Summary
Syngene museortotopiske allotransplantater av pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC) rekapitulerer biologi, fenotyper og terapeutiske responser av sykdomssubtyper. På grunn av deres raske, reproduserbare tumorprogresjon, er de mye brukt i prekliniske studier. Her viser vi vanlig praksis for å generere disse modellene, injisere syngene murine PDAC-kulturer i bukspyttkjertelen.
Abstract
Pankreatisk duktalt adenokarsinom (PDAC) er en svært kompleks sykdom preget av et heterogent tumormikromiljø som består av et mangfoldig stroma, immunceller, kar, nerver og ekstracellulære matrikskomponenter. Gjennom årene har forskjellige musemodeller av PDAC blitt utviklet for å takle utfordringene som følge av progresjon, metastatisk potensial og fenotypisk heterogenitet. Immunkompetente ortotopiske allotransplantater fra mus av PDAC har vist godt løfte på grunn av deres raske og reproduserbare tumorprogresjon sammenlignet med genetisk konstruerte musemodeller. Dessuten, kombinert med deres evne til å etterligne de biologiske egenskapene observert i autochthonous PDAC, muliggjør cellelinjebaserte ortotopiske allograftmusemodeller storskala in vivo-eksperimenter . Dermed er disse modellene mye brukt i prekliniske studier for raske genotype-fenotype- og legemiddelresponsanalyser. Målet med denne protokollen er å gi en reproduserbar og robust tilnærming for å kunne injisere primære PDAC-cellekulturer fra mus i bukspyttkjertelen hos syngene mottakermus. I tillegg til de tekniske detaljene er det gitt viktig informasjon som må vurderes før du utfører disse forsøkene.
Introduction
Nylig ble PDAC den tredje største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i den vestlige verden1. Det forårsaker den høyeste dødeligheten blant alle kreftformer og en 10 års total overlevelse på ~ 1%, som ikke har endret seg i flere tiår2. På grunn av manglende fremgang i PDAC-behandling, forventes denne sykdommen å bli den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall innen det neste tiåret3.
PDAC-svulster er komplekse enheter preget av et mangfoldig tumormikromiljø (TME) sammensatt av en heterogen samling av stroma-, vaskulære, immun- og ekstracellulære matrikskomponenter4. Forskjeller i sammensetningen av TME påvirker sykdomsprognose og respons på terapi 4,5,6. Faktisk har mange studier vist at den basallignende, mesenkymale subtypen av PDAC er assosiert med en svært immunsuppressiv TME og viser redusert overlevelse og mangel på respons på terapier 7,8,9,10,11,12. Derfor er en dypere forståelse av forskjellene i TME-sammensetning og hvordan disse funksjonene påvirker tumorbiologi fortsatt en viktig faktor for utviklingen av molekylært presise terapier. For bedre å forstå biologien bak denne komplekse fenotypen og identifisere terapeutiske strategier som er i stand til å overvinne barrieren som TME av PDAC utgjør, er in vivo-modeller uunnværlige.
Et sentralt aspekt for ethvert kreftpreklinisk modellsystem er at det skal etterligne menneskelige fenotyper, rekapitulere både den genetiske heterogeniteten og miljøet som omfatter mangfoldet av stromale og immunpopulasjoner som utgjør TME. Derfor, når du velger musemodeller for preklinisk forskning, må flere aspekter tas i betraktning. For å undersøke tumor-immuninteraksjonen kan histokompatible kreftcellelinjer injiseres i syngene immunkompetente mus. I de fleste tilfeller injiseres disse subkutant i musens flanke, noe som muliggjør enkel tumorovervåking ved palpasjon eller visuell inspeksjon. Imidlertid etterligner de resulterende modellene ikke veksten av tumorceller i deres opprinnelsesorgan. Derfor ble ortotopiske transplantasjoner gullstandarden for allograftmodeller.
Ortotopiske allotransplantater fra mus har flere fordeler: de er kostnadseffektive, kan genereres med en relativt enkel prosedyre, og resulterer i modeller med kjent molekylær sammensetning, samt en reproduserbar og forutsigbar tumorprogresjon og fenotype. Faktisk, mens pasientavledede xenograftmodeller representerer oppførselen til humane PDAC-celler nøyaktig, begrenser behovet for implantasjon i immundefekte mus for å unngå transplantatavstøtning analysen av tumorimmun- og tumor-stroma-interaksjonene, slik at forskere bare kan fange et delvis bilde av kompleksiteten til disse svulstene. Syngene ortotopiske allotransplantater av PDAC har en fordel i denne forbindelse også i forhold til genetisk konstruerte musemodeller (GEMM). GEMM rekapitulerer nøyaktig human PDAC-tumorigenese og heterogeniteten observert hos PDAC-pasienter. På grunn av disse funksjonene kan GEMM-svulster imidlertid vise høy varians i deres genetiske sminke, tumorprogresjon, aggressivitet, histologisk differensiering og TME-sammensetning. Selv om dette kan være en fordel i visse studier, begrenser det genotype-til-fenotypestudier og fokusert undersøkelse av PDAC-fenotyper13. Derfor utgjør ortotopiske allotransplantater fra mus en god avveining og modell for å utføre tumorvert- og behandlingsstudier in vivo. Dette papiret skisserer en protokoll for ortotopiske transplantasjonseksperimenter av murine PDAC-celler i musens bukspyttkjertel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøkene ble godkjent av institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteer (IACUC) i de lokale myndighetene ved det tekniske universitetet i München og Regierung von Oberbayern.
1. Informasjon som skal vurderes før prosedyren
- Sikre godkjenning av dyreprotokollen og personell av lokale myndigheter før du starter dyreforsøk.
- Velg mottakermus.
- Velg mus i samme alder for implantasjon (C57Bl/6J mottakermus med et aldersspenn mellom 2 måneder og 4 måneder).
- Sikre at resipientdyrenes kjønn og genetiske bakgrunn stemmer overens med kjønn og genetisk bakgrunn hos dyrene som cellelinjen som ble brukt til implantasjon stammer fra (syngene allotransplantater).
- Forbered musene for implantasjon.
MERK: Håndter musene i henhold til de hygieniske standardene til den lokale dyreavdelingen.- På implantasjonsdagen må du ikke mate musene 4 timer før prosedyren for å unngå komplikasjoner på grunn av administrering av anestetika.
- Vei musene før implantasjon for å beregne mengden av nødvendige anestetika.
- Overfør musene til operasjonsrommet.
- Velg PDAC-cellelinjene.
- Forsikre deg om at den genetiske bakgrunnen og kjønnet til musene som cellelinjene er avledet fra, samsvarer med bakgrunnen og kjønnet til mottakermusene (f.eks. PDAC-cellelinjene PDAC 1-3 tidligere generert fra PDAC GEMMs på en C57Bl / 6J-bakgrunn i laboratoriet med følgende genotyper, som beskrevet tidligere14: PDAC 1 og 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Velg cellelinjene som ikke uttrykker proteiner som er potensielt immunogene.
- Dyrkning av PDAC-cellelinjene.
MERK: Utfør cellekulturarbeidet under en laminær strømningshette. Desinfiser hansker, arbeidsplass og materialer før du arbeider.- Tine cellene 1 uke før implantasjon ved å resuspendere pelleten i 5 ml cellekulturmedium. Spinn ned cellene, aspirer supernatanten, resuspender pelleten i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS), og spinn ned cellene igjen. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 5 ml av Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 0,1% penicillin-streptomycin (PS). Overfør cellesuspensjonen til en 25 cm² kolbe.
- Pass cellelinjene minst en gang før implantasjon.
- Fjern cellemediet, vask 1x med PBS, og tilsett 0,5 ml trypsin for å løsne cellene fra kolben. Inkuber cellene ved 37 °C til de løsner fra kolben (avhengig av cellelinjen tar dette vanligvis 5-10 min). Når cellene er løsrevet, resuspendere cellene i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overføre cellesuspensjonen til en 75 cm² kolbe.
MERK: Som FBS inaktiverer trypsin, ville det hindre trypsinisering.
- Fjern cellemediet, vask 1x med PBS, og tilsett 0,5 ml trypsin for å løsne cellene fra kolben. Inkuber cellene ved 37 °C til de løsner fra kolben (avhengig av cellelinjen tar dette vanligvis 5-10 min). Når cellene er løsrevet, resuspendere cellene i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overføre cellesuspensjonen til en 75 cm² kolbe.
- Sørg for sammenløp på ~ 70% -80% på implantasjonsdagen.
- Materiale som trengs for implantasjon
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter.
- Hold bedøvelsen klar basert på dyreforsøkslisensen.
- Bruk meloksikam for smertestillende minst 5 minutter på forhånd som et langvarig smertestillende middel med antiinflammatoriske egenskaper.
- For kirurgi, bruk en kombinasjon av midazolam, medetomidin og fentanyl (MMF) for analgosedasjon.
- Bruk en kombinasjon av atipamezol, flumazenil og nalokson (AFN) for å motvirke MMF-analgosedasjonen etter implantasjon.
- Forbered en steril drapering, en varmematte, en barbermaskin, hansker, øyekrem, 0,9% natriumklorid, jod eller klorhexidinbasert kirurgisk skrubb, 80% etanol, løselig sutur, sårklemmer, en 50 μL injeksjonsvolumsprøyte og tape.
2. Klargjøring av cellelinjene før implantasjon
MERK: Forbered tumorcellene bare når musene er klare for implantasjon. Sørg for en kort tidsramme mellom høsting eller innsamling av celler og implantasjon.
- Varm alle væskene til 37 °C før bruk.
- Forbered cellene (fra 1x T75 (en 75 cm 2 dyrkningskolbe) som beskrevet i trinn 1.5.2.1 til de løsner fra kolben. Resuspender cellene i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør.
- Spinn ned cellene ved 200 × g i 5 minutter i en sentrifuge. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i et tilstrekkelig volum DMEM uten tilsetningsstoffer basert på den nødvendige endelige konsentrasjonen av cellene for injeksjon. Bruk 10 μL av cellesuspensjonen til å telle cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer og beregne antall tilgjengelige celler.
- Fortynn cellene til det endelige nødvendige antall celler for injeksjon (f.eks. 2.500 celler i 20 μL) i DMEM uten tilsetningsstoffer. Overfør 1 ml av den fortynnede cellesuspensjonen til en 1,5 ml slange. Plasser røret på en rotator til implantasjon for å forhindre at cellene aggregerer.
3. Ortotopisk implantasjon av PDAC-celler
MERK: Ved utilstrekkelig kirurgisk erfaring, øv deg med først og få tilstrekkelig opplæring, for eksempel innenfor en treningsprotokoll for dyr. Personellet som utfører operasjonen og dyreforsøkene må oppfylle kriteriene til de respektive myndighetene og institusjonens retningslinjer.
- Bruk meloksikam som et perioperativt analgetikum og påfør 5 mg / kg kroppsvekt subkutant.
- MMF injiseres intraperitonealt i henhold til kroppsvekten til hver mus (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidin [0,5 mg/kg] og fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Sett musen tilbake i buret i 10-15 min.
- Påfør øyekrem når musen sover.
- Sjekk tilstrekkelig analgosedasjon etter 10 min ved å teste pedaluttaksrefleksen (klem på fotputene på begge bakføttene). Ved respons, bruk 1/3 av den opprinnelige dosen av analgosedasjon. Etter 10 min, gjenta prosedyren og fortsett bare i fravær av en pedaluttaksrefleks.
- Barber musens venstre laterale bukflanke. Plasser musen som ligger på høyre side på en steril varmematte og tape bena til overflaten. Desinfiser magen ved hjelp av en jod- eller klorhexidinbasert kirurgisk skrubb etterfulgt av 80% etanol i en sirkulær bevegelse og gjenta prosedyren tre ganger. For å opprettholde steriliteten i det kirurgiske feltet, bruk en kirurgisk drapering.
- Bruk nye hansker og desinfiser dem. Bruk kirurgisk saks til å kutte huden og subkutant fettvev i lengderetningen på venstre flanke der milten projiseres. Utfør et kutt på ca 1 cm i lengde.
- Bruk saks og tang, skille huden fra bukhinnen for å få lettere tilgang til bukhinnen.
- Bytt sakspar. Åpne bukhinnen på miltens sted med en 1 cm langsgående kutt.
- Mobiliser milten og den vedlagte bukspyttkjertelen ved hjelp av stumpe, fintippede tang. Pass på at organene ikke er festet til annet vev og sjekk for tilførsel av blodkar for å unngå å skade karene eller det omkringliggende vevet når du håndterer bukspyttkjertelen.
MERK: Ikke ta milten direkte for å forhindre blødning. - Trekk forsiktig bukspyttkjertelen ut av snittet for å muliggjøre lettere tilgang til organets hale og observere milten etter bukspyttkjertelen. Bruk den ikke-dominerende hånden til å ta tak i bukspyttkjertelen med tang og forsiktig kutte leddbåndene som forhindrer bukspyttkjertelen i ekstrakorporalisering. Forsikre deg om at organet ikke er foldet under injeksjonen, og at organets kapsel holdes under spenning på injeksjonsstedet for nålpenetrasjon for å unngå søl.
- Bruk den dominerende hånden til å utføre injeksjonen. Forsiktig penetrere organets kapsel med sprøytens nål etter organets lengdeakse. Sikt på et stykke bukspyttkjertelvev mellom synlige blodkar for å minimere risikoen for punktering eller injeksjon i et fartøy. Injiser sakte et tilstrekkelig antall celler i henhold til eksperimentell plan (her 2.500 celler i 20 μL DMEM) med en 27 G kanyle og en 50 μL sprøyte i haleområdet av bukspyttkjertelen.
MERK: En gjennomsiktig boble dannes ved vellykket injeksjon i vevet. - Hold bukspyttkjertelen og den innsatte sprøyten i ro i ca. 1 min for å unngå søl av tumorcellene. Fjern nålen forsiktig fra injeksjonsstedet.
MERK: Bytt kanyler mellom mus og bruk en ny steril sprøyte til injeksjon av en ny cellelinje. - Omorganiser organene i magen nøye. Pass på at du ikke skader vevet for å unngå søl av cellene. Hell 1 ml 0,9% natriumklorid på organene for å unngå organadhesjon.
- Sutur bukhinnen forsiktig med den enkle avbrutte suturteknikken og lukk huden med to til tre 9 mm vikleklemmer i rustfritt stål.
MERK: Fjern sårklemmene 7 dager etter implantasjon hvis det kirurgiske snittet har grodd. - Om nødvendig, forhindre dehydrering av dyrene på grunn av prosedyren og anestesien ved å injisere 0,5 ml natriumklorid subkutant.
- Etter implantasjon, motvirke analgosedasjon av MMF med en subkutan injeksjon av AFN (atipamezol [2,5 mg / kg], flumazenil [0,5 mg / kg], nalokson [1,2 mg / kg]), i henhold til kroppsvekten av musen.
- Plasser musen i et oppvarmet kammer på 37 °C til den er våken og helt aktiv. Plasser deretter musen tilbake i det opprinnelige buret. Overvåk musens helsestatus ved å sjekke pels, hudfarge og aktivitet og gjenta dette 3-4 timer etter operasjonen.
4. Ettervern for musene
- Gi musene tilgang til vann og mat når de er tilbake på dyreavdelingen.
- Fortsett subkutan eller oral påføring av meloksikam (5 mg / kg) hver 6-12 timer i 2-3 dager etter operasjonen.
- Overvåk musens helsestatus regelmessig i henhold til dyreprotokollen og de institusjonelle retningslinjene.
- Avhengig av målet med forsøket, overvåke tumorvekst hver uke eller oftere ved palpering, ultralydavbildning, bioluminescens (BLI) eller magnetisk resonansavbildning (MRI).
MERK: Basert på den valgte metoden, vekstraten og antall implanterte celler, kan en svulst detekteres så tidlig som 1 uke etter injeksjonen.
5. Høsting av tumortransplantater
- Høst svulstene ved slutten av forsøket eller når musene må avlives i henhold til kriteriene til institusjonens dyrepleie- og brukskomiteer eller dyreforsøkslisens.
- Avlive musen ved hjelp av en metode tillatt av dyreforsøkslisensen.
MERK: Utfør trinn med minimalt tidstap for å minimere iskemitiden. Derfor anbefales cervikal dislokasjon, da det er en rask metode, og dødstidspunktet kan bestemmes nøyaktig, i motsetning til terminal blødning eller kjemiske metoder. - Plasser musen liggende på en steril matte og tape bena til overflaten. Bruk 80% etanol til å desinfisere magen.
- Bruk nye hansker og desinfiser dem. Bruk kirurgisk saks til å kutte huden i lengderetningen på den sentrale magen.
- Bruk saks og tang, skille huden fra bukhinnen for å få lettere tilgang til bukhinnen.
- Bytt sakspar. Åpne bukhinnen i den sentrale magen med et 5 cm langsgående kutt.
- Mobiliser milten og den vedlagte bukspyttkjertelen ved hjelp av stumpe, fintippede tang. Forsiktig løsne svulsten fra det omkringliggende vevet ved hjelp av tang og kirurgisk saks.
- Oppbevar tumorvevet i et medium som er egnet for nedstrøms eksperimenter. Behandle vevet umiddelbart eller, om nødvendig, oppbevar prøven ved 4 °C i maksimalt 6 timer inntil videre behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sammenheng med en storskala legemiddelresponsstudie implanterte vi vellykket mer enn 170 mus (C75Bl6 / J-mottakermus, mannlige og kvinnelige mus kjønn matchet med PDAC-cellelinjene injisert) ved hjelp av den ovenfor beskrevne protokollen, eksemplifisert i hovedtrinnene i figur 112. I denne protokollen implanterte vi ortotopisk tre KrasG12D-drevne PDAC-cellelinjer (PDAC 1 og 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), som tidligere ble generert i laboratoriet. Transplantasjonen av PDAC-celler kan palperes abdominalt tidligst ca. 7 dager etter operasjonen, avhengig av cellenummeret som injiseres og aggressiviteten og vekstegenskapene til den inokulerte cellelinjen. MR (figur 2A), ultralyd og BLI av musebuken kan brukes til kvantitative målinger av tumorvolumet. Avhengig av tumorcellenes iboende egenskaper i cellelinjene, kan overlevelsen til de resulterende implanterte musene variere (figur 2B). Vellykkede intrapankreasinjeksjoner fører til fullblåste svulster i bukspyttkjertelen hos mus (figur 2C,D). I motsetning til dette kan mislykkede implantasjoner føre til fravær av bukspyttkjerteltumorer på grunn av a) injeksjon av ikke-levedyktige celler, b) avvisning av de implanterte cellene (f.eks. hvis cellene ikke var syngene for mottakermusen), eller c) et utilstrekkelig antall celler injisert. Alternative negative utfall kan føre til fravær av primærtumor i bukspyttkjertelen, men tilstedeværelse av tumor i bukhinnen, svarende til injeksjonsstedet (f.eks. gjennom søl av tumorcellesuspensjonen fra injeksjonsstedet i bukspyttkjertelen).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av hovedtrinnene i protokollen . (A) PDAC-celler bør passeres minst én gang før implantasjon. (B) Celler trypsiniseres for å løsne dem fra kolben, overføres til et 15 ml rør og telles. (C) Riktig cellefortynning plasseres i et rør og bringes til implantasjonsrommet. (D) Mottakermusen bedøves, barberes og desinfiseres i regionen der operasjonen skal finne sted. (E) En 1 cm kutt er laget til musen magen tilsvarer bukspyttkjertelen halen plassering. (F) Det ønskede antall celler injiseres i halen av bukspyttkjertelen. Forkortelse: PDAC = pankreasduktalt adenokarsinom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på vellykkede resultater ved syngene ortotopiske allotransplantater fra mus. (A) Representativ MR av mus 2 uker etter ortotopisk transplantasjon av primære PDAC-celler fra mus. Stiplet omriss betegner svulsten. Skalastang = 5 mm. (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurve for tre forskjellige PDAC-cellelinjer fra mus (PDAC 1-3) ortopisk transplantert i bukspyttkjertelen hos syngene immunkompetente mus (C57Bl/6J bakgrunn). (C) Representativt bilde av en svulst isolert ved endepunktet fra den ortotopisk injiserte PDAC1-cellelinjen. Både en bukspyttkjerteltumor som følge av en vellykket intrapankreatisk injeksjon av tumorceller og milten er vist på fotografiet. Skalastang = 5 mm. (D) Barplot som viser gjennomsnittlig tumorvekt for ortopisk transplanterte svulster fra PDAC 1-3. Prikker representerer individuelle mus. Forkortelser: PDAC = pankreasduktalt adenokarsinom; MR = magnetisk resonansavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syngene ortotopiske allotransplantater fra mus representerer en robust modell for prekliniske studier på grunn av kostnadseffektivitet, reproduserbarhet og relativt enkle eksperimentelle prosedyrer13,15. Disse modellene tillater ikke bare studier av tumor-vert-interaksjoner, men garanterer også bevaring av den genetiske heterogeniteten til svulstene de stammer fra når primære musecellekulturer brukes til forsøket.
Denne protokollen presenterer en enkel og rask prosedyre for ortotopisk implantasjon av PDAC-cellekulturer fra mus i bukspyttkjertelen. For å oppnå reproduserbare resultater, må flere tekniske hensyn tas i betraktning, inkludert kvaliteten på operasjonsteknikken. Siden kirurgisk praksis varierer, anbefales det at en person utfører alle ortotopiske injeksjoner innenfor samme eksperiment.
Injeksjon av celler i bukspyttkjertelen bør utføres med forsiktighet. Spildte celler, piercing bukspyttkjertelen, eller skade på vevet kan føre til at cellene til å engraft på andre organ områder utenfor bukspyttkjertelen. Dette kan komplisere den kliniske evalueringen (f.eks. størrelse og lokal infiltrasjon) av primærtumoren, samt dens lokale og fjerne metastatiske spredning. Det anbefales derfor å dokumentere og vurdere bobledannelse og eventuell informasjon om cellesøl for hver implanterte mus. Kutt i hud og bukhinne bør gjøres i en passende størrelse for å muliggjøre optimal tilgang til bukspyttkjertelen samtidig som sårene holdes så små som mulig.
Antall implanterte celler kan justeres avhengig av eksperimentell plan. Mens større antall implanterte celler fører til fysiologisk raskt voksende svulster og rask progresjon av kliniske symptomer, øker mindre celletall risikoen for at svulster ikke vil engraft. Videre anbefales små volumer av cellesuspensjoner, da større volumer (>20 μL) er forbundet med økt potensial for dannelse av en cystisk kjerne13. Vi fant at implantering av 2,500-5,000 celler i et volum på 20 μL cellekulturmedium er en optimal mengde for prekliniske terapeutiske studier ved å sikre tumorvekst over flere uker. For andre applikasjoner kan imidlertid opptil 1,6 × 106 celler implanteres.
I tillegg til cellekulturmedium kan Matrigel brukes som næringsrikt medium for å resuspendere PDAC-cellene, noe som også øker viskositeten til injeksjonsløsningen og dermed forhindrer lekkasje av tumorcellene13. Injeksjoner i haleområdet av bukspyttkjertelen foretrekkes med denne protokollen, da bukspyttkjertelhalen er lett tilgjengelig og tilgangen til bukspyttkjertelhodet er begrenset. Protokoller for å kunne injisere celler i bukspyttkjertelen hodet er beskrevet andre steder13,15. For å utføre den kirurgiske prosedyren holdes mus under analgosedasjon ved hjelp av en legemiddelkombinasjon, inkludert midazolam, medetomidin og fentanyl, samt meloksikam som peri- og postoperativ smertestillende. Alternativt kan isofluran i kombinasjon med egnede analgetika brukes som anestesi på sniffestoffer under konstant strømning. Valget av den valgte analgosedasjonsmetoden for dyrelisensen avhenger av de institusjonelle retningslinjene og de respektive lokale myndighetene.
Nøye valg av cellelinjer og mottakermus er avgjørende. Faktisk er det viktig å sikre at den genetiske bakgrunnen til mottakermusene samsvarer med den genetiske bakgrunnen til de valgte cellelinjene for å unngå immunogenitet og transplantatavvisning av PDAC-cellene. Videre påvirker immunogene eksogene proteiner, som fluorescerende reporteralleler eller Cas9, uttrykt av implanterte tumorceller vertens respons og kan føre til en immunogen reaksjon. Derfor kan tumorvekst og sammensetningen av TME påvirkes og forårsake skjevhet.
Sammenlignet med GEMM viser syngene ortotopiske museallotransplantater en redusert mengde desmoplasi og i noen tilfeller en lavere spredningsrate for metastatisk, noe som delvis begrenser likheten med humane tumorer. Videre øker behovet for kirurgisk inngrep prosedyrens kompleksitet. Mislykkede implantasjoner som resulterer i fravær av bukspyttkjerteltumorer på ønsket sted på grunn av ikke-levedyktig celleinjeksjon, avvisning av implanterte celler, lavt antall injiserte celler og injeksjonslekkasje kan forhindre fullføring av eksperimentell prosedyre.
Til tross for disse begrensningene har syngene ortotopiske museallograftmodeller av PDAC vist seg å effektivt løse mange av utfordringene ved å studere PDAC og dens heterogenitet. Med sine svært reproduserbare fenotyper og tumorvekstmønstre, samt tumor-TME-interaksjoner, representerer de en uvurderlig ressurs som kan oppnås raskt etter en relativt enkel protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker dyreavdelingen på TUM og kjernefasiliteten ved Institutt for nukleærmedisin, Klinikum rechts der Isar, for utmerket teknisk støtte. Denne studien ble støttet av det tyske kreftkonsortiet (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 og S01) til D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 og 2017.091.2) til D.S., og Det europeiske forskningsrådet (ERC CoG nr. 648521, til D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
