Summary
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för odling och avbildning av musembryon som möjliggör 3D + tidsavbildning av hjärtprogenitorceller. Denna videoverktygslåda tar upp de viktigaste färdigheterna som krävs för framgångsrik live-bildbehandling, annars svårt att förvärva från textpublikationer.
Abstract
De första stegen i hjärtutveckling innebär drastiska förändringar i cellbeteende och differentiering. Medan analys av fasta embryon gör det möjligt att studera i detalj specifika utvecklingsstadier i en stillbild, fångar levande avbildning dynamiska morfogenetiska händelser, såsom cellmigration, formförändringar och differentiering, genom att avbilda embryot när det utvecklas. Detta kompletterar fast analys och utvidgar förståelsen för hur organ utvecklas under embryogenesen. Trots sina fördelar används live-bildbehandling sällan i musmodeller på grund av dess tekniska utmaningar. Tidiga musembryon är känsliga när de odlas ex vivo och kräver effektiv hantering. För att underlätta en bredare användning av levande avbildning i musutvecklingsforskning presenterar detta dokument ett detaljerat protokoll för tvåfotons levande mikroskopi som möjliggör långsiktigt förvärv i musembryon. Utöver protokollet ges tips om embryohantering och odlingsoptimering. Detta kommer att hjälpa till att förstå viktiga händelser i tidig musorganogenes, vilket ökar förståelsen för kardiovaskulär stamfaderbiologi.
Introduction
Hjärtat bildas tidigt under embryogenesen för att börja pumpa näringsämnen till hela embryot, medan det fortsätter att utvecklas1. I musembryon samlas ett och ett halvt dygn efter inledandet av gastrulationen ett rudimentärt hjärtorgan vid den främre polen 2,3. Vid Early Streak (ES) -stadiet tränger hjärtprogenitorer i epiblasten genom den primitiva strimman till det begynnande mesodermala skiktet 4,5,6 och börjar migrera till den främre polen, där de differentierar för att bilda det primitiva hjärtröret. Under hela denna process genomgår tidiga hjärtprogenitorer cellomläggningar, formtransformationer och differentiering, förutom migration7 (figur 1).
Tidiga hjärtprogenitorer har lockat forskare i nästan ett sekel på grund av deras anmärkningsvärda förmåga att differentiera och bygga ett funktionellt organ samtidigt. Under de senaste två decennierna har klonal analys och villkorliga knockoutmodeller visat att tidig hjärtutveckling involverar distinkta cellkällor i en mycket dynamisk process 8,9,10. Men 3D-strukturen hos det primitiva hjärtröret och den dynamiska karaktären av dess morfogenes gör det utmanande att studera (figur 1), och vi är långt ifrån att förstå dess fulla komplexitet11.
För att studera dessa dynamiska cellulära processer erbjuder levande bildmetoder nu en oöverträffad detalj 7,12,13,14. I musmodellen har levande tillvägagångssätt varit nyckeln till att fråga utvecklingsämnen som är svåra att ta itu med genom statisk analys 7,13,15. Medan långsiktig ex vivo-kultur och robusta mikroskopuppsättningar går snabbtframåt 16,17, har få forskare expertisen för att framgångsrikt avbilda levande embryon. Även om pappersbaserade publikationer ger tillräckligt med tekniska detaljer för att reproducera levande bildexperiment, är vissa färdigheter och tricks svåra att förstå utan visuella exempel eller peer-to-peer-hjälp. För att påskynda denna inlärningsprocess och sprida användningen av levande bildbehandling bland laboratorier monterade vi ett videoprotokoll (figur 2) som samlar de nödvändiga färdigheterna för att utföra live-avbildning på gastrulerande musembryon.
Figur 1: Tidig differentiering av hjärtprogenitorceller i musembryot från början av gastrulation till stadiet före primitiv hjärtrörsbildning. Hjärtstamceller tränger in i mesodermen strax efter gastrulationens början och migrerar till motsatt sida av embryot. Morfologiskt och embryonalt dag (E) stadium skrivs ovanpå diagrammen. Streckade pilar visar migrationsbanan för primitiva hjärtrörsprogenitorer under gastrulation. Denna siffra anpassades från11. Förkortningar: ES = Early Streak; MS = Mellanstreck; EHF = Tidig huvudveckning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Arbetsflödesdiagram för levande avbildning av tidiga hjärtprogenitorer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av CNIC Animal Experimentation Ethics Committee, av Madridgemenskapen (referens PROEX 220/15) och överensstämde med EU-direktiv 2010/63EU och rekommendation 2007/526/EG om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål, verkställda i spansk lag enligt Real Decreto 1201/2005.
Detta protokoll inkluderar användning av två hanar från den fluorescerande transgena muslinjen som rapporterar NOTCH-aktivitet Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Se materialtabellen för detaljer om material, djur och utrustning som används i detta protokoll.
1. Anpassning av verktyg och hållare
- Skär 1 cm långa volframtrådstycken och slipa dem till 0,02-0,05 mm diameter med någon av de enkla metoderna som finns tillgängliga, till exempel nedsänkning av trådspetsen i en mättad natriumnitritlösning19.
- Förbered armbågade glaskapillärer.
- Placera mittpunkten på en standard 1,0 mm glaskapillär över en Bunsen-tändare i 3-6 sekunder, dra långsamt från båda ändarna tills kapillären blir tunn och flexibel. Bryt då kapillären på mitten och värm den kort för att få en 90° böjning 2 cm från spetsen.
- Såg en bit polymetylmetakrylat som mäter ca 7 mm lång, 4 mm bred och 2 mm tjock (figur 3D).
OBS: Polymetylmetakrylatark kan antingen erhållas från återvunnen laboratorieutrustning eller beställas nya. - Håll metakrylatbiten med en bänkskruv. Borra sedan hål i anpassad storlek tvärs genom hela stycket (figur 3D).
OBS: Vanligtvis kräver E6.5 till E7.5 musembryon att använda borrar med 0,2-0,5 mm diameter.- Vrid borren långsamt medan du applicerar lågt men konstant tryck. Om en borr går sönder inuti hållaren, kassera biten, eftersom metallen inte kan tas ut.
- Använd en fin fil för att jämna ut hållarens kanter och justera dess storlek. Skapa dessutom en mild lutning på hållarens kanter för att underlätta embryopositionering (figur 3D).
- Lägg den färdiga hållaren i en skål med destillerat vatten för att skölja den.
- Kontrollera hållaren under stereomikroskopet för att se om hålen innehåller borrdamm. Om damm är närvarande, använd volframnålar för att ta bort det.
- För att sterilisera hållaren, placera den i ett koniskt rör fullt av destillerat vatten och sonikera det i 20 minuter med minst 20 W uteffekt.
2. Förberedelse av media
- För att värmeinaktivera komplementsystemet, låt två 500 μl alikvoter kommersiellt eller hemlagat serum på20 råttor stå vid 56 °C i 30 minuter.
OBS: För ett detaljerat protokoll om hur man bereder råttserum, se21. - Bered två alikvoter av mediet för odling av embryon i mikroskopet i en cellodlingshuva. Blanda 490 μl DMEM för avbildning av levande celler, 500 μl inaktiverat råttserum och 10 μl penicillinstreptomycin för att erhålla en slutlig koncentration av 50 μg/ml penicillin och 50 μg/ml streptomycin22.
OBS: Volymen av odlingsmediet beror på tid och antal embryon som ska odlas. Som tumregel kräver optimal tillväxt minst 200 μL per embryo och dag i E7.0-embryon. - Filtrera mediet genom ett membranfilter med en porstorlek på 0,22 μm med en spruta i ett nytt rör och placera det med lock i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 7 %CO2 i 1 timme före embryoodling23.
- Bered dissektionsmediet genom att tillsätta följande till en 500 ml DMEM kompletterad med L-glutaminflaska: 50 ml fetalt bovint serum, 10 ml 25 mM HEPES-NaOH (pH 7,2) och 10 ml penicillin och streptomycin (50 mg / ml).
- Dela sedan upp den i 50 ml alikvoter, placera tre alikvoter i ett 37 °C bad och förvara resten vid 4 °C i upp till 3 månader.
3. Dissektion av embryon
- Avliva en gravid mus på E6.75-E7.5.
- Dra ut livmodern och placera den på en torr och ren pappersduk. Skär sedan livmodern, sätt in spetsen av fin sax från den mesometriala sidan och skjut bladet längs för att exponera löven och överföra dem till dissektionsmediet. För ett detaljerat protokoll, se24.
- Dissekera embryon, håll ektoplacentalkonen intakt (figur 3A, B). För en detaljerad dissektionsmetod, se25.
- Skala sedan av Reicherts membran och lämna en del av det på den extraembryonala regionen (figur 3B).
OBS: Fina pincett är viktiga för detta steg. Oerfarna användare kan dissekera embryon på 2% agarosgelbelagda rätter för att undvika att böja tångens spetsar mot skålytan (figur 3C). - För att hålla dissektionsmediet varmt, byt ut det var 10: e minut. Dissekera dessutom deciduae i grupper om 3-4 medan resten hålls i dissektionsmedium placerat i ett 37 ° C-bad. Placera omedelbart de dissekerade embryon i odlingsmedium.
- Välj embryon med önskade fluorescensegenskaper med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop och placera dem i röret innehållande odlingsmedium i cellodlingsinkubatorn.
- Om embryona befinner sig i E6,5 till E7,0-stadier, stäng locket och låt embryona återhämta sig i 2 timmar före avbildning.
OBS: E6.5 till E7.0 embryon är känsliga. De kan också placeras direkt under mikroskopet men förkultivering möjliggör val av de som bäst återhämtar sig från dissektion, vilket ökar chansen att lyckas.
4. Förberedelse av mikroskop
- Slå på alla mikroskopkomponenter, inklusive lasrar, dator och programvara. Slå på temperaturregulatorerna och ställ in på 37 °C 3 h i förväg för att säkerställa jämvikt.
- Om du använder ett mål för nedsänkningsdetektering, rengör det med en restfri engångsservett. Doppa objektivets spets i dubbeldestillerat vatten med en 60 mm skål och låt den stå tills förvärvet börjar.
- Slå på CO2-styrenheten och ställ in den på 7%.
- Lägg en droppe högvakuum kiselfett på en 35 mm skål med glastäcke (14 mm diameter), placera hållaren ovanpå droppen och tryck försiktigt för att immobilisera den.
- Under ett stereomikroskop, tillsätt odlingsmedium för att fylla den glasbottendelen av skålen. Rikta samtidigt strömmen mot hållarens hål för att förhindra att luftbubblor bildas i dem.
- Om bubblorna kvarstår, använd glaskapillären som förbereddes i steg 1.2, ansluten till ett silikonrör med ett munstycke, för att suga ut bubblorna försiktigt.
OBS: Den armbågade änden av kapillären underlättar åtkomst genom hålen.
5. Embryo montering
- Överför 2-3 embryon som lämnades för att återhämta sig i inkubatorn till skålen med hållaren. Lämna resten i inkubatorn som säkerhetskopia.
- Ställ embryon i hålen med hjälp av ett par pincett och en avsmalnande volframnål. Använd nålen för att haka embryot vid ektoplacentalkonen och sätt in det i ett storleksmatchande hål. För att immobilisera embryot, rotera konen 90-120 ° så att Reihters membran fäster vid hålväggarna (figur 3C). För en alternativ beskrivning, se26.
- Flytta försiktigt skålen som innehåller embryona och hållaren till mikroskopplattan (figur 3F, G).
OBS: Om embryot inte flyttas stadigt kan det röra sig ut ur hållaren. - Sänk målet tills en flytande menisk bildas vid medelmålgränssnittet.
- Lokalisera embryot med hjälp av överfört ljus under mikroskopet binokulärt och placera embryot i fokus.
- Montera inkubationskammaren och försegla den runt målet med tejp (figur 3F).
- Använd en Live Capture vid mikroskopkontrollprogramvaran, justera laserutmatnings- och förstärkningsnivåerna.
OBS: För tvåfotonförvärv av grönt fluorescerande protein (GFP) och Tdtomato-reportrar användes 30% utgångslasereffekt vid 980 nm och 70% förstärkning på icke-avskannade detektorer i detta protokoll (figur 3G). - För att undvika avdunstning, täck mediet med paraffinolja genom att droppa det långsamt på målet.
OBS: Detta är den sista punkten där ytterligare embryon kan monteras i hållaren. När den är täckt med paraffinolja måste man rengöra hållaren och byta ut mediet för att göra det. För alternativa monteringsmetoder, se27.
6. Bildinsamling
- Ställ in time-lapse-inspelning. Ställ in ett tidsintervall på 5-10 minuter med 3-5 μm z-utrymme mellan staplarna. Lämna ett tomt utrymme ovanpå z-stacken för att förutse embryotillväxt, minst 50 μm, tillsätt 30 μm för varje timme som förvärvet inte kommer att övervakas.
- Om tillgängligt, aktivera alternativet Spara automatiskt för att tillåta övervakning av förvärvet från en persondator för att möjliggöra justering av z-stackstorleken, om det behövs, för att passa intresseområdet i fokus.
Figur 3: Live-bildverktyg och installation . a) Dissekering av musembryon med en agarosöverdragen skål under stereomikroskopet. (B) Diagram över stegen för dissekering av musembryon för levande avbildning. c) Embryots placering i innehavaren. d) Embryohållarens utformning och egenskaper. (F) Inkubatorkammare runt nedsänkningsmålet. (G) Diagram över den slutliga installationen för timelapse-förvärv. Skalstapel = 500 μm (A). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde protokollet för att visualisera NOTCH-signalaktivering hos tidiga hjärtprogenitorer som skulle differentiera till endotelceller under primitiv hjärtrörsmorfogenes. För det korsade vi vildtyp C57BL / 6-N-möss med Tg (CBF: H2BVenus, +) möss18 för att få embryon som rapporterar NOTCH-aktivitet genom gult fluorescerande protein Venus. Vid E7.5 är Venusfluorescens närvarande i hela neurala ektodermen, med några positiva kärnor vid splanchnic och extraembryonal mesoderm. Efter 4 timmar aktiverar endotelprogenitorer Venus och samlas för att bilda endokardröret och underliggande aortor, som blir slutna strukturer efter 7 h (figur 4).
Figur 4: Levande hela embryots hjärtutveckling genom multifotonavbildning. Valda tidpunkter från en timelapse-video av ett CBF:H2BVenus+/- musembryo i tidigt knoppstadium (E7.5). (A) Brightfield optiska sektioner. (B) 480-510 nm detektorband som visar Venus fluorescerande proteinuttryck. Skalstänger = 100 μm. Gula pilspetsar pekar på den utvecklande endokardiell lumen och aortas. Tiden anges i h:min uppe till höger på varje bild. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidiga hjärtprogenitorer organiserar sig i ett primitivt hjärtrör som börjar slå medan det fortfarande bildas. Att förstå hur denna process sker är nyckeln till att fastställa det breda spektrumet av medfödda hjärtfel till specifika morfogenetiska händelser. För det erbjuder levande avbildning en möjlighet att studera normal och defekt embryonal utveckling med ökad tidsupplösning. Detta är särskilt användbart för att studera tidiga hjärtstamceller eftersom de snabbt övergår genom flera differentierings- och migrationsbeteenden7.
Eftersom vi kan studera olika embryonala stadier i ett enda prov, kan liveavbildningsprotokollet som presenteras här användas för att bekräfta interpoleringen av morfogenetiska händelser som studerats i statisk analys. Detta kommer att bidra till att förstå sekvensen av utvecklingshändelser på ett kontinuerligt sätt. Dessutom ger levande analys flerdimensionella data, vilket möjliggör klassificering av celltyper med oöverträffad precision genom att mäta cellulära beteenden28.
Trots dess fördelar har den metod som föreslås här vissa begränsningar. Även om embryon kan utvecklas väl upp till 48 timmar inuti mikroskopet, tenderar intresseområdet att flytta ur ramen i långa förvärv. För att förhindra att det händer måste användaren regelbundet kontrollera embryonets drift under förvärvsprocessen. Även om det finns automatiska system för att korrigera provfokus12, kan dessa inte implementeras i de flesta kommersiellt tillgängliga mikroskop. Alternativt kan två eller flera användare turas om att övervaka och justera embryoramen och stacken, så att långa förvärv inte är lika utmanande. Det måste dock komma ihåg att långa förvärv har en stor chans att misslyckas, särskilt för otränade användare. Mindre embryoskador vid dissektion och dålig positionering i hållaren är två av huvudorsakerna. För att förbättra dessa färdigheter kan man börja med att odla monterade embryon i inkubatorn innan man försöker levande bildexperiment. På så sätt kan man testa om embryon utvecklas ordentligt innan man spenderar mikroskopiresurser.
Sammanfattningsvis öppnar levande avbildningsmetoder nya vägar för att studera embryonal utveckling. Protokollet som presenteras här gör det möjligt att analysera i detalj ursprunget till fenotyper i mutanta embryon eller testa funktionen av specifika molekylära vägar genom farmakologisk manipulation. Med denna videoverktygslåda strävar vi efter att underlätta dess breda användning för att förstå komplexiteten hos tidiga hjärtprogenitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Dr. Kenzo Ivanovitch för tidigare arbete med denna metod och gruppen av Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) för att tillhandahålla den första expertisen om embryomontering. Denna studie stöddes av Grant PGC2018-096486-B-I00 från spanska Ministerio de Ciencia e Innovación och Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 från EU Horizon 2020-programmet till MT och Grant 1380918 från FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program till JND. MS stöddes av ett La Caixa Foundation PhD fellowship (LCF / BQ / DE18 / 11670014) och The Company of Biologists travelling fellowship (DEVTF181145). CNIC stöds av det spanska vetenskapsministeriet och ProCNIC Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
