Summary
Hier presenteren we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van totaal vetzuur de novo lipogenese in bruin vetweefsel in vivo.
Abstract
Vetzuursynthese is een complexe en zeer energieverslindende metabole route met een belangrijke functionele rol bij de controle van de metabole homeostase van het hele lichaam en andere fysiologische en pathologische processen. In tegenstelling tot andere belangrijke metabole routes, zoals glucoseverwijdering, wordt de vetzuursynthese niet routinematig functioneel beoordeeld, wat leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status. Bovendien is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier beschrijven we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van de novo synthese van totale vetzuren in bruin vetweefsel in vivo. Deze methode meet de synthese van de producten van vetzuursynthase onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel nuttig voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Details over de monstervoorbereiding voor GCMS en stroomafwaartse berekeningen worden verstrekt. We richten ons op de analyse van bruin vet vanwege de hoge niveaus van de novo vetzuursynthese en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.
Introduction
Obesitas en bijbehorende stofwisselingsziekten zijn een pandemie die huidige en toekomstige generaties in gevaar brengt 1,2. Algemeen vereenvoudigd als gevolg van de onbalans tussen energie-inname en -verbruik, beïnvloedt de metabole ontregeling die gepaard gaat met obesitas een groot aantal metabole routes die worden gecontroleerd door omgevings- en endogenefactoren3. Er zijn echter maar een paar routes die routinematig worden getest in diermodellen van metabole ontregeling.
De verwijdering van glucose wordt bijvoorbeeld routinematig gemeten door middel van glucose- en insulinetolerantietests, waarschijnlijk vanwege de eenvoud van het gebruik van draagbare glucosemeters4. De relatieve snelheid van glucose en lipide-oxidatie in het hele lichaam wordt ook routinematig geschat op basis van de respiratoire uitwisselingsratio van indirecte calorimetrietests 5,6. De meeste andere aspecten van het metabolisme worden echter niet routinematig functioneel beoordeeld. Dit leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status en gemiste therapeutische opties. Een van de belangrijkste dergelijke routes is de novo lipogenese.
De novo lipogenese (DNL) is het proces waarbij nieuwe vetzuren worden gegenereerd uit voorlopers. Glucose wordt beschouwd als de belangrijkste precursor die bijdraagt aan DNL7 voor het hele lichaam, maar van andere precursoren, zoals acetaat, fructose, lactaat en aminozuren met vertakte ketens, is aangetoond dat ze relevante koolstofbronnen zijn op een ruimtelijke en conditieafhankelijke manier 8,9,10,11,12. DNL levert een belangrijke bijdrage aan de metabole homeostase en is essentieel voor een normale ontwikkeling13. Bovendien zijn veranderingen in DNL in verband gebracht met kanker 14,15 en metabole 16,17,18 en hart- en vaatziekten 19,20.
De DNL-route bestaat uit de belangrijkste enzymatische componenten ATP-citraatlyase (ACLY), acetyl-CoA-carboxylase (ACC1/2) en vetzuursynthase (FAS) die voornamelijk palmitaat produceren, een verzadigd vetzuur met 16 koolstofatomen. Oneven ketens en vetzuren met vertakte ketens kunnen echter ook met lagere snelheden wordengeproduceerd9. Elongases en desaturasen modificeren deze vetzuren verder, waardoor een breed scala aan vetzuren ontstaat die nuttig zijn voor een verscheidenheid aan functies (bijv. energieopslag op lange termijn en manipulatie van de membraanvloeibaarheid).
De expressie van de DNL-enzymatische machinerie wordt gecontroleerd door een klein aantal transcriptiefactoren. De meest beschreven tot nu toe zijn de familie van sterolregulerende elementbindende eiwitten (SREBP), koolhydraatresponselementbindende eiwitten (ChREBP) en lever-X-receptoren (LXR)21,22,23,24,25,26. Ondanks een schijnbare overlapping in hun functies, zijn individuele regulaties op basis van celtypedominantie en fysiologische of pathologische aandoeningen gerapporteerd21,22,27,28.
Opmerkelijk is dat een aantal remmers voor geselecteerde stappen van de DNL-route zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik of zich in de preklinische of klinische ontwikkelingsstadia bevinden voor een aantal ziekten, waaronder obesitas, niet-alcoholische leververvetting/niet-alcoholische steatohepatitis (NAFLD/NASH) en hart- envaatziekten. Deze inspanningen onderstrepen de relevantie van DNL voor gezondheid en ziekte.
In de afgelopen jaren is het gebruik van methoden om de novo vetzuursynthese kwantitatief te beoordelen toegenomen30. De meest gebruikelijke methode om dit te beoordelen is het gebruik van zwaar gelabeld water (D2O), waarbij de zwaar gelabelde waterstof tijdens de synthese zowel direct als indirect wordt opgenomen in acylketens, via deuteriumuitwisseling met de waterstofatomen van de DNL-substraten NAPDH, acetyl-CoA en malonyl-CoA. Hoewel deze aanpak aan populariteit wint, is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier schetsen we een methode voor het kwantitatief beoordelen van de de novo synthese van FAS-producten met behulp van D2O en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS), met berekeningen die eerder zijn ontwikkeld door Lee et al.31. Deze methode meet de novo vetzuursynthese onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel bruikbaar voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Hier richten we ons op de analyse van bruin vetweefsel (BAT) vanwege de hoge niveaus van DNL en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Bereiding van D2O
OPMERKING: Om experimentele variatie te voorkomen, moet u voldoende oplossing/drinkwater bereiden voor alle muizen voor de duur van het experiment.
- Voor intraperitoneale injectie: genereer 0,9% w/v zoutoplossing D 2 O door 9 g NaCl op te lossen per liter D 2 O. Filtreerdoor een niet-pyrogeen filter van0,2μm om te steriliseren.
- Voor het drinken van D 2 O-water: genereer 8% v/v D2 O-verrijkt water dat als drinkwater kan worden gebruikt door 80 ml D2O per 920ml gewoon drinkwater te mengen. Regulier drinkwater kan worden verkregen uit de muizenfaciliteit. Filtreer door een niet-pyrogeen filter van 0,2 μm om te steriliseren.
2. Modulatie van de BBT-activiteit door temperatuuracclimatisatie
- Scheid de muizen zodat er 2 weken voor het begin van de temperatuuracclimatisatie twee muizen per kooi zijn. Verander de watertoevoer naar waterflessen zodat de muizen zich kunnen aanpassen aan alle kooien en deze op 22 °C kunnen houden.
- Bereid de muiskamers 1 week voor aanvang van de temperatuuracclimatisatie voor door de juiste temperaturen in te stellen: 30 °C voor thermoneutraliteit, 22 °C voor kamertemperatuur en 18 °C voor blootstelling aan koude.
- Vervang aan het begin van de temperatuuracclimatisatie de kooien door nieuwe zonder omgevingsverrijking (om nesten te voorkomen). Verplaats de kooien naar hun respectievelijke temperaturen.
OPMERKING: Kooien die zijn toegewezen aan thermoneutraliteit blijven gedurende 4 weken op 30 °C. Kooien die op kamertemperatuur zijn toegewezen, blijven gedurende 4 weken op 22 °C. Kooien die zijn toegewezen aan blootstelling aan kou worden geleidelijk kouder volgens een wekelijks schema: 18 °C voor de eerste week, 14 °C voor de tweede week, 10 °C voor de derde week en 6 °C voor de vierde week. - Vervang vuile kooien wekelijks voor alle omstandigheden. Vervang bovendien voedsel- en waterflessen door nieuwe die vooraf zijn aangepast op de juiste temperatuur gedurende ten minste 24 uur.
OPMERKING: Houd rekening met de hoeveelheden voedsel die elke week worden toegevoegd, vooral voor muizen in de kou, omdat ze een aanzienlijk grotere hoeveelheid voedsel zullen consumeren in vergelijking met normale omstandigheden. Zorg voor voedsel ad libitum.
3. Toediening van D2O
- Injecteer elk dier met 0,9% g/v zoutoplossing-D2O bij 35 μl/g lichaamsgewicht, 12 uur tot 3 dagen vóór de afname van het weefsel, via intraperitoneale injectie met behulp van een spuit van 1 ml en een naald van 26 g.
OPMERKING: Zie het discussiegedeelte voor meer informatie over het selecteren van een geschikte etiketteringstijd. - Vervang de waterflessen door flessen met 8% v/v D2O verrijkt drinkwater.
4. Verzameling, verwerking en opslag van plasma en weefsel
- Aan het einde van het experiment offert u de muizen op met behulp van goedgekeurde methodologieën (bijv. overdosis kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie).
- Gebruik warmte-/koelpads of andere methoden om plotselinge temperatuurveranderingen vóór euthanasie te voorkomen die de resultaten kunnen beïnvloeden. Euthanaseer de muizen volgens goedgekeurde methodologieën. Ga onmiddellijk verder met het verzamelen van bloed en weefsel.
- Verzamel bloed door middel van een hartpunctie met behulp van een naald van 26 G en bewaar het in een ethyleendiaminetetra-azijnzuur bloedafnamebuisje. Bewaar het bloed op ijs tot verdere verwerking.
- Snijd de huid open langs de middelste lijn van de rug van de muis vanaf het onderste deel van de borstholte tot aan het bovenste deel van de nek, terwijl u de huid omhoog trekt om te voorkomen dat de weefsels onder de huid worden aangetast. De interscapulaire BAT bevindt zich tussen de schouderbladen onder een dunne laag wit vetweefsel en bestaat uit twee piramidale lobben.
- Reinig het weefsel door het te wassen in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dep op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen, weeg op een analytische weegschaal en verzamel in een microbuisje.
- Vries het weefsel onmiddellijk in met vloeibare stikstof. Ook andere BBT-depots kunnen worden opgehaald.
- Centrifugeer de bloedmonsters bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het plasma na het centrifugeren voorzichtig zonder de rode bloedcelkorrel te verstoren. Breng het over naar een nieuwe ijskoude microbuis en vries het snel in vloeibare stikstof in.
- Bewaar bruine vet- en plasmamonsters bij -80 °C tot gebruik.
5. Lipide-extractie uit vetweefsel
- Voordat u met de extractie begint
- Bereid een 1 mM-oplossing van hexadeceenzuur31 in methanol in een glazen injectieflacon. Dit zal dienen als de interne vetzuurstandaard.
- Koel de benodigde hoeveelheid chloroform (CHCl 3) en methanol (CH3OH) voor in een vriezer van -80 °C of op droogijs.
OPMERKING: De antioxidant di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) kan aan deCHCl 3 worden toegevoegd in een concentratie van 0,01% g/v (2,5 mg/25 ml) om oxidatie van de dubbele bindingen in onverzadigde vetzuren te voorkomen. - Pre-label microcentrifugebuisjes voor elk weefselmonster en een extra buisje dat moet worden gebruikt voor een blanco-extractie.
LET OP: CH 3 OH enCHCl 3 zijn zeer vluchtig en giftig bij inademing. Alleen gebruiken in zuurkasten.
OPMERKING: Verschillende merken microcentrifugebuisjes hebben verschillende niveaus van achtergrondpalmitaat en mogelijkheden om lekkage van oplosmiddelen te voorkomen. We raden aan om eerst verschillende buizen te testen, om er zeker van te zijn dat lekkage van oplosmiddelen wordt voorkomen en dat de buizen minimale niveaus van verontreinigend palmitaat bevatten. Zie Yao et al.32 voor verdere bespreking.
- Haal de monsters uit de vriezer en leg ze op droogijs.
- Plaats de vooraf geëtiketteerde microcentrifugebuis op een analytische balans en tarreer de balans. Plaats een pincet en een scalpel/stalen scheermesje 10-20 seconden op droogijs om af te koelen.
- Gebruik het pincet om het ingevroren weefselmonster uit het buisje te halen en op een plastic weegboot te plaatsen. De weegboot kan op een plat blok droogijs of een ander voorgekoeld oppervlak worden geplaatst.
- Gebruik het scalpel of stalen scheermesje om een klein deel van het weefsel te ontleden, overeenkomend met 5-15 mg in gewicht. Plaats in de microcentrifugebuis en noteer het exacte gewicht. Herhaal dit voor elk preparaat. Monsters kunnen op dit punt in de vriezer worden bewaard of kunnen worden voortgezet naar de onderstaande stappen voor lipide-extractie.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het scalpel goed wordt schoongemaakt met 70% ethanol tussen de monsters en dat tussen elk monster een nieuwe weegboot wordt gebruikt.
- Voeg aan elk monster 1 μL/mg 10 mM hexadeceenzuur 31 (C16:0-d31) toe.
LET OP: De volgende stappen (5.4 tot 5.8) moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast vanwege het inademingsrisico van de oplosmiddelen. - Voeg 250 μL CH 3 OH, 250 μL H2O en 500 μLCHCl 3 toe aan elk monster met drie roestvrijstalen kralen van 5 mm. Plaats de buisjes in een voorgekoeld blok van een maalmolen en meng de monsters met een trillingsfrequentie van 25 Hz gedurende 5 minuten, of gebruik de richtlijnen die door de fabrikant worden aanbevolen voor weefselmonsters. Verwijder de kralen met behulp van een magneet.
- Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Na centrifugatie moet een duidelijke bifasische scheiding worden waargenomen waarbij de bovenste waterige fase polaire metabolieten bevat en de onderste organische fase lipiden en vetzuren. Als er geen scheiding wordt gezien, voeg dan 250 μL H2O toe en herhaal de vortex- en centrifugatiestappen. - Neem met behulp van een micropipet een vast volume van de onderste fase van elk monster in overeenkomstig geëtiketteerde microcentrifugebuisjes.
- Voeg 500 μlCHCl 3 toe aan het resterende monster en herhaal stap 5.6-5.7.
- Plaats de monsters onder stikstofgas of in eenCHCl 3-bestendig gekoeld centrifugaalvacuüm bij 4 °C tot ze volledig droog zijn. Gedroogde monsters kunnen bij -20 °C worden bewaard totdat ze klaar zijn voor derivatisatie.
OPMERKING: De bovenste laag van elk monster kan op dit punt ook worden verzameld en gedroogd zoals in stap 5.9 om polaire metabolieten te analyseren.
6. Bereiding van methylesters van vetzuren (FAME's) en GCMS-analyse
- Met zuur gekatalyseerde verestering en transesterificatie ter voorbereiding van FAME's
LET OP: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast vanwege het inademingsrisico van de oplosmiddelen.- Als de monsters in de vriezer zijn bewaard, droog ze dan 5 minuten onder stikstof om er zeker van te zijn dat er geen water aanwezig is.
- Gebruik oplosmiddelen van MS-kwaliteit om 98 ml watervrij CH3OH in een glazen mediafles te pipetteren. Voeg langzaam 2 ml watervrij zwavelzuur toe in de zuurkast om 2% H2SO4 in CH3OH te maken. Meng door de gesloten fles rond te draaien.
- Voeg 500 μL 2% H2SO4 in CH3OH-oplossing toe aan elk monster en draai kortstondig.
- Incubeer de monsters op een warmteblok bij 50 °C gedurende 2 uur.
- Haal de monsters uit het warmteblok en voeg 100 μL verzadigde NaCl-oplossing en 500 μL hexaan toe aan elk monster.
- Draai de monsters krachtig bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Laat de monsters 1 minuut staan; Hierna zouden twee fasen zichtbaar moeten zijn.
- Vang de bovenste fase op in een nieuwe microcentrifugebuis (zie de opmerking in punt 5.1.3 voor de juiste keuze van de microcentrifugebuis).
- Om de opbrengst te maximaliseren, herhaalt u stap 6.1.5-6.1.7 en verzamelt u het tweede monster in dezelfde gelabelde buisjes.
- Droog de monsters bij kamertemperatuur onder stikstofgas.
- Resuspendeer de monsters in 20 μL/mg hexaan, ten opzichte van het oorspronkelijke weefselgewicht, en breng ze onmiddellijk over in een glazen GC-injectieflacon met een glazen inzetstuk.
NOTITIE: Werk snel tijdens het overbrengen van monsters om verdamping tot een minimum te beperken.
- GCMS-analyse
- Om de abundantie van FAME-isotopologen te bepalen, injecteert u de monsters op een enkele quadrupool-gaschromatografie-massaspectrometer (GCMS).
OPMERKING: Hoewel veel kolomtypen kunnen worden gebruikt om palmitaat te detecteren, is het volgende temperatuurprogramma opgesteld voor een GCMS-kolom die is ontwikkeld voor de scheiding van vetzuur cis/trans-isomeren, zoals beschreven in de materiaaltabel. Deze kolom heeft een lengte van 50 m met een binnendiameter van 0,25 mm. - Injecteer 1 μl monster in een gesplitste/gesplitste inlaat bij een inlaattemperatuur van 270 °C, met helium als draaggas, stromend met een snelheid van 1 ml/min. Gebruik een splitless injectie voor weinig voorkomende vetzuren met een totale stroom van 19 ml/min, een septumspoeling van 3 ml/min en een spoelstroom naar splitventilatie van 15 ml/min bij 0,75 min. Gebruik een splitverhouding van 10:1-40:1 voor vetzuren met een hoog overvloedig gehalte, zoals palmitaat en oleaat.
- Gebruik de volgende ovenparameters: een begintemperatuur van 80 °C; verhoging met stappen van 20 °C/min tot 170 °C; verhoging met stappen van 1 °C/min tot 204 °C; verhoging met stappen van 20 °C/min tot 250 °C; en vervolgens 10 minuten op 250 °C houden.
- Gebruik de volgende parameters van de massaselectieve detector (MSD): een elektronenimpactionisatiemodus van 70 eV en scan over het bereik van 50-400 m/z met een scansnelheid van 1.562 (u/s) en een frequentie van 4,1 scans/s. Gebruik een overdrachtsleiding bij 280 °C, een ionenbron bij 230 °C en een quadrupool bij 150 °C.
NOTITIE: Er kunnen andere kolommen worden gebruikt, maar het temperatuurprogramma zal variëren. - Monstersequentie: Randomiseer de volgorde van injectie en injecteer ten minste twee of drie blanco hexaandeeltjes aan het begin van de sequentie, na elk vijfde monster binnen de sequentie, en twee of drie aan het einde van de sequentie.
- Gebruik instrumentspecifieke software of gratis vrij toegankelijke software zoals Metabolite-Detector33 om de ionen in tabel 1 voor elke methylester van vetzuren te integreren.
OPMERKING: We hebben ionen geschetst die M1-M5-isotopologen bedekken in tabel 1 waarvan we hebben vastgesteld dat ze de hoeveelheid deuteriumopname dekken met dit etiketteringsvenster. Het kan echter nodig zijn dit uit te breiden als de novo flux aanzienlijk hoger is en/of een langere etiketteringstijd wordt gebruikt. - Gebruik de abundantie van elk geïntegreerd ion om een massa-isotomeerverdeling te genereren, waarbij de ionenintensiteiten kunnen worden omgezet in fractionele abundantie, zodat de som van de massa-isotomeerverdeling gelijk is aan één. Zie de voorbeeldspreadsheet in het aanvullende bestand.
OPMERKING: Om de deuteriumopname nauwkeurig te bepalen, moet vervolgens correctie van de natuurlijke isotopenabundantie worden toegepast om rekening te houden met de aanwezigheid van natuurlijk voorkomende isotopen zoals 13C, 15N en 2H. Dit wordt uitgevoerd door een correctiematrix toe te passen zoals uiteengezet door Fernandez et al.34,35, en kan niet worden uitgevoerd door de MID van een niet-gelabelde gemeten metaboliet af te trekken van een gelabelde metaboliet. In de praktijk raden we het gebruik van vrij verkrijgbare software zoals fluxfix 36, polyMID37 of IsoCor38 aan om ruwe gegevens om te zetten in fractionele MID's, en we hebben de formule voor isotopencorrectie voor de methylesterproducten van FAS in tabel 1 gegeven. - Gebruik de volgende formule om de hoeveelheid aanwezig palmitaat te bepalen:
waarbij het aantal ionen verwijst naar de som van alle palmitaatisotopologen die in tabel 1 zijn geïntegreerd en C16:0-d 31 verwijst naar de interne standaard hexadeceen-d31. De inwendige standaard vormt een aparte piek ten opzichte van die van het endogene palmitaat. De relatieve abundantie van andere vetzuren kan ook worden bepaald, maar voor volledige kwantificering kan het nodig zijn om interne standaarden voor vetzuurspecifieke isotopen (met massaverschuivingen die groter zijn dan die waargenomen bij de incorporatie van D2O) of externe standaardcurven te gebruiken. Gebruik het blanco geëxtraheerde monster om de hoeveelheid achtergrondpalmitaat te bepalen en trek dit af van de uiteindelijke weefselwaarde. - Bereken de molaire verrijking (ME) van palmitaat met de volgende vergelijking:
waarin Mi de genormaliseerde, fractionele abundantie van een palmitaatisotopolo is, en n het aantal mogelijke palmitaatisotopogen. Bijvoorbeeld, de ME van een palmitaatmolecuul met de volgende fractionele verdeling, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02, is: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (zie aanvullend bestand).
- Om de abundantie van FAME-isotopologen te bepalen, injecteert u de monsters op een enkele quadrupool-gaschromatografie-massaspectrometer (GCMS).
7. Deuteriumacetonuitwisseling van plasmamonsters om de verrijking van lichaamswater te bepalen
- Reactie
- Bereid 10 standaarden deuterium voor in water, variërend van 0-9% v/v.
- Bereid een 5% v/v aceton/acetonitril-oplossing met 4 μl per monster, met inbegrip van de normen van stap 5.1.1.
- Combineer in gelabelde, safe-lock microcentrifugebuisjes 10 μL van elk plasmamonster of standaard, 4 μL van 10 M NaOH en 4 μL van 5% aceton/acetonitril. Voer dit in drievoud uit voor elk monster.
- Meng de monsters voorzichtig door te pipetteren. Laat de monsters een nacht bij kamertemperatuur incuberen.
- Extractie
- Voeg na incubatie 450-550 mg Na2SO4 toe aan elk monster.
- Voeg in de zuurkast 600 μLCHCl 3 toe aan elke buis en draai krachtig gedurende 15 s.
- Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 300 x g.
- Breng onder een zuurkast drievoud van 80 μl aliquots van het supernatans uit elk monster over in geëtiketteerde, glazen GCMS-injectieflacons met glazen inzetstukken en dop.
- GCMS-analyse
- Scheid monsters op een kolom (30 m, 0,25 mm ID, Agilent DB-35MS) en analyseer ze op de bijgevoegde massaspectrometer.
- Injecteer 1 μL monster in een gesplitste/gesplitste inlaat, met een splitsingsverhouding van 40:1, een heliumstroom van 1 ml/min en een inlaattemperatuur van 270 °C.
- Gebruik de volgende ovenparameters: een begintemperatuur van 60 °C, verhoog met stappen van 20 °C/min tot 100 °C, verhoog met stappen van 50 °C/min tot 220 °C en houd vervolgens gedurende 1 minuut op 220 °C.
- Gebruik de volgende parameters van de massaselectieve detector (MSD): elektronenimpactionisatiemodus bij 70 eV met geselecteerde ionenbewaking van 58 en 59 m/z. Gebruik een overdrachtsleiding bij 280 °C, een ionenbron bij 230 °C en een quadrupool bij 150 °C.
NOTITIE: Andere kolommen met weinig afloop, gebonden, verknoopte kolommen met gemiddelde polariteit kunnen worden gebruikt, maar het temperatuurprogramma kan variëren.
- Stel de methode voor vloeistofmonsternemers zo in dat deze begint met een CHCl 3-wassing en vervolgens een willekeurige volgorde van de monsters, inclusief extraCHCl 3-wasstappen om de zes monsters.
OPMERKING: Als aceton wordt gebruikt als naaldspoeling voor de autosampler, vervang deze dan door CHCl 3 of hexaan en injecteer meerdere blancoCHCl 3-monsters totdat een verontreinigende acetonpiek niet langer zichtbaar is in het chromatogram. - Bij deze methode elueert een acetonpiek na ongeveer 1,25 min. Integreer de gegevens en bereken de fractionele abundantie van acetonverrijking volgens de stappen 6.2.6-6.2.7, met een aanpassing om pieken te analyseren met een m/z-verhouding van 58-60, zoals aangegeven in tabel 1.
- Gebruik de standaarden om een standaardcurve te genereren om het percentage lichaamswaterverrijking (p) van de testmonsters te bepalen, gebaseerd op de fractionele verrijking van aceton.
- Scheid monsters op een kolom (30 m, 0,25 mm ID, Agilent DB-35MS) en analyseer ze op de bijgevoegde massaspectrometer.
8. In vivo de novo lipogenese-berekeningen
- Bereken de fractie van nieuw gesynthetiseerde vetzuren (FNS) die directe producten zijn van FAS (d.w.z. palmitaat, oneven ketenvetzuren en mmBCFA's) in elk monster met de volgende vergelijking:
waarbij ME de gemiddelde molaire verrijking van een palmitaatmolecuul is (stap 6.2.9), p de deuteriumverrijking in water uit het overeenkomstige plasmamonster (stap 7.3.4) en N het aantal uitwisselbare waterstofatomen op palmitaat waarin een deuterium kan worden opgenomen. - Bepaal N met behulp van de onderstaande vergelijking die is vastgesteld door Lee et al.31:
- Bepaal de molaire hoeveelheid nieuw gesynthetiseerde vetzuren (MNS) door:
MNS = FNS x totale hoeveelheid vetzuren (nmol/mg weefsel).
OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een palmitaatmolaire verrijking (ME) van 0,245, een deuteriumverrijking in lichaamswater (p) van 0,045 en een berekend N-getal van 22 verkrijgt, is de fractionele synthese van palmitaat 0,247. Als de hoeveelheid palmitaat in het weefsel 2 mmol/mg is, dan is de mmol nieuw gesynthetiseerd palmitaat 0,494 mmol/mg (zie aanvullend dossier).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van de D 2 O-dosering beschreven in stap 1, vinden we doorgaans dat lichaamswater wordt verrijkt in het bereik van2,5% tot 6%, en dat een basisniveau van deuteriumverrijking in lichaamswater snel wordt bereikt in 1 uur en gedurende de duur van het onderzoek wordt gehandhaafd via 8% verrijkt drinkwater (Figuur 1). Continue steady-state lichaamswaterverrijking is een aanname van de berekeningen die in stap 6 zijn gebruikt, en daarom raden we aan om de kinetiek van lichaamswaterverrijking in nieuwe experimentele modellen experimenteel te valideren.
We hebben geconstateerd dat de hoeveelheid de novo gesynthetiseerde vetzuren bij kamertemperatuur toeneemt ten opzichte van die bij thermoneutraliteit in BAT (Figuur 2). De massa-isotopogenverdeling van palmitaat in BBT van muizen bij thermoneutraliteit en kamertemperatuur na 3 dagen toediening van D2O vertoont een hogere M1- en M2-deuteriumverrijking bij kamertemperatuur (figuur 2A). Deze verrijking bij koudere temperatuur vindt niet alleen plaats in palmitaat, maar ook in een breed scala aan vetzuren in BAT (Figuur 2B). De totale hoeveelheid palmitaat is ook verhoogd in de BBT van muizen bij kamertemperatuur, en door de fractionele synthesesnelheid te combineren met de totale palmitaatniveaus, ontdekten we dat de totale palmitaatsynthese bij muizen bij kamertemperatuur was verhoogd (Figuur 2C,D). Met name de totale vetzuurverrijking in plasma volgt niet dezelfde trend als de BBT, maar in plaats daarvan wordt de vetzuurverrijking verhoogd met thermoneutraliteit (figuur 2E). Deconvolutie van de potentiële opname uit endogene synthese is niet mogelijk met een D2O benadering op één enkel tijdstip, zoals hier beschreven, maar deze tegengestelde trends geven aan dat het vetzuurverrijkingspatroon in BBT niet wordt bepaald door de opname van vetzuren.
Figuur 1: Percentage D 2 O-verrijking in plasma van muizen over meerdere tijdstippen, na injectie met 0,035 ml/g lichaamsgewicht 0,9% NaCl D 2 O en vervanging van drinkwater door8% D2O verrijkt water. Staafdiagrammen geven het gemiddelde ± SD weer. n = 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten in bruin vetweefsel bij muizen na 3 dagen toediening van D 2 O. (A) Massale isotopologe verdeling van palmitaat in BBT na 3 dagen toediening van D2O bij kamertemperatuur (RT) en thermoneutraliteit (TN). (B) BBT-molaire verrijking van een reeks vetzuren na 3 dagen toediening van D2O bij kamertemperatuur en thermoneutraliteit. (C) Totale abundantie en het (D) de novo gesynthetiseerde palmitaat in bruin vetweefsel na 3 dagen toediening van D 2O bij kamertemperatuur en thermoneutraliteit. (E) Molaire verrijking in plasma van een reeks vetzuren na 3 dagen toediening van D2O bij kamertemperatuur en thermoneutraliteit. Staafdiagrammen geven het gemiddelde ± SD weer. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. Statistische analyse werd bepaald door middel van een tweezijdige t-toets van studenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Verbinding | Ionen | Geschatte elutietijd (minuten) | Formule voor isotopencorrectie |
| C16:0 | 270-275 | 20 | C17H34O2 |
| C14:0 | 242-247 | 16.5 | C15H30O2 |
| C15:0 | 256-261 | 18 | C16H32O2 |
| ISO-C16:0 | 270-275 | 18.9 | C17H34O2 |
| ISO-C17:0 | 284-289 | 21 | C18H36O2 |
| Anteiso-C17:0 | 284-289 | 21.5 | C18H36O2 |
| C16 D31 | 301 | 19.2 | ~ |
| Aceton | 58-59 | 1.5 | C3H6O |
Tabel 1: Te integreren fragmentionen van GCMS-verbindingen. Deze tabel omvat een reeks vetzuren die worden geproduceerd door vetzuursynthase van zoogdieren, maar C16:0 is het primaire product. Alle retentietijden zijn voor de GCMS-methode die in stap 6 wordt beschreven, behalve aceton, die in stap 7 wordt beschreven.
Aanvullend bestand: Voorbeeld spreadsheetberekening. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het begrijpen van de balans en interactie tussen complexe metabole routes is een onmisbare stap in de richting van het begrijpen van de biologische basis van metabole gerelateerde ziekten. Hier tonen we een niet-invasieve en goedkope methodologie om veranderingen in de novo vetzuursynthese te bepalen. Deze methode is gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden die berekeningen ontwikkelden voor het schatten van de novo syntheseflux uit vetzuurdeuteriumverrijking31 en voor het gebruik van deuterium-acetonuitwisseling voor het bepalen van het relatieve percentage D2O in lichaamswater39. In de afgelopen jaren hebben we de hier beschreven methode toegepast om veranderingen in de synthese van diverse vetzuren in vetdepots, de hersenen, lever en tumoren aan het licht te brengen. Er zijn een aantal cruciale stappen en aanpasbare aspecten van dit protocol. Deze houden verband met het algehele experimentele ontwerp en de analytische benadering en berekeningen die bij deze methode worden gebruikt. Alternatieve benaderingen voor het berekenen van de novo vetzuursynthese uit stabiele isotooptracers worden ook veel gebruikt. Deze omvatten de alternatieve massa-isotopomeerdistributieanalyse (MIDA)-benadering ontwikkeld door Hellerstein et al.41,42, isotopomeerspectrale analyse (ISA) ontwikkeld door Kelleher et al.43,44, en nieuwere benaderingen die zijn ontwikkeld om de synthese van vetzuren met langere ketens te modelleren, zoals vetzuurbronanalyse (FASA)45. Het voordeel van de methode hier is dat deze gemakkelijk te implementeren is met vrij beschikbare software en het gebruik van een spreadsheet. Het wordt echter beperkt door de noodzaak voor lichaamswaterverrijking (BWE) om in een stabiele toestand te zijn, voorbehouden in verband met het gebruik van de N-parameter (hieronder besproken), en dat het alleen van toepassing is op directe producten van FAS die voornamelijk palmitaat zijn.
Bruin vet DNL en temperatuuracclimatisatie
DNL is sterk gestegen als een belangrijke knobbel van de metabole regulatie van het hele lichaam en is essentieel voor de normale ontwikkeling13,29. Weefselgerichte deletie en metabolomische analyse hebben verschillende belangrijke enzymatische en transcriptionele spelers geïdentificeerd die DNL in vetweefsel beheersen, en hoe het de aanwas van lichaamsvet en normale metabole homeostase 21,28,46,47,48,49 regelt. Hoewel het minder gewaardeerd wordt, is BAT een zeer actief weefsel in DNL, met een hogere expressie van de DNL-enzymmachinerie van het kernlichaam (acly, acaca, fasn) dan de meeste andere weefsels en hogere lipogene activiteiten 22,50,51,52,53,54,55. De BBT is echter uniek, in die zin dat acclimatisatie aan subthermoneutrale temperaturen gelijktijdig DNL- en vetzuuroxidatieactiviteit induceert in BBT 22,54,56. Hoewel de bijbehorende mechanismen niet volledig duidelijk zijn, wordt aangenomen dat BBT een metabole put is voor voedingsstoffen, waaronder voedingsstoffen die bestemd zijn voor DNL voor lipidensynthese, die essentieel zijn voor normale BBT-activiteit53,55. Als zodanig is het relevant om rekening te kunnen houden met alle metabole inkomens en uitkomsten van BBT om de activiteitsniveaus ervan te beoordelen. DNL wordt echter meestal alleen gemeten op basis van genexpressie en functioneel beoordeeld bij getelde gelegenheden. Het hier voorgestelde protocol maakt de functionele beoordeling van DNL mogelijk, waardoor een volledigere interpretatie van de metabole status mogelijk wordt.
D2O dosis, timing en meting van de verrijking van het lichaamswater
Een van de belangrijkste kritische stappen in het ontwerp is de dosis en timing van de toediening van D2O. In dit protocol gebruiken we een dosis- en toedieningsbenadering (bolusinjectie gevolgd door drinkwaterverrijking) waarvan we hebben vastgesteld dat deze leidt tot het snel bereiken en behouden van steady state BWE. De berekeningen die worden gebruikt om de vetzuursynthese te bepalen, zijn gebaseerd op de aanname van steady-state BWE; Het is dus cruciaal dat dit wordt gevalideerd in nieuwe experimentele modellen. Indien steady-state verrijking niet mogelijk is als gevolg van problemen met het gebruik van deze gecombineerde doseringsbenadering, wordt de lezer verwezen naar andere publicaties waar wijzigingen in de berekeningen dit mogelijk maken39. De mate van variatie ten opzichte van de steady-state die kan worden getolereerd bij het gebruik van een doseringsbenadering die gericht is op het snel bereiken hiervan, hangt van veel factoren af. Als BWE wordt verhoogd in aanhoudende pieken boven de waarde die voor de berekening wordt gebruikt, dan zal DNL door de hier te gebruiken benadering worden overschat. Als BWE aanzienlijk lager is dan de waarde die wordt gebruikt voor de berekening voor aanhoudende tijdsperioden, wordt DNL onderschat. Hoewel enige kleine variatie rond het gemiddelde wordt verwacht, is de meest kritische factor dat BWE niet meer varieert in de ene experimentele groep dan in de andere, wat ertoe zou kunnen leiden dat verschillen in de berekende DNL worden veroorzaakt door variatie in BWE. Als beide experimentele groepen in de loop van de tijd een kleine maar vergelijkbare variatie vertonen, zal de tolerantie hiervan afhangen van de nauwkeurigheid en precisie waarmee de onderzoeker de meting moet uitvoeren, evenals de verwachte verschillen tussen experimentele groepen. In het geval van bruin vetweefsel dat wordt blootgesteld aan thermoneutraliteit versus kamertemperatuur, dat hier als voorbeeld werd gegeven, is het verschil in de hoeveelheid aanwezig de novo gesynthetiseerd vetzuur bijvoorbeeld groter dan 50%; het is dus onwaarschijnlijk dat kleine variaties in BWE de resultaten zullen verdoezelen.
Naast het in aanmerking nemen van de steady-state, is een ander aanpasbaar aspect van dit protocol het niveau van BWE. Een verhoogde BWE zorgt mogelijk voor een grotere labeloverdracht op vetzuren, en dus kunnen vetzuurpools met een lagere omzet gemakkelijker in een kortere tijd worden opgespoord. Dit kan een voordeel zijn in situaties waarin de onderzoeker geïnteresseerd is in acute reacties bij DNL. VerhoogdeD2O-spiegels in lichaamswater kunnen echter ongewenste fysiologische effecten veroorzaken, en daarom moet voorzichtigheid worden betracht57. Toediening van lagere niveaus van D 2 O om WWE-niveaus te bereiken, doorgaans rond de 0,5%, wordt vaak gebruikt in studies bij mensen vanwege de kosten diegepaard gaan met toediening van D2O. In dit geval kunnen methoden met verhoogde gevoeligheid nodig zijn om BWE en vetzuurverrijking te kwantificeren. Voor BWE kan dit worden bereikt via massaspectrometrie met ionenverhouding58 of een gemodificeerd acetonuitwisselingsprotocol59. Voor vetzuuranalyse is onlangs aangetoond dat het gebruik van een GCMS-instrument met hoge resolutie de gevoeligheid van de meting van deuterium in vetzuren verhoogt, en dus kwantificering van DNL mogelijk maakt na zeer korte tijdsperioden en/of een lage BWE60. Alternatieve methoden kunnen ook worden gebruikt om de doorvoer waarmee BWE wordt gemeten te verhogen, door gebruik te maken van headspace-analyses van de aceton die in stap 7.1.5 wordt gegenereerd in plaats van deze te extraheren met CHCl3 en vloeistofinjectie uit te voeren. Dit verkort de looptijd van de methode en vermijdt meerdere overdrachtsstappen, waardoor de voorbereidingstijd van het monster wordt verkort. Als er toegang is tot een headspace-injector, wordt deze methode ten zeerste aanbevolen61.
Keuze van de vetzuurpool om te kwantificeren en analytische benadering
In dit protocol is de methode ontworpen om de totale vetzuurpool in het weefsel of plasma te meten, ongeacht de lipidenklasse. Lipideklassen kunnen echter worden gescheiden voordat FAME wordt gegenereerd, via methoden zoals dunnelaagchromatografie of vloeistofchromatografie. Bovendien kunnen bij het analyseren van serum of plasma lipiden uit specifieke lipoproteïnefracties, zoals lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), worden geïsoleerd via ultracentrifugatie58. Deze methode wordt vaak gebruikt in studies bij mensen om lever-DNL vast te stellen, wat waarschijnlijk de primaire bron is van de novo gemaakte vetzuren in VLDL. Het protocol voor lipide-extractie en -derivatisering kan ook worden gewijzigd om de isolatie van specifieke klassen62 te verbeteren. Ten slotte kan deuteriumverrijking van lipidewaterstofatomen ook worden gemeten met behulp van 2H NMR-spectroscopie in plaats van massaspectrometrie. Hoewel deze methode minder gevoelig is dan MS en dus meer materiaal vereist, is het voordeel ervan dat het informatie over positionele verrijking oplevert, die kan worden gebruikt om de rek- en desaturatiesnelheden beter te schatten63.
Berekening
De berekeningen in dit protocol zijn gebaseerd op eerdere berekeningen die rekening houden met steady state BWE, vetzuurverrijking en het aantal uitwisselbare waterstofatomen op de vetzuren31. Zoals bij alle berekeningen, zijn er een aantal beperkingen en aannames waarmee rekening moet worden gehouden bij het toepassen en interpreteren van de resultaten van deze benadering. Een van de belangrijkste overwegingen is de waarde die wordt gebruikt voor N in sectie 8 van de methode. Tijdens de vetzuursynthese wordt 2 H van D2O opgenomen in de acylketen, evenals indirect via uitwisseling met waterstofatomen op NADPH, acetyl-CoA en malonyl-CoA64,65. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze uitwisseling onvolledig is31,66; in de berekening is dus een correctiefactor (N) opgenomen om rekening te houden met deze65. Een N van 22 wordt vaak gebruikt voor veel onderzoeken, omdat eerder is vastgesteld dat dit geschikt is voor een reeks weefsels met behulp van de vergelijking die is beschreven in stap 631,66. Dit kan echter variëren op basis van de experimentele verstoring en diermodel65; Daarom dringen we er bij onderzoekers op aan om hier rekening mee te houden. Een lagere N verhoogt de totale syntheseflux en de waarde die voor deze parameter wordt gebruikt, moet in aanmerking worden genomen bij het vergelijken van metingen tussen onderzoeken of laboratoria. Een beperking van de hier gebruikte benadering is dat deze alleen relevant is voor de analyse van directe producten van FAS, dat voornamelijk uit palmitaat bestaat, met veel lagere hoeveelheden oneven ketenvetzuren en monomethylvertakte ketenvetzuren9. Hoewel deuteriumverrijking van alle vetzuren kan worden gedetecteerd, is de hier gebruikte formule niet geschikt voor het bepalen van de synthese van vetzuren met een langere keten, zoals C18:0, omdat het geen rekening houdt met de opname van niet-gelabelde vetzuren en de verlenging van deze67. Evenzo kunnen de desaturatiepercentages ook worden onderschat.
Algemene beperkingen
Hoewel het gebruik van D2O voor het meten van vetzuren cruciaal inzicht heeft opgeleverd in het belang van DNL in fysiologische homeostase, zijn er een aantal beperkingen verbonden aan deze methodologie. Ten eerste is het, op basis van de hier geschetste timing, niet mogelijk om volledig vertrouwen te hebben in het weefsel van oorsprong van de nieuw gesynthetiseerde vetzuren. Het is gemakkelijk om je een scenario voor te stellen waarin een bepaald weefsel vetzuren genereert uit DNL, en die vervolgens naar andere weefsels worden getransporteerd. Experimenten met een fijn tijdsverloop na behandeling met D2O zouden de resolutie van het weefsel van oorsprong voor nieuw gesynthetiseerde vetzuren kunnen verhogen, waardoor besmetting tussen weefsels wordt verminderd. Het tijdstip van 3 dagen dat werd gebruikt voor de representatieve resultaten was ontworpen om deuteriumverrijking te detecteren in een reeks vetzuren bij zowel thermoneutraliteit (wanneer de flux lager is) als kamertemperatuur. Kortere tijdstippen na toediening van D2O, waarbij palmitaat het primaire doelwit is, minimaliseren het transport van vetzuren tussen weefsels en kunnen dus voordelig zijn. Veel kortere tijdspunten (bijv. 12 uur) zouden ideaal zijn bij het overwegen van muizen in koude omstandigheden en wanneer thermoneutraliteit niet is opgenomen in het experimentele ontwerp. Ten tweede geeft deze methode geen informatie over het substraat van oorsprong van de nieuwe vetzuren. Het identificeren van de specifieke substraten die in bepaalde omstandigheden worden gebruikt, kan een extra informatielaag zijn die nodig is voor een volledig begrip van de regelgevingskaart van DNL. Dit kan worden gedaan met substraten die zijn gelabeld met stabiele isotopen.
Voordelen
Een bijzonder voordeel van deze methode is dat de dieren niet worden vastgehouden (met uitzondering van de eerste injectie met D2O) en bij bewustzijn zijn tijdens de procedure, waardoor een stressarme omgeving wordt bevorderd waarin dieren zich natuurlijk kunnen gedragen, met inbegrip van de gewenste loopervaring en een voedingspatroon en -hoeveelheid die indien nodig een specifieke dieetbehandeling mogelijk maken. D2O is ook opmerkelijk eenvoudig toe te dienen. In tegenstelling tot vloeibare oplossingen van andere tracers (bijv. 13C-U-glucose), heeft D2O geen duidelijke smakelijke kenmerken die van invloed kunnen zijn op het waterverbruik. Naast stabiele isotopentracers is radio-isotopen de andere meest gebruikte methode. Het potentiële voordeel van radio-isotopen is de keuze van de apparatuur voor detectie. Voor stabiele isotopen is een massaspectrometer nodig, terwijl radio-isotopen kunnen worden gedetecteerd met behulp van een scintillatieteller, die mogelijk gemakkelijker toegankelijk is. Er zijn echter een aantal nadelen verbonden aan radio-isotopen vanwege veiligheids- en ethische kwesties. Bovendien is de radio-isotoop over het algemeen op glucose en weerspiegelt dus niet alleen veranderingen in DNL, maar eerder veranderingen in van glucose afgeleide DNL. Bovendien is het niet mogelijk om de synthese van individuele vetzuren te bepalen. D2O is sneller in evenwicht in alle weefsels in vergelijking met specifieke substraten met isotopenlabels68.
DNL is een belangrijk onderdeel van metabole homeostase die wordt gecontroleerd door een aantal enzymen en transcriptiefactoren die elk onafhankelijk de ontwikkeling, het metabolisme en de ziektetoestanden beïnvloeden. DNL zal dus ongetwijfeld een belangrijke metabole route zijn, die breder zal moeten worden onderzocht in onderzoek en therapieontwikkeling. Dit protocol kan worden gebruikt als een eerste stap voorwaarts in het routinematig opnemen van DNL-analyse in metabole fenotypering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken de lableden van Sanchez-Gurmaches en Wallace voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (18CDA34080527 aan JSG en 19POST34380545 aan RM), de NIH (R21OD031907 aan JSG), een CCHMC Trustee Award, een CCHMC Center for Pediatric Genomics Award en een CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 DK078392 van het Digestive Diseases Research Core Center in Cincinnati. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. RT en MW werden ondersteund door een UCD Ad Astra Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 mL Glass Vials | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| 0.2 µm filter | Olympus Plastic | 25-244 | |
| 26G needeled syringes | BD | 309597 | |
| Acetone | Merck | 34850 | |
| Acetonitrile | Merck | 900667 | |
| Blue GC screw cap with septa | Agilent | 5190-1599 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 366927 | |
| Deuterium oxide | Sigma | 151882 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Merck | B1378 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Agilent | CP7419 | |
| EDTA tube | Sarstedt | 411395105 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
| Hexane | Merck | 34859 | |
| Methanol | Merck | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Olympus Plastic | 24-282 | |
| Mouse environmental chamber | Caron | Caron 7001-33 | |
| Potasium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
| Potasium Phosphate | MP Biomedicals | 194727 | |
| SafeLock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Screw top amber GC vial | Agilent | 5182-0716 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | |
| Sodium Phosphate, dibasic | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
| Sodium Sulfate | Merck | 239313 | |
| Sulfuric Acid | Merck | 258105 | |
| Vial insert | Agilent | 5183-2088 |
References
- The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
- Gonzalez-Muniesa, P., et al.
- Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
- Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
- Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
- Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
- Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
- Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
- Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
- Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
- Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
- Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
- Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
- Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
- Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
- Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
- Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
- Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
- Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
- Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
- Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
- Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
- Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
- Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
- Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
- Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
- Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
- Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
- Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
- Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
- Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
- Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
- Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
- Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
- Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
- Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
- Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
- Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
- Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
- Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
- Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
- Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
- Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
- Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
- Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
- McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
- Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
- Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
- Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
- Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
- Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
- Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
- Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
- Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
- Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
- Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
- Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
- Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
- Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
- Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
- Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
- Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
- Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).
