Summary
O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.
Abstract
A imagem de cálcio de campo amplo do neocórtex do rato permite observar a atividade neural em todo o córtex relacionada a várias funções cerebrais. Por outro lado, a imagem de dois fótons pode resolver a atividade de circuitos neurais locais no nível de célula única. É fundamental fazer uma grande janela craniana para realizar análises em várias escalas usando ambas as técnicas de imagem no mesmo mouse. Para conseguir isso, deve-se remover uma grande seção do crânio e cobrir a superfície cortical exposta com materiais transparentes. Anteriormente, crânios de vidro e janelas cranianas à base de polímero foram desenvolvidos para esse fim, mas esses materiais não são facilmente fabricados. O presente protocolo descreve um método simples para fazer uma grande janela craniana consistindo de filme de envoltório de cloreto de polivinilideno (PVDC) comercialmente disponível, um plugue de silicone transparente e um vidro de cobertura. Para a imagem da superfície dorsal de um hemisfério inteiro, o tamanho da janela foi de aproximadamente 6 x 3 mm2. Vibrações cerebrais severas não foram observadas, independentemente de uma janela tão grande. É importante ressaltar que a condição da superfície do cérebro não se deteriorou por mais de um mês. Imagens de campo amplo de um camundongo expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI), GCaMP6f, especificamente em astrócitos, revelaram respostas sincronizadas em poucos milímetros. Imagens de dois fótons do mesmo camundongo mostraram respostas proeminentes de cálcio em astrócitos individuais ao longo de vários segundos. Além disso, uma fina camada de um vírus adenoassociado foi aplicada ao filme PVDC e expressou com sucesso GECI em neurônios corticais sobre a janela craniana. Esta técnica é confiável e econômica para fazer uma grande janela craniana e facilita a investigação da dinâmica neural e glial e suas interações durante o comportamento nos níveis macroscópico e microscópico.
Introduction
A imagem de cálcio de campo amplo investiga efetivamente o padrão de atividade espaço-temporal em uma grande área do cérebro animal 1,2,3. A imagem de campo amplo tem sido amplamente utilizada para observar toda a superfície cortical dos roedores, uma vez que seu córtex é relativamente plano 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Camundongos transgênicos ou camundongos injetados com vírus adenoassociados (AAV), que expressam especificamente GECIs em várias células, como neurônios e células gliais, podem ser utilizados para imagens de cálcio de campo amplo11,12,13. No entanto, a resolução espacial dessa técnica geralmente não é suficiente para resolver a atividade de células individuais in vivo14. Também não é adequado para células de imagem localizadas em camadas mais profundas.
Por outro lado, a imagem de cálcio de dois fótons pode observar a atividade de múltiplas células simultaneamente com a resolução espacial subcelular, permitindo a observação da atividade de células individuais mesmo em dendritos neuronais e processos gliais 15,16,17,18,19,20,21,22. Também pode observar células em camadas mais profundas do córtex cerebral23,24. Embora os recentes avanços tecnológicos na microscopia de dois fótons permitam a obtenção de imagens de regiões corticais de milímetros de largura 25,26,27,28,29, ainda é difícil observar uma área comparável à imagem de campo amplo por meio de imagens de dois fótons.
Para entender a relevância fisiológica da atividade cerebral de célula única para cérebro inteiro, é fundamental preencher a lacuna entre a atividade das regiões corticais em todo o córtex e a resolução de uma única célula em circuitos neurais locais. Portanto, uma combinação de imagens de cálcio de campo amplo e de dois fótons realizadas no mesmo camundongo é especialmente eficaz. Para perceber isso, uma janela craniana larga e estável deve ser criada, idealmente durante um longo período.
Anteriormente, várias técnicas de confecção de janelas cranianas foram desenvolvidas para permitir a realização de imagens de campo amplo e de dois fótons no mesmo camundongo30,31. As janelas de vidro de cobertura em forma de trapezoidal (crânio de cristal), que são moldadas na forma da superfície cortical para substituir o osso removido, permitem o acesso óptico sobre todo o córtex32. Alternativamente, janelas cranianas à base de polímero podem ser feitas com polietileno tereftalato (PET)33 ou fluoropolímeros amorfos revestidos com polietileno revestidos com óxido de etileno nanofolha34. Cada método demonstrou manter uma janela estável por mais de 1 mês. No entanto, produzir essas janelas não é fácil, e os materiais e equipamentos utilizados são muitas vezes caros.
O presente estudo descreve um novo método para a confecção de uma grande janela craniana utilizando o filme PVDC (filme plástico alimentício) (Figura 1). Usando esta janela, experimentos de imagem in vivo de campo amplo e dois fótons podem ser realizados nos mesmos camundongos. Também foi demonstrado que os GECIs podem ser expressos em neurônios em uma ampla área do córtex de camundongos, formando uma fina camada de filme contendo partículas de AAV no envoltório.
Protocol
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Yamanashi. Camundongos do tipo selvagem (C57BL/6J, Japão SLC) e transgênicos expressando GECI ancorado em membrana (Lck-GCaMP6f) em astrócitos foram utilizados neste estudo. Os camundongos transgênicos foram obtidos pelo cruzamento de camundongos AldH1l1-CreERT2 [B6N. Camundongos FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, obtidos comercialmente, ver Tabela de Materiais] e camundongos Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor
1. Preparação para a cirurgia da janela craniana
- Anestesiar camundongos com isoflurano (indução: 3%, cirurgia: 1%-1,5%, taxa de fluxo: 0,2-0,3 L/min). Confirme a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de pinça da cauda ou do dedo do pé. Mantenha a temperatura do corpo usando uma almofada de aquecimento (36-38 °C). Aplique pomada ocular com um cotonete para evitar que os olhos dos ratos sequem sob anestesia.
- Injetar solução de manitol a 15% (ver Tabela de Materiais) por via intraperitoneal (3 ml/100 g de peso corporal). Fixe a cabeça do mouse em um quadro estereotáxico com barras auriculares. Remova o cabelo da cabeça do rato usando um barbeador e creme de depilação.
- Desinfete a superfície da pele com iodopovidona e álcool três vezes. Aplique lidocaína topicamente para fornecer analgesia preventiva. Remova a pele sobre a área de interesse com uma tesoura cirúrgica e exponha o crânio (tamanho: 15 x 15 mm). Se houver sangramento, use um cotonete para parar o sangramento.
NOTA: Neste estudo, a pele foi removida para observar o córtex pré-frontal para o córtex visual. - Remova o periósteo sobre o crânio exposto usando uma microcureta e seque a superfície do crânio para fixar firmemente a placa da cabeça ao crânio com cimento dentário (ver Tabela de Materiais) (Figura 2B).
NOTA: A placa de cabeça personalizada é criada usando uma impressora 3D. O arquivo de design é depositado no repositório do Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates). - Fixar a placa da cabeça com cimento dentário (Figura 2C). Aguarde pelo menos 20 min para que o cimento endureça. Fixe a placa da cabeça com o suporte da placa da cabeça35.
2. Fazendo a janela craniana
- Remova o cimento extra sobre o crânio com uma broca dentária (ver Tabela de Materiais). Tenha cuidado para não perfurar o osso e danificar o cérebro por perfuração.
- Marque a área a ser cortada com uma caneta e corte no osso com um bisturi. Embrulhe a ponta do bisturi para garantir que a ponta não penetre no crânio (Figura 1 Suplementar). Faça referência ao atlas cerebral para determinar onde fazer a janela.
NOTA: Para o presente estudo, foi criada uma janela entre -2 mm e +4 mm do bregma no eixo anteroposterior e da sutura sagital a +3 mm no eixo mediolateral, incluindo os córtices motor, somatossensorial e visual. - Raspe o osso repetidamente com um bisturi para aprofundar o sulco até que o osso na área a ser aparada se mova bem quando levemente tocado.
- Remova o osso incisado com uma pinça fina. Não empurre o retalho ósseo para o cérebro, o que pode danificar o cérebro (Figura 1Ba).
NOTA: Se o sangramento for observado após a remoção do osso, aplique e aspirar imediatamente o líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF, consulte Tabela de Materiais) e repita esse processo até que o sangramento pare. Alternativamente, coloque uma esponja de gelatina hemostática (cerca de 3 mm de cubos quadrados) embebida na ACSF no ponto de sangramento. - Se a dura-máter não for removida, avance para o passo 2.7.
- Remova a dura-máter seguindo os passos abaixo.
- Remova a dura-máter, por exemplo, nas seguintes situações; transfecção pelo método do filme fibroína-AAV36 e observação de pequenas estruturas como espinhos dendríticos.
- Corte a dura-máter usando uma pipeta de vidro puxada com uma ponta cônica de cerca de 10 μm. Para expandir esse corte por toda a janela, use uma agulha em forma de U.
- Defina o zoom do estereomicroscópio para 60-100x e remova a dura-máter cortada com pinças ultrafinas. Se a remoção da dura-máter causar sangramento, enxaguar com ACSF ou usar uma esponja de gelatina para parar o sangramento.
- Recorte o envoltório PVDC.
- Esterilizar uma peça grande (por exemplo, 10 x 15 mm) de envoltório de PVDC (cerca de 11 μm, ver Tabela de Materiais, Figura 2A a) por autoclave e com etanol a 70%.
- Sob um estereomicroscópio, use uma pinça e um bisturi para cortar um envoltório do tamanho necessário.
NOTA: O tamanho do envoltório precisa ser aproximadamente 10 mm maior do que o tamanho da janela craniana, mas menor do que a abertura da placa da cabeça. Para uma janela craniana de 6 x 3 mm 2, prepare um envoltório de 15 x 10 mm2.
- Coloque o envoltório com precisão seguindo as etapas abaixo.
- Coloque o envoltório na superfície do cérebro, deixando o ACSF na superfície. Sugue o ACSF da borda do invólucro, permitindo que o envoltório grude firmemente na superfície do cérebro (Figura 1Bb,c).
NOTA: O envoltório usado é resistente a rugas, portanto, apenas colocá-lo na superfície do cérebro quase não produz rugas. - Aparar o envoltório com um bisturi e uma pinça de modo a que haja aproximadamente uma margem de 1 mm entre a borda da janela craniana e o envoltório (Figura 1Bd).
- Uma vez que o envoltório esteja no lugar, cole a borda do envoltório no crânio com um adesivo biológico (ver Tabela de Materiais, Figura 2D). Deixe o adesivo secar por cerca de 30 min.
- Coloque o envoltório na superfície do cérebro, deixando o ACSF na superfície. Sugue o ACSF da borda do invólucro, permitindo que o envoltório grude firmemente na superfície do cérebro (Figura 1Bb,c).
- Aplique o elastômero de silicone transparente.
- Aplique o elastômero de silicone transparente comercialmente disponível (consulte Tabela de materiais) em cima do invólucro usando um dispensador com uma ponta de mistura (Figura 1B e, 2Ab-d)e coloque o vidro da tampa (0,12-0,17 mm de espessura) na parte superior (Figura 2E).
- Sele o perímetro do vidro de cobertura com filme impermeável, supercola ou cimento dentário (Figura 1Bf).
- Após a cirurgia, monitore o rato até que ele recupere a consciência para manter a decúbito esternal. Depois disso, mantenha os ratos individualmente e permita que eles se recuperem em sua gaiola doméstica por pelo menos 7 dias.
- Para reduzir o estresse e a dor, administre agentes anti-inflamatórios e analgésicos (por exemplo, dexametasona e cetoprofeno, 5 mg/kg cada, i.p.).
- Monitore os ratos regularmente para a infecção. Se uma infecção for confirmada, administre um medicamento antimicrobiano (por exemplo, 10% de enrofloxacina, 1,7 μL/mL) na água potável até que a infecção seja eliminada (normalmente menos de 4 semanas).
3. Fazendo filme de AAV em filme plástico usando solução de fibroína
NOTA: O passo 3 é opcional.
- Preparar solução de fibroína a partir de casulos de bicho-da-seda seguindo um método previamente publicado37.
- Em resumo, ferva casulos normais de bicho da seda comercialmente disponíveis (5 g, ver Tabela de Materiais) em solução de carbonato de sódio (0,02 M, 2 L). Lave os casulos em água ultrapura e seque durante a noite.
- Dissolver os casulos secos em solução de brometo de lítio (9,3 M, 20% p/v de fibroína) enquanto aquece num forno a 60 °C durante 4 h. Dializar a solução de casulo dissolvido, centrifugar (duas vezes a 12.700 x g, a 4 °C durante 20 min)37 e recolher o sobrenadante.
- Prepare o filme de fibroína-AAV seguindo os passos abaixo.
- Misture as soluções de fibroína e AAV20 em uma proporção de 1:4 em um pequeno tubo de amostra usando uma micropipeta. Solte uma alíquota da solução mista de fibroína-AAV no filme plástico da janela craniana e seque-a por pelo menos 3 h.
NOTA: Para expressão em uma área de 3 mm de diâmetro, aplique uma gota de 5 μL de solução de fibroína-AAV. Esta razão determina a quantidade de solução para uma determinada área. - Após a secagem, corte o filme plástico no tamanho necessário para a janela (por exemplo, 10 x 15 mm) e coloque-o na superfície do cérebro. Em seguida, siga o método acima mencionado a partir da etapa 2.8.1 em diante.
NOTA: Antes de colocar o envoltório na superfície do cérebro, remova o ACSF na superfície do cérebro, tanto quanto possível. Isso ocorre porque espera-se que o ACSF dissolva o filme de fibroína-AAV e reduza a concentração de partículas de AAV. - Aguarde cerca de 2-4 semanas após a criação da janela tratada com AAV até que os GECIs sejam expressos o suficiente. Durante este processo, verifique a condição dos ratos e janelas regularmente.
- Misture as soluções de fibroína e AAV20 em uma proporção de 1:4 em um pequeno tubo de amostra usando uma micropipeta. Solte uma alíquota da solução mista de fibroína-AAV no filme plástico da janela craniana e seque-a por pelo menos 3 h.
4. Imagem e análise de cálcio
NOTA: Para obter detalhes sobre a imagem e a análise, consulte os relatórios publicados anteriormente 1,2,38.
- Execute imagens de campo amplo seguindo as etapas abaixo.
- Imobilize o mouse usando um dispositivo de fixação da cabeça sob um macroscópio de fluorescência de lente em tandem (consulte Tabela de materiais).
- Ilumine o córtex cerebral de ratos com luz de excitação de uma fonte de luz LED de 465 nm através de um filtro de excitação, espelho dicroico e lente objetiva.
- Colete as imagens de fluorescência do córtex cerebral por uma câmera CCD através de uma lente objetiva (1,0x), espelho dicroico, filtro de emissão e lente de imagem (2,0x). A combinação dessas lentes dá uma ampliação total de cerca de 0,5x.
- Adquira imagens a uma frequência de amostragem de 50 Hz. Após a aquisição dos dados, analise as imagens utilizando o software ImageJ. Selecione a região de interesse (ROI) manualmente. Calcule a mudança de fluorescência em cada ROI como ΔF/F = (Ft - F0) / F0, onde Ft é o valor de fluorescência bruta de cada quadro e F0 é o valor médio de fluorescência obtido a partir de uma imagem média de todos os quadros.
NOTA: Um programa de macro para ImageJ é depositado no GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), que calcula imagens ΔF/F a partir de dados de imagem de cálcio.
- Execute imagens de dois fótons seguindo as etapas abaixo.
- Imobilize o mouse sob um microscópio de dois fótons usando um dispositivo de fixação da cabeça. Identifique a área a ser fotografada usando o microscópio no modo de campo brilhante com uma lente objetiva de baixa ampliação (5x).
- Alterne para imagens de dois fótons. Use uma lente objetiva de alta ampliação (16x ou 25x) e ilumine o laser para excitação de dois fótons.
NOTA: Lck-GCaMP6f22 verde e XCaMP-R36 vermelho foram excitados por um laser ultrarrápido em comprimentos de onda de excitação de 920 nm e 1070 nm, respectivamente. - Adquira imagens de fluorescência a 30 Hz. Após a aquisição dos dados, corrija os artefatos de movimento pela função de registro do software suite2p39. Obtenha ROI e ΔF/F a partir de imagens usando o mesmo método para imagens de campo amplo.
- Plote os dados usando python com as seguintes bibliotecas: NumPy, Matplotlib e Pandas (consulte Tabela de materiais).
Representative Results
Avaliação de uma grande janela craniana feita utilizando os métodos de envoltório PVDC
Imediatamente após a cirurgia, o sucesso ou o fracasso podem ser verificados de relance pela condição da superfície cortical, como sangramento e mudança de cor devido a danos ou isquemia. Muito tempo após a cirurgia, a superfície cortical pode ser coberta com uma membrana branca opaca devido à infecção, ou o sangue pode cobrir a janela devido ao sangramento (Figura 2G). Nestes casos, o córtex pode não estar em condições saudáveis, e a imagem pode não ser possível. Estes podem ser causados por envoltórios parcialmente cortados ou fixação insuficiente do envoltório pelo adesivo. Se a infecção for repetidamente observada, pode ser eficaz aplicar antibióticos, por exemplo, sulfato de gentamicina (10 μL, 50 mg / mL), sobre a superfície do cérebro na colocação da janela. A regeneração de meninges ou ossos também é observada quando a lacuna vertical entre a superfície cortical e o envoltório é grande. Para evitar isso, aplicar o envoltório o mais firmemente possível na superfície do cérebro durante a preparação da janela é crucial. Isso pode ser conseguido colocando filme plástico na superfície do cérebro e sugando o máximo de ACSF possível. Na ausência de ACSF, isso pode ser feito simplesmente colocando o filme plástico na superfície do cérebro. O cérebro e os vasos sanguíneos são determinados a não serem danificados pelo fato de que a cor do cérebro não é descolorida e os vasos sanguíneos não são cortados.
A longevidade da janela depende em grande parte da qualidade da cirurgia. Quando a condição é boa, não há sinal de infecção, sangramento ou regeneração mais de 1 mês após a cirurgia (Figura 2F e Figura 3B). Em 8 de 10 camundongos, a janela pode ser mantida limpa por até 10 semanas ou mais. As janelas em dois dos ratos não puderam ser mantidas adequadamente devido a infecção ou sangramento. Embora a grande janela possa ser propensa a estresse mecânico ou impacto, janelas quebradas ou rachadas não foram observadas.
Para avaliar a qualidade de imagem da nova janela craniana com o envoltório, silicone e vidro, a função de dispersão pontual foi comparada sob a nova janela com a da janela de vidro convencional por imagem de contas fluorescentes de 0,1 μm em ágar (ver Arquivo Suplementar 1). Os resultados mostraram que não houve diferença na largura total na metade máxima (FWHM) para ambas as condições. [Eixo X (μm): somente vidro, 1,99 ± 0,07, envoltório, 1,76 ± 0,13, eixo Y (μm): somente vidro, 2,11 ± 0,27, envoltório, 1,90 ± 0,15, eixo Z (μm): apenas vidro, 25,29 ± 0,71, envoltório, 26,64 ± 1,02, N = 7 contas, p > 0,05, teste U de Mann-Whitney, Figura suplementar 2A,B]. Portanto, os novos elementos adicionados (envoltório e silicone) não deterioraram a qualidade da imagem.
Artefatos de vibração causados pela respiração, batimentos cardíacos e movimento do corpo estão presentes em imagens de campo amplo e de dois fótons. Para determinar o quanto a nova janela craniana vibra, uma pequena partícula fluorescente foi selecionada a partir dos dados de imagem in vivo de dois fótons e examinou o quanto sua imagem se moveu durante os 60 anos. Verificou-se que o desvio padrão do centroide dessa partícula fluorescente foi de cerca de 0,3 μm, o que é comparável ao de uma janela de vidro convencional (Figura suplementar 2C). Isso indica que, como o cérebro foi mantido pressionado por um plugue de silicone transparente e vidro de cobertura, as vibrações foram comparáveis às observadas em janelas menores convencionais, e o registro de imagem off-line foi suficiente para eliminar artefatos de vibração.
Na imagem de cálcio de campo amplo, a atividade cortical pôde ser observada propagando-se através do córtex induzida por estimulação sensorial (Figura 3A-D, K-N). A imagem de dois fótons permitiu a observação de imagens de fluorescência unicelular específicas para neurônios e células gliais (Figura 3E,O). Alterações de fluorescência induzidas pela estimulação sensorial puderam ser observadas em células individuais (Figura 3E-J,O-T).
Expressão de indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) em uma ampla área do córtex cerebral usando o envoltório PVDC e AAV
O envoltório de PVDC para a janela pode ser aplicado para expressar proteínas funcionais em uma ampla área do córtex. Isso é conseguido usando AAV e fibroína, uma proteína componente dos casulos do bicho-da-seda que têm sido amplamente aplicados como biomateriais37. Estudo prévio mostrou que a fibroína poderia ser misturada com AAVs, formando filmes implantados no cérebro para expressar proteínas funcionais, como opsinas fotoativáveis ou GECIs36. No presente estudo, o AAV expressando GECI e fibroína foi misturado e seco no envoltório, e o envoltório revestido de AAV foi utilizado para a janela craniana. Isso resultou na expressão de GECI sobre a ampla área do córtex 2-4 semanas após a cirurgia (Figura 3K-M). Como a janela era grande, diferentes áreas corticais do mesmo mouse podem ser fotografadas (Figura 3M-T).
Para confirmar a eficiência de expressão deste método, o número de células que expressam GECI foi contado no cérebro fixo (Figura suplementar 2D). Verificou-se que a presente estratégia utilizando o envoltório com fibroína-AAV resultou na expressão de GECI com eficiência de aproximadamente 20% nas camadas superficial e profunda (L2/3: 20,78%, célula expressora XCaMP-R: 32 células, DAPI: 154 locais, L5: 20,08%, célula expressora XCaMP-R: 51 células, DAPI: 254 locais). Assim, este método expressou GECIs em células não apenas em camadas superficiais, mas também em camadas mais profundas.
Figura 1: Diagrama conceitual da grande janela craniana. (A) Desenho esquemático à esquerda da nova janela craniana. É maior que a janela convencional (3 mm de diâmetro). À direita, vista transversal. O método para fazer uma grande janela craniana usa filme de envoltório de alimentos, elastômero de silicone transparente e vidro de cobertura, permitindo imagens de campo amplo e de dois fótons do mesmo mouse. (B) Procedimento de fabricação de janelas cranianas: (a) Remoção óssea. b) Remoção da ACSF sob o invólucro. (c) Aderência do envoltório à superfície do cérebro através da remoção de ACSF. d) Cortar o excesso de envolvimento. e) Aplicação de silicone transparente. f) Vidro de cobertura de afixação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da cirurgia da janela craniana. (A) Materiais e equipamentos necessários para a janela craniana. a) Película de embalagem de cloreto de polivinilideno (PVDC). b) Um dispensador de elastômero de silicone transparente com uma ponta de mistura. c) Vidro de cobertura. d) Silicone transparente colocado entre duas partes do vidro da tampa. (B) Fotografia da pele da cabeça do rato incisada para expor o crânio. O rato foi anestesiado e a cabeça do rato foi imobilizada com barras auriculares. A cabeça foi então despêlada e tratada com analgesia local e a pele foi incisada. (C) Fotografia após a instalação de uma placa de cabeça. Uma placa de cabeça (feita de resina de uma impressora 3D) foi anexada à cabeça do mouse com cimento dental. (D) Fotografia de uma janela craniana. A janela craniana foi criada no córtex do hemisfério direito do cérebro do rato. A dura-máter foi removida e o envoltório foi colado no lugar. (E) Uma foto da janela feita do envoltório com o silicone transparente e o vidro da tampa no topo. (F) Um exemplo típico de uma janela bem-sucedida (hemisfério direito, 7 semanas após a cirurgia). (G) Exemplo de janela com falha (ambos os hemisférios, 5 semanas após a cirurgia). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A grande janela permite imagens de cálcio de campo largo e de dois fótons do mesmo camundongo. (A) A imagem de cálcio foi realizada em um camundongo transgênico expressando GECI ancorado em membrana (Lck-GCaMP6f) em astrócitos40. (B) À esquerda, uma grande janela foi criada com filme plástico, silicone transparente e vidro de cobertura. Imagens de campo amplo foram realizadas através desta janela. À direita, uma foto foi capturada 79 dias após a instalação da janela craniana. (C) Quando a estimulação ar-sopro foi aplicada aos bigodes contralaterais, observaram-se alterações de fluorescência. (D) O curso temporal da mudança de fluorescência no córtex somatossensorial (quadrado vermelho em C) foi plotado. As barras vermelhas e azuis indicam o tempo de sopro de ar e o tempo "antes", "durante" e "depois" em (C), respectivamente. (E) O campo de visão (FOV 1 em C) da imagem de cálcio de dois fótons. Como o GCaMP6f foi expresso para localizar a membrana, as regiões de interesse (quadrados brancos) foram colocadas manualmente para detectar a resposta local nos processos dos astrócitos. (F) As mudanças de fluorescência nos quadrados coloridos em (E) são plotadas. (G) As mudanças de fluorescência em todos os quadrados de (E) são plotadas. Os eixos horizontal e vertical indicam o tempo e o número da célula, respectivamente. (H-J) Os dados para FOV 2 (no córtex visual) em (C) são mostrados. O FOV 2 foi fotografado após a imagem no FOV 1. (K) O GECI vermelho, XCaMP-R, foi expresso em neurônios pelo método da fibroína-AAV no camundongo do tipo selvagem. (L) Fotografia capturada duas semanas após a cirurgia em que a janela foi criada usando o filme de fibroína. (M) Imagens de cálcio de campo amplo foram realizadas neste rato. (N) A alteração de fluorescência evocada pela estimulação do bigode foi plotada a partir do local mais proeminente (córtex somatossensorial, quadrado vermelho em (M)). As linhas vermelha e azul indicam o tempo de sopro de ar e o tempo "antes" e "durante" em (M), respectivamente. (O) Campo de visão (córtex somatossensorial, FOV 1 em (M)) de imagem de cálcio de dois fótons a 300 μm de profundidade. As ROIs foram colocadas manualmente em somatos neuronais. (P) As mudanças de fluorescência nos quadrados coloridos em (O) são plotadas. (Q) As mudanças de fluorescência em todos os quadrados de (O) são plotadas em cores. (R-T) Os dados para FOV 2 em (M) localizado no córtex parietal são mostrados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Dicas para bisturis. A ponta do novo bisturi (em cima) em comparação com o bisturi usado para cortar o crânio com uma ponta embotada (em baixo). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 Suplementar: Validação da nova janela craniana e do método de expressão da fibroína-AAV. (A) Perfil de intensidade de fluorescência das esferas fluorescentes de 0,1 μm em ágar. A linha superior mostra dados de uma condição em que apenas o vidro de cobertura foi colocado sobre contas fluorescentes misturadas em ágar, e a linha inferior mostra dados de uma condição em que o envoltório, o silicone transparente e o vidro de cobertura foram colocados. Os traços cinzas mostram o ajuste gaussiano ao perfil de intensidade de fluorescência para cada talão, e os traços vermelhos mostram seus valores médios (n = 7). (B) Resumo dos dados em (A). Cada gráfico mostra a largura total na metade máxima (FWHM) da função de dispersão de pontos no eixo XYZ. O gráfico cinza mostra os dados para cada talão e o vermelho mostra sua média e erro padrão. (C) A partir dos 2.000 quadros (gravação de 60 s) de dados de imagem in vivo , uma pequena partícula fluorescente foi selecionada e examinou o quanto a imagem se moveu durante os anos 60. A imagem fluorescente no centro representa a média de 2.000 quadros. As imagens foram projetadas por meio de média nas direções dos eixos X e Y. Os histogramas mostram a distribuição do centroide em cada quadro. Os desvios-padrão do centroide foram X: 0,36 e Y: 0,315 μm. (D) Exemplo de expressão do GECI pelo método da fibroína-AAV. Esquerda: Uma fatia do córtex cerebral aplicou o método de expressão de fibroína-AAV. Vermelho e azul indicam fluorescência do XCaMP-R e DAPI, respectivamente; O XCaMP-R foi expresso não apenas em células da camada 2/3, mas também em células da camada 5. Centro e direita. Vistas ampliadas das camadas 2/3 e 5 na figura esquerda (quadrados cianos), respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: (A) Eficiência de expressão do envoltório com o método do filme de fibroína-AAV e (B) Avaliação da função de propagação pontual durante imagens de dois fótons. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Este artigo apresenta um método barato de criar uma grande janela craniana usando um filme plástico PVDC, silicone transparente e vidro de cobertura. Usando este método, mostramos que a imagem de cálcio de campo amplo poderia ser realizada em uma ampla área do córtex cerebral. A imagem de cálcio de dois fótons pode ser realizada a partir de várias regiões corticais diferentes no mesmo camundongo que foi submetido a imagens de campo amplo. Além disso, foi demonstrado que um filme de fibroína-AAV no filme plástico usado para a janela poderia expressar GECI em uma ampla área do córtex.
Etapas críticas
É importante evitar infecções e danos ao cérebro ao fazer janelas cranianas usando filme plástico. Nessas condições, a atividade neural e glial não pode ser observada, e a imagem de áreas mais profundas é impossível. A lesão dos vasos sanguíneos também resulta em sangramento, tornando a imagem impossível devido ao sangue. Para evitar a infecção, fazer com que a superfície do cérebro e o envoltório sejam presos o mais firmemente possível é fundamental, sugando a ACSF. A administração de manitol é importante para evitar danos cerebrais e nos vasos sanguíneos, evitando o aumento da pressão cerebral durante a cirurgia. Isso mantém o espaço entre a superfície do cérebro e a dura-máter e impede que o cérebro e os vasos sanguíneos sejam tocados durante a remoção do crânio e da dura-máter. Um microscópio estéreo com alta ampliação e pinças com pontas afiadas também são eficazes para uma cirurgia precisa.
No método fibroína-AAV, é essencial usar casulos de bicho da seda de carne, não congelar a solução de fibroína, secar suficientemente a solução de fibroína-AAV e aplicar volume suficiente de solução (5 μL por 3 mm de diâmetro). Quando casulos mais antigos foram usados, a eficiência de expressão foi menor. Isso ocorre porque a fibroína de casulos antigos pode ser desnaturada facilmente. Quando a solução de fibroína foi congelada a -80 °C e descongelada no momento do uso, a eficiência de expressão foi baixa. Isso pode ser devido à desnaturação da proteína devido ao congelamento e descongelamento. Uma vez que as soluções de fibroína armazenadas a 4 °C podem ser efetivamente utilizadas até à gelificação, recomenda-se que as soluções de fibroína sejam mantidas refrigeradas e purificadas a partir de casulos novamente após a gelificação. A solução de fibroína-AAV deve ser seca por pelo menos 3 h, pois a expressão é pobre após menos de 3 h. Finalmente, a área de expressão depende da quantidade de solução de fibroína-AAV utilizada. No exemplo da Figura 3M, a quantidade foi pequena (5 μL); assim, o filme de fibroína-AAV cobria apenas a metade superior da janela, resultando em expressão não uniforme sobre a janela. Se uma quantidade suficiente de fibroína-AAV for usada, a expressão será uniforme em toda a janela.
Modificações da técnica
A nova técnica de janela craniana permite examinar a atividade macroscópica dos circuitos corticais e sua atividade subjacente de nível de célula única no mesmo rato. Assim, o método pode ser aplicado a uma variedade de estudos de neurociência. Por exemplo, ele pode ser usado para observar a atividade cortical durante tarefas de tomada de decisão, aprendizagem motora e em modelos de ratos de lesão cerebral e doença. Também acreditamos que o método pode ser aplicado não apenas a roedores, mas também a primatas não humanos.
Este artigo demonstra que a grande janela craniana é eficaz para a imagem de camundongos transgênicos e camundongos injetados com AAV expressando proteínas funcionais. Em particular, é demonstrado que o filme de fibroína-AAV no envoltório é muito mais fácil do que um método convencional de injeção de AAV para expressar GECIs em toda a ampla área do córtex. Usando uma mistura de dois AAVs que codificam GECIs de cores diferentes41, a correlação entre a atividade do neurônio e das células gliais pode ser simultaneamente visualizada em uma ampla área do córtex. Além disso, o método do filme fibroína-AAV também pode ser aplicado a outros biossensores geneticamente codificados 42,43,44,45,46,47.
A janela craniana maior, que pode visualizar ambos os hemisférios, também é possível. Microscópios de dois fótons com um campo de visão muito mais amplo (~25 mm2) foram recentemente desenvolvidos 25,26,27,28,29. A combinação desta técnica de imagem de dois fótons com imagens de campo largo de um fóton usando a ampla janela craniana descrita aqui nos permitirá examinar a relação entre a atividade populacional e a atividade de célula única a partir de escalas sem precedentes.
Limitações
O invólucro alimentar não permite a passagem de quaisquer substâncias. Isso torna o método difícil de ser usado para experimentos farmacológicos. Também é difícil remover o envoltório, impossibilitando a inserção de uma pipeta ou eletrodo de vidro. Portanto, é difícil implementar experimentos combinados com outros métodos, como imagens simultâneas de cálcio e registros eletrofisiológicos, e administração local de drogas usando uma pipeta de vidro. Uma possível solução para essas limitações é usar o envoltório e a janela de vidro com um furo. Isso permite o acesso ao cérebro através de uma pipeta de vidro ou um eletrodo de gravação, mantendo a janela craniana estéril por um longo período48.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB e JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB e JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (to SM), Bolsa para Jovens Pesquisadores da Prefeitura de Yamanashi (para SM) e Takeda Science Foundation (para SM) e parcialmente apoiada pela Bolsa de Pesquisa Frontier Brain da Univ. Yamanashi.
Agradecemos a N. Yaguchi e K. Okazaki pelo cuidado com os animais e assistência técnica e aos membros do laboratório Kitamura pelas discussões úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| 50 mL beaker | |||
| Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
| ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
| ACSF aspiration needle | |||
| Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
| Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
| Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
| Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
| CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
| CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Cotton swab | |||
| Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
| Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
| Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
| Digital scale | Dretec | KS-243 | |
| Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
| Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
| Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
| Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
| Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
| Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
| Glass pipette | custom-made | ||
| Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
| Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
| Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
| Heating pad | |||
| Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
| Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
| Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
| Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
| Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
| Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
| Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
| Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Mixing tip | GC | ||
| Needle (30 G) | |||
| Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
| Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
| Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
| Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
| pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
| Scalpel | Kai | No. 11 | |
| Shaver for animal | |||
| Silicone dispensers | GC | ||
| Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
| Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
| Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
| Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
| Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
| Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
| Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
| Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
| Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |
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