הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.
זיהום של גידולי Brassica על ידי פרוטיסט Plasmodiophora brassicae הנישא בקרקע מוביל להיווצרות כיס על האיברים התת-קרקעיים. היווצרות כיס המרה דורשת תכנות מחדש של התאים ושינויים בחילוף החומרים של הצמח הנגוע. זה הכרחי כדי להקים כיור פיזיולוגי מוכוון פתוגנים שאליו מנותבים חומרי המזון המארחים. להבנה מלאה של האינטראקציה המסוימת הזו בין צמח לפתוגן ואת המנגנונים שבאמצעותם הצמיחה וההתפתחות של המארח מתערערים ומתחדשים, חיוני לעקוב ולבחון את השינויים הפנימיים המלווים את היווצרות הכיס ברזולוציה תאית. שיטות המשלבות כתמים פלואורסצנטיים וחלבונים פלואורסצנטיים משמשות לעתים קרובות לחקר תגובות אנטומיות ופיזיולוגיות בצמחים. למרבה הצער, גודלם הגדול של הגלים ושקיפותם הנמוכה משמשים מכשולים עיקריים בביצוע תצפיות שלמות מתחת למיקרוסקופ. יתר על כן, שקיפות נמוכה מגבילה את השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את התקדמות המחלה ואת היווצרות כיס המרה. מאמר זה מציג שיטה אופטימלית לתיקון וניקוי כיס המרה כדי להקל על אפיפלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית לבדיקת גלים נגועים ב- P. brassicae. נעשה שימוש בפרוטוקול ניקוי רקמות לניקוי אופטי מהיר ואחריו חתך ויברטום כדי לזהות שינויים אנטומיים ולמקם ביטוי גנים עם היתוך מקדם וקווי דיווח המתויגים בחלבונים פלואורסצנטיים. שיטה זו תוכיח את עצמה כיעילה לחקר תגובות תאיות ופיזיולוגיות במבנים אחרים המופעלים על ידי פתוגנים בצמחים, כגון סינקטיה הנגרמת על ידי נמטודה וקשרי שורשים, כמו גם גלי עלים ועיוותים הנגרמים על ידי חרקים.
צמחים המושפעים מפתוגנים או מחרקים עלולים לפתח מבנים לא תקינים (עיוותי איברים או כיס מרה), המאפשרים לפולש לבלוע חומרי מזון ולהתרבות1. כאן, ננקטה גישה היסטופתולוגית יעילה כדי לחקור את השינויים המתרחשים בכיסים המתפתחים בחלקים התת-קרקעיים של צמחים הנגועים ב-Plasmodiophora brassicae (איור 1). החוט הקטין הקשור לפתוגן זה נובע מהעובדה כי נבגי מנוחה P. brassicae יכולים לשמור על יכולתם לפלוש לצמחים במשך שנים רבות. במקרה של גידול בקנה מידה גדול של אונס זרעי שמן (Brassica napus), זוהי בעיה רצינית שכן גורמים כלכליים להגביל את סיבוב היבול, מה שמוביל הצטברות נבגים מנוחהבקרקע 2. עמידותו של אונס זרעי שמן למחלת קלאברוט הנגרמת על ידי P. brassicae נקבעת גנטית. למרבה הצער, הפתוגן לעתים קרובות מתעלה על ההתנגדות בגלל הביולוגיה שלו והמאגר הגנטי הצר שממנו מקורו של אונס זרעי שמן. לכן, זה הפך להיות רלוונטי לחקור את התגובות שלאחר ההדבקה בצמחים המארחים ואת יכולתם להאט את התקדמות המחלה או למנוע התפתחות תסמינים מסוימים.
במחלת קלאברוט, החומרה מוערכת בדרך כלל על סמך התפתחות כיס המרה ומידת הנזק למערכת השורשים. זה ידוע בשם מדד המחלה-DI3. עם זאת, הוא אינו לוכד באופן מלא את ההערכה האמיתית של אינטראקציה זו בין צמח לפתוגן. בפרט, הוא אינו מתייחס לאופן שבו הפתוגן מופץ בתוך השורשים ואם הצמח יכול לרסן P. brassicae תנועה בתוך הרקמות שלה. יתר על כן, לא קל לצפות באיזו מידה P. brassicae מתכנת מחדש אנטומיה של איברים תת קרקעיים. מחקרים על צמח המודל Arabidopsis thaliana הראו כי P. brassicae זיהום מוביל לעיכוב של קסילוגנזה (הן שלבי ההתחלה והן שלבי ההבשלה) ולהגברת התמיינות הפלום בתוך כיס המרה4,5. יתר על כן, בשורשים ובהיפוקוטיל של צמחים נגועים, צאצאי התאים הקמביאליים אינם עוזבים את המצב המיטוטי ומתרבים זמן רב יותר מאשר בצמחים בריאים.6. תהליך זה קובע את הגודל הסופי של כיס המרה וקובע את מספר נבגי המנוחה הפתוגנים המיוצרים בתוך הצמח הנגוע. P. brassicae-תכנות מחדש התפתחותי, מטבולי ופיזיולוגי מונע בפונדקאי הוא מורכב מאוד7; לכן, היישום של כלים המאפשרים בדיקה של שינויים פנימיים בתוך galls הוא חיוני להערכה נכונה של אינטראקציה זו. התקדמות מחזור החיים של P. brassicae מלווה בתכנות מחדש של חילוף החומרים של התא המארח, אשר ניתן לראות כמו עמילן או תצהיר שומנים7,8. המכשול העיקרי למיקרוסקופיה המוצלחת של כיסים נובע מהשקיפות הנמוכה שלהם. בשל כך, רוב הדגימות ההיסטולוגיות המציגות שינויים מונחי-קלאברוט בתוך גאלים מקורן בטכניקות של הטמעת קיבוע (שעווה או שרף) ולאחר מכן חיתוך מיקרוטום. גישות כאלה שימשו בהצלחה לאיתור פעילות המקדם של גנים רבים הפעילים ב-clubroot galls4,5 או טכניקות צביעה שונות המקלות על התצפית של P. brassicae התקדמות מחזור החיים9. עם זאת, יש לציין כי שלבי התיקון וההטבעה גוזלים זמן רב וגורמים לשטיפה חלקית או מלאה של ביומולקולות חשובות (למשל, שומנים), מה שמעכב באופן משמעותי תצפיות מסוימות. לאחרונה P. brassicae התקדמות מחזור החיים בפונדקאי הודגמה בעזרת הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH), שבה מתיל-טרנספראז מסוג SABATH (PbBSMT) בדיקה ספציפית לגן שימשה לסימון היווצרות נבגים במנוחה10. חלופה טובה היא השימוש בשיטות אחרות המבוססות על פלואורסצנציה, שבהן ניתן לראות את ה-autofluorescence של חלק מרכיבי התא, את הפעילות של 5′- אזורים רגולטוריים במעלה הזרם של גנים שהתמזגו לסמני חלבון פלואורסצנטיים, ואת הצטברות של חלבונים מסוימים המתויגים באופן פלואורסצנטי. עם זאת, בנוסף לשקיפות הנמוכה של הדגימות, חסרון גדול הקשור לאובייקטים כאלה הוא עבודה עם דגימות unfixed, אשר מקטין באופן משמעותי את הזמן שבו תמונות באיכות טובה ניתן לתעד. בשנת 2015, Kurihara et al.11 פיתח ריאגנט ניקוי, המאפשר שימור של חלבונים פלואורסצנטיים ומגביר את השקיפות של דגימות רקמת הצמח. בנוסף, הוא תואם כתמים היסטולוגיים רבים. לאחרונה, אותה טכניקה יושמה בהצלחה כדי לדמיין רכיבים שונים של דופן התא ברקמות הצמח12,13. כאן, פרוטוקול זה שימש לניתוח היבטים שונים של פיתוח גל. תהליך העבודה מתחיל בקיבוע של כיס מרה, חיתוך ויברטום, ניקוי רקמות, צביעה והדמיה פלואורסצנטית. בהתאם לצרכים של אחד, ישירות או לאחר צביעה מסוימת, החלקים המתקבלים יכולים להיות נתונים לבדיקה תחת אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו מספקת פתרון יעיל לחקר שינויים מקומיים בביטוי גנים ובתגובות פיזיולוגיות, כולל איזון ואיתות פיטוהורמון. ניתן לעקוב אחר התקדמות המחלה על ידי התבוננות בדפוס ההתפלגות של נבגי מנוחה ודינמיקת ההבשלה. יתר על כן, ניתן ליישם את הפרוטוקול בקלות עבור שינויים אופייניים להדמיה בתוך P. brassicae צמחים נגועים, כולל עיכוב של קסילוגנזה או תגובות ההגנה של הצמח המארח הנראות כגניציה מקומית בגנוטיפים עמידים. דוגמאות בפרוטוקול זה מגיעות מהדמיה שנערכה על Arabidopsis thaliana מודל; עם זאת, ניתן להחיל את הפרוטוקול גם על מיני יבולים אחרים השייכים ל Brassicaceae משפחה. השיטה המתוארת להלן תאפשר מחקרים מפורטים עתידיים של מבנים תאיים ושינויים מולקולריים המלווים היווצרות כיס המרה ב P. brassicae-צמחים נגועים.
זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול היא פשוטה למדי, וניתן לדמות ולאפיין בקלות את כל שלבי הפיתוח (איור 2). מאז P. brassicae הוא פתוגן המועבר, כל הניסויים חייבים להתבצע במערכות מבוססות קרקע. הפתוגן מעדיף תנאים חומציים; לכן, יש להשתמש במצעי קרקע שאינם מטופלים בסיד. למרות P. brassicae אינו מהווה איום על בני אדם, זה בהחלט פתוגן צמחי שיכול להתפשט דרך הקרקע והמים. לכן, כל החלקים של הצמח נגוע, כמו גם את הקרקע, צריך להיהרס לאחר הניסוי על ידי autoclaving או על ידי טיפול עם אקונומיקה.
יישום תמיסת הניקוי על מקטעים חתוכים ברטט של כיס המרה בוודאי משפר את היכולת לחקור את האינטראקציה הביוטרופית בין P. brassicae לבין הצמח המארח. למרות שפרוטוקול הניקוי חל אפילו על מקטעי ידיים, הוא עובד טוב יותר עם קטעי ויברטום. תיקון דגימות בקיבוע PFA פועל כשלב קריטי בפרוטוקול מכיוון שניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לפני שתמשיך בחתך. זה מספק גמישות לאחסון דגימות לתקופה מוגבלת מבלי להתפשר על הביטוי והשימור של חלבונים פלואורסצנטיים במהלך הקיבוע.
אדום הנילוס (ב-DMSO או במתנול) אינו תואם למקטעי שרף בשל ההידרופוביות שלו, הממיסה שרף והורסת את החלקים17 המשובצים בשרף. לפיכך, מקטעי ויברטום מוכיחים את עצמם כמסייעים לחקר התפלגות הפתוגן ומחזור החיים שלו בתוך כיסים מתפתחים, שבהם ניתן להשתמש בקלות בכתמים של אדום הנילוס.
תמיסת הניקוי המשמשת בפרוטוקול זה היא רב-תכליתיתביותר 12, ומאפשרת שימוש במגוון כתמי פלואורסצנציה בשילובים שונים כדי להכתים ביומולקולות/רכיבים שונים של דפנות התא (סוברין, ליגנין, תאית וכיטין באינטראקציות פטרייתיות). ניתן גם לנטרל קטעים של קווי סמן GFP פלואורסצנטיים ובכך לתאם את פעילות המקדם או דפוס הצטברות החלבון עם נוכחות הפתוגן בתאים או באזורים מסוימים של כיס המרה. עם זאת, לא ניתן היה לבטל את ה-autofluorescence של הרקע מ-xylem ותאי ענק מלאים בפתוגנים גם לאחר פרוטוקול הסליקה. זה מציג מגבלה להתבוננות בסמנים פלואורסצנטיים בשלבים מאוחרים יותר של היווצרות כיס מרה, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי והדמיית אותות חלשים.
בשל רמות נמוכות של ביטוי / הצטברות של אותות פלואורסצנטיים, גורמי שעתוק קשה לזהות, אבל, עם טכניקה זו, ניתן להשיג תמונות משביעות רצון עבורם. באופן כללי, שילוב של חיתוך ויברטום עם גישת ניקוי הרקמות מרחיב את ארגז הכלים לתצפיות היסטולוגיות של רקמות מרה מורכבות. הגמישות של פרוטוקול זה מקלה על תהליך קיבוע הרקמות ומפחיתה את הזמן הדרוש לחיתוך והדמיה של דגימות רקמה טריות כדי לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים ולקדם פעילויות. עם שיפורים נוספים ועל ידי שימוש בצבעים פלואורסצנטיים אחרים הספציפיים לביומולקולות שונות, שיטה זו תסמן התקדמות גדולה יותר במחקרים היסטולוגיים ובניתוח תמונה של רקמות צפופות ואטומות עם ארגון רקמות מורכב. בתקופה האחרונה, שיטת ניקוי הרקמות המוצגת התגלתה כפרוטוקול פופולרי ונפוץ לשילוב ולאפשר רכישה בו זמנית של אותות פלואורסצנטיים שונים11,12,13. פיתוח ושינויים עתידיים בטכניקות כאלה ישפרו מאוד את רזולוציית התמונה לצפייה באינטראקציות בין צמחים לפתוגנים ברמה התאית.
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכה על ידי מרכז המדע הלאומי פולין OPUS17 מענק מס ‘2019/33/B/NZ9/00751 “תיאום כלי דם למרחקים ארוכים בצמחים נגועים על ידי פלזמודיופורה brassicae“. אנו מודים לפרופ’ Yrjö Helariutta (מעבדת סיינסבורי, אוניברסיטת קיימברידג’) על שיתוף קו proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |