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ड्यूटेरियम ऑक्साइड का उपयोग करके ब्राउन एडीपोज ऊतक में डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण का मात्रात्मक निर्धारण

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम विवो में भूरे रंग के वसा ऊतक में कुल फैटी एसिड डे नोवो लिपोजेनेसिस के विश्लेषण के लिए ड्यूटेरियम ऑक्साइड और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसीएमएस) का उपयोग करके एक सस्ती मात्रात्मक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

फैटी एसिड संश्लेषण पूरे शरीर के चयापचय होमियोस्टैसिस और अन्य शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के नियंत्रण में महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिकाओं के साथ एक जटिल और अत्यधिक ऊर्जा की मांग वाला चयापचय मार्ग है। ग्लूकोज निपटान जैसे अन्य प्रमुख चयापचय मार्गों के विपरीत, फैटी एसिड संश्लेषण नियमित रूप से कार्यात्मक रूप से मूल्यांकन नहीं किया जाता है, जिससे चयापचय की स्थिति की अधूरी व्याख्या होती है। इसके अलावा, क्षेत्र में नवागंतुकों के लिए उपयुक्त सार्वजनिक रूप से उपलब्ध विस्तृत प्रोटोकॉल की कमी है। यहां, हम विवो में भूरे रंग के वसा ऊतक में कुल फैटी एसिड डी नोवो संश्लेषण के विश्लेषण के लिए ड्यूटेरियम ऑक्साइड और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसीएमएस) का उपयोग करके एक सस्ती मात्रात्मक विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि कार्बन स्रोत से स्वतंत्र रूप से फैटी एसिड सिंथेज़ के उत्पादों के संश्लेषण को मापती है, और यह लगभग किसी भी ऊतक के लिए, किसी भी माउस मॉडल में, और किसी भी बाहरी गड़बड़ी के तहत संभावित रूप से उपयोगी है। जीसीएमएस और डाउनस्ट्रीम गणना के लिए नमूना तैयार करने पर विवरण प्रदान किए गए हैं। हम डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण के उच्च स्तर और चयापचय होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण ब्राउन वसा के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

Introduction

मोटापा और संबंधित चयापचय रोग एक महामारी है जो वर्तमान औरभविष्य की पीढ़ियों को खतरे में डालती है। आमतौर पर ऊर्जा सेवन और व्यय के बीच असंतुलन के परिणामस्वरूप सरलीकृत किया जाता है, मोटापे से जुड़े चयापचय विकृति पर्यावरण और अंतर्जातकारकों द्वारा नियंत्रित चयापचय मार्गों की एक बड़ी संख्या को प्रभावित करती है। हालांकि, चयापचय विकृति के पशु मॉडल में केवल कुछ मार्गों का नियमित रूप से परीक्षण किया जाता है।

एक उदाहरण के रूप में, ग्लूकोज निपटान को नियमित रूप से ग्लूकोज और इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षणों द्वारा मापा जाता है, शायद पोर्टेबल ग्लूकोज मॉनिटर4 का उपयोग करने की सादगी के कारण। पूरे शरीर के ग्लूकोज और लिपिड ऑक्सीकरण सापेक्ष दरों का भी नियमित रूप से अनुमान लगाया जाता है जो अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री से श्वसन विनिमय अनुपात 5,6 पर आधारित होता है। हालांकि, चयापचय के अन्य सभी पहलुओं के बहुमत का नियमित रूप से कार्यात्मक रूप से मूल्यांकन नहीं किया जाता है। यह चयापचय की स्थिति की अधूरी व्याख्या और चिकित्सीय विकल्पों को याद करता है। इस तरह के मुख्य मार्गों में से एक डे नोवो लिपोजेनेसिस है।

डे नोवो लिपोजेनेसिस (डीएनएल) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा अग्रदूतों से नए फैटी एसिड उत्पन्न होते हैं। ग्लूकोज को पूरे शरीर के डीएनएल7 में योगदान देने वाला मुख्य अग्रदूत माना जाता है, हालांकि अन्य अग्रदूत, जैसे एसीटेट, फ्रुक्टोज, लैक्टेट, और ब्रांकेड चेन अमीनो एसिड, को स्थानिक और स्थितिनिर्भर तरीके से प्रासंगिक कार्बन स्रोत दिखाया गया है। डीएनएल चयापचय होमियोस्टैसिस में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है औरसामान्य विकास के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, डीएनएल में परिवर्तन कैंसर 14,15 और चयापचय16,17,18 और कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों 19,20 से जुड़ा हुआ है।

डीएनएल मार्ग कोर एंजाइमेटिक घटकों एटीपी साइट्रेट लाइज़ (एसीएलवाई), एसिटाइल-सीओए कार्बोक्सिलेज (एसीसी 1/2), और फैटी एसिड सिंथेज़ (एफएएस) से बना है जो मुख्य रूप से पामिटेट, 16-कार्बन संतृप्त फैटी एसिड का उत्पादन करते हैं। हालांकि, विषम श्रृंखला और शाखित श्रृंखला फैटी एसिड का उत्पादन कम दरों पर भी किया जा सकताहै। एलोंगेस और डेसैट्यूरेस इन फैटी एसिड को और संशोधित करते हैं, जिससे विभिन्न प्रकार के कार्यों के लिए उपयोगी फैटी एसिड प्रजातियों की एक विविध श्रृंखला बनती है (जैसे, दीर्घकालिक ऊर्जा भंडारण और झिल्ली तरलता का हेरफेर)।

डीएनएल एंजाइमेटिक मशीनरी की अभिव्यक्ति को प्रतिलेखन कारकों की एक छोटी संख्या द्वारा नियंत्रित किया जाता है। आज तक सबसे अच्छी तरह से वर्णित स्टेरोल नियामक तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (एसआरईबीपी) परिवार, कार्बोहाइड्रेट प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (सीएचआरईबीपी), और यकृत एक्स रिसेप्टर (एलएक्सआर) 21,22,23,24,25,26 शामिल हैं। उनके कार्यों में एक स्पष्ट ओवरलैप के बावजूद, सेल प्रकार की डोमिनेंसी और शारीरिक या रोग संबंधी स्थितियों के आधार पर व्यक्तिगत नियमों को21,22,27,28 बताया गया है।

उल्लेखनीय रूप से, डीएनएल मार्ग के चयनित चरणों के लिए कई अवरोधकों को नैदानिक उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है या मोटापा, गैर-मादक फैटी यकृत रोग / गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएफएलडी / एनएएसएच), और कार्डियोवैस्कुलर बीमारीसहित कई बीमारियों के लिए विकास के प्रीक्लिनिकल या नैदानिक चरणों में हैं। ये प्रयास स्वास्थ्य और बीमारी में डीएनएल की प्रासंगिकता को उजागर करते हैं।

हाल के वर्षों में, डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण का मात्रात्मक आकलन करने के तरीकों का रोजगार30 बढ़ गया है। इसका आकलन करने के लिए सबसे आम तरीका भारी लेबल वाले पानी (डी2ओ) का उपयोग है, जहां भारी लेबल हाइड्रोजन को डीएनएल सब्सट्रेट्स एनएपीडीएच, एसिटाइल-सीओए और मैलोनिल-सीओए के हाइड्रोजेन के साथ ड्यूटेरियम विनिमय के माध्यम से प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से संश्लेषण के दौरान एसाइल चेन में शामिल किया जाता है। यद्यपि यह दृष्टिकोण लोकप्रियता में बढ़ रहा है, लेकिन क्षेत्र में नवागंतुकों के लिए उपयुक्त सार्वजनिक रूप से उपलब्ध विस्तृत प्रोटोकॉल की कमी है। यहां, हम डी2ओ और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसीएमएस) का उपयोग करके एफएएस के उत्पादों के डे नोवो संश्लेषण का मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, जिसमें पहले ली एट अल .31 द्वारा विकसित गणना की गई थी। यह विधि कार्बन स्रोत से स्वतंत्र रूप से डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण को मापती है, और यह लगभग किसी भी ऊतक के लिए, किसी भी माउस मॉडल में, और किसी भी बाहरी गड़बड़ी के तहत संभावित रूप से उपयोगी है। यहां, हम डीएनएल के उच्च स्तर और चयापचय होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

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Protocol

सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी प्रयोगों को मंजूरी दी गई थी।

1. डी2ओ की तैयारी

नोट: प्रयोगात्मक भिन्नता से बचने के लिए, प्रयोग की अवधि के लिए सभी चूहों के लिए पर्याप्त समाधान / पीने का पानी तैयार करें।

  1. इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के लिए: डी 2 ओ के प्रति लीटर 9 ग्राम एनएसीएल को घोलकर 0.9% डब्ल्यू / वी सेलाइन डी2ओ उत्पन्नकरें।
  2. डी 2 ओ-पानी पीने के लिए: नियमित पेयजल के प्रति 920 मिलीलीटर डी 2 ओ के 80 मिलीलीटर को मिलाकर पीने के पानी के रूप में उपयोग करने केलिए 8% वी / वी डी2ओ-समृद्ध पानी उत्पन्न करें। माउस सुविधा से नियमित पेयजल प्राप्त किया जा सकता है। निष्फल करने के लिए एक गैर-पायरोजेनिक 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।

2. तापमान अनुकूलन द्वारा बीएटी गतिविधि का मॉड्यूलेशन

  1. चूहों को अलग करें ताकि तापमान अनुकूलन की शुरुआत से 2 सप्ताह पहले प्रति पिंजरे में दो चूहे हों। चूहों को 22 डिग्री सेल्सियस पर सभी पिंजरों को अनुकूलित करने और बनाए रखने के लिए पानी की बोतलों में पानी की आपूर्ति बदलें।
  2. उपयुक्त तापमान सेट करके तापमान अनुकूलन शुरू करने से 1 सप्ताह पहले माउस पर्यावरण कक्ष तैयार करें: थर्मोन्यूट्रैलिटी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, कमरे के तापमान के लिए 22 डिग्री सेल्सियस और ठंडे जोखिम के लिए 18 डिग्री सेल्सियस।
  3. तापमान अनुकूलन की शुरुआत में, पिंजरों को नए लोगों के साथ बदलें जिनमें कोई पर्यावरणीय संवर्धन नहीं है (घोंसले से बचने के लिए)। पिंजरों को उनके संबंधित तापमान पर ले जाएं।
    नोट: थर्मोन्यूट्रैलिटी को सौंपे गए पिंजरे 4 सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रहेंगे। कमरे के तापमान को सौंपे गए पिंजरे 4 सप्ताह के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर रहेंगे। ठंड के संपर्क में आने वाले पिंजरे साप्ताहिक अनुसूची पर उत्तरोत्तर ठंडे हो जाएंगे: पहले सप्ताह के लिए 18 डिग्री सेल्सियस, दूसरे सप्ताह के लिए 14 डिग्री सेल्सियस, तीसरे सप्ताह के लिए 10 डिग्री सेल्सियस और चौथे सप्ताह के लिए 6 डिग्री सेल्सियस।
  4. सभी स्थितियों के लिए साप्ताहिक रूप से गंदे पिंजरों को बदलें। इसके अतिरिक्त, भोजन और पानी की बोतलों को कम से कम 24 घंटे के लिए उपयुक्त तापमान पर नए लोगों के साथ बदलें।
    नोट: हर हफ्ते जोड़े गए भोजन की मात्रा के बारे में सावधान रहें, खासकर ठंड में चूहों के लिए, क्योंकि वे सामान्य परिस्थितियों की तुलना में काफी अधिक मात्रा में भोजन का उपभोग करेंगे। भोजन और लिबिटम प्रदान करें।

3. डी2ओ का प्रशासन

  1. प्रत्येक जानवर को शरीर के वजन के 35 μL / g पर 0.9% w / v सलाइन-D2O के साथ इंजेक्ट करें, ऊतक संग्रह से 12 घंटे -3 दिन पहले, 1 एमएल सिरिंज और 26 ग्राम सुई का उपयोग करके इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से ।
    नोट: कृपया उपयुक्त लेबलिंग समय का चयन करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
  2. पानी की बोतलों को 8% v/v D2O-समृद्ध पीने के पानी वाली बोतलों में बदलें।

4. प्लाज्मा और ऊतक संग्रह, प्रसंस्करण और भंडारण

  1. प्रयोग के अंत में, अनुमोदित पद्धतियों का उपयोग करके चूहों का बलिदान करें (उदाहरण के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज)।
    1. इच्छामृत्यु से पहले अचानक तापमान परिवर्तन से बचने के लिए गर्मी / शांत पैड या अन्य तरीकों का उपयोग करें जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। अनुमोदित पद्धतियों का पालन करते हुए चूहों को इच्छामृत्यु दें। रक्त और ऊतक संग्रह के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  2. 26 ग्राम सुई का उपयोग करके कार्डियक पंचर के माध्यम से रक्त एकत्र करें और एक एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड रक्त संग्रह ट्यूब में स्टोर करें। रक्त को आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर रखें।
  3. त्वचा के नीचे के ऊतकों को प्रभावित करने से बचने के लिए त्वचा को ऊपर खींचते हुए, वक्ष गुहा के निचले क्षेत्र से गर्दन के ऊपरी क्षेत्र तक माउस के पीछे की मध्य रेखा के साथ त्वचा को खोलें। इंटरस्कैपुलर बैट सफेद वसा ऊतक की एक पतली परत के तहत कंधे के ब्लेड के बीच स्थित है, और यह दो पिरामिड के आकार के लोब से बना है।
    1. बर्फ ठंडा फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में धोकर ऊतक को साफ करें। अतिरिक्त तरल को खत्म करने के लिए एक पेपर टॉवल पर दबाएं, विश्लेषणात्मक पैमाने पर वजन करें, और एक माइक्रोट्यूब में इकट्ठा करें।
    2. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके ऊतक को तुरंत फ़्लैश फ्रीज करें। अन्य बैट डिपो भी एकत्र किए जा सकते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर रक्त के नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, लाल रक्त कोशिका गोली को परेशान किए बिना प्लाज्मा को सावधानीपूर्वक एकत्र करें। इसे एक नए बर्फ-ठंडे माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें।
  5. उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भूरे रंग की वसा और प्लाज्मा के नमूने स्टोर करें।

5. वसा ऊतक से लिपिड निष्कर्षण

  1. निष्कर्षण शुरू करने से पहले
    1. एक कांच की शीशी में मेथनॉल में हेक्साडेसेनोइक-डी31 एसिड का 1 एमएम घोल तैयार करें। यह आंतरिक फैटी एसिड मानक के रूप में काम करेगा।
    2. क्लोरोफॉर्म (सीएचसीएल 3) और मेथनॉल (सीएच3ओएच) की आवश्यक मात्रा को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में, या सूखी बर्फ पर प्री-ठंडा करें।
      नोट: असंतृप्त फैटी एसिड में डबल बॉन्ड के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए एंटीऑक्सिडेंट डाइ-टर्ट-ब्यूटाइल-4-मिथाइलफेनोल (बीएचटी) को सीएचसीएल3 में 0.01% डब्ल्यू / वी (2.5 मिलीग्राम / 25 एमएल) की एकाग्रता पर जोड़ा जा सकता है।
    3. प्रत्येक ऊतक नमूने के लिए प्री-लेबल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और रिक्त निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली एक अतिरिक्त ट्यूब।
      चेतावनी:सीएच 3 ओएच और सीएचसीएल3 अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त होते हैं यदि साँस ली जाती है। केवल फ्यूम हुड में उपयोग करें।
      नोट: माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के विभिन्न ब्रांडों में विलायक रिसाव को रोकने के मामले में पृष्ठभूमि पामिटेट और क्षमताओं के अलग-अलग स्तर होते हैं। हम अनुशंसा करते हैं कि विभिन्न प्रकार के ट्यूबों का पहले परीक्षण किया जाए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विलायक रिसाव को रोका जाता है और ट्यूबों में दूषित पामिटेट के न्यूनतम स्तर होते हैं। कृपया आगे की चर्चा के लिए Yao et al.32 देखें।
  2. नमूने को फ्रीजर से बाहर निकालें और सूखी बर्फ पर रखें।
  3. पूर्व-लेबल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर रखें और संतुलन को ट्रैक करें। चिमटी और एक स्केलपेल/स्टील रेजर ब्लेड को 10-20 सेकंड के लिए सूखी बर्फ पर ठंडा होने के लिए रखें।
    1. जमे हुए ऊतक के नमूने को ट्यूब से बाहर निकालने के लिए चिमटी का उपयोग करें और प्लास्टिक वजन नाव पर रखें। वजन नाव को सूखी बर्फ के एक सपाट ब्लॉक या किसी अन्य पूर्व-ठंडा सतह पर रखा जा सकता है।
    2. स्केलपेल या स्टील रेजर ब्लेड का उपयोग करके, ऊतक के एक छोटे से हिस्से को विच्छेदित करें, वजन में 5-15 मिलीग्राम के बराबर। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और सटीक वजन रिकॉर्ड करें। प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएं। नमूने इस बिंदु पर फ्रीजर में संग्रहीत किए जा सकते हैं या लिपिड निष्कर्षण के लिए नीचे दिए गए चरणों में उन्नत किए जा सकते हैं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि स्केलपेल को नमूनों के बीच 70% इथेनॉल के साथ ठीक से साफ किया गया है और प्रत्येक नमूने के बीच एक ताजा वजन नाव का उपयोग किया जाता है।
  4. प्रत्येक नमूने में 10 mM हेक्साडेसेनोइक-डी 31 (C16: 0-d31) एसिड के 1 μL/mg जोड़ें।
    सावधानी: सॉल्वैंट्स के साँस लेने के जोखिम के कारण फ्यूम हुड के तहत निम्नलिखित चरण (5.4 से 5.8) किए जाने चाहिए।
  5. तीन 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मोतियों के साथ प्रत्येक नमूने में सीएच 3 ओएच के 250μL, और CHCl3के 500 μL जोड़ें। ट्यूबों को पीसने वाली मिल के प्री-कूल्ड ब्लॉक में रखें और 5 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज की कंपन आवृत्ति पर नमूने मिलाएं, या ऊतक के नमूनों के लिए निर्माता द्वारा अनुशंसित दिशानिर्देशों का उपयोग करें। चुंबक का उपयोग करके मोतियों को हटा दें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स वाले ऊपरी जलीय चरण और लिपिड और फैटी एसिड युक्त निचले कार्बनिक चरण के साथ एक स्पष्ट द्विध्रुवीय पृथक्करण देखा जाना चाहिए। यदि कोई पृथक्करण नहीं देखा जाता है, तो एच2ओ के 250 μL जोड़ें और भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को दोहराएं।
  7. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने के निचले चरण से एक निश्चित मात्रा को तदनुसार लेबल किए गए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में लें।
  8. शेष नमूने में CHCl3 के 500 μL जोड़ें और चरण 5.6-5.7 दोहराएँ।
  9. नमूने को नाइट्रोजन गैस के नीचे या सीएचसीएल3-प्रतिरोधी प्रशीतित केन्द्रापसारक वैक्यूम में 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से सूखने तक रखें। सूखे नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि व्युत्पन्न के लिए तैयार न हो।
    नोट: ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने की शीर्ष परत को इस बिंदु पर भी एकत्र किया जा सकता है और चरण 5.9 में सुखाया जा सकता है।

6. फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (एफएएमई) और जीसीएमएस विश्लेषण की तैयारी

  1. एफएएमई तैयार करने के लिए एसिड-उत्प्रेरित एस्टरीफिकेशन और ट्रांसस्टेरिफिकेशन।
    सावधानी: सॉल्वैंट्स के साँस लेने के जोखिम के कारण फ्यूम हुड के तहत निम्नलिखित कदम उठाए जाने चाहिए।
    1. यदि नमूने फ्रीजर में संग्रहीत किए गए हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए नाइट्रोजन के तहत सुखाएं कि कोई पानी मौजूद नहीं है।
    2. एमएस-ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करके, पिपेट 98 एमएल निर्जल सीएच3ओएच को ग्लास मीडिया बोतल में डालें। सीएच3ओएच में 2% एच 2 एसओ4 बनाने के लिए फ्यूम हुड में धीरे-धीरे2एमएल निर्जल सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें। बंद बोतल को घुमाकर मिलाएं।
    3. प्रत्येक नमूने और भंवर में सीएच3ओएच समाधान में 2% एच2एसओ4 के 500 μL जोड़ें।
    4. 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
    5. हीट ब्लॉक से नमूने निकालें और प्रत्येक नमूने में 100 μL संतृप्त NaCl समाधान और 500 μL हेक्सेन जोड़ें।
    6. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को जोर से भंवर करें। नमूने को 1 मिनट के लिए बैठने के लिए छोड़ दें; इसके बाद दो चरण स्पष्ट होने चाहिए।
    7. ऊपरी चरण को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें (माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के उचित चयन के लिए अनुभाग 5.1.3 में नोट देखें)।
    8. उपज को अधिकतम करने के लिए, चरण 6.1.5-6.1.7 को दोहराएं, दूसरे नमूने को उसी लेबल वाले ट्यूबों में एकत्र करें।
    9. नाइट्रोजन गैस के तहत कमरे के तापमान पर नमूने सुखाएं।
    10. मूल ऊतक वजन के सापेक्ष हेक्सेन के 20 μL / mg में नमूने को पुन: निलंबित करें, और ग्लास डालने के साथ तुरंत ग्लास जीसी शीशी में स्थानांतरित करें।
      नोट: वाष्पीकरण को कम करने के लिए नमूने स्थानांतरित करते समय जल्दी से काम करें।
  2. जीसीएमएस विश्लेषण
    1. फेम आइसोटोपोलॉग ्स की प्रचुरता निर्धारित करने के लिए, नमूनों को एकल क्वाड्रोपोल गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसीएमएस) पर इंजेक्ट करें।
      नोट: जबकि पामिटेट का पता लगाने के लिए कई कॉलम प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, निम्नलिखित तापमान कार्यक्रम एक जीसीएमएस कॉलम के लिए स्थापित किया गया था जिसे फैटी एसिड सीआईएस / ट्रांस आइसोमर्स के पृथक्करण के लिए विकसित किया गया है, जैसा कि सामग्री की तालिका में विस्तृत है। इस स्तंभ में 0.25 मिमी आंतरिक व्यास के साथ 50 मीटर की लंबाई है।
    2. हीलियम को वाहक गैस के रूप में उपयोग करते हुए, 270 डिग्री सेल्सियस के इनलेट तापमान पर एक विभाजित/ विभाजित इनलेट में 1 μL नमूना इंजेक्ट करें, जो 1 एमएल / मिनट पर बहता है। 19 एमएल / मिनट के कुल प्रवाह के साथ कम प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड के लिए एक विभाजित इंजेक्शन का उपयोग करें, 3 एमएल / मिनट का सेप्टम पर्ज, और 0.75 मिनट पर 15 एमएल / मिनट के विभाजित वेंट के लिए एक शुद्ध प्रवाह। पामिटेट और ओलेट जैसे उच्च प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड के लिए 10: 1-40: 1 के विभाजित अनुपात का उपयोग करें।
    3. निम्नलिखित ओवन मापदंडों का उपयोग करें: 80 डिग्री सेल्सियस का प्रारंभिक तापमान; 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट की वृद्धि 170 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाती है; 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की वृद्धि 204 डिग्री सेल्सियस तक; 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट की वृद्धि 250 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ जाती है; और फिर 10 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    4. निम्नलिखित मास सेलेक्टिव डिटेक्टर (एमएसडी) मापदंडों का उपयोग करें: 70 ईवी का एक इलेक्ट्रॉन प्रभाव आयनीकरण मोड और 1,562 (यू / एस) की स्कैन गति और 4.1 स्कैन / सेकंड की आवृत्ति के साथ 50-400 मीटर / जेड की सीमा पर स्कैन करें। 280 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थानांतरण लाइन, 230 डिग्री सेल्सियस पर एक आयन स्रोत और 150 डिग्री सेल्सियस पर एक क्वाड्रोपोल का उपयोग करें।
      नोट: अन्य स्तंभों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन तापमान कार्यक्रम अलग-अलग होगा।
    5. नमूना अनुक्रम: इंजेक्शन के नमूना क्रम को यादृच्छिक करें और अनुक्रम की शुरुआत में कम से कम दो या तीन हेक्सेन रिक्त स्थान इंजेक्ट करें, अनुक्रम के भीतर हर पांचवें नमूने के बाद, और अनुक्रम के अंत में दो या तीन।
    6. प्रत्येक फैटी एसिड मिथाइल एस्टर के लिए तालिका 1 में आयनों को एकीकृत करने के लिए उपकरण विशिष्ट सॉफ्टवेयर, या मेटाबोलाइट-डिटेक्टर33 जैसे मुफ्त ओपन-एक्सेस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      नोट: हमने उन आयनों को रेखांकित किया है जो तालिका 1 में एम 1-एम 5 आइसोटोपोलॉग को कवर करते हैं जो हमने पाया है कि इस लेबलिंग विंडो के साथ ड्यूटेरियम निगमन की मात्रा को कवर करता है। हालांकि, इसे विस्तारित करने की आवश्यकता हो सकती है यदि डे नोवो फ्लक्स काफी अधिक है और / या लंबे लेबलिंग समय का उपयोग किया जाता है।
    7. द्रव्यमान आइसोटोपोमर वितरण उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक एकीकृत आयन की प्रचुरता का उपयोग करें, जहां आयन तीव्रता को आंशिक बहुतायत में परिवर्तित किया जा सकता है ताकि द्रव्यमान आइसोटोपोमर वितरण का योग एक के बराबर हो। कृपया पूरक फ़ाइल में उदाहरण स्प्रेडशीट देखें।
      नोट: ड्यूटेरियम निगमन को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, प्राकृतिक आइसोटोप बहुतायत का सुधार तब 13सी, 15एन और 2एच जैसे स्वाभाविक रूप से होने वाले आइसोटोप की उपस्थिति की अनुमति देने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। यह फर्नांडीज एट अल .34,35 द्वारा उल्लिखित सुधार मैट्रिक्स को लागू करके किया जाता है, और लेबल किए गए मेटाबोलाइट से बिना लेबल वाले मापा मेटाबोलाइट के एमआईडी को घटाकर नहीं किया जा सकता है। व्यवहार में, हम कच्चे डेटा को आंशिक एमआईडी में बदलने के लिए फ्लक्सफिक्स36, पॉलीएमआईडी 37, या आइसोकोर38 जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के उपयोग की सलाह देते हैं, और हमने तालिका 1 में एफएएस के मिथाइल एस्टर उत्पादों के लिए आइसोटोप सुधार के लिए सूत्र प्रदान किया है।
    8. मौजूद पामिटेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
      Equation 1 
      जहां आयन गिनती तालिका 1 में एकीकृत सभी पामिटेट आइसोटोपोलॉग के योग को संदर्भित करती है और सी 16: 0-डी 31 आंतरिक मानक हेक्साडेसेनोइक-डी31 को संदर्भित करता है। आंतरिक मानक अंतर्जात पामिटेट के लिए एक अलग शिखर बनाता है। अन्य फैटी एसिड की सापेक्ष बहुतायत भी निर्धारित की जा सकती है, लेकिन फैटी एसिड विशिष्ट आइसोटोप आंतरिक मानकों (डी2ओ निगमन से अधिक द्रव्यमान बदलाव के साथ) या बाहरी मानक वक्रों को पूर्ण मात्रा के लिए नियोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। पृष्ठभूमि पामिटेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए रिक्त निकाले गए नमूने का उपयोग करें और इसे अंतिम ऊतक मान से घटाएं।
    9. निम्नलिखित समीकरण द्वारा पामिटेट के दाढ़ संवर्धन (एमई) की गणना करें:
      Equation 2
      जहां एमआई एक पामिटेट आइसोटोपोलॉग की सामान्यीकृत, आंशिक बहुतायत है, और एन संभावित पामिटेट आइसोटोपोलॉग की संख्या है। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित आंशिक वितरण के साथ एक पामिटेट अणु का एमई, M1 = 0.25, M2 = 0.08, M3 = 0.02, है: (0.025 *1) + (0.08 *2) + (0.02 *3) = 0.245 ( पूरक फ़ाइल देखें)।

7. शरीर के जल संवर्धन को निर्धारित करने के लिए प्लाज्मा नमूनों का ड्यूटेरियम एसीटोन आदान-प्रदान।

  1. प्रतिक्रिया
    1. पानी में ड्यूटेरियम के 10 मानक तैयार करें, 0-9% v / v से लेकर।
    2. एसिटोनिट्राइल समाधान तैयार करें जो चरण 5.1.1 से मानकों सहित प्रति नमूने 4 μL की अनुमति देता है।
    3. लेबल किए गए, सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में, प्रत्येक प्लाज्मा नमूने या मानक के 10 μL, 10 M NaOH के 4 μL, और 5% एसीटोन / एसिटोनिट्राइल के 4 μL को मिलाएं। प्रत्येक नमूने के लिए इसे तीन प्रतियों में करें।
    4. पाइपिंग द्वारा नमूने को धीरे से मिलाएं। नमूनों को रात भर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने दें।
  2. कुल
    1. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक नमूने में 450-550 मिलीग्राम Na2SO4 जोड़ें।
    2. फ्यूम हुड में, प्रत्येक ट्यूब में सीएचसीएल3 के 600 μL जोड़ें और 15 सेकंड के लिए सख्ती से भंवर करें।
    3. 2 मिनट के लिए 300 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. फ्यूम हुड के तहत, प्रत्येक नमूने से सतह पर तैरनेवाले के 80 μL एलिकोट को लेबल किए गए, ग्लास जीसीएमएस शीशियों में ग्लास इंसर्ट और कैप कसकर स्थानांतरित करें।
  3. जीसीएमएस विश्लेषण
    1. एक कॉलम (30 मीटर, 0.25 मिमी यानी, एगिलेंट डीबी -35 एमएस) पर अलग-अलग नमूने और संलग्न द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण करें।
      1. 40: 1 के विभाजित अनुपात, 1 एमएल / मिनट के हीलियम प्रवाह और 270 डिग्री सेल्सियस के इनलेट तापमान के साथ एक विभाजित / विभाजित इनलेट इनलेट में नमूने के 1 μL इंजेक्ट करें।
      2. निम्नलिखित ओवन मापदंडों का उपयोग करें: 60 डिग्री सेल्सियस का प्रारंभिक तापमान, 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट की वृद्धि से 100 डिग्री सेल्सियस तक वृद्धि, 50 डिग्री सेल्सियस / मिनट की वृद्धि से 220 डिग्री सेल्सियस तक वृद्धि, और फिर 1 मिनट के लिए 220 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      3. निम्नलिखित मास चयनात्मक डिटेक्टर (एमएसडी) मापदंडों का उपयोग करें: 58 और 59 मीटर / जेड की चुनिंदा आयन निगरानी के साथ 70 ईवी पर इलेक्ट्रॉन प्रभाव आयनीकरण मोड। 280 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थानांतरण लाइन, 230 डिग्री सेल्सियस पर एक आयन स्रोत और 150 डिग्री सेल्सियस पर एक क्वाड्रोपोल का उपयोग करें।
        नोट: अन्य कम-रक्तस्राव, बंधुआ, क्रॉसलिंक्ड, मध्य-ध्रुवीयता कॉलम का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन तापमान कार्यक्रम अलग-अलग होगा।
    2. सीएचसीएल 3 वॉश के साथ शुरू करने के लिए तरल नमूना विधि सेट करें और फिर नमूनों का एक यादृच्छिक अनुक्रम, जिसमें हर छह नमूने में अतिरिक्त सीएचसीएल3 वॉश स्टेप शामिल हैं।
      नोट: यदि एसीटोन का उपयोग ऑटोसैंपलर के लिए सुई धोने के रूप में किया जाता है, तो सीएचसीएल 3 या हेक्सेन के साथ बदलें और कई खाली सीएचसीएल3 नमूने इंजेक्ट करें जब तक कि क्रोमैटोग्राम में कोई दूषित एसीटोन पीक स्पष्ट न हो।
    3. इस विधि का उपयोग करके, एक एसीटोन पीक लगभग 1.25 मिनट पर समाप्त होता है। डेटा को एकीकृत करें और चरण 6.2.6-6.2.7 का पालन करते हुए एसीटोन संवर्धन की आंशिक प्रचुरता की गणना करें, जिसमें तालिका 1 में दर्शाए अनुसार 58-60 के एम / जेड अनुपात वाले चोटियों का विश्लेषण करने के लिए समायोजन किया गया है।
    4. एसीटोन के आंशिक संवर्धन के आधार पर परीक्षण नमूनों के शरीर जल संवर्धन (पी) के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए मानकों का उपयोग करें।

8. विवो डी नोवो लिपोजेनेसिस गणना में।

  1. निम्नलिखित समीकरण के साथ प्रत्येक नमूने में नए संश्लेषित फैटी एसिड (एफएनएस) के अंश की गणना करें जो एफएएस (यानी, पामिटेट, विषम श्रृंखला फैटी एसिड और एमएमबीसीएफए) के प्रत्यक्ष उत्पाद हैं:
    Equation 3
    जहां एमई एक पामिटेट अणु (चरण 6.2.9) का औसत दाढ़ संवर्धन है, पी संबंधित प्लाज्मा नमूने (चरण 7.3.4) से पानी में ड्यूटेरियम संवर्धन है, और एन पामिटेट पर विनिमय योग्य हाइड्रोजन परमाणुओं की संख्या है जहां एक ड्यूटेरियम को शामिल किया जा सकता है।
  2. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके N का निर्धारण करें जिसे ली एट अल.31 द्वारा स्थापित किया गया था:
    Equation 4
  3. नव संश्लेषित फैटी एसिड (MNS) की दाढ़ की मात्रा किसके द्वारा निर्धारित करें?
    एमएनएस = एफएनएस एक्स कुल फैटी एसिड मात्रा (एनएमओएल / मिलीग्राम ऊतक)।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि 0.245 का पामिटेट मोलर संवर्धन (एमई), 0.045 के शरीर के पानी (पी) में ड्यूटेरियम संवर्धन और 22 की गणना की गई एन संख्या प्राप्त होती है, तो पामिटेट का आंशिक संश्लेषण 0.247 है। यदि ऊतक में मौजूद पामिटेट की मात्रा 2 mmol / mg है, तो नए संश्लेषित पामिटेट का mmol 0.494 mmol / mg है ( पूरक फ़ाइल देखें)।

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Representative Results

चरण 1 में वर्णित डी 2 ओ खुराक के आधार पर, हम आमतौर पर पाते हैं कि शरीर का पानी2.5% से 6% की सीमा में समृद्ध होता है, और यह कि शरीर के पानी में ड्यूटेरियम संवर्धन का आधारभूत स्तर 1 घंटे में तेजी से प्राप्त किया जाता है और 8% समृद्ध पेयजल के माध्यम से अध्ययन की अवधि के लिए बनाए रखा जाता है (चित्रा 1)। निरंतर स्थिर राज्य शरीर जल संवर्धन चरण 6 में उपयोग की जाने वाली गणना की एक धारणा है, और इसलिए हम नए प्रयोगात्मक मॉडल में शरीर के जल संवर्धन के कैनेटीक्स के प्रयोगात्मक सत्यापन की सिफारिश करते हैं।

हमने पाया है कि बीएटी (चित्रा 2) में थर्मोन्यूट्रैलिटी के सापेक्ष, कमरे के तापमान पर डी नोवो संश्लेषित फैटी एसिड की मात्रा बढ़ जाती है। डी 2 ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद थर्मोन्यूट्रैलिटी और कमरे के तापमान पर चूहों से बैट में पामिटेट का द्रव्यमान आइसोटोपोलॉग वितरण कमरे के तापमान पर पाए जाने वाले उच्च एम 1 और एम 2 ड्यूटेरियम संवर्धन को दर्शाता है (चित्रा 2 ए)। यह ठंडा तापमान संवर्धन न केवल पामिटेट में होता है, बल्कि बीएटी (चित्रा 2 बी) में फैटी एसिड की एक विस्तृत श्रृंखला में भी होता है। कमरे के तापमान पर चूहों के बीएटी में कुल पामिटेट बहुतायत भी बढ़ जाती है, और कुल पामिटेट स्तरों के साथ आंशिक संश्लेषण दर को मिलाकर, हमने पाया कि कमरे के तापमान पर चूहों में कुल पामिटेट संश्लेषण में वृद्धि हुई थी (चित्रा 2 सी, डी)। विशेष रूप से, प्लाज्मा कुल फैटी एसिड संवर्धन बीएटी के समान प्रवृत्ति का पालन नहीं करता है, लेकिन इसके बजाय, फैटी एसिड संवर्धन थर्मोन्यूट्रैलिटी (चित्रा 2 ई) के साथ बढ़ जाता है। अंतर्जात संश्लेषण से संभावित उत्थान डी2ओ एकल समय-बिंदु दृष्टिकोण के साथ संभव नहीं है, जैसा कि यहां वर्णित है, लेकिन इन विरोधी रुझानों से संकेत मिलता है कि बीएटी में फैटी एसिड संवर्धन पैटर्न फैटी एसिड अपटेक द्वारा संचालित नहीं किया जा रहा है।

Figure 1
चित्र 1: चूहों के प्लाज्मा में डी 2 ओ संवर्धन का प्रतिशत कई समय बिंदुओं पर, 0.035 मिलीलीटर / जी शरीर के वजन 0.9% एनएसीएल डी 2 ओ के साथ इंजेक्शन के बादऔर 8% डी2ओ समृद्ध पानी के साथ पीने केपानी का प्रतिस्थापन। बार ग्राफ़ माध्य ± SD. n = 9 का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डी 2 ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद चूहों के भूरे रंग के वसा ऊतक में प्रतिनिधि परिणाम। (ए) कमरे के तापमान (आरटी) और थर्मोन्यूट्रैलिटी (टीएन) पर डी2ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद बीएटी में पामिटेट का बड़े पैमाने पर आइसोटोपोलॉग वितरण। (बी) कमरे के तापमान और थर्मोन्यूट्रैलिटी पर डी2ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद फैटी एसिड की एक श्रृंखला का बीएटी मोलर संवर्धन। (सी) कमरे के तापमान और थर्मोन्यूट्रैलिटी पर डी2ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद भूरे रंग के वसा ऊतक में कुल बहुतायत और (डी) डी नोवो संश्लेषित पामिटेट। (ई) कमरे के तापमान और थर्मोन्यूट्रैलिटी पर डी2ओ प्रशासन के 3 दिनों के बाद फैटी एसिड की एक श्रृंखला का प्लाज्मा मोलर संवर्धन। बार ग्राफ़ औसत ± SD. *p < 0.05, *p < 0.01, ***p < 0.001 का प्रतिनिधित्व करते हैं। n = 6. सांख्यिकीय विश्लेषण दो पूंछ वाले छात्रों टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यौगिक आयनों अनुमानित क्षालन समय (मिनट) आइसोटोप सुधार के लिए सूत्र
C16:0 270-275 20 C17H34O2
C14:0 242-247 16.5 C15H30O2
C15:0 256-261 18 C16H32O2
Iso-C16:0 270-275 18.9 C17H34O2
ISO-C17:0 284-289 21 C18H36O2
Anteiso-C17:0 284-289 21.5 C18H36O2
C16 D31 301 19.2 ~
शुक्ता 58-59 1.5 C3H6O

तालिका 1: जीसीएमएस यौगिक टुकड़ा आयनों को एकीकृत करने के लिए। यह तालिका स्तनधारी फैटी एसिड सिंथेज़ द्वारा उत्पादित फैटी एसिड की एक श्रृंखला को कवर करती है, लेकिन सी 16: 0 प्राथमिक उत्पाद है। एसीटोन को छोड़कर चरण 6 में विस्तृत जीसीएमएस विधि के लिए सभी प्रतिधारण समय हैं, जो चरण 7 में विस्तृत है।

पूरक फ़ाइल: उदाहरण स्प्रेडशीट गणना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जटिल चयापचय मार्गों के बीच संतुलन और बातचीत को समझना चयापचय संबंधी बीमारियों के जैविक आधार को समझने की दिशा में एक अनिवार्य कदम है। यहां, हम डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए एक गैर-आक्रामक और सस्ती पद्धति दिखाते हैं। इस विधि को पहले प्रकाशित विधियों से अनुकूलित किया गया है जिसमें फैटी एसिड ड्यूटेरियम संवर्धन31 से डी नोवो संश्लेषण प्रवाह का अनुमान लगाने और शरीर के पानी में डी2ओ के सापेक्ष प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए ड्यूटेरियम-एसीटोन एक्सचेंज का उपयोग करने के लिए गणना विकसित कीगई है। हाल के वर्षों में, हमने यहां वर्णित विधि ली है और इसे वसा डिपो, मस्तिष्क, यकृत और ट्यूमर 9,22,40 में विविध फैटी एसिड के संश्लेषण में परिवर्तन को उजागर करने के लिए लागू किया है। इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण कदम और परिवर्तनीय पहलू हैं। ये समग्र प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ-साथ इस पद्धति में उपयोग किए जाने वाले विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण और गणना से संबंधित हैं। स्थिर आइसोटोप ट्रेसर से डे नोवो फैटी एसिड संश्लेषण की गणना के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण भी व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। इनमें हेलरस्टीन एट अल.41,42 द्वारा विकसित वैकल्पिक द्रव्यमान आइसोटोपोमर वितरण विश्लेषण (एमआईडीए) दृष्टिकोण, केलेहर एट अल.43,44 द्वारा विकसित आइसोटोपोमर स्पेक्ट्रल विश्लेषण (आईएसए) और फैटी एसिड स्रोत विश्लेषण (एफएएसए) 45 जैसे लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के संश्लेषण को मॉडल करने के लिए विकसित किए गए नए दृष्टिकोण शामिल हैं।. यहां विधि का लाभ यह है कि यह स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर और स्प्रेडशीट के उपयोग के साथ आसानी से लागू करने योग्य है। हालांकि, यह शरीर के जल संवर्धन (बीडब्ल्यूई) की स्थिर स्थिति में होने की आवश्यकता से सीमित है, एन पैरामीटर (नीचे चर्चा की गई) के उपयोग से जुड़ी चेतावनी, और यह केवल एफएएस के प्रत्यक्ष उत्पादों पर लागू होता है जो मुख्य रूप से पामिटेट है।

ब्राउन वसा डीएनएल और तापमान अनुकूलन।
डीएनएल पूरे शरीर के चयापचय विनियमन के एक मुख्य नोड्यूल के रूप में बढ़ गया है और सामान्य विकास के लिए आवश्यक है13,29. ऊतक लक्षित विलोपन और मेटाबोलिक विश्लेषण ने कई प्रमुख एंजाइमेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल खिलाड़ियों को इंगित किया है जो वसा ऊतक में डीएनएल को नियंत्रित करते हैं, और यह पूरे शरीर में वसा अभिवृद्धि और सामान्य चयापचय होमियोस्टैसिस 21,28,46,47,48,49 को कैसे नियंत्रित करता है। हालांकि कम सराहना की जाती है, बीएटी डीएनएल में एक अत्यधिक सक्रिय ऊतक है, जिसमें अधिकांश अन्य ऊतकों की तुलना में कोर बॉडी डीएनएल एंजाइम मशीनरी (एसीली, एकाका, फासन) की उच्च अभिव्यक्ति होती है और उच्च लिपोजेनिक गतिविधियां 22,50,51,52,53,54,55 होती हैं।. हालांकि बीएटी अद्वितीय है, इस अर्थ में कि उप-थर्मोन्यूट्रल तापमान के अनुकूल होने से एक साथ बीएटी 22,54,56 में डीएनएल और फैटी एसिड ऑक्सीकरण गतिविधि होती है। हालांकि जुड़े तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हैं, यह स्वीकार किया जाता है कि बीएटी पोषक तत्वों के लिए एक चयापचय सिंक है, जिसमें लिपिड संश्लेषण के लिए डीएनएल के लिए नियत हैं, जो सामान्य बीएटी गतिविधि53,55 के लिए आवश्यक हैं। इस प्रकार, इसकी गतिविधि के स्तर का आकलन करने के लिए बीएटी के सभी चयापचय आय और परिणामों का हिसाब रखने में सक्षम होना प्रासंगिक है। हालांकि, डीएनएल को आमतौर पर केवल जीन अभिव्यक्ति के आधार पर मापा जाता है और कार्यात्मक रूप से गिने गए अवसरों पर मूल्यांकन किया जाता है। यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल डीएनएल के कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है, जिससे चयापचय स्थिति की अधिक पूर्ण व्याख्या हो सकती है।

डी2ओ खुराक, समय और शरीर के जल संवर्धन माप।
डिजाइन में प्राथमिक महत्वपूर्ण चरणों में से एक डी2ओ प्रशासन की खुराक और समय है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक खुराक और प्रशासन दृष्टिकोण (पीने के पानी के संवर्धन के बाद बोलस इंजेक्शन) को नियोजित करते हैं जो हमने पाया है कि स्थिर राज्य बीडब्ल्यूई की तेजी से उपलब्धि और रखरखाव की ओर जाता है। फैटी एसिड संश्लेषण को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली गणना स्थिर राज्य बीडब्ल्यूई की धारणा पर आधारित है; इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि यह नए प्रयोगात्मक मॉडल में मान्य है। यदि इस संयुक्त खुराक दृष्टिकोण का उपयोग करने में समस्याओं के कारण स्थिर राज्य संवर्धन संभव नहीं है, तो पाठक को अन्य प्रकाशनों में संदर्भित किया जाता है जहां गणना में परिवर्तन इस39 के लिए अनुमति देते हैं। स्थिर अवस्था से भिन्नता की डिग्री जिसे सहन किया जा सकता है, जब एक खुराक दृष्टिकोण को नियोजित किया जाता है जिसका उद्देश्य इसकी तेजी से उपलब्धि है, कई कारकों पर निर्भर करता है। यदि बीडब्ल्यूई को गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले मूल्य से ऊपर निरंतर स्पाइक्स में बढ़ाया जाता है, तो यहां दृष्टिकोण का उपयोग करके, डीएनएल को कम करके आंका जाएगा। यदि BWE समय की निरंतर मात्रा के लिए गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले मूल्य से काफी कम है, तो DNL को कम करके आंका जाएगा। जबकि औसत के आसपास कुछ मामूली भिन्नता की उम्मीद है, सबसे महत्वपूर्ण कारक यह है कि बीडब्ल्यूई एक प्रयोगात्मक समूह में दूसरे की तुलना में अधिक भिन्न नहीं होता है, जिससे गणना की गई डीएनएल में अंतर हो सकता है जो बीडब्ल्यूई में भिन्नता से प्रेरित हो सकता है। यदि दोनों प्रयोगात्मक समूह समय के साथ कुछ मामूली लेकिन समान भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, तो इसकी सहनशीलता सटीकता और सटीकता पर निर्भर करेगी जिसके साथ अन्वेषक को प्रदर्शन करने के लिए माप की आवश्यकता होती है, साथ ही प्रयोगात्मक समूहों के बीच अपेक्षित अंतर भी। उदाहरण के लिए, थर्मोन्यूट्रैलिटी बनाम कमरे के तापमान के संपर्क में भूरे रंग के वसा ऊतक के मामले में, जिसे यहां एक उदाहरण के रूप में प्रदान किया गया था, डी नोवो संश्लेषित फैटी एसिड की मात्रा में अंतर 50% से अधिक है; इस प्रकार, BWE में छोटे बदलाव परिणामों को अस्पष्ट करने की संभावना नहीं है।

स्थिर स्थिति पर विचार करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल का एक और परिवर्तनीय पहलू बीडब्ल्यूई का स्तर है। बढ़ा हुआ BWE संभावित रूप से फैटी एसिड पर बढ़े हुए लेबल हस्तांतरण की अनुमति देता है, और इस प्रकार, कम कारोबार वाले फैटी एसिड पूल कम समय में अधिक आसानी से पता लगाने योग्य हो सकते हैं। यह उन स्थितियों में एक फायदा हो सकता है जहां शोधकर्ता डीएनएल में तीव्र प्रतिक्रियाओं में रुचि रखते हैं। हालांकि, शरीर के पानी में डी2ओ के स्तर में वृद्धि अवांछित शारीरिक प्रभाव पैदा कर सकती है, और इस प्रकारसावधानी बरतनी चाहिए। बीडब्ल्यूई स्तरों को प्राप्तकरने के लिए डी 2 ओ के निचले स्तर का प्रशासन आमतौर पर लगभग 0.5% डी2ओ प्रशासन से जुड़ी लागत के कारण मानव अध्ययन में नियोजित किया जाता है। इस मामले में, बीडब्ल्यूई और फैटी एसिड संवर्धन को मापने के लिए बढ़ी हुई संवेदनशीलता वाले तरीकों की आवश्यकता हो सकती है। BWE के लिए, यह आयन अनुपात मास स्पेक्ट्रोमेट्री58 या एक संशोधित एसीटोन एक्सचेंज प्रोटोकॉल59 के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। फैटी एसिड विश्लेषण के लिए, एक उच्च रिज़ॉल्यूशन जीसीएमएस उपकरण का उपयोग हाल ही में फैटी एसिड में ड्यूटेरियम के माप की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, और इस प्रकार बहुत कम समय अवधि और / या कम बीडब्ल्यूई60 के बाद डीएनएल की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। वैकल्पिक तरीकों का उपयोग उस थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है जिसके साथ बीडब्ल्यूई को मापा जाता है, सीएचसीएल 3 के साथ इसे निकालने और तरल इंजेक्शन करने के बजाय चरण 7.1.5 में उत्पन्न एसीटोन के हेडस्पेस विश्लेषण का उपयोग करके। यह विधि रन टाइम को कम करता है और कई स्थानांतरण चरणों से बचता है, इस प्रकार नमूना तैयारी समय को कम करता है। यदि हेडस्पेस इंजेक्टर तक पहुंच उपलब्ध है, तो इस विधि कीअत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

मात्रा और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के लिए फैटी एसिड पूल का विकल्प
इस प्रोटोकॉल में, विधि को लिपिड वर्ग के बावजूद, ऊतक या प्लाज्मा में कुल फैटी एसिड पूल को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, पतली परत क्रोमैटोग्राफी या तरल क्रोमैटोग्राफी जैसे तरीकों के माध्यम से लिपिड वर्गों को एफएएमई पीढ़ी से पहले अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, सीरम या प्लाज्मा का विश्लेषण करते समय, विशिष्ट लिपोप्रोटीन अंशों से लिपिड, जैसे कि बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन58 के माध्यम से अलग किया जा सकता है। यह विधि आमतौर पर हेपेटिक डीएनएल का पता लगाने के लिए मानव अध्ययन में नियोजित की जाती है, जो वीएलडीएल में डे नोवो मेड फैटी एसिड का प्राथमिक स्रोत होने की संभावना है। लिपिड निष्कर्षण और व्युत्पन्न प्रोटोकॉल को विशिष्ट वर्गों62 के अलगाव को बढ़ाने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। अंत में, लिपिड हाइड्रोजन के ड्यूटेरियम संवर्धन को मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बजाय 2एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके भी मापा जा सकता है। यद्यपि यह विधि एमएस की तुलना में कम संवेदनशील है और इसलिए बढ़ी हुई सामग्री की आवश्यकता होती है, इसका लाभ यह है कि यह स्थितिगत संवर्धन जानकारी देता है, जिसका उपयोग बढ़ाव और संतृप्ति दर63 का बेहतर अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

गणना
इस प्रोटोकॉल में गणना पिछली गणनाओं पर आधारित है जो स्थिर राज्य बीडब्ल्यूई, फैटी एसिड संवर्धन और फैटी एसिड31 पर विनिमय योग्य हाइड्रोजन की संख्या को ध्यान में रखते हैं। किसी भी गणना के साथ, कई सीमाएं और धारणाएं हैं जिन्हें इस दृष्टिकोण से परिणामों को लागू करने और व्याख्या करते समय विचार किया जाना चाहिए। प्राथमिक विचारों में से एक विधि के खंड 8 में एन के लिए उपयोग किया जाने वाला मूल्य है। फैटी एसिड संश्लेषण के दौरान, डी 2 ओ से2एच को एसाइल श्रृंखला में शामिल किया जाता है, साथ ही अप्रत्यक्ष रूप से एनएडीपीएच, एसिटाइल-सीओए और मैलोनिल-सीओए64,65 पर हाइड्रोजन के साथ आदान-प्रदान के माध्यम से। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यह विनिमय अधूरा है31,66; इस प्रकार, गणना में इस65 के लिए अनुमति देने के लिए एक सुधार कारक (एन) शामिल है। 22 का एन आमतौर पर कई अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह पहले पाया गया है कि यह चरण 631,66 में उल्लिखित समीकरण का उपयोग करके ऊतकों की एक श्रृंखला के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह प्रयोगात्मक गड़बड़ी और पशु मॉडल65 के आधार पर भिन्न हो सकता है; इस प्रकार, हम जांचकर्ताओं से इसे ध्यान में रखने का आग्रह करते हैं। एक कम एन कुल संश्लेषण प्रवाह को बढ़ाता है, और अध्ययन या प्रयोगशालाओं में माप की तुलना करते समय इस पैरामीटर के लिए नियोजित मूल्य पर विचार किया जाना चाहिए। यहां उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह केवल एफएएस के प्रत्यक्ष उत्पादों के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है जो मुख्य रूप से पामिटेट है, जिसमें विषम श्रृंखला फैटी एसिड और मोनो-मिथाइल ब्रांकेड चेन फैटी एसिड की बहुत कममात्रा है। यद्यपि सभी फैटी एसिड के ड्यूटेरियम संवर्धन का पता लगाया जा सकता है, यहां उपयोग किया जाने वाला सूत्र सी 18: 0 जैसे लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के संश्लेषण को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि यह बिना लेबल वाले फैटी एसिड के उत्थान और इन67 के बढ़ाव की अनुमति नहीं देता है। इसी तरह, डिसैचुरेशन दरों को भी कम करके आंका जा सकता है।

सामान्य सीमाएँ
यद्यपि फैटी एसिड को मापने के लिए डी2ओ के उपयोग ने शारीरिक होमियोस्टैसिस में डीएनएल के महत्व में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उत्पन्न की है, इस पद्धति से जुड़ी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, यहां उल्लिखित समय के आधार पर, नए संश्लेषित फैटी एसिड की उत्पत्ति के ऊतक में पूरी तरह से आश्वस्त होना संभव नहीं है। एक परिदृश्य की कल्पना करना आसान है जिसमें एक निश्चित ऊतक डीएनएल से फैटी एसिड उत्पन्न करता है, और फिर उन्हें अन्य ऊतकों में ले जाया जाता है। डी2ओ उपचार के बाद ठीक समय पाठ्यक्रम प्रयोग नए संश्लेषित फैटी एसिड के लिए मूल के ऊतक के संकल्प को बढ़ा सकते हैं, क्रॉस-ऊतक संदूषण को कम कर सकते हैं। प्रतिनिधि परिणामों के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 दिन के समय बिंदु को थर्मोन्यूट्रैलिटी (जब प्रवाह कम होता है) और कमरे के तापमान दोनों पर फैटी एसिड की एक श्रृंखला में ड्यूटेरियम संवर्धन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। डी2ओ प्रशासन के बाद कम समय बिंदु, जहां पामिटेट प्राथमिक लक्ष्य है, क्रॉस-ऊतक फैटी एसिड परिवहन को कम करता है और इसलिए फायदेमंद हो सकता है। ठंड की स्थिति में चूहों पर विचार करते समय बहुत कम समय बिंदु (जैसे, 12 घंटे) आदर्श होंगे और जब थर्मोन्यूट्रैलिटी को प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल नहीं किया जाता है। दूसरा, यह विधि नए फैटी एसिड की उत्पत्ति के सब्सट्रेट के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है। विशेष परिस्थितियों में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट सब्सट्रेट्स की पहचान करना डीएनएल के नियामक मानचित्र की पूरी समझ के लिए आवश्यक जानकारी की एक अतिरिक्त परत हो सकती है। यह स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल किए गए सब्सट्रेट्स के साथ किया जा सकता है।

लाभ
इस पद्धति का एक विशेष लाभ यह है कि जानवर अनियंत्रित होते हैं (डी2ओ के प्रारंभिक इंजेक्शन को छोड़कर) और प्रक्रिया के दौरान सचेत होते हैं, जानवरों के लिए स्वाभाविक रूप से व्यवहार करने के लिए कम तनाव के माहौल को बढ़ावा देते हैं, जिसमें वांछित अनुकरण और एक आहार पैटर्न और मात्रा शामिल है जो आवश्यक होने पर विशिष्ट आहार उपचार की अनुमति देती है। डी2ओ भी उल्लेखनीय रूप से प्रशासित करने के लिए आसान है। अन्य ट्रेसर (जैसे, 13सी-यू-ग्लूकोज) के तरल समाधानों के विपरीत, डी2ओ में पानी की खपत को प्रभावित करने की संभावना वाले विशिष्ट स्वादिष्ट विशेषताएं नहीं हैं। स्थिर आइसोटोप ट्रेसर से परे, अन्य सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि रेडियोआइसोटोप है। रेडियोआइसोटोप का संभावित लाभ पता लगाने के लिए उपकरणों का विकल्प है। स्थिर आइसोटोप के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमीटर की आवश्यकता होती है, जबकि रेडियोआइसोटोप को एक सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है, जो अधिक आसानी से सुलभ हो सकता है। हालांकि, सुरक्षा और नैतिक मुद्दों के कारण रेडियोआइसोटोप से जुड़े कई नुकसान हैं। इसके अलावा, रेडियोआइसोटोप आम तौर पर ग्लूकोज पर होता है और इसलिए यह केवल डीएनएल में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करता है, बल्कि ग्लूकोज व्युत्पन्न डीएनएल में परिवर्तन को दर्शाता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत फैटी एसिड के संश्लेषण का निर्धारण संभव नहीं है। डी2ओ आइसोटोप लेबल68 के साथ विशिष्ट सब्सट्रेट्स की तुलना में सभी ऊतकों में अधिक तेजी से समानता करता है।

डीएनएल चयापचय होमियोस्टैसिस का एक प्रमुख घटक है जो कई एंजाइमों और प्रतिलेखन कारकों द्वारा नियंत्रित होता है जो प्रत्येक स्वतंत्र रूप से विकास, चयापचय और रोग की स्थिति को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, डीएनएल एक प्रमुख चयापचय मार्ग होने के लिए बाध्य है, जिसे अनुसंधान और चिकित्सा विकास में अधिक व्यापक रूप से पूछताछ करने की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल का उपयोग चयापचय फेनोटाइपिंग में नियमित रूप से डीएनएल विश्लेषण को शामिल करने में पहले कदम के रूप में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मूल्यवान चर्चा ओं के लिए सांचेज़-गुरमाचेस और वालेस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (जेएसजी को 18सीडीए 34080527 और आरएम को 19पोस्ट34380545), एनआईएच (जेएसजी के R21OD031907), एक सीसीएचएमसी ट्रस्टी अवार्ड, एक सीसीएचएमसी सेंटर फॉर पीडियाट्रिक जीनोमिक्स अवार्ड और सीसीएचएमसी सेंटर फॉर मेंडेलियन जीनोमिक्स एंड थेरेप्यूटिक्स अवार्ड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। यह काम सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान कोर सेंटर के एनआईएच पी 30 DK078392 द्वारा समर्थित था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो। आरटी और एमडब्ल्यू को यूसीडी एड एस्ट्रा फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

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ड्यूटेरियम ऑक्साइड का उपयोग करके ब्राउन एडीपोज ऊतक में <em>डे नोवो</em> फैटी एसिड संश्लेषण का मात्रात्मक निर्धारण
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Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

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