Summary
Het huidige protocol bepaalt de trekspannings-ontspannings- en faaleigenschappen van varkenspijp. Resultaten van dergelijke methoden kunnen helpen het begrip van de visco-elastische en faaldrempels van de luchtpijp te verbeteren en de mogelijkheden van computationele modellen van het longsysteem te bevorderen.
Abstract
De biomechanische eigenschappen van de luchtpijp hebben direct invloed op de luchtstroom en dragen bij aan de biologische functie van het ademhalingssysteem. Het begrijpen van deze eigenschappen is van cruciaal belang voor het begrijpen van het letselmechanisme in dit weefsel. Dit protocol beschrijft een experimentele aanpak om het stress-ontspanningsgedrag van varkenspijpen te bestuderen die vooraf werden uitgerekt tot 0% of 10% spanning gedurende 300 s, gevolgd door mechanische trekbelasting tot falen. Deze studie geeft details over het experimentele ontwerp, data-acquisitie, analyses en voorlopige resultaten van de biomechanische testen van varkenstracheae. Met behulp van de gedetailleerde stappen in dit protocol en de MATLAB-code voor gegevensanalyse, kunnen toekomstige studies het tijdsafhankelijke visco-elastische gedrag van luchtpijpweefsel onderzoeken, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van de biomechanische reacties tijdens fysiologische, pathologische en traumatische omstandigheden. Bovendien zullen diepgaande studies van het biomechanische gedrag van de luchtpijp kritisch helpen bij het verbeteren van het ontwerp van gerelateerde medische hulpmiddelen zoals endotracheale implantaten die veel worden gebruikt tijdens operaties.
Introduction
Ondanks zijn cruciale rol bij longziekten, heeft de grootste luchtwegstructuur, de luchtpijp, beperkte studies die de visco-elastische eigenschappen ervan beschrijven1. Een diepgaand begrip van het tijdsafhankelijke, visco-elastische gedrag van de luchtpijp is van cruciaal belang voor longmechanicaonderzoek, omdat het begrijpen van de luchtwegspecifieke materiaaleigenschappen kan helpen de wetenschap van letselpreventie, diagnose en klinische interventie voor longziekten te bevorderen, die de derde belangrijkste doodsoorzaak zijn in de Verenigde Staten 2,3,4.
Beschikbare weefselkarakteriseringsstudies hebben de stijfheidseigenschappen van de luchtpijp 5,6,7,8 gerapporteerd. De tijdsafhankelijke mechanische reacties zijn minimaal onderzocht ondanks hun belang bij weefselremodellering, die ook wordt veranderd door pathologie 9,10. Bovendien beperkt het gebrek aan tijdsafhankelijke responsgegevens ook de voorspellende mogelijkheden van de computationele modellen van de longmechanica die momenteel hun toevlucht nemen tot het gebruik van de generieke constitutieve wetten. Er is behoefte om deze kloof aan te pakken door stress-ontspanningsstudies uit te voeren die de vereiste materiaalkenmerken kunnen bieden om biofysische studies van de luchtpijp te informeren. De huidige studie biedt details van testmethoden, data-acquisitie en data-analyses om het stress-ontspanningsgedrag van de varkenspijp te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Drexel University. Alle cadaverische dieren werden verkregen van een door het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) goedgekeurde boerderij in Pennsylvania, VS. Voor dit onderzoek werd een kadaver van een mannelijk Yorkshire varken (3 weken oud) gebruikt.
1. Weefseloogst
- Verkrijg een kadaver van een varken van een erkend bedrijf en voer de experimenten uit binnen 2 uur na euthanasie. Houd het kadaver op ijs totdat de weefseloogst is voltooid om ervoor te zorgen dat de biomechanische eigenschappen van vers weefsel behouden blijven.
OPMERKING: In de gepubliceerde literatuur wordt vers weefselonderzoek bij dieren gewoonlijk uitgevoerd binnen 2 uur na euthanasie. Zie voor nadere bijzonderheden de referenties 11,12,13,14,15,16,17,18,19. - Plaats het kadaver in rugligging, maak een verticale middenlijnincisie langs de nek en stel het schildklierkraakbeen, cricoid kraakbeen en luchtpijp bloot van het tongbeen naar de suprasternale inkeping.
- Oogst het strottenhoofd en de luchtpijp over de volledige lengte met een # 10-mes (figuur 1A).
- Scheid het luchtpijpmonster van het strottenhoofd en snijd vervolgens de tracheale buis langs de gehele lengte aan één kant met behulp van het # 10-blad (figuur 1B).
- Meet de dikte van de luchtpijp met behulp van het verkregen dwarsdoorsnedebeeld (verkregen met afbeeldingJ20, zie materiaaltabel) (figuur 1C). Gebruik de gemeten weefseldikte om het doorsnedegebied te berekenen tijdens de gegevensanalyse.
- Snijd de luchtpijp in twee omtrekstroken van ongeveer 5 mm breed (proximaal) en twee langsstroken van ongeveer 5 mm breed (distaal), waarbij de minimumlengte van deze stroken 25 mm is (figuur 1D).
- Verkrijg afbeeldingen van de vier monsters (d.w.z. gesneden luchtpijpstroken) naast een liniaal. Gebruik deze afbeeldingen om gedigitaliseerde metingen van de monsterbreedte te bieden met behulp van afbeelding J (figuur 1E). Gebruik vervolgens deze gemeten breedte om het dwarsdoorsnedegebied van het monster te berekenen tijdens de gegevensanalyse.
- Zorg ervoor dat alle weefselmonsters gedurende het hele onderzoek gehydrateerd worden gehouden met behulp van steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de monsters gehydrateerd in PBS-gedrenkt gaas totdat ze klaar zijn om te testen. Dompel het weefsel onder in PBS vlak voordat u test op een goede hydratatie.
2. Biomechanisch testen
- Bevestig elk monster aan een op maat ontworpen klem (zie de vorige rapporten 11,12,13,14,15,16,17,18,19) zodat het monster in de lengterichting tussen de klemmen wordt gehouden (figuur 1F).
- Bevestig de klemmen zorgvuldig (zonder enige rek te veroorzaken) aan een materiaaltestmachine (zie Materiaaltabel), die een 50 N-loadcel heeft die aan de bovenste actuator is bevestigd (figuur 1G).
- Meet de grip-to-grip (d.w.z. klem) afstand met behulp van een liniaal. Gebruik deze afstand als de initiële weefsellengte voor stamberekeningen.
- Voer de voorconditionering uit door elk monster vijf keer te trekken met een spanningssnelheid van 1% tot 1%.
- Houd elk monster op piekrek van 0% of 10% gedurende 300 s om de visco-elastische stress-ontspanningsrespons van het weefsel te onderzoeken.
- Na de stress-ontspanningstest, rekt u het weefsel onmiddellijk uit met 1% / s totdat mechanisch falen optreedt.
- Documenteer de storingslocatie en bevestig dat er geen slip is opgetreden door ervoor te zorgen dat monsters in de klemmen aanwezig zijn na het testen (figuur 1H).
3. Data-acquisitie
- Verkrijg geen gegevens tijdens de voorconditionering.
- Neem de stress-ontspannings- en faaltestvideo's op met een digitale camera met een minimum van 30 frames / s.
- Verkrijg tijd (s), belasting (N) en verplaatsing (mm) gegevens met behulp van een data-acquisitie software (zie Tabel van materialen) met een bemonsteringssnelheid van 250 monsters / s tijdens zowel stress-ontspanning als faaltests.
- Sla de verkregen gegevens op als een .csv bestand en gebruik deze voor gegevensanalyse zoals beschreven in stap 4.
- Verkrijg stilstaande beelden van het geklemde weefsel vóór stress-ontspanning, na stress-ontspanning en na falen (figuur 2).
4. Data-analyse
- Gegevensinvoer
- Download en installeer MATLAB-software voor gegevensanalyse (zie Materiaaltabel), inclusief de toolboxen "Optimalisatie" en "Beeldverwerking".
- Download de zipped folder (Supplementary Coding File 1), die de MATLAB-codes en een voorbeeldgegevensset bevat die zal worden gebruikt om de stappen voor gegevensanalyse uit te leggen.
- Navigeer naar de gedownloade gezipte map en pak de inhoud ervan uit.
- Open MATLAB en stel de uitgepakte map in als de werkmap. Zorg ervoor dat de werkmap de volgende mappen en bestanden heeft met het label zoals vermeld in de onderstaande opmerking. Zorg ervoor dat er geen extra mappen of bestanden aanwezig zijn in deze werkmap, omdat deze de code kunnen verstoren en tot een fout kunnen leiden.
OPMERKING: (1) Falen (na ontspanning), (2) Alleen falen, (3) Ontspanning, (4) calc_relax_failure, (5) main_relax_failure uur, (6) testenDatums.xlsx. - Navigeer naar de map Alleen mislukken .
OPMERKING: De gegevens in deze map zijn afgeleid van de controlegroep in deze studie, d.w.z. biomechanische gegevens van tracheale monsters die werden blootgesteld aan mechanisch falen na een rek van 0%. - Sla gegevens van voorbeelden die op een bepaalde datum zijn getest op in één Microsoft Excel-bestand met behulp van de volgende bestandsnaamconventie: mmddyy. Gegevens van alle tracheale monsters van de controlegroep die op 30 april 2022 zijn getest, moeten bijvoorbeeld worden opgeslagen in Failure Only | 043022.xlsx.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat in de huidige studie alle biomechanische tests op één dag zijn uitgevoerd; Als de gegevens echter zijn afgeleid van meerdere testdatums, maakt u een nieuw Microsoft Excel-bestand met de naam in de beschreven conventie voor elk van die testdatums. - Alleen open mislukt | 043022.xlsx en erken dat er meerdere werkbladtabbladen zijn, elk met de onbewerkte gegevens van elk monster dat op deze specifieke datum, d.w.z. 30 april 2022, mechanisch defect is.
- Zorg ervoor dat de monsters zijn gelabeld met behulp van de volgende conventie: [monstertype]_[monsternummer]_[pre-stretch stamniveau invoegen]%.
OPMERKING: In de huidige studie werden de tracheale monsters van de controlegroep bijvoorbeeld onderworpen aan mechanische faaltests onder axiale of circumferentiële belasting zonder voorafgaande spanningsversoepeling. Daarom worden deze monsters in het volgende formaat genoemd: respectievelijk TA_1_0% en TC_1_0%. De 0% duidt op geen pre-stretch. Tracheale monsters uit onze experimentele groep werden eerst gehouden bij vaste rek onder axiale of circumferentiële belasting van 10% om de visco-elastische stressontspanningsrespons te evalueren en vervolgens onderworpen aan mechanisch falen. Daarom worden deze monsters in het volgende formaat genoemd: TA_1_10% en TC_1_10% (zie stap 4.1.16 en stap 4.1.23, die respectievelijk de axiale en circumferentiële belastingsomstandigheden vertegenwoordigen). - Selecteer het werkbladtabblad TA_1_0%. Zorg ervoor dat de kolommen met onbewerkte gegevenskoppen precies zo zijn gelabeld als vetgedrukt in de onderstaande notitie.
OPMERKING: (1) Tijd (sec), (2) Belasting (N), (3) Positie (mm), (4) Diameters (mm) (stap 1.7), (5) Gemiddeld doorsnedegebied (Dikte x Breedte, mm2) (verkregen in stap 1.5 en stap 1.7), (6) Beginlengte (mm) (stap 2.3). - Sluit het huidige Microsoft Excel-bestand , Alleen mislukt | 043022.xlsx.
- Ga terug naar de werkmap van de data-analysesoftware.
- Navigeer naar de map Ontspanning.
OPMERKING: De gegevens in deze map zijn afgeleid van de experimentele groep in deze studie, d.w.z. biomechanische gegevens van tracheale monsters die werden onderworpen aan stressontspanningstests met een vaste rek van 10% gedurende 300 s. - Sla gegevens op van de experimentele groepsvoorbeelden die op een bepaalde datum zijn getest in één Microsoft Excel-bestand met behulp van de volgende labelconventie: mmddyy.
OPMERKING: Gegevens van alle experimentele groepstracheale monsters die op 30 april 2022 zijn getest, moeten bijvoorbeeld worden opgeslagen in ontspannings- | 043022.xlsx. Raadpleeg de opmerking in stap 4.1.6 voor meer informatie. - Open ontspannings- | 043022.xlsx en erken dat er meerdere werkbladtabbladen zijn, die elk de ruwe belastingrelaxatiegegevens bevatten van elk monster in de experimentele groep die op deze specifieke datum is getest, d.w.z. 30 april 2022.
- Pauzeer en merk op dat elk van de voorbeelden, zoals aangegeven door de werkbladtabbladen in dit Microsoft Excel-bestand, vervolgens werd onderworpen aan mechanische storingen onder mechanische belasting van treksterkte.
OPMERKING: De bijbehorende foutgegevens voor elk van de aanwezige voorbeelden moeten worden opgeslagen in de map Failure (Post-Relaxation), verder beschreven in stap 4.1.20. - Zorg ervoor dat de monsters zijn geëtiketteerd volgens de conventie die is beschreven in stap 4.1.8.
- Blader door elk werkbladtabblad in het huidige Microsoft Excel-bestand en raadpleeg stap 4.1.9 om ervoor te zorgen dat onbewerkte laadrelaxatiegegevens voor elk voorbeeld, aangegeven door een bepaald werkbladtabblad, correct zijn opgemaakt.
- Sla het huidige Microsoft Excel-bestand, ontspannings- | op en sluit het 043022.xlsx.
- Ga terug naar de werkmap van de data-analysesoftware.
- Navigeer naar de map Failure (Post-Relaxation).
- Zorg ervoor dat er een Microsoft Excel-bestand(en) is met dezelfde datum(s) (zie stap 4.1.6 voor meer informatie over het benoemen van de Microsoft Excel-bestanden die overeenkomen met elke testdatum) als die in de map Ontspanning.
OPMERKING: Gegevens in de huidige map, Failure (Post-Relaxation) zijn de overeenkomstige ruwe mechanische storingsgegevens van tracheale monsters die worden onderworpen aan stressontspanningstests met een vaste rek van 10% gedurende 300 s. - Open Failure (Post-Ontspanning) | 043022.xlsx en herken meerdere werkbladtabbladen, die elk ruwe mechanische storingsgegevens bevatten van dezelfde voorbeelden die aanwezig zijn in Ontspanning | 043022.xlsx.
- Zorg ervoor dat de monsters zijn geëtiketteerd met behulp van de conventie die wordt vermeld in stap 4.1.8 en dat de labels overeenkomen met die in Ontspanning | 043022.xlsx.
OPMERKING: De gegevens in het huidige Microsoft Excel-bestand voor TA_1_10% vertegenwoordigen bijvoorbeeld ruwe mechanische storingsgegevens voor tracheale specimen # 1 onder axiale belasting die eerder stressontspanningstests onderging bij 10% vaste rek gedurende 300 s. - Blader door elk werkbladtabblad en raadpleeg stap 4.1.9 om ervoor te zorgen dat de kopkolom voor de onbewerkte mechanische foutgegevens voor elk voorbeeld correct is opgemaakt.
- Sluit het huidige Microsoft Excel-bestand , Failure (Post Relaxation) | 043022.xlsx.
- Ga terug naar de werkmap van de data-analysesoftware.
- Herhaal stap 4.1.5-4.1.26 voor aanvullende testdata, indien van toepassing.
- Open het Microsoft Excel-bestand testingDates.xlsx, waarmee de code wordt gebruikt om door de gebruiker opgegeven testdatums te analyseren.
- Vermeld testdatums in de eerste kolom in de volgende notatie: mm/dd/jj.
- Geef in de tweede kolom met behulp van een Y (voor ja) of N (voor nee) aan of monsters op deze specifieke testdatum afkomstig waren uit de experimentele groep (stressrelaxatie gevolgd door mechanisch falen).
- Geef in de derde kolom met behulp van een Y (voor ja) of N (voor nee) aan of monsters op deze specifieke testdatum afkomstig waren uit de controlegroep (direct mechanisch falen).
- Herhaal stap 4.1.29-4.1.31 voor aanvullende testdata.
- Sla het huidige Microsoft Excel-bestand op en sluit het, testingDates.xlsx.
- Ga terug naar de werkmap van de data-analysesoftware.
- Open het hoofdscriptbestand main_relax_failure.m.
- Selecteer de grote, groene pijl op de software-interface om de code uit te voeren. U kunt ook uitvoeren main_calc_relax typen in het opdrachtvenster.
- Wanneer daarom wordt gevraagd, voert u de door komma's gescheiden vaste rekniveaus (in %) in voor de verschillende experimentele groepen en drukt u op OK.
OPMERKING: In de huidige studie werd slechts één stressontspanningsverlenging gebruikt, d.w.z. enter 10. Neem geen 0% op voor de controlegroep. Als gegevens echter zijn afgeleid van meerdere verlengingen, bijvoorbeeld 10% en 20%, voer dan 10,20 in. - Wanneer u hierom wordt gevraagd, voert u de duur van de door komma's gescheiden stress-ontspanningstests in (in seconden) voor de verschillende experimentele groepen en drukt u op OK.
OPMERKING: In de huidige studie werden tracheale monsters gehouden met een vaste rek gedurende 300 s en dus input 300. Als gegevens echter zijn afgeleid van meerdere stressontspanningsduur, bijvoorbeeld 90 s en 300 s, voer dan 90.300 in.
- Visco-elastische stressontspanningsreactie
- Converteer met behulp van de code (main_relax_failure.m) belastingstijdgegevens (coderegel 144) naar nominale spanningstijdgegevens met behulp van de volgende vergelijking19:
, waarbij σ staat voor spanning (mega Pascals [MPa]), F staat voor omtrek- of axiale belasting (Newton [N]) en A0 voor het initiële dwarsdoorsnedegebied (millimeters in het kwadraat [mm2]). - Bepaal met behulp van de code (main_relax_failure.m) de piekbelasting en spanningsgrootheden (coderegels 138 en 146) als reactie op de toepassing van de 10% vaste rek op het monster aan het begin van de 300 s ontspanningstest.
OPMERKING: Deze waarden worden hierna respectievelijk de initiële piekbelasting en de initiële piekspanning genoemd. - Bereken met behulp van de code (main_relax_failure.m) de procentuele vermindering van stress (of belasting) bij 300 s (coderegels 141 en 149) met behulp van de volgende vergelijking:
, waarbij Rel% het ontspanningspercentage vertegenwoordigt, σ (0+) de initiële piekspanning (of initiële piekbelasting) vertegenwoordigt en σ(300) het geregistreerde stressniveau (of belasting) na ontspanning boven 300 s. - Raadpleeg de code (main_relax_failure.m) voor het modelleren van de visco-elastische stressrelaxatierespons (coderegels 152-161) met behulp van een exponentieel vervalmodel van de Prony-serie met twee termijnen. Dit model wordt vaak gebruikt om het visco-elastische gedrag van verschillende biologische weefsels te beschrijven, waaronder verschillende kraakbeenachtige luchtwegniveaus (luchtpijp, grote bronchiën en kleine bronchiën)21,22.
OPMERKING: Berekende spanningswaarden [σ(t)] worden genormaliseerd om de volgende verminderde ontspanningsfunctie te produceren:
en G(0) = 1. Om visco-elastische stress-relaxatiereacties te vergelijken, is G(t) curve-fitted met behulp van niet-lineaire kleinste-kwadraten regressie als volgt: 
, waarbij t de tijd is tijdens stressontspanning, g is de relaxatiecoëfficiënt, τ1 en τ2 en geeft de ontspanningstijden (in seconden) aan die respectievelijk het korte- (initiële) en lange termijn (evenwicht) gedrag van het weefsel beschrijven.
- Converteer met behulp van de code (main_relax_failure.m) belastingstijdgegevens (coderegel 144) naar nominale spanningstijdgegevens met behulp van de volgende vergelijking19:
- Reactie op mechanische storingen
- Gebruik code (main_relax_failure.m) om de door de trekproefmachine geregistreerde gegevens over de verplaatsing van de belasting (coderegels 143-144) om te zetten in gegevens over nominale spanningsspanning met behulp van de vergelijkingen die in de onderstaande opmerking worden vermeld.
OPMERKING:, waarbij σ staat voor nominale spanning (MPa), F voor omtrek- of axiale belasting (N) en A0 voor het initiële dwarsdoorsnedegebied (mm2); 
, waar 
staat voor resulterende spanning, ΔL voor verplaatsing en L0 voor de beginlengte van het monster. Voor monsters die worden onderworpen aan faaltrektests na stressontspanning, vertegenwoordigt L0 de vooraf uitgerekte lengte van het weefsel. Monster 3 (initiële lengte van 8 mm) werd bijvoorbeeld vooraf uitgerekt tot 10%, en daarom werd L0 beschouwd als 8,8 mm voor het berekenen van de resulterende rekwaarden19. - Gebruik de functie (calc_relax_failure.m) om de maximale belasting (d.w.z. storingsbelasting) en de bijbehorende storingsverplaatsing te identificeren, evenals de maximale spanning (d.w.z. faalspanning) en de bijbehorende faalspanning (coderegels 33 en 61-63).
- Gebruik de functie (calc_relax_failure.m) om de gegevens over de verplaatsing van de belasting na de storingsbelasting te verwijderen (regel 34).
- Gebruik de functie (calc_relax_failure.m) om de belastingsverplaatsingscurve uit te zetten en selecteer, wanneer daarom wordt gevraagd, handmatig twee punten in het lineaire gebied van de curve om de weefselstijfheid (N/mm) te benaderen (coderegels 37-58).
OPMERKING: Aangezien de belastingsverplaatsingscurve wordt genormaliseerd door het doorsnedegebied en de initiële lengte van het monster om de spannings-rekcurve op te leveren, gebruikt de code de door de gebruiker geselecteerde x- en y-coördinaten van de belastingsverplaatsingscurve om de elasticiteitsmodulus (MPa) te berekenen met behulp van de volgende vergelijking19:
, waarbij E de elasticiteitsmodulus vertegenwoordigt, x en y de geselecteerde coördinaten op de belastingsverplaatsingscurve vertegenwoordigen; Een0 vertegenwoordigt het dwarsdoorsnedegebied, L0 vertegenwoordigt de lengte van het monster aan het begin van mechanisch falen en Δσ en Δ vertegenwoordigen respectievelijk de verandering in spanning en spanning over het lineaire gebied van de storingsrespons. - Herhaal stap 4.3.4 voor elk monster.
- Gebruik code (main_relax_failure.m) om de door de trekproefmachine geregistreerde gegevens over de verplaatsing van de belasting (coderegels 143-144) om te zetten in gegevens over nominale spanningsspanning met behulp van de vergelijkingen die in de onderstaande opmerking worden vermeld.
- Gegevensuitvoer
- Zodra de code met succes is uitgevoerd, moet u ervoor zorgen dat de berekende resultaten beschikbaar zijn in de werkmap van de gegevensanalysesoftware als een Microsoft Excel-bestand in de volgende naamgevingsconventie: relax_failure_results_mmddyy.xlsx, waarbij mmddyy wordt vervangen door de datum waarop de code is uitgevoerd.
, waarbij σ staat voor spanning (mega Pascals [MPa]), F staat voor omtrek- of axiale belasting (Newton [N]) en A0 voor het initiële dwarsdoorsnedegebied (millimeters in het kwadraat [mm2]).
, waarbij Rel% het ontspanningspercentage vertegenwoordigt, σ (0+) de initiële piekspanning (of initiële piekbelasting) vertegenwoordigt en σ(300) het geregistreerde stressniveau (of belasting) na ontspanning boven 300 s.
en G(0) = 1. Om visco-elastische stress-relaxatiereacties te vergelijken, is G(t) curve-fitted met behulp van niet-lineaire kleinste-kwadraten regressie als volgt: 
, waarbij t de tijd is tijdens stressontspanning, g is de relaxatiecoëfficiënt, τ1 en τ2 en geeft de ontspanningstijden (in seconden) aan die respectievelijk het korte- (initiële) en lange termijn (evenwicht) gedrag van het weefsel beschrijven.
, waar 
staat voor resulterende spanning, ΔL voor verplaatsing en L0 voor de beginlengte van het monster. Voor monsters die worden onderworpen aan faaltrektests na stressontspanning, vertegenwoordigt L0 de vooraf uitgerekte lengte van het weefsel. Monster 3 (initiële lengte van 8 mm) werd bijvoorbeeld vooraf uitgerekt tot 10%, en daarom werd L0 beschouwd als 8,8 mm voor het berekenen van de resulterende rekwaarden19.
, waarbij E de elasticiteitsmodulus vertegenwoordigt, x en y de geselecteerde coördinaten op de belastingsverplaatsingscurve vertegenwoordigen; Een0 vertegenwoordigt het dwarsdoorsnedegebied, L0 vertegenwoordigt de lengte van het monster aan het begin van mechanisch falen en Δσ en ΔSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het defecte weefsel in de buurt van de klemplaats en de aanwezigheid van weefsel in de klem, wat bevestigt dat er geen slip is tijdens trekproeven. Figuur 2 geeft verschillende faalplaatsen aan, waaronder de bovenste of onderste klemplaatsen of langs de lengte van het weefsel, die werden waargenomen tijdens trekproeven tussen de geteste monsters. De resultaten van de gegevensanalyse zijn samengevat in de figuren 3-4 en 1-2. Stressontspanningsreacties voor tracheale monsters na axiale of circumferentiële pre-stretch tot 10% spanning zijn weergegeven in figuur 3. De initiële piekbelasting en stress, de procentuele vermindering van stress over de 300 s hold en tijdconstanten, t1 en t2, in een 2-term Prony-serie ontspanningsfunctie werden berekend uit deze ontspanningscurves. Deze visco-elastische parameters zijn opgenomen in tabel 1. De stress-rekresponsen van het tracheale monster dat wordt onderworpen aan faaltests onder axiale of omtrekbelastingen na geen pre-stretch of 10% pre-stretch zijn weergegeven in figuur 4. Uit deze curven werden faalspanning en de bijbehorende faalspanning, evenals de elasticiteitsmodulus, bepaald en zijn opgenomen in tabel 2.
De voorlopige tests hebben met succes de stress-ontspanningsreacties van het tracheale weefsel gekarakteriseerd. In deze eerste experimenten meldde de 10% pre-stretch stress-relaxatierespons dat de initiële piekspanning hoger was in axiale laadrichtingen, terwijl de procentuele vermindering van stress hoger was in de omtrekrichting in vergelijking met de axiale laadrichting (tabel 1). De relaxatietijden (τ1 en τ2 die het korte- [initiële] en lange termijn [evenwicht] gedrag van het weefsel beschrijven) waren ook hoger in de axiale belastingsrichting in vergelijking met de omtrekrichting voor dezelfde 10% pre-stretchgroep. Bij het vergelijken van de storingsgegevens waren de faalspannings- en E-waarden hoger in omtrekrichtingen in zowel de 0% als de 10% pre-stretchgroepen, terwijl de faalspanning gerapporteerd in de axiale belastingsrichtingen hoger was (tabel 2). Deze voorlopige bevindingen rechtvaardigen aanvullende experimenten om de stress-ontspannings- en faalreacties in tracheaal weefsel verder te karakteriseren om de stress-ontspanningsreacties in trekbelastingsomstandigheden beter te begrijpen, zowel axiaal als omtrekig. De stappen die in dit protocol worden beschreven, kunnen helpen dit doel te bereiken.
Figuur 1: Details van het oogsten van weefsels en mechanische tests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Storingssites. Voorbeeld van storingslocaties zoals aangegeven door gele pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stressontspanningsrespons over een 300 s ruim van luchtpijpmonsters die vooraf zijn uitgerekt tot 10% spanning. (A) Axiale of (B) omtrekbelasting (n = 1 per belastingsconditie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stress-rekreacties voor het testen van storingen van luchtpijpmonsters onder axiale of omtrekbelasting na geen pre-stretch of 10% pre-stretch (n = 1 per belastingsconditie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Monster | Pre-stretch stam | Laadrichting | Initiële piekbelasting (N) | Initiële piekspanning (MPa) | % Vermindering van stress | τ1 (s) | τ2 (s) | Gecorrigeerde R2 (%) | |
| 3 | 10% | Axiale | 0.56 | 0.089 | 33.93 | 11.59 | 152.44 | 98.79 | |
| 4 | Omtrek | 0.26 | 0.057 | 42.31 | 1.58 | 14.86 | 99.08 | ||
Tabel 1: Gemeten en berekende spanningsrelaxatieparameterwaarden voor luchtpijpmonsters die worden onderworpen aan een pre-stretch van 10% belasting om gedurende 300 s stressontspanning te ondergaan.
| Monster | Pre-stretch stam | Laadrichting | Faalstress (MPa) | Faal spanning | Elasticiteitsmodulus (MPa) |
| 3 | 10% | Axiale | 0.89 | 0.38 | 2.9 |
| 4 | Omtrek | 1.78 | 0.51 | 3.74 | |
| 5 | 0% (alleen storing) | Axiale | 1.02 | 0.86 | 2.3 |
| 6 | Omtrek | 2.15 | 0.57 | 6.3 |
Tabel 2: Faalreacties van luchtpijpmonsters onder verschillende experimentele groepen.
Aanvullend coderingsbestand 1: De aangepaste codes om het stress-ontspanningsgedrag van de luchtpijp te bestuderen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zeer weinig studies hebben de stress-relaxatie-eigenschappen van de luchtpijpgemeld 21,23. Studies zijn nodig om ons begrip van de tijdsafhankelijke reacties van het tracheale weefsel verder te versterken. Deze studie biedt gedetailleerde stappen om dergelijke onderzoeken uit te voeren; voor betrouwbare tests moeten echter de volgende kritische stappen binnen het protocol worden gewaarborgd: (1) een goede weefselhydratatie, (2) vergelijkbare weefseltypeverdeling (aantal kraakbeenachtige ringen en spieren) in omtrek- en longitudinale monsters, (3) klemmen van het monster zonder voorrek, (4) het gebruik van de dikte en breedte van het monster om het dwarsdoorsnedegebied te schatten dat wordt gebruikt om de weefselspanning tijdens biomechanische trekproeven te berekenen; (5) het weefselmonster goed klemmen, 6) de meetlengte van het geklemde monster gebruiken om de reksnelheid van 1%/s in te voeren voor trekproeven, en (7) bevestigen dat er geen slip is met de aanwezigheid van weefsel in de klem na het testen. Bovendien kan het voor probleemoplossing nodig zijn dat de software voor gegevensverzameling opnieuw wordt opgestart om de communicatie met de controller van het testapparaat te herstellen.
De huidige studie biedt ook gedetailleerde beschrijvingen van de testmethoden, gegevensanalyses en de aangepaste MATLAB-codes (Supplementary Coding File 1) die zijn gemaakt om het stress-ontspanningsgedrag van de luchtpijp te bestuderen. Geen enkele eerdere studie levert dergelijke uitgebreide informatie op. Bovendien kunnen de methoden die in de huidige studie worden beschreven op educatief gebied gemakkelijk worden geïntegreerd als een onderwijsmodule voor stress-ontspanningslaboratoria in technische cursussen in zowel traditionele als virtual reality-formaten 24,25,26,27.
Momenteel beschikbare stress-ontspanningsstudies op de luchtpijp en ander zacht weefsel passen in de ontspanningsfunctie van een twee-termijn Prony-serie 28,29,30. De huidige studie maakt ook gebruik van deze functie; toekomstige studies zouden hun onderzoek echter kunnen uitbreiden door quasi-lineaire visco-elastische modelleringstechnieken te gebruiken om visco-elastisch gedrag te karakteriseren. Dergelijke studies zullen niet alleen helpen bij het creëren van een robuust voorspellend computationeel model van luchtwegbiomechanica, maar ook helpen bij het ontwerpen van implantaten zoals luchtwegstents die weefselmateriaaleigenschappen vereisen voor prestatietests.
Ten slotte kunnen de in deze studie beschreven methoden niet alleen worden gebruikt om de effecten van leeftijd en soorten op het stress-ontspanningsgedrag van de luchtpijp te beoordelen, maar kunnen ze ook worden toegepast op ander zacht en hard weefsel zoals ligamenten, tussenwervelschijven en botten. Dergelijke visco-elastische gegevens kunnen worden geïntegreerd om bestaande high-fidelity eindige element computationele modellen te verbeteren 31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health onder awardnummer R15HD093024 en de National Science Foundation CAREER Award Number 1752513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable safety scalpels | Fine Science Tools Inc | 10000-10 | |
| eXpert 7600 | ADMET Inc. | N/A | Norwood, MA |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Gauge Safe | ADMET Inc. | N/A | Free Download |
| Image J | NIH | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Sterile phosphate buffer solution | Millipore, Thomas Scientific | MFCD00131855 |
References
- Brand-Saberi, B. E. M., Schäfer, T.
- Barnett, S. B., Nurmagambetov, T. A. Costs of asthma in the United States: 2002-2007. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (1), 145-152 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/index.html (2022).
- Wilson, L., Devine, E. B., So, K. Direct medical costs of chronic obstructive pulmonary disease: chronic bronchitis and emphysema). Respiratory Medicine. 94 (3), 204-213 (2000).
- Codd, S. L., Lambert, R. K., Alley, M. R., Pack, R. J. Tensile stiffness of ovine tracheal wall. Journal of Applied Physiology. 76 (6), 2627-2635 (1994).
- Noble, P. B., Sharma, A., McFawn, P. K., Mitchell, H. W. Elastic properties of the bronchial mucosa: epithelial unfolding and stretch in response to airway inflation. Journal of Applied Physiology. 99 (6), 2061-2066 (2005).
- Teng, Z., et al. Anisotropic material behaviours of soft tissues in human trachea: An experimental study. Journal of Biomechanics. 45 (9), 1717-1723 (2012).
- Wang, L., et al. Mechanical properties of the tracheal mucosal membrane in the rabbit. I. steady-state stiffness as a function of age. Journal of Applied Physiology. 88 (3), 1014-1021 (2000).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59 (4), 863-883 (2011).
- Bai, T. R., Knight, D. A. Structural changes in the airways in asthma: Observations and consequences. Clinical Science. 108 (6), 463-477 (2005).
- Singh, A. Extent of impaired axoplasmic transport and neurofilament compaction in traumatically injured axon at various strains and strain rates. Brain Injury. 31 (10), 1387-1395 (2017).
- Singh, A., Kallakuri, S., Chen, C., Cavanaugh, J. M. Structural and functional changes in nerve roots due to tension at various strains and strain rates: An in-vivo study. Journal of Neurotrauma. 26 (4), 627-640 (2009).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Cavanaugh, J. M. Mechanical properties of spinal nerve roots subjected to tension at different strain rates. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1669-1676 (2006).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Kallakuri, S., Cavanaugh, J. M. A new model of traumatic axonal injury to determine the effects of strain and displacement rates. Stapp Car Crash Journal. 50, 601-623 (2006).
- Singh, A., Magee, R., Balasubramanian, S. Methods for in vivo biomechanical testing on brachial plexus in neonatal piglets. Journal of Visualized Experiments. (154), e59860 (2019).
- Singh, A., Magee, R., Balasubramanian, S. Mechanical properties of cervical spinal cord in neonatal piglet: in vitro. Neurology and Neurobiology. 3 (2), (2020).
- Singh, A., Magee, R., Balasubramanian, S. An in vitro study to investigate biomechanical responses of peripheral nerves in hypoxic neonatal piglets. Journal of Biomechanical Engineering. 143 (11), 114501 (2021).
- Singh, A., Shaji, S., Delivoria-Papadopoulos, M., Balasubramanian, S. Biomechanical responses of neonatal brachial plexus to mechanical stretch. Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury. 13, 8-14 (2018).
- Singh, A. The effects of tensile loading on mechanical, neurophysiological and morphological changes in spinal nerve roots. , Wayne State University. PhD thesis (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Eskandari, M., Arvayo, A. L., Levenston, M. E. Mechanical properties of the airway tree: Heterogeneous and anisotropic pseudoelastic and viscoelastic tissue responses. Journal of Applied Physiology. 125 (3), 878-888 (2018).
- Toby, E. B., Rotramel, J., Jayaraman, G., Struthers, A. Changes in the stress relaxation properties of peripheral nerves after transection. Journal of Hand Surgery. 24 (4), 694-699 (1999).
- Safshekan, F., Tafazzoli-Shadpour, M., Abdouss, M., Shadmehr, M. B. Viscoelastic properties of human tracheal tissues. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (1), (2017).
- Singh, A. A new approach to teaching biomechanics through active, adaptive, and experiential learning. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (7), 0710011-0710017 (2017).
- Singh, A., Ferry, D., Balasubramanian, S. Efficacy of clinical simulation based training in biomedical engineering education. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (12), 121011-121017 (2019).
- Singh, A., Ferry, D., Mills, S. Improving biomedical engineering education through continuity in adaptive, experiential, and interdisciplinary learning environments. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (8), 0810091-0810098 (2018).
- Singh, A., Ferry, D., Ramakrishnan, A., Balasubramanian, S. Using virtual reality in biomedical engineering education. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (11), 111013 (2020).
- Majmudar, T., Balasubramanian, S., Magee, R., Gonik, B., Singh, A. In-vitro stress relaxation response of neonatal peripheral nerves. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 110702 (2021).
- Orozco, V., Magee, R., Balasubramanian, S., Singh, A. A systematic review of the tensile biomechanical properties of the neonatal brachial plexus. Journal of Biomechanical Engineering. 143 (11), 110802 (2021).
- Singh, A. M. T., Magee, R., Gonik, B., Balasubramanian, S. Effects of pre-stretch on neonatal peripheral nerve: An in-vitro study. Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury. 17 (1), 1-9 (2022).
- Balasubramanian, S., D'Andrea, C., Viraraghavan, G., Cahill, P. J. Development of a finite element model of the pediatric thoracic and lumbar spine, ribcage, and pelvis with orthotropic region-specific vertebral growth. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (10), 101007 (2022).
- Hadagali, P., Peters, J. R., Balasubramanian, S. Morphing the feature-based multi-blocks of normative/healthy vertebral geometries to scoliosis vertebral geometries: Development of personalized finite element models. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 21 (4), 297-324 (2018).
- Singh, A. Available computational and physical models to understand the mechanisms of neonatal brachial plexus injury during shoulder dystocia. Open Access Journal of Neurology and Neurosurgery. 9 (4), 555768 (2019).
