Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ bestemmelse av de novo fettsyresyntese i brunt fettvev ved bruk av deuteriumoksid

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en billig kvantitativ metode som benytter deuteriumoksid og gasskromatografi massespektrometri (GCMS) for analyse av total fettsyre de novo lipogenese i brunt fettvev in vivo.

Abstract

Fettsyresyntese er en kompleks og svært energikrevende metabolsk vei med viktige funksjonelle roller i kontrollen av helkroppens metabolske homeostase og andre fysiologiske og patologiske prosesser. I motsetning til andre viktige metabolske veier, som glukoseavhending, blir fettsyresyntese ikke rutinemessig funksjonelt vurdert, noe som fører til ufullstendige tolkninger av metabolsk status. I tillegg mangler det offentlig tilgjengelige detaljerte protokoller som passer for nykommere i feltet. Her beskriver vi en billig kvantitativ metode som benytter deuteriumoksid og gasskromatografi massespektrometri (GCMS) for analyse av total fettsyre de novo-syntese i brunt fettvev in vivo. Denne metoden måler syntesen av produktene av fettsyresyntase uavhengig av en karbonkilde, og den er potensielt nyttig for nesten hvilket som helst vev, i hvilken som helst musemodell og under enhver ekstern forstyrrelse. Detaljer om prøveforberedelsen for GCMS og nedstrømsberegninger er gitt. Vi fokuserer på analysen av brunt fett på grunn av dets høye nivåer av de novo fettsyresyntese og kritiske roller i å opprettholde metabolsk homeostase.

Introduction

Fedme og tilhørende metabolske sykdommer er en pandemi som truer nåværende og fremtidige generasjoner 1,2. Vanligvis forenklet som følge av ubalansen mellom energiinntak og forbruk, påvirker metabolsk dysregulering forbundet med fedme et stort antall metabolske veier kontrollert av miljømessige og endogene faktorer3. Imidlertid blir bare noen få veier rutinemessig testet i dyremodeller av metabolsk dysregulering.

Som et eksempel måles glukoseavhending rutinemessig ved glukose- og insulintoleransetester, sannsynligvis på grunn av enkelheten ved å bruke bærbare glukosemonitorer4. Relative rater for glukose og lipidoksidasjon for hele kroppen estimeres også rutinemessig basert på respiratorisk utvekslingsforhold fra indirekte kalorimetrianalyser 5,6. Imidlertid blir flertallet av alle andre aspekter av metabolisme ikke rutinemessig funksjonelt vurdert. Dette fører til ufullstendige tolkninger av metabolsk status og tapte terapeutiske alternativer. En av de viktigste slike veier er de novo lipogenese.

De novo lipogenese (DNL) er prosessen der nye fettsyrer genereres fra forløpere. Glukose anses å være den viktigste forløperen som bidrar til hele kroppen DNL7, men andre forløpere, som acetat, fruktose, laktat og forgrenede aminosyrer, har vist seg å være relevante karbonkilder på en romlig og tilstandsavhengig måte 8,9,10,11,12. DNL er en viktig bidragsyter til metabolsk homeostase og er avgjørende for normal utvikling13. I tillegg har endringer i DNL vært assosiert med kreft 14,15 og metabolsk 16,17,18 og hjerte- og karsykdommer 19,20.

DNL-banen består av kjerneenzymatiske komponenter ATP-citratlyase (ACLY), acetyl-CoA-karboksylase (ACC1/2) og fettsyresyntase (FAS) som primært produserer palmitat, en 16-karbon mettet fettsyre. Imidlertid kan oddekjedede og forgrenede fettsyrer også produseres ved lavere hastigheter9. Elongaser og desaturaser modifiserer disse fettsyrene ytterligere, og skaper et mangfoldig utvalg av fettsyrer som er nyttige for en rekke funksjoner (f.eks. Langsiktig energilagring og manipulering av membranfluiditet).

Ekspresjonen av DNLs enzymatiske maskineri styres av et kort antall transkripsjonsfaktorer. De mest beskrevne til dags dato inkluderer sterol regulatorisk element bindende protein (SREBP) familie, karbohydratresponselement bindende protein (ChREBP) og lever X-reseptor (LXR) 21,22,23,24,25,26. Til tross for en tilsynelatende overlapping i deres funksjoner, har individuelle forskrifter basert på celletypedominans og fysiologiske eller patologiske forhold blitt rapportert21,22,27,28.

Bemerkelsesverdig nok har en rekke hemmere for utvalgte trinn i DNL-banen blitt godkjent for klinisk bruk eller er i prekliniske eller kliniske utviklingsstadier for en rekke sykdommer, inkludert fedme, ikke-alkoholholdig fettleversykdom / ikke-alkoholisk steatohepatitt (NAFLD / NASH) og kardiovaskulær sykdom29. Disse anstrengelsene fremhever relevansen av DNL i helse og sykdom.

I de senere år har bruken av metoder for kvantitativt å vurdere de novo fettsyresyntese økt30. Den vanligste metoden for å vurdere dette er bruk av tungt merket vann (D2O), der det tungt merkede hydrogenet blir inkorporert i acylkjeder under syntese både direkte og indirekte, via deuteriumutveksling med hydrogenene i DNL-substratene NAPDH, acetyl-CoA og malonyl-CoA. Selv om denne tilnærmingen blir stadig mer populær, mangler det offentlig tilgjengelige detaljerte protokoller som passer for nykommere i feltet. Her skisserer vi en metode for kvantitativt å vurdere de novo-syntesen av produkter av FAS ved bruk av D2O og gasskromatografi massespektrometri (GCMS), med beregninger tidligere utviklet av Lee et al.31. Denne metoden måler de novo fettsyresyntese uavhengig av en karbonkilde, og den er potensielt nyttig for nesten alle vev, i hvilken som helst musemodell, og under enhver ekstern forstyrrelse. Her fokuserer vi på analysen av brunt fettvev (BAT) på grunn av dets høye nivåer av DNL og kritiske roller i å opprettholde metabolsk homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Fremstilling av D2O

MERK: For å unngå eksperimentell variasjon, lag tilstrekkelig løsning/drikkevann for alle mus i løpet av forsøket.

  1. For intraperitoneal injeksjon: generer 0,9% w / v saltvann D 2 O ved å oppløse 9 g NaCl per liter D 2 O. Filtrer gjennom etikke-pyrogent0,2μm filter for å sterilisere.
  2. For drikke D 2O-vann: generer 8% v / v D 2 O-anriket vann som skal brukes som drikkevann ved å blande 80 ml D2O per 920 ml vanlig drikkevann. Vanlig drikkevann kan fås fra museanlegget. Filtrer gjennom et ikke-pyrogent 0,2 μm filter for å sterilisere.

2. Modulering av BAT-aktivitet ved temperaturakklimatisering

  1. Separer musene slik at det er to mus per bur 2 uker før temperaturakklimatiseringen starter. Bytt vannforsyning til vannflasker slik at musene kan tilpasse seg og vedlikeholde alle burene ved 22 °C.
  2. Forbered musens miljøkamre 1 uke før temperaturakklimatiseringen startes ved å stille inn passende temperaturer: 30 °C for termonøytralitet, 22 °C for romtemperatur og 18 °C for kald eksponering.
  3. Ved starten av temperaturakklimatisering, bytt burene med nye uten miljøberikelse (for å unngå reir). Flytt merdene til deres respektive temperaturer.
    MERK: Bur tildelt termonøytralitet vil holde seg på 30 °C i 4 uker. Bur tilordnet romtemperatur vil holde seg på 22 °C i 4 uker. Bur som er tilordnet kald eksponering vil bli gradvis kaldere på en ukentlig plan: 18 ° C for den første uken, 14 ° C for den andre uken, 10 ° C for den tredje uken og 6 ° C for den fjerde uken.
  4. Bytt skitne bur ukentlig for alle forhold. I tillegg må du bytte ut mat- og vannflasker med nye som er forhåndstilpasset ved riktig temperatur i minst 24 timer.
    MERK: Vær oppmerksom på matmengdene som tilsettes hver uke, spesielt for mus i kulde, siden de vil konsumere en betydelig større mengde mat sammenlignet med normale forhold. Gi mat ad libitum.

3. Administrasjon av D2O

  1. Hvert dyr injiseres med 0,9 % w/v saltvann-D2O ved 35 μl/g kroppsvekt, 12 timer - 3 dager før vevsoppsamling, via intraperitoneal injeksjon med en 1 ml sprøyte og 26 G kanyle.
    MERK: Se diskusjonsdelen for mer informasjon om valg av passende merkingstidspunkt.
  2. Bytt vannflasker til flasker som inneholder 8% v/v D2O-beriket drikkevann.

4. Plasma- og vevsinnsamling, prosessering og lagring

  1. På slutten av forsøket, ofre musene ved hjelp av godkjente metoder (f.eks. Overdosering av karbondioksid etterfulgt av cervikal dislokasjon).
    1. Bruk varme/kjøleputer eller andre metoder for å unngå plutselige temperaturendringer før aktiv dødshjelp som kan påvirke resultatene. Avlive musene etter godkjente metoder. Fortsett umiddelbart til blod- og vevsoppsamling.
  2. Samle blod gjennom hjertepunktering ved hjelp av en 26 G nål og oppbevar i et etylendiamintetraeddiksyre blodoppsamlingsrør. Hold blodet på is inntil videre behandling.
  3. Klipp opp huden langs midtlinjen på baksiden av musen fra det nedre området av brysthulen opp til det øvre området av nakken, mens du trekker huden opp for å unngå å påvirke vev under huden. Den interscapulære BAT er plassert mellom skulderbladene under et tynt lag av hvitt fettvev, og det består av to pyramideformede lober.
    1. Rengjør vevet ved å vaske i iskaldt fosfatbufret saltvann (PBS). Dab på et papirhåndkle for å eliminere overflødig væske, veie på en analytisk skala og samle i et mikrorør.
    2. Blits umiddelbart fryse vevet ved hjelp av flytende nitrogen. Andre BAT-depoter kan også hentes.
  4. Sentrifuger blodprøvene ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Etter sentrifugering, samle plasmaet forsiktig uten å forstyrre den røde blodcellepelleten. Overfør den til et nytt iskaldt mikrorør og flashfrys i flytende nitrogen.
  5. Oppbevar brune fett- og plasmaprøver ved -80 °C til bruk.

5. Lipidekstraksjon fra fettvev

  1. Før du begynner utvinningen
    1. Forbered en 1 mM løsning av heksadecenoic-d31 syre i metanol i et hetteglass. Dette vil tjene som den interne fettsyrestandarden.
    2. Forkjøl den nødvendige mengden kloroform (CHCl3) og metanol (CH3OH) i en fryser på -80 °C eller på tørris.
      MERK: Antioksidanten di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) kan tilsettes CHCl3 i en konsentrasjon på 0,01% w / v (2,5 mg / 25 ml) for å forhindre oksidasjon av dobbeltbindingene i umettede fettsyrer.
    3. Pre-label mikrosentrifuge rør for hver vevsprøve og et ekstra rør som skal brukes til en tom ekstraksjon.
      FORSIKTIG:CH3OH og CHCl3 er svært flyktige og giftige ved innånding. Skal bare brukes i avtrekkshetter.
      MERK: Ulike merker av mikrosentrifugerør har forskjellige nivåer av bakgrunnspalmitat og evner når det gjelder å forhindre løsemiddellekkasje. Vi anbefaler at en rekke rør testes først, for å sikre at løsemiddellekkasje forhindres og at rørene har minimale nivåer av forurensende palmitat. Se Yao et al.32 for nærmere diskusjon.
  2. Ta prøvene ut av fryseren og legg på tørris.
  3. Plasser det forhåndsmerkede mikrosentrifugerøret på en analytisk vekt og rist balansen. Legg pinsett og en skalpell/stål barberblad på tørris i 10-20 s for å avkjøles.
    1. Bruk pinsetten til å ta den frosne vevsprøven ut av røret og legg den på en veiebåt av plast. Veiebåten kan plasseres på en flat blokk med tørris eller en annen forkjølt overflate.
    2. Bruk skalpellen eller stålbarberbladet, dissekere en liten del av vevet, tilsvarende 5-15 mg i vekt. Plasser i mikrosentrifugerøret og registrer den nøyaktige vekten. Gjenta for hvert eksemplar. Prøver kan lagres i fryseren på dette tidspunktet eller kan gå videre til trinnene nedenfor for lipidekstraksjon.
      MERK: Sørg for at skalpellen er ordentlig rengjort med 70% etanol mellom prøvene og en ny veiebåt brukes mellom hver prøve.
  4. Tilsett 1 μL/mg 10 mM heksadecenoic-d 31(C16:0-d31) syre til hver prøve.
    FORSIKTIG: Følgende trinn (5,4 til 5,8) bør utføres under en avtrekkshette på grunn av innåndingsrisikoen for oppløsningsmidlene.
  5. Tilsett 250 μLCH3OH, 250 μLH2Oog 500 μL CHCl3 til hver prøve med tre 5 mm rustfrie stålperler. Plasser rørene i en forkjølt blokk av et slipeverk og bland prøvene med en vibrasjonsfrekvens på 25 Hz i 5 minutter, eller bruk retningslinjer anbefalt av produsenten for vevsprøver. Fjern perlene med en magnet.
  6. Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    MERK: Etter sentrifugering bør en klar bifasisk separasjon observeres med den øvre vandige fase som inneholder polare metabolitter og den nedre organiske fase som inneholder lipider og fettsyrer. Hvis ingen separasjon sees, tilsett 250 μL H2O og gjenta virvel- og sentrifugeringstrinnene.
  7. Bruk en mikropipette til å ta et fast volum fra bunnfasen av hver prøve inn i tilsvarende merkede mikrosentrifugerør.
  8. Legg til 500 mikroliter CHCl3 i den gjenværende prøven, og gjenta trinn 5,6–5,7.
  9. Legg prøvene under nitrogengass eller i et CHCl 3-resistent nedkjølt sentrifugalvakuum ved 4 °C til de er helt tørre. Tørkede prøver kan oppbevares ved -20 °C til de er klare for derivatisering.
    MERK: Det øverste laget av hver prøve kan også samles på dette punktet og tørkes som i trinn 5.9 for å analysere polare metabolitter.

6. Fremstilling av fettsyremetylestere (FAMEs) og GCMS-analyse

  1. Syrekatalysert forestring og transesterifisering for å forberede FAME
    FORSIKTIG: Følgende trinn bør utføres under en avtrekkshette på grunn av innåndingsrisikoen for oppløsningsmidlene.
    1. Hvis prøvene har blitt lagret i fryseren, tørk under nitrogen i 5 min for å sikre at det ikke er vann til stede.
    2. Bruk MS-grade løsemidler til å pipette 98 ml vannfriCH3OH inn i en glassmedieflaske. Tilsett sakte 2 ml vannfri svovelsyre i avtrekkshetten for å lage 2% H2SO4 i CH3OH. Bland ved å virvle den lukkede flasken.
    3. Tilsett 500 μL 2%H2SO4 iCH3OH-oppløsningtil hver prøve og hvirvel kort.
    4. Inkuber prøvene på en varmeblokk ved 50 °C i 2 timer.
    5. Fjern prøvene fra varmeblokken og tilsett 100 μL mettet NaCl-løsning og 500 μL heksan til hver prøve.
    6. Virv prøvene kraftig ved romtemperatur i 1 min. La prøvene sitte i 1 min; To faser bør være tydelige etter dette.
    7. Samle den øvre fasen i et nytt mikrosentrifugerør (se merknad i pkt. 5.1.3 for passende valg av mikrosentrifugerøret).
    8. For å maksimere utbyttet, gjenta trinn 6.1.5-6.1.7, og samle den andre prøven i de samme merkede rørene.
    9. Tørk prøvene ved romtemperatur under nitrogengass.
    10. Resuspender prøvene i 20 mikrol / mg heksan, i forhold til den opprinnelige vevsvekten, og overfør umiddelbart til glass GC hetteglass med en glassinnsats.
      MERK: Arbeid raskt mens du overfører prøver for å minimere fordampning.
  2. GCMS-analyse
    1. For å bestemme overflod av FAME-isotopologer, injiser prøvene på et enkelt kvadrupolgasskromatografimassespektrometer (GCMS).
      MERK: Mens mange kolonnetyper kan brukes til å oppdage palmitat, ble følgende temperaturprogram etablert for en GCMS-kolonne som er utviklet for separasjon av fettsyre cis / trans-isomerer, som beskrevet i materialfortegnelsen. Denne kolonnen har en lengde på 50 m med en indre diameter på 0,25 mm.
    2. Injiser 1 μL prøve i et delt/splittfritt inntak ved en innløpstemperatur på 270 °C, med helium som bærergass, strømmende ved 1 ml/min. Bruk en splittfri injeksjon for fettsyrer med lite rikelig med en total strømning på 19 ml / min, en septumrensing på 3 ml / min, og en rensestrøm for å dele ventilen på 15 ml / min ved 0,75 min. Bruk et delt forhold på 10: 1-40: 1 for høye rikelig fettsyrer som palmitat og oleat.
    3. Bruk følgende ovnparametere: en innledende temperatur på 80 °C; øke trinnvis med 20 °C/min til 170 °C; økning med trinn på 1 °C/min til 204 °C; øke trinnvis med 20 °C/min til 250 °C; og hold deretter ved 250 °C i 10 min.
    4. Bruk følgende masseselektive detektor (MSD) parametere: en elektronpåvirkningsioniseringsmodus på 70 eV og skann over området 50-400 m / z med en skannehastighet på 1,562 (u / s) og en frekvens på 4,1 skanning / s. Bruk en overføringslinje ved 280 °C, en ionekilde ved 230 °C og en kvadrupol ved 150 °C.
      MERK: Andre kolonner kan brukes, men temperaturprogrammet vil variere.
    5. Prøvesekvens: Randomiser prøverekkefølgen for injeksjon og injiser minst to eller tre heksanemner i begynnelsen av sekvensen, etter hver femte prøve i sekvensen, og to eller tre på slutten av sekvensen.
    6. Bruk instrumentspesifikk programvare, eller gratis programvare med åpen tilgang, for eksempel metabolittdetektor33, for å integrere ionene i tabell 1 for hver fettsyremetylester.
      MERK: Vi har skissert ioner som dekker M1-M5 isotopologer i tabell 1 som vi har funnet dekker mengden deuteriuminkorporering med dette merkingsvinduet. Det kan imidlertid være nødvendig å utvide dette dersom de novo flux er betydelig høyere og/eller det brukes lengre merketid.
    7. Bruk overflod av hvert integrerte ion for å generere en masseisotopomerfordeling, hvor ionintensitetene kan konverteres til fraksjonell overflod slik at summen av masseisotopomerfordelingen er lik en. Se eksempelregnearket i tilleggsfilen.
      MERK: For å kunne bestemme deuteriuminkorporering nøyaktig, må korreksjon av den naturlige isotopmengden deretter brukes for å tillate tilstedeværelse av naturlig forekommende isotoper som 13C, 15N og 2H. Dette utføres ved å bruke en korreksjonsmatrise som skissert av Fernandez et al.34,35, og kan ikke utføres ved å subtrahere MID av en umerket målt metabolitt fra en merket metabolitt. I praksis anbefaler vi bruk av fritt tilgjengelig programvare som fluxfix 36, polyMID37 eller IsoCor38 for å gjøre rådata til fraksjonelle MIDs, og vi har gitt formelen for isotopkorreksjon for metylesterproduktene til FAS i tabell 1.
    8. For å bestemme mengden palmitat tilstede, bruk følgende formel:
      Equation 1 
      der ionantall refererer til summen av alle palmitatisotopologer integrert i tabell 1 og C16:0-d 31 refererer til den interne standarden heksadecenoic-d31. Den interne standarden danner en egen topp til den for det endogene palmitatet. Den relative overflod av andre fettsyrer kan også bestemmes, men fettsyrespesifikke isotopinterne standarder (med masseforskyvninger større enn det som observeres fra D2O-inkorporering) eller eksterne standardkurver må kanskje brukes for full kvantifisering. Bruk den blanke ekstraherte prøven til å bestemme mengden bakgrunnspalmitat og trekke dette fra den endelige vevsverdien.
    9. Beregn molær anrikning (ME) av palmitat ved følgende ligning:
      Equation 2
      hvor Mi er den normaliserte, fraksjonelle overflod av en palmitatisotopolog, og n er antall mulige palmitatisotopologer. For eksempel er ME i et palmitatmolekyl med følgende fraksjonsfordeling, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (se tilleggsfil).

7. Deuterium aceton utveksling av plasmaprøver for å bestemme kroppens vannanrikning

  1. Reaksjon
    1. Forbered 10 standarder for deuterium i vann, fra 0-9% v / v.
    2. Forbered en 5% v / v aceton / acetonitril løsning som tillater 4 μL per prøve, inkludert standardene fra trinn 5.1.1.
    3. I merkede, safe-lock mikrosentrifugerør, kombiner 10 μL av hver plasmaprøve eller standard, 4 μL av 10 M NaOH og 4 μL av 5% aceton / acetonitril. Utfør dette i triplikat for hver prøve.
    4. Bland prøvene forsiktig ved pipettering. La prøvene ruge ved romtemperatur over natten.
  2. Utvinning
    1. Etter inkubering, tilsett 450-550 mgNa2SO4til hver prøve.
    2. I avtrekkshetten tilsettes 600 μLCHCl 3 til hver tube og virvel kraftig i 15 s.
    3. Sentrifuger prøvene ved 300 x g i 2 minutter.
    4. Under en avtrekkshette overføres triplikate, 80 μl alikoter av supernatanten fra hver prøve til merkede GCMS-hetteglass av glass med glassinnlegg og korken tett.
  3. GCMS-analyse
    1. Separate prøver på en kolonne (30 m, 0,25 mm i.d, Agilent DB-35MS) og analyser på vedlagte massespektrometer.
      1. Injiser 1 μL prøve i et delt/delt innløp, med et delt forhold på 40:1, en heliumstrøm på 1 ml/min og en innløpstemperatur på 270 °C.
      2. Bruk følgende ovnparametere: en starttemperatur på 60 °C, øk trinnvis med 20 °C/min til 100 °C, øk trinnvis med 50 °C/min til 220 °C, og hold deretter ved 220 °C i 1 min.
      3. Bruk følgende masseselektive detektor (MSD) parametere: elektronpåvirkningsioniseringsmodus ved 70 eV med valg av ioneovervåking på 58 og 59 m / z. Bruk en overføringslinje ved 280 °C, en ionekilde ved 230 °C og en kvadrupol ved 150 °C.
        MERK: Andre kolonner med lav blødning, limt, tverrbundet, midtpolaritet kan brukes, men temperaturprogrammet vil variere.
    2. Sett væskeprøvetakingsmetoden til å begynne med en CHCl 3-vask og deretter en randomisert sekvens av prøvene, inkludert ytterligere CHCl3-vasketrinn hver sjette prøve.
      MERK: Hvis aceton brukes som nålevask for den automatiske prøvetakeren, erstatt med CHCl 3 eller heksan og injiser flere tomme CHCl3-prøver til en forurensende acetontopp ikke lenger er tydelig i kromatogrammet.
    3. Ved hjelp av denne metoden elueres en acetontopp på rundt 1,25 min. Integrer dataene og beregn fraksjonell overflod av acetonberikelse etter trinn 6.2.6-6.2.7, med en justering for å analysere topper som inneholder et m / z-forhold på 58-60 som angitt i tabell 1.
    4. Bruk standardene til å generere en standardkurve for å bestemme prosentandelen av kroppsvannberikelse (p) av testprøvene, basert på fraksjonell anrikning av aceton.

8. In vivo de novo lipogenese beregninger

  1. Beregn fraksjonen av nylig syntetiserte fettsyrer (FNS) som er direkte produkter av FAS (dvs. palmitat, merkelige kjedefettsyrer og mmBCFAer) i hver prøve med følgende ligning:
    Equation 3
    der ME er den gjennomsnittlige molare anrikningen av et palmitatmolekyl (trinn 6.2.9), p er deuteriumanrikningen i vann fra den tilsvarende plasmaprøven (trinn 7.3.4), og N er antall utskiftbare hydrogenatomer på palmitat hvor et deuterium kan inkorporeres.
  2. Bestem N ved hjelp av ligningen nedenfor som ble etablert av Lee et al.31:
    Equation 4
  3. Bestem molarmengden av nylig syntetiserte fettsyrer (MNS) ved å:
    MNS = FNS x total fettsyremengde (nmol/mg vev).
    MERK: For eksempel, hvis man oppnår en palmitatmolar anrikning (ME) på 0,245, en deuteriumanrikning i kroppsvann (p) på 0,045 og et beregnet N-tall på 22, er fraksjonssyntesen av palmitat 0,247. Hvis mengden palmitat som er tilstede i vevet er 2 mmol / mg, er mmol av nylig syntetisert palmitat 0,494 mmol / mg (se tilleggsfil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Basert på doseringen av D 2 O beskrevet i trinn 1, finner vi vanligvis at kroppsvann anrikes i området2,5% til 6 %, og at et baselinenivå av deuteriumanrikning i kroppsvann raskt oppnås i løpet av 1 time og opprettholdes i løpet av studien via 8 % anriket drikkevann (figur 1). Kontinuerlig steady state kroppsvannberikelse er en forutsetning for beregningene som ble brukt i trinn 6, og vi anbefaler derfor eksperimentell validering av kinetikken til kroppsvannberikelse i nye eksperimentelle modeller.

Vi har funnet at mengden de novo-syntetiserte fettsyrer økes ved romtemperatur i forhold til de ved termonøytralitet i BAT (figur 2). Masseisotopologfordelingen av palmitat i BAT fra mus ved termonøytralitet og romtemperatur etter 3 dager med D2O-administrasjon viser en høyere M1 og M2 deuteriumanrikning funnet ved romtemperatur (figur 2A). Denne kaldere temperaturberikelsen skjer ikke bare i palmitat, men også i et bredt spekter av fettsyrer i BAT (figur 2B). Total palmitatmengde økes også i BAT av mus ved romtemperatur, og ved å kombinere fraksjonssyntesehastigheten med de totale palmitatnivåene, fant vi at total palmitatsyntese ble økt hos mus ved romtemperatur (figur 2C, D). Spesielt følger plasma total fettsyreanrikning ikke samme trend som BAT, men i stedet økes fettsyreanrikningen med termonøytralitet (figur 2E). Dekonvoluting av potensielt opptak fra endogen syntese er ikke mulig med en D2O enkeltpunktstilnærming, som beskrevet her, men disse motstridende trendene indikerer at fettsyreanrikningsmønsteret i BAT ikke drives av fettsyreopptak.

Figure 1
Figur 1: Prosentandel av D 2 O-anrikning i plasma hos mus over flere tidspunkter, etter injeksjon med 0,035 ml/g kroppsvekt 0,9 % NaCl D 2 O og erstatning av drikkevann med 8% D2O-anriket vann. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SD. n = 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater i mus brunt fettvev etter 3 dager med D 2 O-administrasjon. (A) Masseisotopologfordeling av palmitat i BAT etter 3 dager med D2O-administrasjon ved romtemperatur (RT) og termonøytralitet (TN). (B) BAT molar anrikning av en rekke fettsyrer etter 3 dager med D2O administrasjon ved romtemperatur og termonøytralitet. (C) Total overflod og (D) de novo syntetiserte palmitat i brunt fettvev etter 3 dager med D 2O-administrasjon ved romtemperatur og termonøytralitet. (E) Plasma molar anrikning av en rekke fettsyrer etter 3 dager med D2O administrasjon ved romtemperatur og termonøytralitet. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. Statistisk analyse ble bestemt med tosidig student-t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammensatt Ioner Estimert elueringstid (minutter) Formel for isotopkorreksjon
C16:0 270-275 20 C17H34O2
C14:0 242-247 16.5 C15T30O2
C15:0 256-261 18 C16H32O2
ISO-C16:0 270-275 18.9 C17H34O2
ISO-C17:0 284-289 21 C18H36O2
Anteiso-C17:0 284-289 21.5 C18H36O2
C16 D31 301 19.2 ~
Aceton 58-59 1.5 C3H6O

Tabell 1: GCMS-sammensatte fragmentioner som skal integreres. Denne tabellen dekker en rekke fettsyrer produsert av pattedyrfettsyresyntase, men C16:0 er primærproduktet. Alle oppbevaringstider er for GCMS-metoden som er beskrevet i trinn 6, unntatt aceton, som er beskrevet i trinn 7.

Tilleggsfil: Eksempel på regnearkberegning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å forstå balansen og samspillet mellom komplekse metabolske veier er et uunnværlig skritt mot å forstå det biologiske grunnlaget for metabolske relaterte sykdommer. Her viser vi en ikke-invasiv og billig metodikk for å bestemme endringer i de novo fettsyresyntese. Denne metoden er tilpasset fra tidligere publiserte metoder som utviklet beregninger for estimering av de novo syntesefluks fra fettsyre deuteriumanrikning31 og for bruk av deuterium-acetonutveksling for å bestemme den relative prosentandelen av D2O i kroppsvann39. De siste årene har vi tatt metoden beskrevet her og brukt den til å avdekke endringer i syntesen av ulike fettsyrer i fettdepoter, hjerne, lever og svulster 9,22,40. Det er en rekke kritiske trinn og modifiserbare aspekter ved denne protokollen. Disse er relatert til den generelle eksperimentelle designen, samt den analytiske tilnærmingen og beregningene som brukes i denne metoden. Alternative tilnærminger for beregning av de novo fettsyresyntese fra stabile isotopsporstoffer er også mye brukt. Disse inkluderer den alternative masseisotopomerfordelingsanalysen (MIDA) utviklet av Hellerstein et al.41,42, isotopomerspektralanalyse (ISA) utviklet av Kelleher et al.43,44, og nyere tilnærminger som er utviklet for å modellere syntesen av langkjedede fettsyrer som fettsyrekildeanalyse (FASA)45. Fordelen med metoden her er at den enkelt kan implementeres med fritt tilgjengelig programvare og bruk av regneark. Det er imidlertid begrenset av behovet for kroppsvannberikelse (BWE) å være i en jevn tilstand, forbehold knyttet til utnyttelse av N-parameteren (diskutert nedenfor), og at den bare gjelder for direkte produkter av FAS som primært er palmitat.

Brunt fett DNL og temperaturakklimatisering
DNL har steget som en hovedknute for helkroppens metabolske regulering og er avgjørende for normal utvikling13,29. Vevsmålrettet delesjon og metabolomisk analyse har identifisert flere viktige enzymatiske og transkripsjonelle aktører som kontrollerer DNL i fettvev, og hvordan det kontrollerer helkroppsfettakkresjon og normal metabolsk homeostase 21,28,46,47,48,49. Selv om det er mindre verdsatt, er BAT et svært aktivt vev i DNL, med et høyere uttrykk for kjernelegemets DNL-enzymmaskineri (acly, acaca, fasn) enn de fleste andre vev og høyere lipogene aktiviteter 22,50,51,52,53,54,55. BAT er imidlertid unikt, i den forstand at akklimatisering til subtermonøytrale temperaturer samtidig induserer DNL og fettsyreoksidasjonsaktivitet i BAT 22,54,56. Selv om de tilknyttede mekanismene ikke er helt klare, er det akseptert at BAT er en metabolsk vask for næringsstoffer, inkludert de som er bestemt til DNL for lipidsyntese, som er essensielle for normal BAT-aktivitet53,55. Som sådan er det relevant å kunne redegjøre for alle metabolske inntekter og utfall av BAT for å vurdere aktivitetsnivået. Imidlertid måles DNL vanligvis bare basert på genuttrykk og funksjonelt vurdert ved tellede anledninger. Protokollen som foreslås her tillater funksjonell vurdering av DNL, noe som muliggjør en mer fullstendig tolkning av metabolsk status.

D2O-dose, timing og måling av kroppsvannberikelse
Et av de viktigste kritiske trinnene i designet er dosen og tidspunktet for administreringen av D2O. I denne protokollen bruker vi en dose- og administrasjonstilnærming (bolusinjeksjon etterfulgt av drikkevannsberikelse) som vi har funnet fører til rask oppnåelse og opprettholdelse av steady state BWE. Beregningene som brukes til å bestemme fettsyresyntese er basert på antagelsen om steady state BWE; Det er derfor avgjørende at dette valideres i nye eksperimentelle modeller. Dersom steady state-anrikning ikke er mulig på grunn av problemer med å bruke denne kombinerte doseringsmetoden, henvises leseren til andre publikasjoner der endringer i beregningene åpner for denne39. Graden av variasjon fra steady state som kan tolereres ved bruk av en doseringsmetode som tar sikte på rask oppnåelse av dette, avhenger av mange faktorer. Hvis BWE økes i vedvarende topper over verdien som brukes til beregning, vil DNL bli overvurdert ved å bruke tilnærmingen her. Hvis BWE er betydelig lavere enn verdien som brukes til beregning i vedvarende tid, vil DNL bli underestimert. Mens det forventes noe liten variasjon rundt gjennomsnittet, er den mest kritiske faktoren at BWE ikke varierer mer i den ene eksperimentelle gruppen enn den andre, noe som kan føre til at forskjeller i den beregnede DNL drives av variasjon i BWE. Hvis begge eksperimentelle gruppene viser en liten, men lignende variasjon over tid, vil toleransen for dette avhenge av nøyaktigheten og presisjonen som etterforskeren krever at målingen skal utføre, samt de forventede forskjellene mellom eksperimentelle grupper. For eksempel, når det gjelder brunt fettvev utsatt for termonøytralitet versus romtemperatur, som ble gitt som et eksempel her, er forskjellen i mengden de novo syntetisert fettsyre tilstede større enn 50%; Dermed vil små variasjoner i BWE neppe tilsløre resultatene.

I tillegg til vurdering av steady state, er et annet modifiserbart aspekt av denne protokollen nivået på BWE. Økt BWE gir potensielt økt etikettoverføring til fettsyrer, og dermed kan fettsyrebassenger med lavere omsetning lettere kunne påvises på kortere tid. Dette kan være en fordel i situasjoner der forskeren er interessert i akutte responser i DNL. Imidlertid kan økte D2O-nivåer i kroppsvann forårsake uønskede fysiologiske effekter, og det bør derfor utvises forsiktighet57. Administrasjon av lavere nivåer av D 2 Ofor å oppnå BWE-nivåer, vanligvis rundt 0.5%, brukes vanligvis i menneskelige studier på grunn av kostnadene forbundet med D2O-administrasjon. I dette tilfellet kan det være behov for metoder med økt følsomhet for å kvantifisere BWE og fettsyreanrikning. For BWE kan dette oppnås via ioneforholdets massespektrometri58 eller en modifisert acetonutvekslingsprotokoll59. For fettsyreanalyse har bruk av et høyoppløselig GCMS-instrument nylig vist seg å øke sensitiviteten til måling av deuterium i fettsyrer, og dermed tillate kvantifisering av DNL etter svært korte tidsperioder og / eller lav BWE60. Alternative metoder kan også brukes til å øke gjennomstrømningen som BWE måles med, ved å benytte headspace-analyser av acetonen generert i trinn 7.1.5 i stedet for å ekstrahere den med CHCl3 og utføre væskeinjeksjon. Dette reduserer kjøretiden for metoden og unngår flere overføringstrinn, noe som reduserer forberedelsestiden for prøver. Hvis tilgang til en headspace-injektor er tilgjengelig, anbefales denne metoden på det sterkeste61.

Valg av fettsyrepool for kvantifisering og analytisk tilnærming
I denne protokollen er metoden designet for å måle den totale fettsyrepoolen i vev eller plasma, uavhengig av lipidklasse. Imidlertid kan lipidklasser separeres før FAME-generering, ved hjelp av metoder som tynnsjiktskromatografi eller væskekromatografi. I tillegg, ved analyse av serum eller plasma, kan lipider fra spesifikke lipoproteinfraksjoner, slik som lipoprotein med svært lav tetthet (VLDL), isoleres via ultrasentrifugering58. Denne metoden brukes ofte i humane studier for å fastslå hepatisk DNL, som sannsynligvis vil være den primære kilden til de novo-produserte fettsyrer i VLDL. Lipidekstraksjons- og derivatiseringsprotokollen kan også modifiseres for å forbedre isoleringen av spesifikke klasser62. Endelig kan deuteriumanrikning av lipidhydrogener også måles ved hjelp av 2H NMR-spektroskopi i stedet for massespektrometri. Selv om denne metoden er mindre følsom enn MS og derfor krever økt materiale, er fordelen at den gir posisjonsberikelsesinformasjon, som kan brukes til å bedre estimere forlengelses- og desaturasjonshastigheter63.

Beregning
Beregningene i denne protokollen er basert på tidligere beregninger som tar hensyn til steady state BWE, fettsyreanrikning og antall utskiftbare hydrogener på fettsyrene31. Som med alle beregninger, er det en rekke begrensninger og forutsetninger som bør vurderes når man bruker og tolker resultatene fra denne tilnærmingen. Et av de viktigste hensynene er verdien som brukes for N i avsnitt 8 i metoden. Under fettsyresyntese inkorporeres 2 H fra D2O i acylkjeden, så vel som indirekte via utveksling med hydrogener på NADPH, acetyl-CoA og malonyl-CoA64,65. Tidligere studier har vist at denne utvekslingen er ufullstendig 31,66; I beregningen inngår altså en korreksjonsfaktor (N) for å ta høyde for disse65. En N på 22 er ofte brukt i mange studier, da det tidligere har blitt funnet at dette passer for en rekke vev ved hjelp av ligningen skissert i trinn 631,66. Dette kan imidlertid variere basert på eksperimentell forstyrrelse og dyremodell65; Vi oppfordrer derfor etterforskerne til å ta hensyn til dette. En lavere N øker den totale syntesefluksen, og verdien som brukes for denne parameteren bør vurderes når man sammenligner målinger på tvers av studier eller laboratorier. En begrensning av tilnærmingen som brukes her er at den bare er relevant for analysen av direkte produkter av FAS som primært er palmitat, med mye lavere mengder odde kjedefettsyrer og monometylforgrenede fettsyrer9. Selv om deuteriumanrikning av alle fettsyrer kan detekteres, er formelen som brukes her ikke egnet for å bestemme syntesen av langkjedede fettsyrer, slik som C18: 0, da det ikke tillater opptak av umerket fettsyre og forlengelse av disse67. Tilsvarende kan desaturasjonshastigheter også undervurderes.

Generelle begrensninger
Selv om bruken av D2O for måling av fettsyrer har generert avgjørende innsikt i betydningen av DNL i fysiologisk homeostase, er det en rekke begrensninger knyttet til denne metodikken. For det første, basert på tidspunktet som er skissert her, er det ikke mulig å være helt trygg på opprinnelsesvevet til de nylig syntetiserte fettsyrene. Det er lett å forestille seg et scenario der et bestemt vev genererer fettsyrer fra DNL, og deretter transporteres de til andre vev. Fine tidskurseksperimenter etter D2O-behandling kan øke oppløsningen av opprinnelsesvevet for nylig syntetiserte fettsyrer, og redusere kryssvevsforurensning. 3-dagers tidspunktet, som ble benyttet for de representative resultatene, ble designet for å oppdage deuteriumanrikning i en rekke fettsyrer ved både termonøytralitet (når flussen er lavere) og romtemperatur. Kortere tidspunkter etter D2O-administrasjon, hvor palmitat er det primære målet, minimerer fettsyretransport på tvers av vev og kan derfor være fordelaktig. Mye kortere tidspunkter (f.eks. 12 timer) ville være ideelt når man vurderer mus under kalde forhold og når termonøytralitet ikke er inkludert i eksperimentell design. For det andre gir denne metoden ikke informasjon om opprinnelsessubstratet til de nye fettsyrene. Identifisering av de spesifikke substratene som brukes under spesielle omstendigheter kan være et ekstra lag med informasjon som er nødvendig for full forståelse av reguleringskartet til DNL. Dette kan gjøres med substrater merket med stabile isotoper.

Fordeler
En spesiell fordel med denne metoden er at dyrene er uhemmet (unntatt den første injeksjonen av D2O) og bevisste under prosedyren, og fremmer et lavt stressmiljø for dyr å oppføre seg naturlig, inkludert ønsket ambulering og et fôringsmønster og mengde som tillater spesifikk diettbehandling om nødvendig. D2O er også bemerkelsesverdig enkel å administrere. I motsetning til flytende løsninger av andre sporstoffer (f.eks. 13C-U-glukose), har D2O ikke distinkte velsmakende egenskaper som sannsynligvis vil påvirke vannforbruket. Utover stabile isotopsporere er den andre mest brukte metoden radioisotoper. Den potensielle fordelen med radioisotoper er valg av utstyr for deteksjon. Et massespektrometer er nødvendig for stabile isotoper, mens radioisotoper kan detekteres ved hjelp av en scintillasjonsteller, som kan være lettere tilgjengelig. Det er imidlertid en rekke ulemper forbundet med radioisotoper på grunn av sikkerhetsmessige og etiske problemer. I tillegg er radioisotopen generelt på glukose og reflekterer derfor ikke bare endringer i DNL, men heller endringer i glukoseavledet DNL. I tillegg er bestemmelse av syntesen av individuelle fettsyrer ikke mulig. D2O likevekter raskere over alle vev sammenlignet med spesifikke substrater med isotopetiketter68.

DNL er en nøkkelkomponent i metabolsk homeostase kontrollert av en rekke enzymer og transkripsjonsfaktorer som hver uavhengig påvirker utvikling, metabolisme og sykdomstilstander. Dermed er DNL nødt til å være en viktig metabolsk vei, som må undersøkes bredere i forskning og terapiutvikling. Denne protokollen kan brukes som et første skritt fremover for å inkorporere DNL-analyse rutinemessig i metabolsk fenotyping.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sanchez-Gurmaches og Wallace lab medlemmer for verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Heart Association (18CDA34080527 til JSG og 19POST34380545 til RM), NIH (R21OD031907 til JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award, og en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH P30 DK078392 av Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. RT og MW ble støttet av et UCD Ad Astra Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

Biologi utgave 195 brunt fettvev deuteriumoksid metabolsk vei funksjonelle roller helkroppens metabolske homeostase fysiologiske prosesser patologiske prosesser glukoseavhending funksjonell vurdering detaljerte protokoller kvantitativ metode gasskromatografi massespektrometri (GCMS) total fettsyresyntese karbonkilde prøvepreparering nedstrømsberegninger brunt fett metabolsk homeostase
Kvantitativ bestemmelse av <em>de novo</em> fettsyresyntese i brunt fettvev ved bruk av deuteriumoksid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace,… More

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter