Detta protokoll beskriver hur man producerar aktinkometer på pärlornas ytor med kommersiellt tillgängliga proteiningredienser. Sådana system efterliknar de utskjutande strukturer som finns i celler och kan användas för att undersöka fysiologiska mekanismer för kraftproduktion på ett förenklat sätt.
Många cellrörelser och formförändringar och vissa typer av intracellulär bakterie- och organellmotilitet drivs av biopolymeraktinet som bildar ett dynamiskt nätverk vid ytan av cellen, organellen eller bakterien. Den biokemiska och mekaniska grunden för kraftproduktion under denna process kan studeras genom att reproducera aktinbaserad rörelse på ett acellulärt sätt på inerta ytor såsom pärlor som funktionaliseras och inkuberas med en kontrollerad uppsättning komponenter. Under lämpliga förhållanden monteras ett elastiskt aktinnätverk vid pärlytan och bryts upp på grund av den spänning som genereras av nätverkstillväxt och bildar en “aktinkomet” som driver pärlan framåt. Sådana experiment kräver emellertid rening av en mängd olika aktinbindande proteiner, vilket ofta sätter dem utom räckhåll för icke-specialister. Denna artikel beskriver ett protokoll för reproducerbart erhållande av aktinkometer och rörlighet hos pärlor med hjälp av kommersiellt tillgängliga reagenser. Pärlbeläggning, pärlstorlek och motilitetsblandning kan ändras för att observera effekten på pärlhastighet, banor och andra parametrar. Denna analys kan användas för att testa de biokemiska aktiviteterna hos olika aktinbindande proteiner och för att utföra kvantitativa fysikaliska mätningar som belyser aktiva substansegenskaper hos aktinnätverk. Detta kommer att vara ett användbart verktyg för samhället, vilket möjliggör studier av in vitro aktinbaserad rörlighet utan expertkunskap inom aktinbindande proteinrening.
Aktinpolymerisation i celler styrs rumsligt och tidsmässigt genom tät reglering av aktinfilamentkärnbildning nedströms cellsignalering1. Kärnbildning sker via bildandet av en aktin trimer, och sedan polymeriseras båda ändarna av det framväxande filamentet spontant, även om den ena änden är mer dynamisk (den taggiga änden) än den andra (den spetsiga änden)2. När kärnbildning och taggad ändpolymerisation riktas mot en yta producerar de tillräckligt med kraft (i pico-till-nano Newton-området) för att skjuta ut cellmembranet för rörelse och för att flytta mikronstora föremål inuti cellen med ATP-hydrolys som energikälla3. Några exempel är Listeria monocytogenes bakterier som använder aktinkometer för att sprida sig från cell till cell, och mitokondrier, där aktin kometbaserad rörelse är viktig för randomiserat arv under mitos 4,5. Aktinkometer på endosomer och andra intracellulära vesiklar är inblandade i lossning från donatormembran 6,7,8.
Med den metod som presenteras här kringgås signalaspekterna av cellulär aktinpolymerisation, och aktinpolymerisation produceras på mikrometriska polystyrenpärlor genom att belägga dem med aktivatorer av grenad aktinkärnbildning, speciellt den aktiva domänen för det humana WASP-proteinet, VCA (även kallat WA eller WCA)1. De belagda pärlorna inkuberas sedan i en blandning innehållande de ingredienser som är nödvändiga för aktinpolymerisation, inklusive huvudaktinpolymerisationsnukleatorn i celler, Arp2/3-komplexet, som aktiveras av VCA vid pärlytan för att bilda nya filament som grenar från sidorna av dotterfilament1. Actin polymeriserar initialt jämnt runt pärlan, men bryter sedan spontant symmetrin för att skapa en aktinkomet som skjuter pärlan framåt och därigenom återskapar cellliknande utskjutande nätverk och kometer på ett kontrollerat sätt. Liknande tillvägagångssätt med pärlor och andra belagda ytor har tidigare använts av oss och andra för att studera biokemi och biofysik för aktinpolymerisation 9,10,11,12, men omfattande expertis inom aktinbindande proteiner krävdes för dessa experiment. Protokollet som presenteras här beskriver hur man robust skapar aktinkometer och rörlighet helt med kommersiellt tillgängliga (eller snart tillgängliga) reagenser, vilket gör detta tillvägagångssätt tillgängligt för alla, inklusive i en pedagogisk miljö för undervisning av biofysiska begrepp. Viktiga funktioner inkluderar vikten av mild och pålitlig pipettering, användningen av profilinkomplex monomer som aktinkälla och väsentligheten i att använda en mycket aktiv Apr2/3-komplexaktivator som ett pärlbeläggningsreagens.
Protokollet som beskrivs här beskriver hur man får aktinnätverkstillväxt på pärlytor, kometbildning och pärlmotilitet med hjälp av kommersiellt tillgängliga proteiner. Ibland observeras emellertid inte kometer reproducerbart eller är inhomogena mellan bilden och täckglaset. Följande diskussion betonar några viktiga punkter i protokollet och föreslår några parametrar som kan justeras. En faktor att tänka på är att kometbildning och pärlhastighet påverkas av temperaturen, med temperaturer mycket över 25 °C eller mycket under 23 °C som påverkar kometbildningen negativt och ger irreproducerbara data. Användning av ett temperaturkontrollerat mikroskop eller ett mikroskop i ett klimatkontrollerat rum rekommenderas starkt. Även om fluorescerande märkt aktin ofta ingår i motilitetsblandningen för att observera kometer genom fluorescensmikroskopi, när kometer är mer än en pärldiameter i längd, är de också synliga med faskontrastmikroskopi som ett mörkt smet bredvid pärlan. Faskontrastvisualisering är mer lämplig för time-lapse-avbildning eftersom viss fototoxicitet är associerad med fluorescensavbildning även via snurrande skiva. Eftersom pärlor sätter sig med tiden ger ett inverterat mikroskop mindre horisontell pärldrift än ett upprätt och är mer lämpligt för filmer. Användningen av smält VALAP för att täta objektsglas är viktigt eftersom ämnen som nagellack stör kometbildningen. Stora mängder VALAP kan tillverkas i en bägare och sedan skopas ut för att fylla på mindre bägare som är mer mottagliga för snabb smältning. VALAP är bra i flera år vid rumstemperatur.
En annan viktig teknisk aspekt är noggrann beredning av buffert- och rörlighetsblandningar. Försiktighet bör iakttas vid beredning av MB13, särskilt vid pH-justeringssteget. pH-värdet i MB13 bör justeras snabbt till neutralt med NaOH för att undvika ATP-hydrolys, men inte för snabbt eftersom EGTA solubiliseras när pH-värdet närmar sig neutralt. EGTA är en viktig ingrediens eftersom den komplexiserar kalciumet bundet till aktin, vilket ger i motilitetsblandningen den mer aktiva magnesiumformen16. MB13 beredd för snabbt eller för långsamt ger suboptimal kometbildning eller till och med ingen alls. En ytterligare viktig punkt är att hålla noggrann koll på KCl-koncentrationen i motilitetsmixen när man leker med förhållanden. Till exempel, vid användning av 1x MB13 i reaktionsblandningen och utspädning av profilin, kapslingsprotein och Arp2/3-komplexet i MB13, är den slutliga KCl-koncentrationen i motilitetsreaktionen ca 40-50 mM på grund av utspädning med G-buffert. Denna koncentration ger de bästa resultaten i kometanalysen, och mer än 60 mM KCl minskar Arp2/3 komplex kärnbildningsaktivitet.
På proteinsidan av saker är en kritisk teknisk aspekt av att erhålla aktinkometer korrekt hantering av kommersiella aktinbindande proteiner, i synnerhet exakt pipettering av mikrolitermängder. Linjäriteten i Bradfords standardkurva är ett bra test av pipettering och kurvan kan sedan användas för rutinmässiga mätningar av proteinkoncentrationer. När man använder återsuspenderade kommersiella proteiner för kometproceduren är det viktigt att alltid verifiera proteinkoncentrationer, eftersom batchvariation och användarfel under resuspension kan leda till skillnader mellan verkliga och förväntade koncentrationer. Ibland kan små skillnader i proteinkoncentrationer leda till fullständig frånvaro av kometer.
En annan viktig aspekt av metoden som presenteras här är användningen av profilinkomplexat G-aktin som bränsle för polymerisation. Historiskt sett använde in vitro-system förpolymeriserat trådformigt aktin (F-aktin) som aktinkälla: depolymerisation i bulkmatad polymerisation på ytan10,17. Detta hade fördelen att kontrollera G-aktinnivåer, men lade till ett lager av komplexitet som krävde ytterligare komponenter för att katalysera depolymerisation. Eftersom omsättningen av aktinnätverket inte är nödvändig för kraftproduktion och rörlighet, som drivs av kärnbildning och polymerisation vid bönans yta, medan aktindepolymerisationsfaktorer som ADF/cofilin verkar på de åldrade nätverken långt från ytan18, görs nu den mesta in vitro-rekonstitueringen av aktinbaserad rörlighet utan omsättning för enkelhetens skull. Det finns emellertid vissa nackdelar med att använda G-aktin. För det första, när man använder kommersiellt aktin, som har lyofiliserats, är oligomerer närvarande. Depolymerisationsstegen som beskrivs här är mycket viktiga för att erhålla reproducerbara resultat. I synnerhet, även om G-buffert traditionellt justeras till pH 8, verkar lägre pH (pH 7, till exempel) fungera bättre i de analyser som beskrivs i denna artikel, möjligen för att lågt pH förbättrar depolymerisation19. En annan nackdel med att använda G-aktin är att en gång placerad i saltförhållanden som är tillåtna för polymerisation uppträder spontan kärnbildning och F-aktin bildas i bulk såväl som på pärlytan. Komplexbildning av G-aktin med profilin undertrycker spontan kärnbildning i bulk och spetsig ändpolymerisation, varigenom både kärnbildning och taggad ändpolymerisation fokuseras vid ytan20. Profilin-G-aktin är fysiologiskt relevant, eftersom mycket av aktinet i cellen är närvarande i denna form21. Här används ett 1: 1-förhållande mellan profilin: aktin; emellertid hämmar högre förhållanden (till exempel 3: 1) mer noggrant polymerisation i bulk, även om högre förhållanden också hämmar Arp2 / 3-komplexet och taggad ändförlängning till viss del22,23.
Kapslingsaktivitet är också nyckeln till kometbildning eftersom det säkerställer införande av nytt aktin vid ytan via kärnbildningscykler av ytaktiverat Arp2/3-komplex24,25. Utan capping bryter aktinmoln inte symmetri för att bilda kometer eftersom polymerisation vid ytan inte bygger upp tillräckligt med spänning för att bryta upp molnet26. Tidigare har vi använt hemrenat rekombinant muskapslingsprotein13, men tester som utförts för denna artikel indikerar att kommersiellt tillgängligt rekombinant humant kapslingsprotein är lika effektivt, liksom kommersiellt tillgängligt gelsolin, även om 10x mer gelsolin måste användas, och för vissa applikationer kanske det inte är lämpligt eftersom det har aktinavskiljningsaktivitet samt tak27.
Slutligen ligger robustheten hos denna metod i användningen av en mycket aktiv Arp2/3-komplexaktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderar WASP:s (p-domänen) profilin-G-aktinbindningsdomän utöver den komplexa bindningsdomänen Arp2/3 eftersom detta visar sig vara mest effektivt i profilin-G-aktinförhållanden29. Ännu viktigare är att användningen av streptavidin-taggen, som ursprungligen introducerades för att möjliggöra ytfunktionalisering via biotin-streptavidinlänken, har den ytterligare effekten av att öka Arp2/3-komplexaktiveringen, förmodligen på grund av det faktum att streptavidin är en tetramer och därmed kluster aktivatorn, känd för att öka Arp2/3-komplexaktiviteten30 . Kommersiellt producerad SpVCA är för närvarande under utveckling och kommer snart att finnas att köpa. Det bör vidare noteras att även om 40 μL av 2 μM SpVCA rutinmässigt används för att belägga 3 cm2 pärlyta, fungerar också andra beläggningskoncentrationer (högre och lägre), och att leka med dessa förhållanden ger olika komettillväxthastigheter och morfologier. När kometer inte bildas eller kometstorleken inte är homogen på objektsglaset bör olika beläggningsförhållanden testas, liksom olika KCl- och profilinkoncentrationer i motilitetsblandningen. Koncentrationerna av aktin, Arp2/3-komplex och kapslingsprotein i motilitetsblandningen kan också ändras för att optimera kometbildning, men i våra händer ger förändring av dessa proportioner ofta förvirrande resultat.
Sammanfattningsvis producerar de metoder som beskrivs här aktinmontering på pärlytor och rörlighet, men alla ytor som kan funktionaliseras med SpVCA kan användas. I de fall adsorption som beskrivs här inte fungerar kan streptavidindelen användas för att fästa SpVCA på ytan av intresse efter biotinylering. De sålunda bildade aktinstrukturerna, kometer eller på annat sätt, kan användas för att testa olika biokemiska och biofysiska aspekter av aktinnätverk och är särskilt lämpliga för fysiska manipulationer med mikropipetter, optisk pincett och laserablationer 15,26,31,32. Förutom dess användningsområden för forskarsamhället är det tillvägagångssätt som beskrivs här lämpligt som ett undervisningsverktyg för grundutbildningsstudenter i biofysik för att studera aktiva materiabegrepp som symmetribrytning och självorganisation.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner uppriktigt medlemmarna i vårt nya hem på LPENS för deras varma välkomnande, och i synnerhet ABCDJ-teamet för all deras hjälp och stöd. JP erkänner ekonomiskt stöd från Foundation ARC (Grant PJA 20191209604), och CS erkänner ekonomiskt stöd från Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | A12373 (recently discontinued) | This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol. |
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 | Hypermol | 8153 | |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
Arp2/3 complex | Cytoskeleton | RP01P | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BioSpectrometer, basic | Eppendorf | 035739 | |
Bradford Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
BSA, high quality | Sigma | A3059 | |
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) | Thermo Scientific | 23209 | |
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) | Home-purified (Reference 13) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
Capping protein (a1b2, human recombinant) | Hypermol | 8322 | |
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 | Olympus | discontinued | Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used. |
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) | Eppendorf | 035963 | |
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL | Eppendorf | 035969 | |
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) | Cytoskeleton | HPG6 | |
Lanolin | Sigma | 49909 | |
Microcentrifuge 5427R + rotor | Eppendorf | 934126 | |
Microscope, upright: BX51 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Microscope, inverted: IX70 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Paraffin | Sigma | 76244 | |
Petroleum jelly: Vaseline | Sigma | 16415 | |
Pipettes Research Plus | Eppendorf | Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example). | |
**10 µL | 933954 | ||
**2.5 µL | 933953 | These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended. | |
Polystyrene carboxylate beads | Polysciences | ||
**approx. 1 µm diameter | 08226 | ||
**approx. 4.5 µm diameter | 17140-5 | ||
Profilin 1 (human recombinant, untagged) | Cytoskeleton | PR02 | |
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) | Home-purified (Reference 14) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) | Cytoskeleton | VCG03 |