Summary
우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.
Abstract
심장 발달의 첫 번째 단계는 세포 행동과 분화의 급격한 변화를 의미합니다. 고정된 배아를 분석하면 특정 발달 단계를 스틸 스냅샷에서 자세히 연구할 수 있지만, 라이브 이미징은 배아가 발달하는 과정을 이미징하여 세포 이동, 모양 변화 및 분화와 같은 동적 형태 발생 사건을 캡처합니다. 이것은 고정 분석을 보완하고 배아 발생 동안 장기가 어떻게 발달하는지에 대한 이해를 넓혀줍니다. 장점에도 불구하고 라이브 이미징은 기술적인 문제로 인해 마우스 모델에서 거의 사용되지 않습니다. 초기 마우스 배아는 생체 외에서 배양할 때 민감하며 효율적인 처리가 필요합니다. 마우스 발달 연구에서 라이브 이미징의 광범위한 사용을 촉진하기 위해 이 논문은 마우스 배아에서 장기간 획득할 수 있는 이광자 라이브 현미경에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜 외에도 배아 처리 및 배양 최적화에 대한 팁이 제공됩니다. 이것은 초기 마우스 기관 형성의 주요 사건을 이해하는 데 도움이 될 것이며, 심혈관 전구 생물학에 대한 이해를 높일 것입니다.
Introduction
심장은 배아 발생 초기에 형성되어 전체 배아에 영양분을 펌핑하기 시작하면서 계속 발달합니다1. 마우스 배아에서, gastrulation이 시작된 지 1 일 반 후, 초보적인 심장 기관이 전극 2,3에 모입니다. 초기 줄무늬(ES) 단계에 이르면 상복부의 심장 전구체는 원시 줄무늬를 통해 초기 중배엽층 4,5,6으로 침투하고 전극으로 이동하기 시작하여 분화하여 원시 심장관을 형성합니다. 이 과정을 통해 초기 심장 전구체는 이동과 더불어 세포 재배열, 형태 변형, 분화를 겪는다7(그림 1).
초기 심장 전구체는 기능 기관을 동시에 구별하고 구축하는 놀라운 능력으로 인해 거의 한 세기 동안 연구자들을 매료 시켰습니다. 지난 20년 동안, 클론 분석 및 조건부 녹아웃 모델은 초기 심장 발달이 매우 역동적인 과정 8,9,10에서 뚜렷한 세포 공급원을 연루시킨다는 것을 보여주었다. 그러나 원시 심장관의 3D 구조와 형태 형성의 역동적인 특성으로 인해 연구하기가 어려우며(그림 1), 우리는 그것의 완전한 복잡성을 이해하는 것과는 거리가 멀다11.
이러한 동적 세포 과정을 연구하기 위해 라이브 이미징 방법은 이제 전례 없는 세부 정보를 제공합니다 7,12,13,14. 마우스 모델에서 실시간 접근 방식은 정적 분석 7,13,15로 다루기 어려운 발달 주제를 조사하는 데 핵심이었습니다. 장기간의 생체 외 배양과 강력한 현미경 설정이 빠르게 발전하고 있지만16,17, 살아있는 배아를 성공적으로 이미지화할 수 있는 전문 지식을 갖춘 연구자는 거의 없습니다. 종이 기반 출판물은 실시간 이미징 실험을 재현하기에 충분한 기술적 세부 정보를 제공하지만 일부 기술과 트릭은 시각적 예제나 피어 투 피어 지원 없이는 파악하기 어렵습니다. 이 학습 과정을 가속화하고 실험실 간에 실시간 이미징 사용을 확산하기 위해 우리는 가스를 배출하는 마우스 배아에 대한 라이브 이미징을 수행하는 데 필요한 기술을 수집하는 비디오 프로토콜(그림 2)을 조립했습니다.
그림 1: 마우스 배아에서 심장 전구 세포의 초기 분화는 위축의 시작부터 원시 심장관 형성 이전 단계까지 진행됩니다. 심장 전구 세포는 gastrulation이 시작된 직후 중배엽으로 침투하여 배아의 반대쪽으로 이동합니다. 형태학적 및 배아일(E) 단계가 다이어그램 위에 기록됩니다. 점선 화살표는 gastrulation 동안 원시 심장 튜브 전구 세포의 이동 궤적을 나타냅니다. 이 수치는11에서 채택되었습니다. 약어: ES = Early Streak; MS = 중간 줄무늬; EHF = 초기 머리 접기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초기 심장 전구체의 실시간 이미징을 위한 워크플로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
모든 동물 절차는 CNIC 동물 실험 윤리 위원회, 마드리드 커뮤니티(참조 PROEX 220/15)의 승인을 받았으며 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 EU 지침 2010/63EU 및 권장 사항 2007/526/EC를 준수했으며, Real Decreto 1201/2005에 따라 스페인 법률에서 시행되었습니다.
이 프로토콜에는 NOTCH 활성 Tg(CBF:H2BVenus,+)18를 보고하는 형광 형질전환 마우스 라인에서 두 마리의 수컷을 사용하는 것이 포함됩니다. 이 프로토콜에 사용된 재료, 동물 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 공구 및 홀더 사용자 정의
- 1cm 길이의 텅스텐 와이어 조각을 자르고 0.02-0.05mm 직경으로 날카롭게 합니다(예: 와이어 끝을 포화 아질산나트륨 용액19에 담그는 것).
- 팔꿈치 유리 모세관을 준비하십시오.
- 표준 1.0mm 유리 모세관의 중간점을 분젠 라이터 위에 3-6초 동안 놓고 모세관이 얇고 유연해질 때까지 양쪽 끝에서 천천히 당깁니다. 이때 모세관을 반으로 쪼개고 짧게 가열하여 팁에서 90cm 떨어진 2° 구부러지도록 합니다.
- 길이 약 7mm, 너비 4mm, 두께 2mm의 폴리메틸 메타크릴레이트 조각을 보았습니다(그림 3D).
알림: 폴리메틸 메타크릴레이트 시트는 재활용 실험실 장비에서 얻거나 새 것으로 주문할 수 있습니다. - 벤치 바이스를 사용하여 메타크릴레이트 조각을 잡습니다. 그런 다음 전체 조각을 가로로 뚫는 사용자 정의 크기의 구멍을 뚫습니다(그림 3D).
참고: 일반적으로 E6.5에서 E7.5 마우스 배아는 0.2-0.5mm 직경의 드릴을 사용해야 합니다.- 낮지만 일정한 압력을 가하면서 드릴을 천천히 돌립니다. 홀더 내부에서 드릴이 파손되면 금속을 꺼낼 수 없으므로 조각을 버리십시오.
- 미세한 파일을 사용하여 홀더의 가장자리를 매끄럽게 하고 크기를 조정합니다. 또한 배아 위치 지정을 용이하게 하기 위해 홀더의 가장자리에 완만한 경사를 만듭니다(그림 3D).
- 완성 된 홀더를 증류수가 담긴 접시에 담아 헹굽니다.
- 구멍에 드릴링 먼지가 포함되어 있는지 확인하기 위해 실체 현미경으로 홀더를 확인하십시오. 먼지가 있으면 텅스텐 바늘을 사용하여 제거하십시오.
- 홀더를 멸균하려면 증류수로 가득 찬 원추형 튜브에 넣고 최소 20W 출력으로 20분 동안 초음파 처리합니다.
2. 매체 준비
- 보체 시스템을 열 비활성화하려면 상업용 또는 수제 20마리 쥐 혈청 500μL 분취액 2개를 56°C에서30 분 동안 그대로 두십시오.
참고: 쥐 혈청을 준비하는 방법에 대한 자세한 프로토콜은21을 참조하십시오. - 세포 배양 후드에서, 현미경에서 배아를 배양하기 위한 배지의 두 분취량을 준비한다. 각각에 대해 생세포 이미징을 위한 DMEM 490μL, 비활성화된 쥐 혈청 500μL, 페니실린-스트렙토마이신 10μL를 혼합하여 최종 농도 50μg/mL 페니실린 및 50μg/mL 스트렙토마이신22를 얻습니다.
참고: 배양 배지의 부피는 배양할 배아의 시간과 수에 따라 다릅니다. 일반적으로 최적의 성장을 위해서는 E7.0 배아에서 하루에 배아당 최소 200μL가 필요합니다. - 2 mL 주사기를 이용하여 배지를 0.22 μm 공극 크기의 멤브레인 필터를 통해 여과하여 새로운 튜브에 넣고 배아 배양23일 전에 37°C 및 7%CO2에서 1시간 동안 세포 배양 배양기에서 뚜껑을 열었습니다.
- L-글루타민 병이 보충된 DMEM 500mL에 소 태아 혈청 50mL, 25mM HEPES-NaOH(pH 7.2) 10mL, 페니실린 및 스트렙토마이신 10mL(50mg/mL)를 추가하여 해부 배지를 준비합니다.
- 다음으로, 50mL 분취량으로 분리하고, 3개의 분취량을 37°C 수조에 넣고, 나머지는 4°C에서 최대 3개월 동안 보관한다.
3. 배아 해부
- E6.75-E7.5 임신한 마우스를 안락사시킨다.
- 자궁을 추출하여 건조하고 깨끗한 종이 닦기에 올려 놓으십시오. 그런 다음 자궁을 자르고 중간 쪽에서 가는 가위 끝을 삽입하고 칼날을 따라 밀어 탈락을 노출시키고 해부 매체로 옮깁니다. 자세한 프로토콜은24를 참조하십시오.
- 배아를 해부하여 외배반 원뿔을 온전하게 유지합니다(그림 3A,B). 자세한 해부 방법은25를 참조하십시오.
- 그런 다음 Reichert의 막을 떼어내고 일부를 배아 외 영역에 남깁니다(그림 3B).
알림: 이 단계에는 미세 집게가 필수적입니다. 경험이 없는 사용자는 2% 아가로스 겔 코팅 접시에서 배아를 해부하여 집게의 끝이 접시 표면에 구부러지는 것을 방지할 수 있습니다(그림 3C). - 해부 매체를 따뜻하게 유지하려면 10분마다 교체하십시오. 또한, 탈락을 3-4마리의 그룹으로 해부하고 나머지는 37°C 수조에 넣어 해부배지에 보관한다. 해부된 배아를 즉시 배양액에 넣습니다.
- 형광 실체현미경을 사용하여 원하는 형광 특징을 가진 배아를 선택하고 세포 배양 배양기의 배양 배지가 들어 있는 튜브에 넣습니다.
- 배아가 E6.5에서 E7.0 단계에 있는 경우 뚜껑을 닫고 이미징 전에 배아가 2시간 동안 회복되도록 둡니다.
참고: E6.5에서 E7.0 배아는 민감합니다. 현미경 바로 아래에 놓을 수도 있지만 사전 배양을 통해 해부에서 가장 잘 회복되는 것을 선택할 수 있어 성공 가능성이 높아집니다.
4. 현미경 준비
- 레이저, 컴퓨터 및 소프트웨어를 포함한 모든 현미경 구성 요소를 켭니다. 온도 조절기를 켜고 평형을 유지하기 위해 37°C 3시간 전에 미리 설정하십시오.
- 침수 감지 대물렌즈를 사용하는 경우 잔여물이 없는 일회용 물티슈를 사용하여 청소하십시오. 60mm 접시를 사용하여 대물렌즈의 팁을 이중 증류수에 담그고 수집이 시작될 때까지 그대로 두십시오.
- CO2 컨트롤러를 켜고 7%로 설정합니다.
- 유리 커버슬립 바닥(직경 14mm)이 있는 35mm 접시에 고진공 실리콘 그리스 한 방울을 떨어뜨리고 홀더를 드롭 위에 놓고 부드럽게 눌러 고정합니다.
- 실체 현미경으로 배양 배지를 추가하여 접시의 유리 바닥 부분을 채웁니다. 그렇게 하는 동안 스트림이 홀더의 구멍으로 향하게 하여 기포가 형성되는 것을 방지하십시오.
- 기포가 남아 있으면 마우스피스로 실리콘 튜브에 연결된 1.2단계에서 준비한 유리 모세관을 사용하여 기포를 부드럽게 빨아들입니다.
알림: 모세관의 팔꿈치 끝은 구멍을 통한 접근을 용이하게 합니다.
5. 배아 장착
- 인큐베이터에서 회복하기 위해 남겨진 2-3 개의 배아를 홀더와 함께 접시에 옮깁니다. 나머지는 인큐베이터에 백업으로 남겨 둡니다.
- 한 쌍의 집게와 테이퍼 텅스텐 바늘을 사용하여 구멍에 배아를 놓습니다. 바늘을 사용하여 배아를 외태반 원뿔로 연결하고 크기에 맞는 구멍에 삽입합니다. 배아를 고정시키려면 원뿔을 90-120° 회전시켜 Reichter의 막이 구멍 벽에 달라붙도록 합니다(그림 3C). 다른 설명은26을 참조하십시오.
- 배아와 홀더가 들어 있는 접시를 현미경 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다(그림 3F,G).
참고: 꾸준히 움직이지 않으면 배아가 홀더 밖으로 이동할 수 있습니다. - 중간 대물렌즈 계면에 액체 메니스커스가 형성될 때까지 대물렌즈를 내립니다.
- 현미경 쌍안경으로 투과광을 사용하여 배아를 찾고 배아에 초점을 맞춥니다.
- 배양 챔버를 장착하고 테이프를 사용하여 대물렌즈 주위를 밀봉합니다(그림 3F).
- 현미경 제어 소프트웨어에서 Live Capture를 사용하여 레이저 출력 및 게인 레벨을 조정합니다.
참고: 녹색 형광 단백질(GFP) 및 Tdtomato 리포터의 이광자 획득을 위해 980nm에서 30% 출력 레이저 출력과 비스캔 검출기에서 70% 이득이 이 프로토콜에 사용되었습니다(그림 3G). - 증발을 방지하려면 대물렌즈에 천천히 떨어뜨려 파라핀 오일로 배지를 덮으십시오.
참고: 이것은 추가 배아를 홀더에 장착할 수 있는 마지막 지점입니다. 파라핀 오일로 덮인 후에는 홀더를 청소하고 매체를 교체해야 합니다. 다른 장착 방법은27을 참조하십시오.
6. 이미지 획득
- 타임랩스 녹화를 설정합니다. 스택 사이에 3-5μm z-공간으로 5-10분의 시간 간격을 설정합니다. 배아 성장을 예상하기 위해 z-스택 상단에 최소 50μm의 빈 공간을 남겨두고 획득이 감독되지 않는 시간마다 30μm를 추가합니다.
- 사용 가능한 경우 자동 저장 옵션을 활성화하여 PC에서 획득을 감독할 수 있도록 하여 필요한 경우 초점 내의 관심 영역에 맞게 z-스택 크기를 조정할 수 있습니다.
그림 3: 실시간 이미징 도구 및 설정 . (A) 실체현미경 하에서 아가로스 코팅된 접시로 마우스 배아를 해부합니다. (B) 라이브 이미징을 위해 마우스 배아를 해부하는 단계의 다이어그램. (C) 홀더의 배아 위치. (D) 배아 홀더 디자인 및 기능. (F) 침지 목표 주변의 인큐베이터 챔버. (G) 타임랩스 획득을 위한 최종 설정 다이어그램. 스케일 바 = 500 μm (A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
우리는 원시 심장관 형태 형성 동안 내피 세포로 분화하려는 초기 심장 전구체에서 NOTCH 신호 활성화를 시각화하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. 이를 위해 야생형 C57BL/6-N 마우스와 Tg(CBF:H2BVenus,+) 마우스18 을 교배하여 노란색 형광 단백질 Venus를 통해 NOTCH 활성을 보고하는 배아를 얻었습니다. E7.5에서 금성 형광은 신경 외배엽 전체에 존재하며 내장 및 배아 외 중배엽에 몇 개의 양성 핵이 있습니다. 4시간 후, 내피 전구체는 금성을 활성화하고 조립하여 심내막관과 기저 대동맥을 형성하며, 이는 7시간 후에 밀폐된 구조가 됩니다(그림 4).
그림 4: 다광자 이미징에 의한 살아있는 전체 배아 심장 발달. 초기 새싹 단계(E7.5)에서 CBF:H2BVenus+/- 마우스 배아의 타임랩스 비디오에서 선택된 시점. (A) 명시야 광학 섹션. (b) 금성 형광 단백질 발현을 보여주는 480-510 nm 검출기 밴드. 스케일 바 = 100 μm. 노란색 화살촉은 발달중인 심내막과 대동맥을 가리 킵니다. 시간은 각 이미지의 오른쪽 상단에 h:min으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초기 심장 전구 세포는 원시 심장 관을 조직하여 아직 형성되는 동안 박동하기 시작합니다. 이 과정이 어떻게 일어나는지 이해하는 것은 특정 형태 발생 사건에 대한 선천성 심장 결함의 광범위한 스펙트럼을 정확히 찾아내는 데 중요합니다. 이를 위해 라이브 이미징은 시간적 해상도가 증가하여 정상 및 결함 있는 배아 발달을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이것은 초기 심장 전구 세포가 여러 분화 및 이동 행동을 통해 빠르게 전환되기 때문에 연구하는 데 특히 유용합니다7.
단일 표본에서 다양한 배아 단계를 연구할 수 있기 때문에 여기에 제시된 라이브 이미징 프로토콜을 사용하여 정적 분석에서 연구된 형태 발생 사건의 보간을 확증할 수 있습니다. 이것은 발달 사건의 순서를 지속적으로 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, 실시간 분석은 다차원 데이터를 산출하며, 이를 통해 세포 행동을 측정함으로써 전례 없는 정밀도로 세포 유형을 분류할 수 있다28.
장점에도 불구하고 여기에서 제안한 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 배아는 현미경 내부에서 최대 48시간까지 잘 발달할 수 있지만 관심 영역은 긴 획득에서 프레임 밖으로 이동하는 경향이 있습니다. 이를 방지하기 위해 사용자는 획득 과정에서 배아의 드리프트를 정기적으로 확인해야 합니다. 샘플 초점을 교정하는 자동 시스템이 존재하지만12, 대부분의 상용 현미경에서는 이러한 시스템을 구현할 수 없습니다. 또는 두 명 이상의 사용자가 번갈아 가며 배아 프레임과 스택을 감독하고 조정할 수 있으므로 긴 획득이 어렵지 않습니다. 그러나 장기 획득은 특히 교육을 받지 않은 사용자의 경우 상당한 실패 가능성이 있음을 명심해야 합니다. 해부 중 경미한 배아 손상과 홀더의 잘못된 위치가 두 가지 주요 원인입니다. 이러한 기술을 향상시키기 위해 라이브 이미징 실험을 시도하기 전에 인큐베이터에서 탑재된 배아를 배양하는 것으로 시작할 수 있습니다. 그렇게 하면 현미경 자원을 소비하기 전에 배아가 제대로 발달하는지 테스트할 수 있습니다.
요약하면, 라이브 이미징 방법은 배아 발달을 연구하는 새로운 길을 열고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 돌연변이 배아에서 표현형의 기원을 자세히 분석하거나 약리학적 조작을 통해 특정 분자 경로의 기능을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오 툴킷을 통해 우리는 초기 심장 전구 세포의 복잡성을 이해하는 데 광범위한 사용을 촉진하는 것을 목표로합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Kenzo Ivanovitch 박사와 배아 장착에 대한 초기 전문 지식을 제공한 Shigenori Nonaka 박사(일본 국립 자연 과학 연구소) 그룹에 감사를 표합니다. 이 연구는 스페인 Ministerio de Ciencia e Innovación의 Grant PGC2018-096486-B-I00 및 EU Horizon 2020 프로그램의 Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427에서 MT로, FEDER Andalucía 2014-2020 운영 프로그램에서 JND로의 Grant 1380918의 지원을 받았습니다. MS는 La Caixa Foundation PhD 펠로우십(LCF/BQ/DE18/11670014)과 The Company of Biologists 여행 펠로우십(DEVTF181145)의 지원을 받았습니다. CNIC는 스페인 과학부와 ProCNIC 재단의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
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