换。更具体地说，了解转录组对于理解发育和疾病至关重要。然而，RNA在任何给定时间可能处于不同的成熟水平，并且可能使下游分析复杂化。该协议允许从核和细胞质亚细胞组分中分离RNA的能力，这可以帮助RNA的研究，并允许更好地了解感兴趣的特定RNA，例如非编码RNA的定位或细胞核内剪接连接的分析。
由于所使用的RNA纯化柱的大小选择性，该协议已针对分离细胞质和核长RNA（包括mRNA，rRNA和长非编码RNA（lncRNA）进行了优化，可以对其进行修饰以分离其他感兴趣的RNA。以前，长RNA的功能，如mRNA和lncRNA，高度依赖于它们各自在细胞内的定位4，5。因此，从细胞核到亚细胞结构域的输出研究变得更加有针对性的是了解输出RNA或其他细胞成分对细胞的作用。lncRNA就是一个典型的例子，因为它们的翻译和后续效应在很大程度上依赖于与其他形式的RNA6的接近和相互作用。此外，细胞核和细胞质区域之间的细胞元件交换与对各种癌症治疗的耐药机制有关7。细胞内区室的分离允许核输出抑制剂的发展，这减轻了对不同疗法的耐药机制的影响8。
分离核和细胞质RNA后，执行步骤以纯化感兴趣的RNA。由于RNA纯化试剂盒通常在实验室中发现，并且具有纯化和分离长RNA的功能，因此它们可以很好地满足本协议的目的。对于RNA纯化，产生大于1.8的260：280比率对于确保RNA测序或其他需要高纯度和分离的类似程序的样品质量至关重要。不规则的 260：280 值表示苯酚污染，表明分离效果差，结果不准确9.
一旦RNA纯化完成并且确认260：280值高于可接受的范围，则使用qPCR验证核和细胞质级分的分离结果。在此过程中，使用特定于感兴趣区域的引物来证明核和细胞质分离水平。在该协议中，MALAT1和TUG1分别用作核和细胞质标志物10。总之，它们允许使用MALAT1证明高水平的核分离，而细胞质分离预计较低。相反，当使用TUG1时，预计细胞质分级水平将高于核分离水平。
利用该协议，可以根据RNA在细胞中的作用位置分离RNA。由于在该实验中广泛使用许多材料，并且仅使用裂解缓冲液和基于密度的离心技术，因此对其他RNA类型和其他细胞组分的适用性很普遍。这可以通过阐明特定于位置的表达事件来提供重要信息，否则如果不进行分离，这些事件将无法区分。
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Protocol
K562细胞用于本研究。该协议已经过优化，适用于1 x 106-5 x 10600 万个细胞。然而，通过适当增加体积，该程序可以扩大到更大的细胞量。
1.0.25x裂解缓冲液的制备
- 通过混合 表1A中提供的以下组分制备0.25x裂解缓冲液。
注意：样品需要大约 300 μL 的 0.25x 裂解缓冲液。推荐体积 = 样品数量 x 300 μL。
2. 核和细胞质组分的分离
- 使用 1.5 mL 管在 2000 x g（室温）下离心 5 分钟沉淀细胞。使用吸液管弃去上清液。
注意：在此协议期间使用了K562细胞。然而，该方案可以适应各种细胞系。 - 将沉淀重悬于300μL冰冷的0.25x裂解缓冲液中。
注意：在冰上保持2分钟，每45秒旋转一次试管，以确保细胞正确裂解。 - 在4°C下以最高速度（12，000× g）旋转管2分钟。
- 离心后，小心地除去上清液并将其放入新的 1.5 mL 管中。这将是细胞质部分。将获得大约 300 μL 的细胞质级分。
- 剩余的颗粒将是核部分。向沉淀中加入 500 μL 冰冷的 PBS，并在室温下以 2，000 x g 离心 5 分钟。
注意：在此步骤中，多余的DNA被移除。
3. 使用 RNA 纯化试剂盒进行 RNA 净化
注意：该方案是使用市售RNA纯化试剂盒实现的（参见 材料表）。
- 分离细胞质RNA样品和核细胞质样品（因为分离步骤在它们之间有所不同）。
- 要分离细胞质级分，加入 1，050 μL 3.5x RLT 裂解缓冲液（参见 材料表）并短暂涡旋。然后，加入 750 μL 90% 乙醇，并将其从 RNA 净化试剂盒加载到色谱柱上。
注意：在将溶液装入色谱柱之前，必须充分混合溶液。 - 要分离核级分，加入 600 μL 3.5x 裂解缓冲液并涡旋。然后，加入 600 μL 70% 乙醇。
- 要分离细胞质级分，加入 1，050 μL 3.5x RLT 裂解缓冲液（参见 材料表）并短暂涡旋。然后，加入 750 μL 90% 乙醇，并将其从 RNA 净化试剂盒加载到色谱柱上。
- 将细胞质和核级分加载到RNA柱上（参见 材料表）。
注意：对于步骤3的其余部分，细胞质和核样品都遵循相同的程序。但是，请确保这些样本彼此独立。- 将细胞质和核级分加载到RNA柱上，并在室温下以8，000 x g 离心30秒。丢弃多余的流量。
- 从市售纯化试剂盒（RW1缓冲液，参见 材料表）中加入350 μL洗涤缓冲液，再次旋转，并丢弃流出的流量。
- 在室温下加入DNA酶溶液（1U / uL）15分钟。然后，加入 350 μL 洗涤缓冲液，再次旋转，并丢弃流出的流量。
- 加入 500 μL 温和洗涤缓冲液（RPE，参见 材料表），再次旋转，并丢弃流出的液体。加入 500 μL 温和洗涤缓冲液，再次旋转，但仅 2 分钟。
- 将色谱柱移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并向离心柱中加入 30 μL 水。让色谱柱静置 1 分钟，然后再旋转。
4. 核-细胞质分离的验证
- 进行cDNA合成
- 提取并纯化RNA的亚细胞区室后，使用qPCR确认区室的分离。为此，首先，按照制造商的说明使用市售试剂盒将RNA转换为cDNA（参见 材料表）。
- 制备逆转录酶预混液。添加模板 RNA。在热循环仪中孵育反应。
注意：对于随机六聚体，使用的循环参数在 表2A中提供。立即使用逆转录酶反应或储存在-20°C（表1B）。
- 进行定量聚合酶链反应（qPCR）和分析。
- 用DEPC水稀释cDNA合成（参见 材料表），最终浓度为20 ng / mL。
- 使用PCR预混液，使用下面列出的手动说明为每个样品制备反应。
- 获取检测细胞质和细胞核分离所需的商业探针。使用MALAT1作为核标志物，TUG1作为细胞质标志物（见 材料表）。
注意： 表 3 中提供了 MALAT1 和 TUG1 的序列。 - 通过将单个样品的每个技术重复的每个组分乘以 3 来计算每个组分的体积。
- 对于每个核和细胞质样品，为每个样品获取以下混合物：（a）具有MALAT1的核级分，（b）具有MALAT1的细胞质级分，（c）具有TUG1的核级分和（d）具有TUG1的细胞质级分（表1C）。
- 短暂涡旋以混合溶液，并将 20 μL 混合物转移到光学反应板的每个孔中（参见 材料表）。
- 用用于qPCR的透明胶膜覆盖板（参见 材料表），并短暂离心板以消除气泡，然后在室温下以300× g 旋转样品5分钟。
- 使用设计和分析软件（见 材料表），选择循环参数的标准曲线（表2B）。
- 使用 qPCR 软件，选择 设置运行 （补充图 1）。
- 在“数据文件属性”页上，从表 2B 中选择方法和输入周期参数（补充图 2）。
- 输入循环参数后，选择 板 选项卡，然后输入要运行的样品（补充图3）。选择 “开始运行”。
注意：所述步骤是使用市售预混液在qPCR仪中进行的（参见 材料表）。
- 执行数据分析
- 运行完成后，创建一个数据电子表格，其中包含样品名称、靶标名称和定量周期（Cq）（补充表1）。
- 从MALAT1样品开始计算核分数。从MALAT1核部分减去MALAT1细胞质部分（表4）。
- 然后，计算 ΔCq （2^（-值））（表 5）。
- 继续使用MALAT1样品计算细胞质级分，从MALAT1细胞质级分中减去MALAT1核级分，然后计算ΔCq（2^（-值））（表6）。
注意：观察ΔCq，观察到核MALAT1级分（绿色高亮）比细胞质（红色高亮）具有更大的MALAT1标记，但现在需要确认以确保细胞质部分主要是细胞质并且核级分不含细胞质污染。 - 对于TUG1样品，执行与上述相同的计算（步骤4.3.2-4.3.4）（表7）。
注意：观察ΔCq，观察到细胞质TUG1级分（绿色突出显示）比核级分（红色突出显示）具有更大的TUG1标记，从而确认了细胞质和核级分的良好分离（表8， 图1）。
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Representative Results
为了确保实现核和细胞质分离，进行了qPCR以验证结果。在此过程中，使用特定于感兴趣区域的引物来证明核和细胞质分离水平。在这项研究中，MALAT1和TUG1分别用作核和细胞质引物。总之，它们允许证明高水平的核分级分离，MALAT1作为核元素的阳性对照，而细胞质分离预计较低。相反，当TUG1作为细胞质元件的阳性对照存在时，预计细胞质分离水平将高于核分离水平。这可以在 图2中看到，这是确认核和细胞质RNA分离的阳性结果的示例。
阴性结果如图 3所示，其中在MALAT1样品中观察到细胞质分级分离水平。这表明从核级分中分离的RNA受到污染，可能是由于裂解浓度过低或过高。这项研究还试验了其他引物，但MALAT1和TUG1与细胞核和细胞质分离的相关性最高，这通过蛋白质印迹和RNA电泳证实了这一点，这证实了样品的纯度和质量（图4 和 图5）。
此外，核提取物和细胞质提取物的纯度可以通过蛋白质免疫印迹来证明，蛋白质印迹使用层粘连蛋白作为核级分的标记物，α-微管蛋白作为细胞质级分10的阳性标记物，如图 4所示。仅在核级分中层粘连蛋白有明确的表达，α-微管蛋白在细胞质级分中清晰表达，表明每个样品内的相对纯度。
由于RNA在qPCR过程中有降解的趋势，因此有必要使用RNA电泳确认RNA产量的质量。进行了RNA电泳，由于在32S rRNA亚基处存在峰，因此证明了高质量的RNA，这是仅存在于核级分中的特征。该峰的存在表明核纯度和足够的分馏。相反，在细胞质RNA电泳中未观察到峰，表明细胞质RNA样品11 中质量高且污染很少或没有污染（图5）。
图 1：协议步骤示意图。 细胞处理后，裂解并离心分离。接下来，进行RNA分离，并在使用qPCR验证分离之前生成cDNA。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：阳性结果数据。 该图突出了通过核和细胞质成分的高水平分离所表现出的方案成功。核RNA引物MALAT1表现出统计学上显着的更高水平的核部分。在细胞质RNA引物TUG1中，观察到统计学上显着的细胞质部分水平较高。 通过t检验在两个样品中观察到较高的统计学意义。p < 0.0001。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：阴性结果数据。 该图突出显示了使用方案的阴性结果示例，该方案通过核和细胞质成分的高水平分离而表现出来。核RNA引物MALAT1表现出由核污染引起的细胞质部分水平。 通过t检验在分数之间的统计学显著性方面没有观察到差异。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：蛋白质印迹显示细胞质和细胞核组分的纯度。 该图突出显示了核和细胞质组分的蛋白质印迹。层粘连蛋白用于验证核样品的纯度，而α-微管蛋白用于证明细胞质级分的纯度。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：通过 RNA 电泳 确认 细胞质和细胞核组分的 RNA 纯度。 （A）核部分的RNA电泳。Arrow展示了32S rRNA，仅在核级分中观察到。（B）RNA电泳的细胞质级分。没有32S峰表明细胞质级分的RNA纯度。 请点击此处查看此图的大图。
表1：裂解缓冲液、反应混合物和样品的组成。 （A）0.25x裂解缓冲液的组成。（B）RNA转录为cDNA过程中使用的逆转录酶混合物的组成。（C）使用逆转录酶试剂盒组成核和细胞质样品。 请按此下载此表格。
表 2：循环参数。 （A）热循环仪的循环参数。在qPCR过程中利用这些参数来扩增靶序列。（B）核和细胞质样品的循环参数。在qPCR过程中利用这些参数来扩增靶序列。 请按此下载此表格。
表3：核和细胞质标志物序列。 该表包括用于确认核和细胞质分离的标记物序列。 请按此下载此表格。
表4：减去MALAT1核和细胞质部分的程序。 用于减去 MALAT1 核级分的数据手册示例 - MALAT1 细胞质级分。 请按此下载此表格。
表 5：计算 ΔCq （2^（-值） 的过程。 用于计算ΔCq（2^（-值））的数据手册示例。 请按此下载此表格。
表6：计算细胞质级分的程序。 用于计算细胞质级分的数据手册示例。 请按此下载此表格。
表7：计算核分数的程序。 用于计算核分数的数据表示例。 请按此下载此表格。
表8：确认成功分馏结果的程序。 用于验证成功分馏的数据手册示例。 请按此下载此表格。
补充图1：qPCR机设计和分析软件的图像。 演示 qPCR 机操作的图像。 请点击此处下载此文件。
补充图2：qPCR“数据文件属性”的图像。 演示设置 qPCR 运行参数的过程的图像。 请点击此处下载此文件。
补充图3：将样品加载到qPCR机中的图像。 演示将样品添加到qPCR软件进行分析的过程的图像。 请点击此处下载此文件。
补充表1：样品名称数据表。 包含样品名称、目标名称和Cq值的数据手册示例。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在整个方案中，采取了一些步骤来优化元件，使其对感兴趣的细胞系最有效。虽然协议中的步骤相对简单，但在协议的关键方面可能需要分析和细微调整。方案中最关键的步骤是根据感兴趣的细胞系和细胞靶标将裂解缓冲液的浓度修改为适当的浓度。由于裂解缓冲液的使用在很大程度上取决于细胞膜的破坏，因此裂解缓冲液在不同细胞系上的有效性存在自然差异，因为不同细胞系之间的细胞脆性和膜通透性略有不同12。从1x裂解缓冲液的基线开始，执行方案中的步骤，同时逐渐将裂解缓冲液的浓度降低至0.25x，这保证了更有效的结果。由于该实验旨在最终分离大量亚细胞成分，因此确保裂解缓冲液的浓度针对感兴趣的细胞系进行优化对于实现最高产量和最佳结果至关重要。
除了调整裂解缓冲液浓度外，重要的是要注意RNA的脆性和RNA分离过程中的应力警告。RNA比DNA和许多其他细胞元件更容易降解，因为它的2'羟基可以作为RNA酶的结合点，RNA酶是可以降解RNA并导致不良结果的酶家族。RNase具有很强的RNA降解能力，即使少量存在13。由于RNA酶在裂解步骤期间和之后从细胞中释放出来，因此必须小心防止污染，这可能导致不必要的RNA降解14。这些步骤包括在实验过程中戴上手套并经常更换手套，以避免将RNase从环境或表面传播到样品。此外，应使用不含RNase的溶液，并且在处理RNA时应使用单独的工作空间。最后，由于RNase对裂解缓冲液和变性具有很强的抵抗力，因此RNase抑制剂可用于减轻其对RNA分离的负面影响15。
虽然协议期间的步骤产生了非常成功的结果，但也存在一些局限性。首先，虽然RNA和细胞质成分可以在很大程度上相互分离，但两者不能完全分离而不损害研究RNA的质量。因此，基于来自这些单独区域的分子的活性或功能差异的任何结论都可能因无法获得完全分离的样品而略有偏差。同样重要的是要注意，如果该方案适用于其他细胞分子，例如蛋白质，则某些蛋白质或其他细胞元素可能会在核提取物的分离过程中降解，从而导致活性丧失并影响结果16。同样重要的是要注意，在该协议期间，使用MALAT1和TUG1对核和细胞质部分进行qPCR只是为了验证样品的纯度和质量。为了扩展这一想法，在该协议期间没有分析或比较核和细胞质RNA的相对比例，因为它仅用于验证目的。然而，该协议可以适应其他用途，例如比较核和细胞质部分的相对比例，但这些值必须归一化为总RNA的量，以便进行准确的分析或比较。将细胞质和核部分标准化为总RNA水平的步骤先前已在其他协议11中描述过。
然而，如前所述，该方法利用常见的实验室材料经济高效地生成高质量的RNA提取物。此外，这种研究核和细胞质相互作用的方法被证明是最有效的程序之一。使用 RNA 纯度试剂盒可实现非常有效的 RNA 净化，并有助于确保从不同细胞区域进行高水平的 RNA 分离，从而获得更有效的样品进行研究。最后，该协议的适应性本身是一个关键优势，因为修改裂解缓冲液浓度可以用于研究许多不同的细胞系，并且诸如离心之类的密度分离技术可以导致几种不同细胞元素的分离。随着对细胞质和核相互作用的研究越来越广泛，定位对细胞成分的影响可以得到更好的理解。可以分析细胞质和细胞核之间的交换，表明在这些交换过程中的某些分子是否会导致癌症的发展，正如对核蛋白（如XPO1）的研究表明的那样17。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
由美国血液学会、罗伯特·伍德·约翰逊基金会、多丽丝·杜克慈善基金会、爱德华·埃文斯基金会和国家癌症研究所（1K08CA230319）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
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