Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करके परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों से आरएनए को अलग करने के लिए एक कुशल और लचीली विधि प्रदान करता है, और फिर क्यूपीसीआर का उपयोग करके मान्य करता है। यह प्रभावी रूप से अन्य आरएनए तैयारी किट के प्रतिस्थापन के रूप में कार्य करता है।
Abstract
इंट्रासेल्युलर घटकों का पृथक्करण अब कई वर्षों से सेलुलर जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण उपकरण रहा है और उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है कि उनका स्थान उनके कार्य को कैसे प्रभावित कर सकता है। विशेष रूप से, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए का पृथक्करण कैंसर कोशिकाओं के संदर्भ में और दवाओं के लिए नए लक्ष्य खोजने की खोज में महत्वपूर्ण हो गया है। परमाणु-साइटोप्लाज्मिक आरएनए निष्कर्षण के लिए किट खरीदना महंगा हो सकता है जब कई आवश्यक सामग्री एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग के भीतर पाई जा सकती है। वर्तमान विधि का उपयोग करते हुए, जो अधिक महंगी किट या अन्य समय लेने वाली प्रक्रियाओं को बदल सकता है, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए को अलग करने के लिए केवल एक होममेड लाइसिस बफर, एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज और आरएनए अलगाव शुद्धिकरण कॉलम की आवश्यकता होती है। लाइसिस बफर का उपयोग परमाणु लिफाफे की अखंडता को प्रभावित किए बिना कोशिका की बाहरी झिल्ली को धीरे से लाइस करने के लिए किया जाता है, जिससे इसके इंट्रासेल्युलर घटकों को जारी करने की अनुमति मिलती है। फिर, नाभिक को एक साधारण सेंट्रीफ्यूजेशन चरण द्वारा अलग किया जा सकता है क्योंकि उनके पास लाइसिस समाधान की तुलना में उच्च घनत्व होता है। सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग इन क्षेत्रों को उनके घनत्व अंतर के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है ताकि नाभिक में उपकोशिकीय तत्वों को साइटोप्लाज्म से अलग किया जा सके। एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन ने विभिन्न घटकों को अलग कर दिया है, तो आरएनए सामग्री को शुद्ध करने के लिए एक आरएनए क्लीन-अप किट का उपयोग किया जाता है, और क्यूपीसीआर को पृथक्करण गुणवत्ता को मान्य करने के लिए किया जाता है, जो विभिन्न अंशों में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए की मात्रा से निर्धारित होता है। प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को दर्शाते हुए, अलगाव के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण स्तर हासिल किए गए थे। इसके अलावा, इस प्रणाली को विभिन्न प्रकार के आरएनए (कुल, छोटे आरएनए, आदि) के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो साइटोप्लाज्म-न्यूक्लियस इंटरैक्शन के लक्षित अध्ययन की अनुमति देता है, और नाभिक और साइटोप्लाज्म में रहने वाले आरएनए के कार्य में अंतर को समझने में सहायता करता है।
Introduction
उपकोशिकीय घटकों में सेलुलर फ्रैक्शनेशन विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के स्थानीयकरण को निर्धारित करने में परिभाषित जैव रासायनिक डोमेन और एड्स के अलगाव और अध्ययन की अनुमति देता है और यह उनके कार्यको कैसे प्रभावित कर सकता है। विभिन्न इंट्रासेल्युलर स्थानों से आरएनए का अलगाव प्रतिलेखन स्तर की घटनाओं और नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच अन्य इंटरैक्शन के आनुवंशिक और जैव रासायनिक विश्लेषण की बेहतर सटीकता के लिए अनुमति दे सकता है, जो वर्तमान प्रोटोकॉल2 के प्राथमिक उद्देश्य के रूप में कार्य करता है। यह प्रोटोकॉल परमाणु निर्यात में उनकी संबंधित भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए साइटोप्लाज्मिक और परमाणु आरएनए के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए विकसित किया गया था और यह समझने के लिए कि नाभिक और साइटोप्लाज्म में आरएनए का उपकोशिकीय स्थानीयकरण सेलुलर प्रक्रियाओं में उनके कार्य को कैसे प्रभावित कर सकता है। एक विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग से सामग्री का उपयोग करके, परिणामों की गुणवत्ता को खतरे में डाले बिना पहले से स्थापित प्रोटोकॉल की तुलना में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन को अधिक प्रभावी ढंग से और कम खर्चीला प्राप्त करना संभव था।
इसके अतिरिक्त, साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच अणुओं के आदान-प्रदान का अध्ययन सीधे इन क्षेत्रों को अलग करके किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, ट्रांसस्क्रिप्टम को समझना विकास और बीमारी को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, आरएनए किसी भी समय अलग-अलग परिपक्वता स्तरों पर हो सकते हैं और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल परमाणु और साइटोप्लाज्मिक उपकोशिकीय अंशों से आरएनए को अलग करने की क्षमता की अनुमति देता है, जो आरएनए के अध्ययन में सहायता कर सकता है और रुचि के एक विशेष आरएनए की बेहतर समझ के लिए अनुमति दे सकता है, जैसे कि गैर-कोडिंग आरएनए का स्थानीयकरण या नाभिक के भीतर स्प्लिस जंक्शनों का विश्लेषण।
इस प्रोटोकॉल को साइटोप्लाज्मिक और परमाणु लंबे आरएनए को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें एमआरएनए, आरआरएनए और लंबे गैर-कोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) शामिल हैं, क्योंकि उपयोग किए गए आरएनए शुद्धि करण कॉलम की आकार चयनात्मकता है, जिसे रुचि के अन्य आरएनए को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इससे पहले, एमआरएनए और एलएनसीआरएनए जैसे लंबे आरएनए का कार्य, सेल 4,5 के भीतर उनके संबंधित स्थानीयकरण पर अत्यधिक निर्भर करता था। इसलिए, नाभिक से उपकोशिकीय डोमेन में निर्यात का अध्ययन उस भूमिका को समझने की दिशा में अधिक लक्षित हो गया है जो आरएनए या अन्य सेलुलर घटकों का निर्यात सेल पर हो सकता है। एलएनसीआरएनए इसके एक प्रमुख उदाहरण के रूप में काम करते हैं, क्योंकि उनका अनुवाद और बाद के प्रभाव काफी हद तक आरएनए6 के अन्य रूपों के साथ निकटता और बातचीत पर निर्भर करते हैं। इसके अलावा, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों के बीच सेलुलर तत्वों का आदान-प्रदान विभिन्न कैंसरउपचारों के प्रतिरोध तंत्र से जुड़ा हुआ है। इंट्रासेल्युलर डिब्बों के अलगाव ने परमाणु निर्यात अवरोधकों के विकास की अनुमति दी है, जिसने विभिन्न उपचारों के प्रतिरोध तंत्र के प्रभाव को कम कर दियाहै।
परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए को अलग करने के बाद, रुचि के आरएनए को शुद्ध करने के लिए चरण किए जाते हैं। चूंकि आरएनए शुद्धिकरण किट आमतौर पर प्रयोगशालाओं के भीतर पाए जाते हैं और लंबे आरएनए को शुद्ध करने और अलग करने के लिए कार्य करते हैं, इसलिए वे इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य को अच्छी तरह से पूरा करते हैं। आरएनए शुद्धिकरण के लिए, 1.8 से अधिक 260: 280 अनुपात उत्पन्न करना आरएनए अनुक्रमण या अन्य समान प्रक्रियाओं के लिए नमूनों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें उच्च स्तर की शुद्धता और अलगाव की आवश्यकता होती है। अनियमित 260: 280 मान फिनोल संदूषण का संकेत देते हैं, खराब अलगाव का प्रदर्शन करते हैं और गलत परिणाम देतेहैं।
एक बार जब आरएनए शुद्धिकरण पूरा हो जाता है और 260: 280 मान एक स्वीकार्य सीमा से ऊपर होने की पुष्टि की जाती है, तो क्यूपीसीआर का उपयोग परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के अलगाव परिणामों को मान्य करने के लिए किया गया था। ऐसा करने में, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन स्तरों को प्रदर्शित करने के लिए रुचि के क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, एमएएलएटी 1 और टीयूजी 1 का उपयोग क्रमशः परमाणु और साइटोप्लाज्मिकमार्करों के रूप में किया गया था। साथ में, वे एमएएलटी 1 के साथ परमाणु विभाजन के उच्च स्तर के प्रदर्शन की अनुमति देते हैं, जबकि साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन कम होने की उम्मीद है। इसके विपरीत, जब टीयूजी 1 का उपयोग किया जाता है, तो साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन का स्तर परमाणु विभाजन स्तरों से अधिक होने की उम्मीद है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सेल के भीतर कार्रवाई की स्थिति के आधार पर आरएनए को अलग करना संभव था। इस प्रयोग के दौरान कई सामग्रियों तक व्यापक पहुंच और केवल लाइसिस बफर और घनत्व-आधारित सेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकों के उपयोग के कारण, अन्य आरएनए प्रकारों और अन्य सेलुलर घटकों के लिए प्रयोज्यता व्यापक है। यह स्थान-विशिष्ट अभिव्यक्ति घटनाओं पर प्रकाश डालकर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है जो अन्यथा अलगाव के बिना अप्रभेद्य होंगे।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए K562 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को 1 x 106-5 x 106 मिलियन कोशिकाओं के लिए काम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, उचित रूप से मात्रा में वृद्धि करके प्रक्रिया को बड़ी सेल मात्रा के लिए बढ़ाया जा सकता है।
1. 0.25x लाइसिस बफर की तैयारी
- तालिका 1ए में दिए गए निम्नलिखित घटकों को मिलाकर 0.25x लाइसिस बफर तैयार करें।
नोट: नमूने को 0.25 x लाइसिस बफर के लगभग 300 μL की आवश्यकता होती है। अनुशंसित मात्रा = नमूनों की संख्या x 300 μL।
2. परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों का पृथक्करण
- 2000 x g (कमरे के तापमान) पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से 1.5 एमएल ट्यूबों का उपयोग करके कोशिकाओं को गोली मार दें। एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
नोट: K562 कक्षों का उपयोग इस प्रोटोकॉल के दौरान किया गया था। हालांकि, प्रोटोकॉल को विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। - पेलेट को 300 μL बर्फ ठंडा 0.25x लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें।
नोट: 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें और कोशिकाओं के उचित लाइसिस को सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को हर 45 सेकंड में घुमाएं। - ट्यूबों को 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्चतम गति (12,000 x g) पर घुमाएं।
- सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। यह साइटोप्लाज्मिक अंश होगा। साइटोप्लाज्मिक अंश का लगभग 300 μL प्राप्त किया जाएगा।
- शेष गोली परमाणु अंश होगा। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,000 x g पर पेलेट और सेंट्रीफ्यूज में 500 μL बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें।
नोट: इस चरण के दौरान, अतिरिक्त डीएनए हटा दिया जाता है।
3. आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके आरएनए सफाई
नोट: यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके हासिल किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
- साइटोप्लाज्मिक आरएनए नमूने और परमाणु साइटोप्लाज्मिक नमूने को अलग करें (क्योंकि विभाजन चरण उनके बीच भिन्न होते हैं)।
- साइटोप्लाज्मिक अंश को अलग करने के लिए, 3.5x RLT लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिका देखें) और भंवर के 1,050 μL को संक्षेप में जोड़ें। फिर, 90% इथेनॉल का 750 μL जोड़ें और इसे आरएनए क्लीन-अप किट से कॉलम पर लोड करें।
नोट: कॉलम पर लोड करने से पहले समाधान अच्छी तरह से मिश्रित होना चाहिए। - परमाणु अंश को अलग करने के लिए, 3.5x लाइसिस बफर और भंवर के 600 μL जोड़ें। फिर, 70% इथेनॉल के 600 μL जोड़ें।
- साइटोप्लाज्मिक अंश को अलग करने के लिए, 3.5x RLT लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिका देखें) और भंवर के 1,050 μL को संक्षेप में जोड़ें। फिर, 90% इथेनॉल का 750 μL जोड़ें और इसे आरएनए क्लीन-अप किट से कॉलम पर लोड करें।
- आरएनए कॉलम पर साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंश दोनों लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: चरण 3 के शेष के लिए, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु नमूने दोनों एक ही प्रक्रिया का पालन करते हैं। हालांकि, सुनिश्चित करें कि ये नमूने एक दूसरे से स्वतंत्र रहें।- आरएनए कॉलम पर साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशदोनों लोड करें और कमरे के तापमान पर 8,000 x g पर 30 सेकंड के लिए स्पिन करें। अतिरिक्त प्रवाह को छोड़ दें।
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्धिकरण किट (आरडब्ल्यू 1 बफर, सामग्री की तालिका देखें) से 350 μL वाशिंग बफर जोड़ें, फिर से स्पिन करें, और प्रवाह को छोड़ दें।
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए DNAse समाधान (1U / uL) जोड़ें। फिर, वॉशिंग बफर के 350 μL जोड़ें, फिर से स्पिन करें, और प्रवाह को छोड़ दें।
- हल्के वाशिंग बफर (आरपीई, सामग्री की तालिका देखें) के 500 μL जोड़ें, फिर से स्पिन करें, और प्रवाह को छोड़ दें। हल्के वॉशिंग बफर के 500 μL जोड़ें, फिर से स्पिन करें, लेकिन केवल 2 मिनट के लिए।
- कॉलम को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं और स्पिन कॉलम में 30 μL पानी जोड़ें। नीचे घूमने से पहले स्तंभ को 1 मिनट तक बैठने दें।
4. परमाणु-साइटोप्लाज्मिक पृथक्करण का सत्यापन
- सीडीएनए संश्लेषण करें
- एक बार आरएनए के उपकोशिकीय डिब्बों को निकालने और शुद्ध करने के बाद, क्यूपीसीआर का उपयोग करके डिब्बों के पृथक्करण की पुष्टि करें। ऐसा करने के लिए, सबसे पहले, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस मास्टरमिक्स तैयार करें। टेम्पलेट आरएनए जोड़ें। थर्मोसाइक्लर में प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: यादृच्छिक हेक्सामर्स के लिए, उपयोग किए गए साइकिलिंग पैरामीटर तालिका 2 ए में प्रदान किए जाते हैं। रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस प्रतिक्रिया का तुरंत उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस (तालिका 1 बी) पर स्टोर करें।
- मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) और विश्लेषण करें।
- 20 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए डीईपीसी पानी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सीडीएनए संश्लेषण को पतला करें।
- पीसीआर मास्टर मिक्स का उपयोग करके, नीचे सूचीबद्ध मैनुअल निर्देशों का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया तैयार करें।
- साइटोप्लाज्मिक और परमाणु विभाजन का पता लगाने के लिए आवश्यक वाणिज्यिक जांच प्राप्त करें। परमाणु मार्कर के रूप में MALAT1 और साइटोप्लाज्मिक मार्कर के रूप में TUG1 का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: MALAT1 और TUG1 के अनुक्रम तालिका 3 में दिए गए हैं। - व्यक्तिगत नमूने के लिए प्रत्येक तकनीकी प्रतिकृति के लिए प्रत्येक घटक को 3 से गुणा करके प्रत्येक घटक की मात्रा की गणना करें।
- प्रत्येक परमाणु और साइटोप्लाज्मिक नमूने के लिए, प्रत्येक के लिए निम्नलिखित मिश्रण प्राप्त करें: (ए) एमएएलएटी 1 के साथ परमाणु अंश, (बी) एमएएलएटी 1 के साथ साइटोप्लाज्मिक अंश, (सी) टीयूजी 1 के साथ परमाणु अंश, और (डी) टीयूजी 1 के साथ साइटोप्लाज्मिक अंश (तालिका 1 सी)।
- भंवर संक्षेप में समाधान ों को मिलाने और ऑप्टिकल प्रतिक्रिया प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 20 μL स्थानांतरित करने के लिए ( सामग्री की तालिका देखें)।
- प्लेट को क्यूपीसीआर के लिए उपयोग की जाने वाली एक स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें) और हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए प्लेट को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर नमूने को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर घुमाएं।
- डिजाइन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), साइकिल िंग मापदंडों (तालिका 2 बी) के लिए मानक वक्र का चयन करें।
- QPCR सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, सेट अप रन (पूरक चित्र 1) का चयन करें।
- डेटा फ़ाइल गुण पृष्ठ पर, तालिका 2B (पूरक चित्र 2) से विधि और इनपुट चक्र पैरामीटर का चयन करें.
- चक्र पैरामीटर डालने के बाद, प्लेट टैब का चयन करें, और चलाए जाने वाले नमूने इनपुट करें (पूरक चित्रा 3)। प्रारंभ रन का चयन करें.
नोट: वर्णित चरणों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मास्टर मिश्रण का उपयोग करके एक QPCR मशीन में किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
- डेटा विश्लेषण करें
- रन पूरा होने के बाद, नमूना नाम, लक्ष्य नाम और परिमाणीकरण चक्र (सीक्यू) (पूरक तालिका 1) के साथ एक डेटा स्प्रेडशीट बनाएं।
- परमाणु अंश की गणना करने के लिए एमएएलएटी 1 नमूने से शुरू करें। MALAT1 परमाणु अंश से MALAT1 साइटोप्लाज्मिक अंश घटाएं (तालिका 4)।
- फिर, 2^(-मान)) (तालिका 5) की गणना करें।
- साइटोप्लाज्मिक अंश की गणना करने के लिए MALAT1 नमूनों के साथ जारी रखें, MALAT1 साइटोप्लाज्मिक अंश से MALAT1 परमाणु अंश घटाएं, और फिर ΔCq (2^(-मान)) की गणना करें (तालिका 6)।
नोट: ईक्यूएसक्यू को देखते हुए, यह देखा गया है कि परमाणु एमएएलएटी 1 अंश (हरे रंग का हाइलाइट) में साइटोप्लाज्म (लाल हाइलाइट) की तुलना में अधिक एमएएलटी 1 मार्कर है, लेकिन अब यह सुनिश्चित करने के लिए पुष्टि की आवश्यकता है कि साइटोप्लाज्मिक अंश मुख्य रूप से साइटोप्लाज्मिक है और परमाणु अंश में साइटोप्लाज्मिक संदूषण नहीं है। - TUG1 नमूनों के साथ, ऊपर के समान गणना करें (चरण 4.3.2-4.3.4) (तालिका 7)।
नोट: ईक्यूएसक्यू को देखते हुए, यह देखा गया है कि साइटोप्लाज्मिक टीयूजी 1 अंश (हरे रंग का हाइलाइट) में परमाणु अंश (लाल हाइलाइट) की तुलना में अधिक टीयूजी 1 मार्कर है, इस प्रकार साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों के अच्छे पृथक्करण की पुष्टि होती है (तालिका 8, चित्रा 1)।
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Representative Results
यह सुनिश्चित करने के लिए कि परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अलगाव हासिल किया गया था, परिणामों को मान्य करने के लिए एक क्यूपीसीआर किया गया था। ऐसा करने में, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन स्तरों को प्रदर्शित करने के लिए रुचि के क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में, एमएएलएटी 1 और टीयूजी 1 का उपयोग क्रमशः परमाणु और साइटोप्लाज्मिक प्राइमरों के रूप में किया गया था। साथ में, वे परमाणु तत्वों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एमएएलटी 1 के साथ परमाणु विभाजन के उच्च स्तर के प्रदर्शन की अनुमति देते हैं, जबकि साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन कम होने की उम्मीद है। इसके विपरीत, जब टीयूजी 1 साइटोप्लाज्मिक तत्वों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में मौजूद होता है, तो साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन का स्तर परमाणु विभाजन स्तरों से अधिक होने की उम्मीद है। यह चित्रा 2 में देखा जा सकता है, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए पृथक्करण की पुष्टि करने वाले सकारात्मक परिणाम का एक उदाहरण।
एक नकारात्मक परिणाम चित्रा 3 में देखा जा सकता है, जिसमें एमएएलटी 1 के साथ नमूने में साइटोप्लाज्मिक फ्रैक्शनेशन के स्तर देखे जाते हैं। यह परमाणु अंश से पृथक आरएनए के संदूषण को इंगित करता है, संभवतः लाइसिस सांद्रता के कारण जो बहुत कम या बहुत अधिक है। इस अध्ययन ने अन्य प्राइमरों का भी परीक्षण किया, लेकिन एमएएलएटी 1 और टीयूजी 1 ने परमाणु और साइटोप्लाज्मिक पृथक्करण के साथ उच्चतम सहसंबंध प्रदर्शित किया, जैसा कि पश्चिमी धब्बा और आरएनए वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से पुष्टि की गई है, जिसने नमूनों की शुद्धता और गुणवत्ता की पुष्टि की (चित्रा 4 और चित्रा 5)।
इसके अतिरिक्त, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अर्क की शुद्धता को एक पश्चिमी धब्बा द्वारा परमाणु अंश के लिए एक मार्कर के रूप में लैमिन और साइटोप्लाज्मिक अंश10 के लिए सकारात्मक मार्कर के रूप में अल्फा-ट्यूबुलिन का उपयोग करके प्रदर्शित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। पूरी तरह से परमाणु अंश के भीतर लैमिन की एक स्पष्ट अभिव्यक्ति है, जिसमें साइटोप्लाज्मिक अंश के भीतर अल्फा-ट्यूबुलिन की स्पष्ट अभिव्यक्ति है, जो प्रत्येक नमूने के भीतर सापेक्ष शुद्धता का संकेत देती है।
क्यूपीसीआर की प्रक्रिया के दौरान आरएनए की गिरावट की प्रवृत्ति के कारण, आरएनए वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आरएनए उपज की गुणवत्ता की पुष्टि करना आवश्यक है। आरएनए वैद्युतकणसंचलन किया गया था और 32 एस आरआरएनए सबयूनिट में एक शिखर की उपस्थिति के कारण आरएनए की उच्च गुणवत्ता का प्रदर्शन किया गया था, जो केवल परमाणु अंशों में मौजूद एक विशेषता है। इस चोटी की उपस्थिति परमाणु शुद्धता और पर्याप्त विभाजन को इंगित करती है। इसके विपरीत, साइटोप्लाज्मिक आरएनए वैद्युतकणसंचलन में कोई शिखर नहीं देखा गया था, जो साइटोप्लाज्मिक आरएनए नमूना11 (चित्रा 5) में उच्च गुणवत्ता और बहुत कम या कोई संदूषण नहीं दर्शाता है।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल चरणों का योजनाबद्ध। कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, उन्हें अलगाव के लिए लाइस्ड और सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। इसके बाद, आरएनए अलगाव किया जाता है, और क्यूपीसीआर का उपयोग करके अलगाव के सत्यापन से पहले सीडीएनए उत्पन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सकारात्मक परिणाम डेटा। यह आंकड़ा परमाणु और साइटोप्लाज्मिक घटकों के पृथक्करण के उच्च स्तर द्वारा प्रदर्शित प्रोटोकॉल सफलता पर प्रकाश डालता है। एमएएलएटी 1, एक परमाणु आरएनए प्राइमर, ने परमाणु अंश के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण उच्च स्तर का प्रदर्शन किया। टीयूजी 1 में, एक साइटोप्लाज्मिक आरएनए प्राइमर, सांख्यिकीय रूप से साइटोप्लाज्मिक अंश के उच्च स्तर देखे गए थे। टी-टेस्ट के माध्यम से दोनों नमूनों में उच्च सांख्यिकीय महत्व देखा गया था। पी < 0.0001. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: नकारात्मक परिणाम डेटा। यह आंकड़ा परमाणु और साइटोप्लाज्मिक घटकों के पृथक्करण के उच्च स्तर द्वारा प्रदर्शित प्रोटोकॉल का उपयोग करके नकारात्मक परिणामों के एक उदाहरण पर प्रकाश डालता है। एमएएलएटी 1, एक परमाणु आरएनए प्राइमर, परमाणु संदूषण के कारण साइटोप्लाज्मिक अंश स्तर का प्रदर्शन करता है। टी-टेस्ट के माध्यम से अंशों के बीच सांख्यिकीय महत्व में कोई अंतर नहीं देखा जाता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: वेस्टर्न ब्लोट साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों की शुद्धता का प्रदर्शन करता है। यह आंकड़ा परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के एक पश्चिमी धब्बे पर प्रकाश डालता है। लेमिन का उपयोग परमाणु नमूने की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए किया गया था, जबकि अल्फा-ट्यूबुलिन का उपयोग साइटोप्लाज्मिक अंश की शुद्धता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: आरएनए वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों की आरएनए शुद्धता की पुष्टि। (ए) परमाणु अंश का आरएनए वैद्युतकणसंचलन। एरो 32 एस आरआरएनए प्रदर्शित करता है, जो केवल परमाणु अंशों में देखा जाता है। (बी) साइटोप्लाज्मिक अंश का आरएनए वैद्युतकणसंचलन। 32 एस शिखर की अनुपस्थिति साइटोप्लाज्मिक अंश की आरएनए शुद्धता को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: लाइसिस बफर, प्रतिक्रिया मिश्रण और नमूने की संरचना। (ए) 0.25 एक्स लाइसिस बफर की संरचना। (बी) आरएनए को सीडीएनए में प्रतिलेखन के दौरान उपयोग किए जाने वाले रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस मिश्रण की संरचना। (सी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज किट का उपयोग करके परमाणु और साइटोप्लाज्मिक नमूनों की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 2: चक्रीय पैरामीटर। (ए) थर्मोसाइकलर के लिए साइकिल िंग पैरामीटर। इन पैरामीटरों का उपयोग लक्ष्य अनुक्रम के प्रवर्धन के लिए क्यूपीसीआर के दौरान किया गया था। (बी) परमाणु और साइटोप्लाज्मिक नमूनों के लिए साइकिल िंग पैरामीटर। इन पैरामीटरों का उपयोग लक्ष्य अनुक्रम के प्रवर्धन के लिए क्यूपीसीआर के दौरान किया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 3: परमाणु और साइटोप्लाज्मिक मार्करों के अनुक्रम। तालिका में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक पृथक्करण की पुष्टि करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों के अनुक्रम शामिल हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 4: एमएएलएटी 1 परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों को घटाने की प्रक्रिया। एमएएलएटी 1 परमाणु अंश को घटाने के लिए उपयोग की जाने वाली डेटा शीट का एक उदाहरण - एमएएलएटी 1 साइटोप्लाज्मिक अंश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 5: 2^(-मान) की गणना के लिए प्रक्रिया। 2^(-मान)) की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा शीट का एक उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 6: साइटोप्लाज्मिक अंश की गणना के लिए प्रक्रिया। साइटोप्लाज्मिक अंश की गणना करने के लिए उपयोग की जाने वाली डेटा शीट का एक उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 7: परमाणु अंश की गणना के लिए प्रक्रिया। परमाणु अंश की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा शीट का एक उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 8: सफल विभाजन परिणाम की पुष्टि करने के लिए प्रक्रिया। सफल विभाजन को सत्यापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा शीट का एक उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 1: क्यूपीसीआर मशीन डिजाइन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की छवि। QPCR मशीन के संचालन को प्रदर्शित करने वाली एक छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 2: क्यूपीसीआर की छवि "डेटा फ़ाइल गुण"। QPCR रन के लिए पैरामीटर सेट करने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने वाली एक छवि. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 3: क्यूपीसीआर मशीन में नमूने लोड करने की छवि। विश्लेषण के लिए QPCR सॉफ्टवेयर में नमूने जोड़ने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने वाली एक छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका 1: नमूना नाम डेटाशीट। नमूना नाम, लक्ष्य नाम, और CQ मान के साथ डेटा पत्रक का एक उदाहरण. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रोटोकॉल के दौरान, रुचि की सेल लाइन के लिए सबसे प्रभावी तत्वों को अनुकूलित करने के लिए कुछ कदम उठाए गए थे। जबकि प्रोटोकॉल के भीतर कदम अपेक्षाकृत सरल हैं, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं के दौरान विश्लेषण और मामूली समायोजन आवश्यक हो सकते हैं। प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम लाइसिस बफर की एकाग्रता को ब्याज की सेल लाइन और सेलुलर लक्ष्य के आधार पर उचित एकाग्रता में संशोधित करना है। चूंकि लाइसिस बफर का उपयोग काफी हद तक कोशिका झिल्ली के विघटन पर निर्भर करता है, इसलिए विभिन्न सेल लाइनों पर लाइसिस बफर की प्रभावशीलता में प्राकृतिक भिन्नता है क्योंकि विभिन्न सेल लाइनोंके बीच सेल नाजुकता और झिल्ली पारगम्यता में मामूली अंतर हैं। 1x lysis बफर की बेसलाइन से शुरू करते हुए, प्रोटोकॉल में चरणों को धीरे-धीरे लाइसिस बफर की एकाग्रता को 0.25x तक कम करते हुए किया गया था, जिसके लिए अधिक प्रभावी परिणामों की आवश्यकता थी। चूंकि प्रयोग का उद्देश्य अंततः बड़ी संख्या में उपकोशिकीय घटकों को अलग करना है, इसलिए यह सुनिश्चित करना कि लाइसिस बफर की एकाग्रता को सेल लाइन ऑफ इंटरेस्ट के लिए अनुकूलित किया गया है, उच्चतम उपज और सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
लाइसिस बफर सांद्रता के समायोजन के अलावा, आरएनए के अलगाव के दौरान आरएनए की नाजुकता और तनाव सावधानी पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। आरएनए डीएनए और कई अन्य सेलुलर तत्वों की तुलना में गिरावट के लिए अधिक संवेदनशील है, क्योंकि इसका 2 'हाइड्रॉक्सिल समूह आरएनएस के लिए एक बाध्यकारी बिंदु के रूप में काम कर सकता है, एंजाइमों का एक परिवार जो आरएनए को नीचा दिखा सकता है और खराब परिणाम दे सकता है। आरएनएस आरएनए क्षरण के लिए अत्यधिक सक्षम हैं, भले ही मामूली मात्रा13 में प्रस्तुत किया जाए। चूंकि आरएनएस लाइसिस चरणों के दौरान और बाद में कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं, इसलिए संदूषण को रोकने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, जिससे अवांछित आरएनए क्षरण हो सकताहै। चरणों में प्रयोग के दौरान दस्ताने पहनना और पर्यावरण या सतहों से नमूनों तक आरएनएस प्रसारित करने से बचने के लिए इन्हें अक्सर बदलना शामिल है। इसके अलावा, RNase-मुक्त समाधानों का उपयोग किया जाना चाहिए, और आरएनए को संभालते समय एक अलग कार्यक्षेत्र का उपयोग किया जाना चाहिए। अंत में, चूंकि आरएनएस लाइसिस बफर और विकृतीकरण के लिए बहुत प्रतिरोधी हो सकता है, आरएनएस इनहिबिटर का उपयोग आरएनए अलगाव15 पर उनके नकारात्मक प्रभावों को कम करने के लिए किया जा सकता है।
जबकि प्रोटोकॉल के दौरान चरणों ने अत्यधिक सफल परिणाम उत्पन्न किए, कुछ सीमाएं हैं। शुरू करने के लिए, जबकि आरएनए और साइटोप्लाज्मिक घटकों को काफी हद तक एक दूसरे से अलग किया जा सकता है, अध्ययन के लिए आरएनए की गुणवत्ता को खतरे में डाले बिना दोनों को पूरी तरह से अलग नहीं किया जा सकता है। इसके कारण, इन अलग-अलग क्षेत्रों से अणुओं की गतिविधि या कार्य में अंतर के आधार पर कोई भी निष्कर्ष पूरी तरह से पृथक नमूने प्राप्त करने में असमर्थता से थोड़ा तिरछा हो सकता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यदि प्रोटोकॉल को अन्य सेल अणुओं, जैसे प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो परमाणु अर्क के पृथक्करण के दौरान कुछ प्रोटीन या अन्य सेलुलर तत्व ों को नीचा दिखाया जा सकता है, जिससे गतिविधि का नुकसान हो सकता है और किसी के परिणामों को प्रभावितकिया जा सकता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल के दौरान, एमएएलएटी 1 और टीयूजी 1 का उपयोग करके परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के क्यूपीसीआर को नमूनों की शुद्धता और गुणवत्ता के सत्यापन के रूप में किया गया था। इस विचार पर विस्तार करने के लिए, इस प्रोटोकॉल के दौरान परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आरएनए के सापेक्ष अनुपात का विश्लेषण या तुलना नहीं की गई थी, क्योंकि इसका उपयोग केवल सत्यापन के उद्देश्य से किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य उपयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के सापेक्ष अनुपात की तुलना करना, लेकिन इन मूल्यों को सटीक विश्लेषण या तुलना के लिए कुल आरएनए की मात्रा में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों को कुल आरएनए स्तरों तक सामान्य करने के चरणों को पहले अन्य प्रोटोकॉल11 में वर्णित किया गया है।
हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, यह विधि उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए अर्क को लागत प्रभावी ढंग से उत्पन्न करने के लिए सामान्य प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग करती है। इसके अलावा, परमाणु और साइटोप्लाज्मिक इंटरैक्शन का अध्ययन करने की यह विधि सबसे अधिक समय प्रभावी प्रक्रियाओं में से एक साबित होती है। आरएनए शुद्धता किट का उपयोग करने से बहुत प्रभावी आरएनए सफाई होती है और विभिन्न सेलुलर क्षेत्रों से आरएनए अलगाव के उच्च स्तर को सुनिश्चित करने में मदद मिलती है, जिससे अध्ययन के लिए अधिक प्रभावी नमूने होते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल की अनुकूलनशीलता खुद को एक महत्वपूर्ण लाभ के रूप में प्रस्तुत करती है, क्योंकि लाइसिस बफर एकाग्रता को संशोधित करने से कई अलग-अलग सेल लाइनों के अध्ययन तक पहुंच मिल सकती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन जैसी घनत्व पृथक्करण तकनीक कई अलग-अलग सेलुलर तत्वों के अलगाव का कारण बन सकती है। चूंकि साइटोप्लाज्मिक और परमाणु इंटरैक्शन पर अध्ययन अधिक व्यापक होते हैं, सेलुलर घटकों पर स्थानीयकरण का प्रभाव बेहतर ढंग से समझा जा सकता है। साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच विनिमय का विश्लेषण किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि क्या इन आदान-प्रदानों के दौरान कुछ अणु कैंसर के विकास का कारण बन सकते हैं, जैसा कि एक्सपीओ 1 जैसे परमाणु प्रोटीन पर अध्ययन ने17 का संकेत दिया है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी, रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन, डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन, एडवर्ड पी इवांस फाउंडेशन और नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (1K08CA230319) से अनुदान द्वारा समर्थित।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
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- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
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