本プロトコルは、 Plasmodiophora brassicae によって誘導されるゴールの組織学的観察のための最適化された方法を記載する。胚軸のビブラトーム切片は、蛍光イメージングの前に除去され、疾患進行中の転写因子と植物ホルモンの関与を研究します。このプロトコルは、樹脂包埋の制限を克服し、蛍光タンパク質の プランタ 可視化を可能にします。
土壌媒介原生生物 Plasmodiophora brassicae によるアブラナ属作物の感染は、地下器官の胆汁形成につながります。ゴールの形成には、細胞のリプログラミングと感染した植物の代謝の変化が必要です。これは、宿主栄養素がリダイレクトされる病原体指向の生理学的シンクを確立するために必要です。この特定の植物と病原体の相互作用と、宿主の成長と発達が破壊され、再パターン化されるメカニズムを完全に理解するためには、細胞分解能で胆汁形成に伴う内部変化を追跡および観察することが不可欠です。蛍光染色と蛍光タンパク質を組み合わせた方法は、植物の解剖学的および生理学的応答を研究するためによく使用されます。残念ながら、ゴールのサイズが大きく、透明度が低いことが、顕微鏡下でのホールマウント観察を行う際の大きなハードルとなっています。さらに、透明度が低いため、根管疾患の進行と胆汁形成を研究するための蛍光顕微鏡の使用が制限されます。この記事では、P . brassicaeに感染したゴールを検査するための落射蛍光と共焦点顕微鏡を容易にするために、ゴールを固定および除去するための最適化された方法を紹介します。迅速な光学的透明化のための組織透明化プロトコルを使用し、続いてビブラトーム切片を使用して解剖学的変化を検出し、プロモーター融合体および蛍光タンパク質でタグ付けされたレポーター株で遺伝子発現を局在化しました。この方法は、線虫誘発性シンシチアやネコブ、葉のこぶや昆虫によって引き起こされる変形など、植物の他の病原体誘発構造における細胞および生理学的応答の研究に役立つことが証明されています。
病原体や昆虫の影響を受けた植物は、異常な構造(臓器の変形やゴール)を発達させる可能性があり、侵入者は栄養素を摂取して繁殖することができます1。ここでは、原生生物である マラリア属のアブラナ原 虫に感染した植物の地下部に発生するゴールの変化を調べるために、効率的な組織病理学的アプローチが行われました(図1)。この病原体に関連するマイナースレッドは、 P.アブラナ科 の安静胞子が長年にわたって植物に侵入する能力を保持できるという事実から生じます。アブラナ属の大規模栽培の場合、経済的要因が輪作を制限し、土壌中の休眠胞子の蓄積につながるため、これは深刻な問題です2。アブラナ科による内反根病に対するセイヨウ ア ブラナの抵抗性は遺伝的に決定されています。悲しいことに、病原体は、その生物学とナタネの起源である狭い遺伝子プールのために、しばしば耐性を凌駕します。したがって、宿主植物における感染後の反応と、病気の進行を遅らせたり、特定の症状の発症を予防したりするそれらの能力を研究することが重要になっています。
クラブルート病では、重症度は一般にゴールの発生と根系損傷の程度に基づいて評価されます。これは、疾患指数-DIとして知られています。3.しかし、それはこの植物と病原体の相互作用の真の評価を完全には捉えていません。特に、病原体が根内にどのように分布しているか、そして植物が抑制できるかどうかについては言及していません。 P. brassicae その組織内の動き。さらに、どの程度まで予測することは容易ではありません P. brassicae 地下臓器解剖学を再プログラムします。モデルプラントに関する研究 Arabidopsis thaliana それを示しています P. brassicae 感染は、木生の阻害(開始ステップと成熟ステップの両方)とゴール内の師部分化の促進につながります4,5.さらに、感染した植物の根および胚軸では、形成層細胞の子孫は有糸分裂状態を辞めず、健康な植物よりも長く増殖します。6.このプロセスは、胆汁の最終的なサイズを制御し、感染した植物内で生成される病原体の休止胞子の数を決定します。 P. brassicae-宿主における発生的、代謝的、生理学的リプログラミングは非常に複雑です7;したがって、GALLS内の内部変化を検査できるツールの適用は、この相互作用を適切に評価するために重要です。のライフサイクルの進行 P. brassicae 宿主細胞代謝の再プログラミングを伴い、これはデンプンまたは脂質沈着として観察することができる7,8.ゴールの顕微鏡検査を成功させるための主な障害は、透明度が低いことです。このため、ゴール内のクラブルート主導の変化を示す組織学的標本の大部分は、固定包埋(ワックスまたは樹脂)技術とそれに続くミクロトーム切片化に由来します。このようなアプローチは、クラブルートゴールで活性な多数の遺伝子のプロモーター活性を見つけるために首尾よく使用されました4,5 または観察を容易にするさまざまな染色技術 P. brassicae ライフサイクルの進行9.ただし、固定および埋め込みの段階には時間がかかり、重要な生体分子(脂質など)が部分的または完全に洗い流され、特定の観察が著しく妨げられることに注意する必要があります。最近 P. brassicae 宿主におけるライフサイクルの進行は、SABATH型メチルトランスフェラーゼ(PbBSMT)遺伝子特異的プローブを使用して、休止胞子形成をマークしました10.良い代替案は、いくつかの細胞成分の自己蛍光、蛍光タンパク質マーカーに融合した遺伝子の5′-上流調節領域の活性、および特定の蛍光タグ付きタンパク質の蓄積が見られる他の蛍光ベースの方法の使用である。ただし、サンプルの透明度が低いことに加えて、このようなオブジェクトに関連する主な欠点は、未固定の標本での作業であり、これにより、高品質の画像を文書化できる時間が大幅に短縮されます。2015年、栗原ら。11 蛍光タンパク質の保存を可能にし、植物組織標本の透明性を高める透明化試薬を開発しました。さらに、それは多数の組織学的染色と互換性があります。最近、同じ技術を適用して、植物組織のさまざまな細胞壁成分を視覚化することに成功しました。12,13.ここでは、このプロトコルは、さまざまなクラブルートゴールの発達の側面を分析するために使用されています。ワークフローは、ゴールの固定、ビブラトーム切片作成、組織透明化、染色、および蛍光イメージングから始まります。必要に応じて、直接または特定の染色後に、得られた切片を落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で検査することができます。この方法は、植物ホルモンのバランスやシグナル伝達など、遺伝子発現や生理学的応答の局所的な変化を研究するための効果的なソリューションを提供します。病気の進行は、安静胞子の分布パターンと成熟ダイナミクスを調べることで追跡できます。さらに、このプロトコルは、内のイメージング特性変化に簡単に適用できます。 P. brassicae 感染した植物は、耐性遺伝子型における局所的な木化として見える木質形成または宿主植物の防御応答の阻害を含む。このプロトコルの例は、 Arabidopsis thaliana モデル;ただし、このプロトコルは、に属する他の作物種にも適用できます。 Brassicaceae 家族。以下に説明する方法は、細胞構造と胆汁形成に伴う分子変化の将来の詳細な研究を容易にします。 P. brassicae-感染した植物。
プロトコルの一般的なワークフローは非常に単純であり、胆汁発生のすべての段階を簡単に画像化して特徴付けることができます(図2)。 P. brassicae は土壌伝染性病原体であるため、すべての実験は土壌ベースのシステムで実行する必要があります。病原体は酸性条件を好む。したがって、石灰処理されていない土壌基質を使用する必要があります。 P. brassicae は人間に脅威を与えませんが、それは厳密に土壌や水を介して広がることができる植物病原体です。したがって、感染した植物のすべての部分、および土壌は、実験後にオートクレーブまたは漂白剤による処理によって破壊する必要があります。
ゴールのビブラトームカット切片に透明化溶液を適用すると、 アブラナ属菌と 宿主植物との間の生物栄養相互作用を研究する能力が確実に向上します。クリアリングプロトコルはハンドセクションにも適用されますが、ビブラトームセクションでより適切に機能します。PFA固定液でサンプルを固定することは、サンプルを切片作成に進む前に4°Cで数日間保存できるため、プロトコルの重要なステップとして機能します。これにより、固定中の蛍光タンパク質の発現と保存を損なうことなく、限られた期間サンプルを保存する柔軟性が得られます。
ナイルレッド(DMSOまたはメタノール中)は、樹脂を溶解し、樹脂が埋め込まれた切片を破壊する疎水性のため、樹脂切片と相溶性がありません17。したがって、ビブラトーム切片は、発生中のゴール内の病原体分布とそのライフサイクルを研究するのに役立つことが証明されており、ナイルレッド染色を簡単に使用できます。
このプロトコルで使用される透明化溶液は非常に汎用性が高く12、さまざまな蛍光染色をさまざまな組み合わせで使用して、細胞壁のさまざまな生体分子/成分(真菌相互作用におけるスベリン、リグニン、セルロース、およびキチン)を染色することができます。蛍光GFPマーカー株の切片を対比染色し、それによってプロモーター活性またはタンパク質蓄積パターンを、特定の細胞または胆汁の領域における病原体の存在と相関させることも可能である。しかし、木部および病原体で満たされた巨細胞からのバックグラウンド自己蛍光は、クリアリングプロトコルの後でも排除できませんでした。これは、胆汁形成の後期、特に落射蛍光顕微鏡を使用して弱いシグナルをイメージングする場合に、蛍光マーカーを見る上で制限を提示します。
蛍光シグナルの発現・蓄積が少ないため、転写因子の検出は困難ですが、この手法では満足のいく画像を得ることができます。全体として、ビブラトーム切片作成と組織クリアリングアプローチを組み合わせることで、複雑な胆汁組織の組織学的観察のためのツールキットが拡張されます。このプロトコルの柔軟性により、組織固定のプロセスが容易になり、蛍光タンパク質とプロモーター活性を観察するための新鮮な組織サンプルの切断とイメージングに必要な時間が短縮されます。さらなる改良と、さまざまな生体分子に特異的な他の蛍光色素を利用することにより、この方法は、複雑な組織組織を持つ高密度で不透明な組織の組織学的研究と画像解析においてより大きな進歩を遂げるでしょう。最近、提示された組織透明化法は、異なる蛍光シグナル11、12、13を組み合わせて同時取得を可能にするための一般的で広く使用されているプロトコルとして浮上している。このような技術の将来の開発と改変は、細胞レベルで植物と病原体の相互作用を観察するための画像解像度を大幅に向上させます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ポーランド国立科学センターOPUS17助成金番号2019/33 / B / NZ9 / 00751「 マラリアブラナ原虫に感染した植物における長距離血管協調」によってサポートされました。 ProHCA2::erRFP ラインを共有してくれたYrjö Helariutta教授(ケンブリッジ大学セインズベリー研究所)に感謝します。
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |