Summary
Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.
Abstract
Die ersten Schritte der Herzentwicklung implizieren drastische Veränderungen im Zellverhalten und in der Zelldifferenzierung. Während die Analyse von fixierten Embryonen es ermöglicht, bestimmte Entwicklungsstadien in einem Standbild im Detail zu untersuchen, erfasst die Live-Bildgebung dynamische morphogenetische Ereignisse wie Zellmigration, Formveränderungen und Differenzierung, indem sie den Embryo während seiner Entwicklung abbildet. Dies ergänzt die fixe Analyse und erweitert das Verständnis dafür, wie sich Organe während der Embryogenese entwickeln. Trotz seiner Vorteile wird die Live-Bildgebung aufgrund ihrer technischen Herausforderungen selten in Mausmodellen eingesetzt. Frühe Mausembryonen sind empfindlich, wenn sie ex vivo kultiviert werden, und erfordern eine effiziente Handhabung. Um eine breitere Nutzung der Live-Bildgebung in der Entwicklungsforschung von Mäusen zu ermöglichen, wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Zwei-Photonen-Live-Mikroskopie vorgestellt, das eine langfristige Erfassung in Mausembryonen ermöglicht. Zusätzlich zum Protokoll werden Tipps zum Umgang mit Embryonen und zur Kulturoptimierung gegeben. Dies wird dazu beitragen, Schlüsselereignisse in der frühen Organogenese von Mäusen zu verstehen und das Verständnis der kardiovaskulären Vorläuferbiologie zu verbessern.
Introduction
Das Herz bildet sich früh während der Embryogenese, um Nährstoffe in den gesamten Embryo zu pumpen, während er sich weiter entwickelt1. Bei Mausembryonen sammelt sich eineinhalb Tage nach Beginn der Gastrulation ein rudimentäres Herzorgan am vorderen Pol 2,3. Im Early Streak (ES)-Stadium dringen kardiale Vorläuferzellen im Epiblasten durch den primitiven Streifen in die entstehende mesodermale Schicht 4,5,6 ein und beginnen zum vorderen Pol zu wandern, wo sie sich differenzieren, um den primitiven Herzschlauch zu bilden. Während dieses Prozesses durchlaufen frühe Herzvorläuferzellen zusätzlich zur Migration Zellumlagerungen, Formtransformationen und Differenzierung7 (Abbildung 1).
Frühe kardiale Vorläuferzellen haben Forscher seit fast einem Jahrhundert aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, ein funktionelles Organ gleichzeitig zu differenzieren und aufzubauen, angezogen. In den letzten zwei Jahrzehnten haben klonale Analysen und bedingte Knockout-Modelle gezeigt, dass die frühe Herzentwicklung unterschiedliche Zellquellen in einen hochdynamischen Prozess einbezieht 8,9,10. Die 3D-Struktur des primitiven Herzschlauchs und die dynamische Natur seiner Morphogenese machen es jedoch schwierig, ihn zu untersuchen (Abbildung 1), und wir sind weit davon entfernt, seine volle Komplexität zu verstehen11.
Um diese dynamischen zellulären Prozesse zu untersuchen, bieten Live-Imaging-Verfahren jetzt eine noch nie dagewesene Detailgenauigkeit 7,12,13,14. Im Mausmodell waren Live-Ansätze der Schlüssel zur Befragung von Entwicklungsthemen, die durch statische Analyse schwer zu beantworten sind 7,13,15. Während langfristige Ex-vivo-Kulturen und robuste Mikroskopaufbauten schnell voranschreiten16,17, verfügen nur wenige Forscher über das Fachwissen, um lebende Embryonen erfolgreich abzubilden. Obwohl papierbasierte Veröffentlichungen genügend technische Details enthalten, um Live-Bildgebungsexperimente zu reproduzieren, sind einige Fähigkeiten und Tricks ohne visuelle Beispiele oder Peer-to-Peer-Unterstützung schwer zu verstehen. Um diesen Lernprozess zu beschleunigen und den Einsatz von Live-Bildgebung in Laboratorien zu verbreiten, haben wir ein Videoprotokoll (Abbildung 2) zusammengestellt, das die notwendigen Fähigkeiten für die Durchführung von Live-Bildgebung an gastulierenden Mausembryonen sammelt.
Abbildung 1: Frühe Differenzierung kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo vom Beginn der Gastrulation bis zum Stadium vor der primitiven Herzschlauchbildung. Herzvorläuferzellen dringen kurz nach Beginn der Gastrulation in das Mesoderm ein und wandern auf die gegenüberliegende Seite des Embryos. Das morphologische und das embryonale Tagesstadium (E) werden oben auf den Diagrammen geschrieben. Gestrichelte Pfeile zeigen die Migrationsbahn primitiver Herzröhrenvorläufer während der Gastrulation. Diese Zahl wurde von11 angepasst. Abkürzungen: ES = Early Streak; MS = Mittlerer Streifen; EHF = Frühe Kopffalte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow-Diagramm für die Live-Bildgebung von frühen Herzvorläufern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der CNIC und der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Referenz PROEX 220/15) genehmigt und entsprachen der EU-Richtlinie 2010/63/EU und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, die im spanischen Recht gemäß Real Decreto 1201/2005 durchgesetzt wurden.
Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei Männchen aus der fluoreszierenden transgenen Mauslinie, die die NOTCH-Aktivität Tg(CBF:H2BVenus,+)18 melden. In der Materialtabelle finden Sie Details zu Materialien, Tieren und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Anpassung von Werkzeugen und Haltern
- Schneiden Sie 1 cm lange Wolframdrahtstücke und schärfen Sie sie auf einen Durchmesser von 0,02 bis 0,05 mm mit einer der verfügbaren einfachen Methoden, z. B. indem Sie die Spitze des Drahtes in eine gesättigte Natriumnitritlösung19 tauchen.
- Bereiten Sie gebogene Glaskapillaren vor.
- Legen Sie den Mittelpunkt einer Standard-1,0-mm-Glaskapillare 3-6 s lang über ein Bunsenfeuerzeug und ziehen Sie langsam an beiden Enden, bis die Kapillare dünn und flexibel wird. Brechen Sie dann die Kapillare in zwei Hälften und erhitzen Sie sie kurz, um eine 90°-Biegung 2 cm von der Spitze entfernt zu erzeugen.
- Säge ein Stück Polymethylmethacrylat mit einer Länge von ca. 7 mm, einer Breite von 4 mm und einer Dicke von 2 mm (Abbildung 3D).
HINWEIS: Polymethylmethacrylatplatten können entweder aus recycelten Laborgeräten bezogen oder neu bestellt werden. - Halten Sie das Methacrylatstück mit einem Schraubstock fest. Bohren Sie als Nächstes Löcher in benutzerdefinierter Größe quer durch das gesamte Stück (Abbildung 3D).
HINWEIS: In der Regel müssen für Mausembryonen der Klassen E6,5 bis E7,5 Bohrer mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,5 mm verwendet werden.- Drehen Sie den Bohrer langsam und üben Sie dabei einen niedrigen, aber konstanten Druck aus. Wenn ein Bohrer in der Halterung bricht, entsorgen Sie das Stück, da das Metall nicht herausgenommen werden kann.
- Verwenden Sie eine feine Feile, um die Kanten des Halters zu glätten und seine Größe anzupassen. Erzeugen Sie zusätzlich eine leichte Neigung an den Kanten des Halters, um die Positionierung des Embryos zu erleichtern (Abbildung 3D).
- Legen Sie den fertigen Halter zum Abspülen in eine Schüssel mit destilliertem Wasser.
- Überprüfen Sie die Halterung unter dem Stereomikroskop, um festzustellen, ob die Löcher Bohrstaub enthalten. Wenn Staub vorhanden ist, verwenden Sie Wolframnadeln, um ihn zu entfernen.
- Um den Halter zu sterilisieren, legen Sie ihn in ein konisches Röhrchen mit destilliertem Wasser und beschallen Sie ihn 20 Minuten lang mit einer Leistung von mindestens 20 W.
2. Medienvorbereitung
- Um das Komplementsystem hitzeinaktiv zu machen, lassen Sie zwei 500-μl-Aliquote handelsübliches oder hausgemachtes 20-Ratten-Serum30 Minuten lang bei 56 °C stehen.
HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Rattenserum finden Sie unter21. - Bereiten Sie in einer Zellkulturhaube zwei Aliquote des Mediums für die Kultivierung der Embryonen im Mikroskop vor. Mischen Sie jeweils 490 μl DMEM für die Lebendzellbildgebung, 500 μl inaktiviertes Rattenserum und 10 μl Penicillin-Streptomycin, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin22 zu erhalten.
HINWEIS: Das Volumen des Nährmediums hängt von der Zeit und der Anzahl der zu kultivierenden Embryonen ab. Als Faustregel gilt, dass für ein optimales Wachstum mindestens 200 μl pro Embryo und Tag bei E7.0-Embryonen erforderlich sind. - Filtern Sie das Medium mit einer 2-ml-Spritze durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm in ein neues Röhrchen und legen Sie es mit geöffnetem Deckel in einen Zellkulturinkubator bei 37 °C und 7 % CO2 für 1 h vor der Embryokultur23.
- Bereiten Sie das Dissektionsmedium vor, indem Sie in eine 500-ml-DMEM-Flasche mit L-Glutamin-Flasche Folgendes geben: 50 ml fötales Rinderserum, 10 ml 25 mM HEPES-NaOH (pH 7,2) und 10 ml Penicillin und Streptomycin (50 mg/ml).
- Als nächstes trennen Sie es in 50-ml-Aliquots, legen drei Aliquote in ein 37 °C-Bad und lagern den Rest bis zu 3 Monate bei 4 °C.
3. Embryonen-Dissektion
- Euthanasieren Sie eine schwangere E6.75-E7.5-Maus.
- Extrahieren Sie die Gebärmutter und legen Sie sie auf ein trockenes und sauberes Papiertuch. Schneiden Sie dann die Gebärmutter ab, führen Sie die Spitze einer feinen Schere von der mesometrialen Seite ein und schieben Sie die Klinge entlang, um die Deciduae freizulegen und auf das Dissektionsmedium zu übertragen. Ein ausführliches Protokoll finden Sie unter24.
- Sezieren Sie die Embryonen und lassen Sie den ektoplazentaren Kegel intakt (Abbildung 3A, B). Eine detaillierte Dissektionsmethode finden Sie unter25.
- Ziehen Sie dann die Reichert-Membran ab und lassen Sie einen Teil davon auf der extraembryonalen Region (Abbildung 3B).
HINWEIS: Für diesen Schritt sind feine Pinzetten unerlässlich. Unerfahrene Anwender können Embryonen auf mit 2% Agarosegel überzogenen Schalen präzieren, um zu vermeiden, dass sich die Zangenspitzen gegen die Schalenoberfläche biegen (Abbildung 3C). - Um die Dissektion mittelwarm zu halten, ersetzen Sie sie alle 10 Minuten. Darüber hinaus werden die Deciduae in Gruppen von 3 bis 4 Personen präpariert, während der Rest in einem Dissektionsmedium in einem 37 °C heißen Bad aufbewahrt wird. Legen Sie die sezierten Embryonen sofort in ein Nährmedium.
- Wählen Sie die Embryonen mit den gewünschten Fluoreszenzmerkmalen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop aus und legen Sie sie in das Röhrchen mit dem Kulturmedium im Zellkultur-Inkubator.
- Wenn sich die Embryonen im Stadium E6,5 bis E7,0 befinden, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Embryonen vor der Bildgebung 2 Stunden lang erholen.
HINWEIS: E6,5 bis E7,0 Embryonen sind empfindlich. Sie können auch direkt unter dem Mikroskop platziert werden, aber die Präkultivierung ermöglicht die Auswahl derjenigen, die sich am besten von der Dissektion erholen, was die Erfolgschancen erhöht.
4. Vorbereitung des Mikroskops
- Schalten Sie alle Mikroskopkomponenten ein, einschließlich Laser, Computer und Software. Schalten Sie die Temperaturregler ein und stellen Sie 3 h im Voraus auf 37 °C ein, um den Ausgleich zu gewährleisten.
- Wenn Sie ein Immersionserkennungsobjektiv verwenden, reinigen Sie es mit einem rückstandsfreien Einwegtuch. Tauchen Sie die Spitze des Objektivs mit einer 60-mm-Schale in doppelt destilliertes Wasser und lassen Sie es bis zum Beginn der Aufnahme stehen.
- Schalten Sie den CO2 -Regler ein und stellen Sie ihn auf 7% ein.
- Geben Sie einen Tropfen Hochvakuum-Silikonfett auf eine 35-mm-Schale mit Glasdeckglasboden (14 mm Durchmesser), setzen Sie den Halter auf den Tropfen und drücken Sie ihn leicht an, um ihn zu immobilisieren.
- Fügen Sie unter einem Stereomikroskop Nährmedium hinzu, um den Glasbodenteil der Schale zu füllen. Richten Sie dabei den Strahl auf die Löcher des Halters, um die Bildung von Luftblasen in ihnen zu verhindern.
- Wenn die Blasen zurückbleiben, verwenden Sie die in Schritt 1.2 vorbereitete Glaskapillare, die mit einem Silikonschlauch mit Mundstück verbunden ist, um die Blasen vorsichtig abzusaugen.
HINWEIS: Das gebogene Ende der Kapillare erleichtert den Zugang durch die Löcher.
5. Embryonenmontage
- Übertragen Sie 2-3 Embryonen, die sich im Inkubator erholen mussten, mit dem Halter in die Schale. Lassen Sie den Rest als Backup im Inkubator.
- Setzen Sie die Embryonen mit einer Pinzette und einer sich verjüngenden Wolframnadel in die Löcher. Verwenden Sie die Nadel, um den Embryo am ektoplazentaren Kegel einzuhaken und in ein größengerechtes Loch einzuführen. Um den Embryo zu immobilisieren, drehen Sie den Kegel um 90-120°, so dass die Reichter-Membran an den Lochwänden haftet (Abbildung 3C). Eine alternative Beschreibung finden Sie unter26.
- Bewegen Sie die Schale mit den Embryonen und dem Halter vorsichtig auf die Mikroskopplatte (Abbildung 3F,G).
HINWEIS: Wenn der Embryo nicht gleichmäßig bewegt wird, kann er sich aus dem Halter bewegen. - Senken Sie das Objektiv ab, bis sich an der Grenzfläche zwischen Medium und Objektiv ein flüssiger Meniskus bildet.
- Lokalisieren Sie den Embryo mit Durchlicht unter dem binokularen Mikroskop und stellen Sie den Embryo in den Fokus.
- Montieren Sie die Inkubationskammer und versiegeln Sie sie mit Klebeband um das Objektiv (Abbildung 3F).
- Passen Sie mit einer Live-Aufnahme in der Mikroskopsteuerungssoftware die Laserleistung und die Verstärkungspegel an.
HINWEIS: Für die Zwei-Photonen-Erfassung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) und Tdtomat-Reportern wurden in diesem Protokoll 30 % Ausgangslaserleistung bei 980 nm und 70 % Verstärkung bei nicht abgetasteten Detektoren verwendet (Abbildung 3G). - Um Verdunstung zu vermeiden, bedecken Sie das Medium mit Paraffinöl, indem Sie es langsam auf das Objektiv tropfen.
HINWEIS: Dies ist der letzte Punkt, an dem zusätzliche Embryonen in die Halterung montiert werden können. Sobald man mit Paraffinöl bedeckt ist, müsste man den Halter reinigen und das Medium ersetzen, um dies zu tun. Alternative Montagemethoden finden Sie unter27.
6. Bildaufnahme
- Richten Sie eine Zeitrafferaufnahme ein. Stellen Sie ein Zeitintervall von 5-10 Minuten mit einem z-Abstand von 3-5 μm zwischen den Stapeln ein. Lassen Sie einen leeren Raum auf dem Z-Stapel, um das Wachstum des Embryos zu antizipieren, mindestens 50 μm, und fügen Sie 30 μm für jede Stunde hinzu, in der die Entnahme nicht überwacht wird.
- Falls verfügbar, aktivieren Sie die Option "Automatisches Speichern", um die Überwachung der Erfassung von einem PC aus zu ermöglichen, damit die Z-Stapelgröße bei Bedarf an den interessierenden Bereich im Fokus angepasst werden kann.
Abbildung 3: Live-Imaging-Tools und Setup . (A) Sezieren von Mausembryonen mit einer mit Agarose überzogenen Schale unter dem Stereomikroskop. (B) Diagramm der Schritte zum Sezieren von Mausembryonen für die Lebendbildgebung. (C) Positionierung des Embryos im Halter. (D) Design und Merkmale des Embryohalters. (F) Inkubatorkammer um das Immersionsobjektiv. (G) Diagramm des endgültigen Aufbaus für die Zeitrafferaufnahme. Maßstabsbalken = 500 μm (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir haben das Protokoll verwendet, um die Aktivierung des NOTCH-Signalwegs in frühen kardialen Vorläuferzellen zu visualisieren, die sich während der primitiven Herzröhrenmorphogenese zu Endothelzellen differenzieren. Dazu kreuzten wir Wildtyp-C57BL/6-N-Mäuse mit Tg(CBF:H2BVenus,+)-Mäusen18 , um Embryonen zu erhalten, die NOTCH-Aktivität durch das gelb fluoreszierende Protein Venus berichteten. Bei E7.5 ist die Venusfluoreszenz im gesamten neuralen Ektoderm vorhanden, mit einigen positiven Kernen am splanchnischen und extraembryonalen Mesoderm. Nach 4 h aktivieren endotheliale Vorläuferzellen die Venus und setzen sich zusammen, um den Endokardtubus und die darunter liegenden Aorten zu bilden, die nach 7 h zu geschlossenen Strukturen werden (Abbildung 4).
Abbildung 4: Lebende Herzentwicklung des gesamten Embryos durch Multiphotonen-Bildgebung. Ausgewählte Zeitpunkte aus einem Zeitraffervideo eines CBF:H2BVenus+/- Mausembryos im frühen Knospenstadium (E7.5). (A) Optische Hellfeldabschnitte. (B) 480-510 nm Detektorbande, die die Expression des fluoreszierenden Proteins der Venus zeigt. Maßstabsbalken = 100 μm. Gelbe Pfeilspitzen zeigen auf das sich entwickelnde Endokardlumen und die Aorten. Die Uhrzeit wird in h:min oben rechts auf jedem Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frühe Herzvorläufer organisieren sich in einem primitiven Herzschlauch, der zu schlagen beginnt, während er sich noch bildet. Zu verstehen, wie dieser Prozess abläuft, ist der Schlüssel, um das breite Spektrum angeborener Herzfehler auf bestimmte morphogenetische Ereignisse zurückzuführen. Dafür bietet die Live-Bildgebung die Möglichkeit, die normale und fehlerhafte Embryonalentwicklung mit erhöhter zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, um frühe kardiale Vorläuferzellen zu untersuchen, da sie schnell durch multiples Differenzierungs- und Migrationsverhalten übergehen7.
Da wir verschiedene Embryonalstadien in einer einzigen Probe untersuchen können, kann das hier vorgestellte Live-Bildgebungsprotokoll verwendet werden, um die Interpolation morphogenetischer Ereignisse zu bestätigen, die in der statischen Analyse untersucht wurden. Dies wird dazu beitragen, die Abfolge von Entwicklungsereignissen kontinuierlich zu verstehen. Darüber hinaus liefert die Live-Analyse mehrdimensionale Daten, die eine Klassifizierung von Zelltypen mit bisher unerreichter Präzision durch Messung des zellulären Verhaltens ermöglichen28.
Trotz seiner Vorteile weist das hier vorgeschlagene Verfahren einige Einschränkungen auf. Obwohl sich die Embryonen bis zu 48 Stunden im Mikroskop gut entwickeln können, neigt die interessierende Region dazu, sich bei langen Aufnahmen aus dem Rahmen zu bewegen. Um dies zu verhindern, muss der Benutzer die Drift des Embryos während des Entnahmeprozesses regelmäßig überprüfen. Obwohl es automatische Systeme zur Korrektur des Probenfokus12 gibt, können diese in den meisten kommerziell erhältlichen Mikroskopen nicht implementiert werden. Alternativ können zwei oder mehr Benutzer abwechselnd den Embryorahmen und -stapel überwachen und anpassen, so dass lange Akquisitionen nicht so schwierig sind. Es muss jedoch bedacht werden, dass lange Anschaffungen insbesondere für ungeübte Benutzer eine erhebliche Wahrscheinlichkeit des Scheiterns bergen. Geringfügige Embryoschäden während der Dissektion und eine schlechte Positionierung in der Halterung sind zwei der Hauptursachen. Um diese Fähigkeiten zu verbessern, kann man zunächst montierte Embryonen im Inkubator kultivieren, bevor man Live-Imaging-Experimente ausprobiert. Auf diese Weise kann man testen, ob sich Embryonen richtig entwickeln, bevor man Mikroskopie-Ressourcen ausgibt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Live-Bildgebungsmethoden neue Wege eröffnen, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es, den Ursprung von Phänotypen in mutierten Embryonen detailliert zu analysieren oder die Funktion spezifischer molekularer Signalwege durch pharmakologische Manipulation zu testen. Mit diesem Video-Toolkit wollen wir den breiten Einsatz erleichtern, um die Komplexität der frühen kardialen Vorläuferzellen zu verstehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Kenzo Ivanovitch für seine früheren Arbeiten zu dieser Methode und der Gruppe von Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) für die Bereitstellung der ersten Expertise zur Embryonenmontage. Diese Studie wurde durch den Zuschuss PGC2018-096486-B-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und den Zuschuss H2020-MSCA-ITN-2016-722427 aus dem EU-Programm Horizon 2020 für MT und Zuschuss 1380918 aus dem FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program an JND unterstützt. MS wurde durch ein PhD-Stipendium der La Caixa Foundation (LCF/BQ/DE18/11670014) und ein Reisestipendium der Company of Biologists (DEVTF181145) unterstützt. Das CNIC wird vom spanischen Wissenschaftsministerium und der ProCNIC-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
