Summary
We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo's dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.
Abstract
De eerste stappen van de ontwikkeling van het hart impliceren drastische veranderingen in celgedrag en differentiatie. Terwijl analyse van vaste embryo's het mogelijk maakt om specifieke ontwikkelingsstadia in een stilstaande momentopname in detail te bestuderen, legt live beeldvorming dynamische morfogenetische gebeurtenissen vast, zoals celmigratie, vormveranderingen en differentiatie, door het embryo in beeld te brengen terwijl het zich ontwikkelt. Dit is een aanvulling op vaste analyse en vergroot het begrip van hoe organen zich ontwikkelen tijdens embryogenese. Ondanks de voordelen wordt live imaging zelden gebruikt in muismodellen vanwege de technische uitdagingen. Vroege muizenembryo's zijn gevoelig wanneer ze ex vivo worden gekweekt en vereisen een efficiënte behandeling. Om een breder gebruik van live imaging in onderzoek naar de ontwikkeling van muizen mogelijk te maken, presenteert dit artikel een gedetailleerd protocol voor twee-foton live microscopie dat langdurige acquisitie in muizenembryo's mogelijk maakt. Naast het protocol worden er tips gegeven over embryobehandeling en kweekoptimalisatie. Dit zal helpen bij het begrijpen van belangrijke gebeurtenissen in de vroege organogenese van muizen, waardoor het begrip van de cardiovasculaire voorloperbiologie wordt verbeterd.
Introduction
Het hart vormt zich vroeg tijdens de embryogenese om voedingsstoffen naar het hele embryo te pompen, terwijl het zich blijft ontwikkelen1. Bij muizenembryo's verzamelt anderhalve dag na het begin van de gastrulatie een rudimentair hartorgaan zich aan de voorste pool 2,3. In het stadium van de vroege streep (ES) dringen hartvoorlopers in de epiblast binnen via de primitieve streep naar de ontluikende mesodermale laag 4,5,6 en beginnen te migreren naar de voorste pool, waar ze differentiëren om de primitieve hartbuis te vormen. Gedurende dit proces ondergaan vroege hartvoorlopers celherschikkingen, vormtransformaties en differentiatie, naast migratie7 (figuur 1).
Vroege cardiale voorlopers hebben bijna een eeuw lang onderzoekers aangetrokken vanwege hun opmerkelijke vermogen om tegelijkertijd te differentiëren en een functioneel orgaan te bouwen. In de afgelopen twee decennia hebben klonale analyse en voorwaardelijke knock-outmodellen aangetoond dat vroege hartontwikkeling verschillende celbronnen impliceert in een zeer dynamisch proces 8,9,10. De 3D-structuur van de primitieve hartbuis en de dynamische aard van zijn morfogenese maken het echter een uitdaging om te bestuderen (figuur 1), en we zijn nog lang niet klaar met het begrijpen van de volledige complexiteitervan 11.
Om deze dynamische cellulaire processen te bestuderen, bieden live beeldvormingsmethoden nu een ongekend detail 7,12,13,14. In het muismodel zijn live benaderingen de sleutel geweest tot het ondervragen van ontwikkelingsonderwerpen die moeilijk aan te pakken zijn door statische analyse 7,13,15. Terwijl langdurige ex vivo kweek en robuuste microscoopopstellingen snel vorderen16,17, hebben maar weinig onderzoekers de expertise om levende embryo's met succes in beeld te brengen. Hoewel papieren publicaties voldoende technische details bieden om live beeldvormingsexperimenten te reproduceren, zijn sommige vaardigheden en trucs moeilijk te begrijpen zonder visuele voorbeelden of peer-to-peer-assistentie. Om dit leerproces te versnellen en het gebruik van live imaging onder laboratoria te verspreiden, hebben we een videoprotocol samengesteld (figuur 2) dat de nodige vaardigheden verzamelt om live imaging uit te voeren op gastrulerende muizenembryo's.
Figuur 1: Vroege differentiatie van cardiale voorlopercellen in het muizenembryo vanaf het begin van gastrulatie tot het stadium voorafgaand aan primitieve hartbuisvorming. Cardiale voorlopercellen dringen het mesoderm binnen kort na het begin van de gastrulatie en migreren naar de andere kant van het embryo. Morfologische en embryonale dag (E) fase zijn geschreven op de top van de diagrammen. Onderbroken pijlen verbeelden het migratietraject van primitieve hartbuisvoorlopers tijdens gastrulatie. Dit cijfer werd aangepast van11. Afkortingen: ES = Early Streak; MS = middelste streep; EHF = vroege hoofdplooi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werkstroomdiagram voor live beeldvorming van vroege hartvoorlopers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van de CNIC, door de Gemeenschap van Madrid (referentie PROEX 220/15) en voldeden aan EU-richtlijn 2010/63EU en aanbeveling 2007/526/EG betreffende de bescherming van dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden, afgedwongen in de Spaanse wetgeving onder Real Decreto 1201/2005.
Dit protocol omvat het gebruik van twee mannetjes uit de fluorescerende transgene muizenlijn die NOTCH-activiteit Tg(CBF:H2BVenus,+)18 rapporteren. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over materialen, dieren en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Gereedschap en houder aanpassen
- Knip 1 cm lange wolfraamdraadstukken en slijp ze tot een diameter van 0,02-0,05 mm met behulp van een van de eenvoudige beschikbare methoden, bijvoorbeeld het onderdompelen van de punt van de draad in een verzadigde natriumnitrietoplossing19.
- Bereid elleboogvormige glazen haarvaten voor.
- Plaats het middelpunt van een standaard 1,0 mm glazen capillair gedurende 3-6 s over een Bunsen-aansteker en trek langzaam aan beide uiteinden totdat het capillair dun en flexibel wordt. Breek op dat moment het capillair doormidden en verwarm het kort om een bocht van 90° te maken op 2 cm van de punt.
- Zaag een stuk polymethylmethacrylaat van ongeveer 7 mm lang, 4 mm breed en 2 mm dik (figuur 3D).
OPMERKING: Polymethylmethacrylaatplaten kunnen worden verkregen uit gerecyclede laboratoriumapparatuur of nieuw worden besteld. - Houd het methacrylaatstuk vast met behulp van een bankschroef. Boor vervolgens gaten op maat dwars door het hele stuk (figuur 3D).
OPMERKING: Doorgaans moeten E6,5 tot E7,5 muizenembryo's boren met een diameter van 0,2-0,5 mm worden gebruikt.- Draai de boor langzaam terwijl u een lage maar constante druk uitoefent. Als een boor in de houder breekt, gooi het stuk dan weg, omdat het metaal er niet uit kan worden gehaald.
- Gebruik een fijne vijl om de randen van de houder glad te strijken en de grootte aan te passen. Maak bovendien een milde helling aan de randen van de houder om de positionering van het embryo te vergemakkelijken (figuur 3D).
- Plaats de afgewerkte houder in een schaal met gedestilleerd water om deze af te spoelen.
- Controleer de houder onder de stereomicroscoop om te zien of de gaten boorstof bevatten. Als er stof aanwezig is, gebruik dan wolfraamnaalden om het te verwijderen.
- Om de houder te steriliseren, plaatst u deze in een conische buis vol gedestilleerd water en soniceert u deze gedurende 20 minuten met een minimaal vermogen van 20 W.
2. Mediavoorbereiding
- Om het complementsysteem te inactiveren, laat u twee 500 μL aliquots van commercieel of zelfgemaakt 20 rattenserum gedurende30 minuten op 56 °C staan.
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol over het bereiden van rattenserum, zie21. - Bereid in een celkweekkap twee aliquots van het medium voor het kweken van de embryo's in de microscoop. Meng voor elk 490 μL DMEM voor beeldvorming van levende cellen, 500 μL geïnactiveerd rattenserum en 10 μL penicilline-streptomycine om een eindconcentratie van 50 μg / ml penicilline en 50 μg / ml streptomycine22 te verkrijgen.
OPMERKING: Het volume van het kweekmedium is afhankelijk van de tijd en het aantal te kweken embryo's. Als vuistregel geldt dat optimale groei minimaal 200 μL per embryo per dag vereist in E7.0-embryo's. - Filtreer met een spuit van 2 ml het medium door een membraanfilter van 0,22 μm poriegrootte in een nieuwe buis en plaats het deksel open in een celkweekincubator bij 37 °C en 7% CO2 gedurende 1 uur vóór embryocultuur23.
- Bereid het dissectiemedium door aan een 500 ml DMEM aangevuld met L-glutaminefles het volgende toe te voegen: 50 ml foetaal runderserum, 10 ml 25 mM HEPES-NaOH (pH 7,2) en 10 ml penicilline en streptomycine (50 mg / ml).
- Scheid het vervolgens in aliquots van 50 ml, plaats drie aliquots in een bad van 37 °C en bewaar de rest bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
3. Embryodissectie
- Euthanaseer een E6.75-E7.5 zwangere muis.
- Pak de baarmoeder uit en plaats deze op een droog en schoon papieren doekje. Knip vervolgens de baarmoeder, steek de punt van de fijne schaar van de mesometrische kant in en schuif het mes langs om de deciduae bloot te leggen en over te brengen naar het dissectiemedium. Voor een gedetailleerd protocol, zie24.
- Ontleed de embryo's en houd de ectoplacentale kegel intact (figuur 3A,B). Voor een gedetailleerde dissectiemethode, zie25.
- Verwijder vervolgens het membraan van de Reichert en laat een deel ervan achter op het extra-embryonale gebied (figuur 3B).
OPMERKING: Fijne tangen zijn essentieel voor deze stap. Onervaren gebruikers kunnen embryo's ontleden op 2% agarose gel-gecoate gerechten om te voorkomen dat de uiteinden van de tang tegen het schoteloppervlak buigen (figuur 3C). - Om de dissectie medium warm te houden, vervang je deze elke 10 min. Ontleed bovendien deciduae in groepen van 3-4 terwijl u de rest in een bad van 37 °C houdt. Plaats de ontleedde embryo's onmiddellijk in het kweekmedium.
- Selecteer de embryo's met de gewenste fluorescentiekenmerken met behulp van een fluorescentiestereomicroscoop en plaats ze in de buis met kweekmedium in de celkweekincubator.
- Als de embryo's zich in de stadia E6,5 tot E7,0 bevinden, sluit u het deksel en laat u de embryo's gedurende 2 uur herstellen voordat u de beeldvorming uitvoert.
OPMERKING: E6.5 tot E7.0 embryo's zijn gevoelig. Ze kunnen ook direct onder de microscoop worden geplaatst, maar preculturing maakt het mogelijk om degenen te selecteren die het beste herstellen van dissectie, waardoor de kans op succes toeneemt.
4. Microscoop voorbereiding
- Schakel alle microscooponderdelen in, inclusief lasers, computer en software. Zet de temperatuurregelaars aan en stel 3 uur van tevoren in op 37 °C om evenwicht te garanderen.
- Als u een onderdompelingsdetectiedoel gebruikt, reinigt u het met een residuvrij wegwerpdoekje. Dompel de punt van het objectief in dubbel gedestilleerd water met behulp van een schaal van 60 mm en laat het staan totdat de acquisitie begint.
- Schakel de CO2-controller in en stel deze in op 7%.
- Plaats een druppel hoogvacuüm siliciumvet op een schaal van 35 mm met glazen afdekplaat (14 mm diameter), plaats de houder bovenop de druppel en druk zachtjes aan om deze te immobiliseren.
- Voeg onder een stereomicroscoop kweekmedium toe om het glazen bodemgedeelte van de schaal te vullen. Terwijl u dit doet, richt u de stroom naar de gaten van de houder om de vorming van luchtbellen daarin te voorkomen.
- Als de bubbels achterblijven, gebruik dan het glazen capillair dat is voorbereid in stap 1.2, verbonden met een siliconenbuis met een mondstuk, om de bubbels voorzichtig naar buiten te zuigen.
OPMERKING: Het elleboogvormige uiteinde van het capillair vergemakkelijkt de toegang door de gaten.
5. Montage van embryo's
- Breng 2-3 embryo's die zijn achtergelaten om te herstellen in de couveuse over naar de schaal met de houder. Laat de rest in de couveuse als back-up.
- Zet de embryo's in de gaten met behulp van een tang en een taps toelopende wolfraamnaald. Gebruik de naald om het embryo aan de ectoplacentale kegel te haken en in een gat te steken dat overeenkomt met de grootte. Om het embryo te immobiliseren, draait u de kegel 90-120° zodat het membraan van de Reichter zich aan de gatwanden hecht (figuur 3C). Voor een alternatieve beschrijving, zie26.
- Verplaats de schaal met de embryo's en de houder voorzichtig naar de microscoopplaat (figuur 3F,G).
OPMERKING: Als het embryo niet gestaag wordt verplaatst, kan het uit de houder bewegen. - Verlaag het objectief totdat een vloeibare meniscus wordt gevormd op het middel-objectieve grensvlak.
- Lokaliseer het embryo met behulp van doorgelaten licht onder de microscoop verrekijker en plaats het embryo in focus.
- Monteer de incubatiekamer en sluit deze met tape rond het objectief af (figuur 3F).
- Met behulp van een Live Capture op de microscoopbesturingssoftware kunt u de laseruitvoer- en versterkingsniveaus aanpassen.
OPMERKING: Voor twee-foton acquisitie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en Tdtomato-verslaggevers werden 30% uitgangslaservermogen bij 980 nm en 70% versterking op niet-gescande detectoren gebruikt in dit protocol (figuur 3G). - Om verdamping te voorkomen, bedek het medium met paraffineolie door het langzaam op het doel te druppelen.
OPMERKING: Dit is het laatste punt waar extra embryo's in de houder kunnen worden gemonteerd. Eenmaal bedekt met paraffineolie, zou men de houder moeten reinigen en het medium moeten vervangen om dit te doen. Voor alternatieve montagemethoden zie27.
6. Beeldacquisitie
- Time-lapse-opname instellen. Stel een tijdsinterval van 5-10 minuten in met 3-5 μm z-ruimte tussen stapels. Laat een lege ruimte bovenop de z-stack om te anticiperen op de groei van het embryo, minimaal 50 μm, waarbij 30 μm wordt toegevoegd voor elk uur dat de acquisitie niet wordt gecontroleerd.
- Schakel, indien beschikbaar, de optie Automatisch opslaan in om toezicht op de acquisitie vanaf een pc mogelijk te maken, zodat de grootte van de z-stack, indien nodig, kan worden aangepast aan het interessegebied binnen de focus.
Figuur 3: Live imaging tools en setup . (A) Ontleden van muizenembryo's met een met agarose bedekte schaal onder de stereomicroscoop. (B) Diagram van de stappen om muizenembryo's te ontleden voor levende beeldvorming. C) Plaatsing van het embryo in de houder. (D) Ontwerp en kenmerken van de embryohouder. (F) Incubatorkamer rond het onderdompelingsdoel. (G) Diagram van de definitieve instellingen voor time-lapse-acquisitie. Schaalbalk = 500 μm (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten het protocol om NOTCH-signaleringsactivatie te visualiseren in vroege cardiale voorlopers die op het punt stonden te differentiëren naar endotheelcellen tijdens primitieve morfogenese van de hartbuis. Daarvoor kruisten we wild-type C57BL / 6-N-muizen met Tg (CBF: H2BVenus, +) muizen18 om embryo's te verkrijgen die NOTCH-activiteit rapporteerden via geel fluorescerend eiwit Venus. Bij E7.5 is venusfluorescentie aanwezig in het neurale ectoderm, met enkele positieve kernen bij het splanchnische en extra-embryonale mesoderm. Na 4 uur activeren endotheelvoorlopers Venus en assembleren zich om de endocardiale buis en onderliggende aorta's te vormen, die na 7 uur ingesloten structuren worden (figuur 4).
Figuur 4: Levende hartontwikkeling van het hele embryo door middel van multifotonenbeeldvorming. Geselecteerde tijdspunten uit een time-lapse video van een CBF:H2BVenus+/- muisembryo in het vroege knopstadium (E7.5). (A) Optische profielen van Brightfield. (B) 480-510 nm detectorband die Venus fluorescerende eiwitexpressie laat zien. Schaalstaven = 100 μm. Gele pijlpunten wijzen naar het zich ontwikkelende endocardiale lumen en aorta's. De tijd wordt aangegeven in h:min rechtsboven in elke afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vroege hartvoorlopers organiseren zich in een primitieve hartbuis die begint te kloppen terwijl deze zich nog aan het vormen is. Begrijpen hoe dit proces plaatsvindt, is de sleutel tot het lokaliseren van het brede spectrum van aangeboren hartafwijkingen tot specifieke morfogenetische gebeurtenissen. Daarvoor biedt live beeldvorming de mogelijkheid om de normale en gebrekkige embryonale ontwikkeling met verhoogde temporele resolutie te bestuderen. Dit is vooral nuttig om vroege cardiale voorlopercellen te bestuderen, omdat ze snel overgaan door meerdere differentiatie- en migratiegedragingen7.
Omdat we verschillende embryonale stadia in een enkel exemplaar kunnen bestuderen, kan het hier gepresenteerde live beeldvormingsprotocol worden gebruikt om de interpolatie van morfogenetische gebeurtenissen die in statische analyse worden bestudeerd, te bevestigen. Dit zal helpen om de opeenvolging van ontwikkelingsgebeurtenissen op een continue manier te begrijpen. Bovendien levert live analyse multidimensionale gegevens op, waardoor celtypen met ongekende precisie kunnen worden geclassificeerd door cellulair gedrag te meten28.
Ondanks de voordelen heeft de hier voorgestelde methode enkele beperkingen. Hoewel de embryo's zich tot 48 uur in de microscoop goed kunnen ontwikkelen, heeft het gebied van belang de neiging om uit beeld te raken bij lange verwervingen. Om dat te voorkomen, moet de gebruiker tijdens het verwervingsproces regelmatig de drift van het embryo controleren. Hoewel er automatische systemen bestaan om de focus van monsters te corrigeren12, kunnen deze niet worden geïmplementeerd in de meeste commercieel verkrijgbare microscopen. Als alternatief kunnen twee of meer gebruikers om de beurt toezicht houden op het embryoframe en de stapel, zodat lange acquisities niet zo uitdagend zijn. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat lange overnames een aanzienlijke kans op mislukking hebben, vooral voor ongetrainde gebruikers. Kleine embryoschade tijdens dissectie en slechte positionering in de houder zijn twee van de belangrijkste oorzaken. Om deze vaardigheden te verbeteren, kan men beginnen met het kweken van gemonteerde embryo's in de couveuse voordat men live beeldvormingsexperimenten probeert. Op die manier kan men testen of embryo's zich goed ontwikkelen voordat men microscopiemiddelen uitgeeft.
Kortom, live beeldvormingsmethoden openen nieuwe wegen om de embryonale ontwikkeling te bestuderen. Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om de oorsprong van fenotypes in gemuteerde embryo's in detail te analyseren of de functie van specifieke moleculaire routes door farmacologische manipulatie te testen. Met deze videotoolkit willen we het brede gebruik ervan vergemakkelijken om de complexiteit van vroege cardiale voorlopers te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Dr. Kenzo Ivanovitch voor eerder werk aan deze methode en de groep van Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) voor het leveren van de initiële expertise over embryomontage. Deze studie werd ondersteund door Grant PGC2018-096486-B-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 van het EU Horizon 2020-programma aan MT en Grant 1380918 van het FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program aan JND. MS werd ondersteund door een La Caixa Foundation PhD fellowship (LCF/BQ/DE18/11670014) en The Company of Biologists travelling fellowship (DEVTF181145). De CNIC wordt ondersteund door het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de ProCNIC Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
