O presente protocolo descreve um método otimizado para a observação histológica de galhas induzidas por Plasmodiophora brassicae. Seções vibratórias de hipocótilos são limpas antes da imagem de fluorescência para estudar o envolvimento de fatores de transcrição e fitohormônios durante a progressão da doença. Este protocolo supera as limitações de incorporação de resina, possibilitando na planta a visualização de proteínas fluorescentes.
A infecção de culturas de Brassica pelo protista Plasmodiophora brassicae leva à formação de galhas nos órgãos subterrâneos. A formação de galhas requer reprogramação celular e mudanças no metabolismo da planta infectada. Isso é necessário para estabelecer um sumidouro fisiológico orientado a patógenos para o qual os nutrientes do hospedeiro são redirecionados. Para uma compreensão completa dessa interação planta-patógeno particular e dos mecanismos pelos quais o crescimento e o desenvolvimento do hospedeiro são subvertidos e repadronizados, é essencial rastrear e observar as mudanças internas que acompanham a formação de galhas com resolução celular. Métodos que combinam corantes fluorescentes e proteínas fluorescentes são frequentemente empregados para estudar respostas anatômicas e fisiológicas em plantas. Infelizmente, o grande tamanho das galhas e sua baixa transparência atuam como grandes obstáculos na realização de observações de montagem inteira sob o microscópio. Além disso, a baixa transparência limita o emprego de microscopia de fluorescência para estudar a progressão da doença clubroot e a formação de galhas. Este artigo apresenta um método otimizado para fixação e limpeza de galhas para facilitar a epifluorescência e a microscopia confocal para inspeção de galhas infectadas por P. brassicae. Um protocolo de limpeza tecidual para limpeza óptica rápida foi usado seguido de secção vibratomática para detectar alterações anatômicas e localizar a expressão gênica com fusões promotoras e linhas repórteres marcadas com proteínas fluorescentes. Este método será útil para o estudo de respostas celulares e fisiológicas em outras estruturas desencadeadas por patógenos em plantas, como sincítias induzidas por nematoides e nós radiculares, bem como galhas foliares e deformações causadas por insetos.
Plantas afetadas por patógenos ou insetos podem desenvolver estruturas anormais (deformações de órgãos ou galhas), que permitem ao invasor ingerir nutrientes e se reproduzir1. Aqui, uma abordagem histopatológica eficiente foi realizada para estudar as mudanças que ocorrem nas galhas que se desenvolvem nas partes subterrâneas de plantas infectadas com o protista Plasmodiophora brassicae (Figura 1). O fio menor associado a este patógeno emerge do fato de que os esporos em repouso de P. brassicae podem manter sua capacidade de invadir plantas por muitos anos. No caso do cultivo em larga escala de colza (Brassica napus), este é um problema grave, uma vez que fatores econômicos restringem a rotação de culturas, levando ao acúmulo de esporos em repouso no solo2. A resistência da colza à doença clubroot causada por P. brassicae é geneticamente determinada. Infelizmente, o patógeno muitas vezes supera a resistência por causa de sua biologia e do estreito pool genético do qual a colza se originou. Portanto, tornou-se relevante estudar as respostas pós-infecção em plantas hospedeiras e sua capacidade de retardar a progressão da doença ou prevenir o desenvolvimento de certos sintomas.
Na doença clubroot, a gravidade é geralmente avaliada com base no desenvolvimento de galhas e no grau de dano ao sistema radicular. Isso é conhecido como o Índice de Doença-DI3. No entanto, não captura totalmente a verdadeira avaliação dessa interação planta-patógeno. Em particular, não aborda como o patógeno é distribuído dentro das raízes e se a planta pode se conter. P. brassicae movimento dentro de seus tecidos. Além disso, não é fácil antecipar até que ponto P. brassicae reprograma a anatomia dos órgãos subterrâneos. Estudos sobre a planta modelo Arabidopsis thaliana demonstraram que P. brassicae a infecção leva à inibição da xilogênese (tanto as etapas de iniciação quanto de maturação) e ao aumento da diferenciação do floema dentro das galhas4,5. Além disso, em raízes e hipocótilos de plantas infectadas, a progênie de células cambiais não abandona o estado mitótico e prolifera por mais tempo do que em plantas saudáveis.6. Este processo governa o tamanho final da galha e determina o número de esporos de repouso de patógenos produzidos dentro da planta infectada. P. brassicaeA reprogramação do desenvolvimento, metabólica e fisiológica no hospedeiro é muito complexa7; portanto, a aplicação de ferramentas que permitam a inspeção de alterações internas dentro das galhas é crucial para a avaliação adequada dessa interação. A progressão do ciclo de vida de P. brassicae é acompanhada por reprogramação do metabolismo da célula hospedeira, que pode ser observada como deposição de amido ou lipídios7,8. O principal obstáculo para a microscopia bem-sucedida das galhas vem de sua baixa transparência. Devido a isso, a maioria dos espécimes histológicos que apresentam alterações impulsionadas por raiz de clube dentro das galhas origina-se de técnicas de fixação (cera ou resina) seguidas de corte de micrótomos. Tais abordagens foram usadas com sucesso para localizar a atividade promotora de numerosos genes ativos em galhas de raiz de clube.4,5 ou várias técnicas de coloração que facilitam a observação de P. brassicae progressão do ciclo de vida9. No entanto, deve-se notar que os estágios de fixação e incorporação são demorados e resultam em lavagem parcial ou completa de biomoléculas importantes (por exemplo, lipídios), dificultando significativamente certas observações. Recentemente P. brassicae a progressão do ciclo de vida no hospedeiro foi visualizada com o auxílio da Hibridização In Situ Fluorescente (FISH), na qual uma metiltransferase do tipo SABATH (PbBSMT) sonda gene-específica foi utilizada para marcar a formação de esporos em repouso10. Uma boa alternativa é o uso de outros métodos baseados em fluorescência, onde a autofluorescência de alguns componentes celulares, a atividade de regiões reguladoras a montante de 5′- de genes fundidos a marcadores de proteínas fluorescentes e o acúmulo de proteínas específicas marcadas fluorescentemente podem ser vistos. No entanto, além da baixa transparência das amostras, uma grande desvantagem associada a esses objetos é trabalhar com espécimes não fixos, o que diminui significativamente o tempo em que imagens de boa qualidade podem ser documentadas. Em 2015, Kurihara et al.11 desenvolveu um reagente de limpeza, que permite a preservação de proteínas fluorescentes e aumenta a transparência dos espécimes de tecido vegetal. Além disso, é compatível com inúmeras colorações histológicas. Recentemente, a mesma técnica foi aplicada com sucesso para visualizar diferentes componentes da parede celular em tecidos vegetais.12,13. Aqui, este protocolo tem sido usado para analisar vários aspectos do desenvolvimento da galha clubroot. O fluxo de trabalho começa com a fixação de galhas, secção de vibratome, limpeza de tecidos, coloração e imagens de fluorescência. Dependendo das necessidades, diretamente ou após uma coloração específica, as seções resultantes podem ser submetidas a inspeção sob um microscópio de epifluorescência ou confocal. Este método fornece uma solução eficaz para estudar as mudanças locais na expressão gênica e respostas fisiológicas, incluindo o equilíbrio e a sinalização de fitohormônios. A progressão da doença pode ser rastreada observando o padrão de distribuição dos esporos em repouso e a dinâmica de maturação. Além disso, o protocolo pode ser facilmente aplicado para alterações de características de imagem dentro P. brassicae plantas infectadas, incluindo a inibição da xilogênese ou as respostas de defesa da planta hospedeira visíveis como lignificação local em genótipos resistentes. Exemplos neste protocolo vêm de imagens realizadas no Arabidopsis thaliana modelo; no entanto, o protocolo também pode ser aplicado a outras espécies de culturas pertencentes à Brassicaceae família. O método descrito abaixo facilitará futuros estudos detalhados das estruturas celulares e das alterações moleculares que acompanham a formação de galhas em P. brassicae-plantas infectadas.
O fluxo de trabalho geral do protocolo é bastante simples, e todos os estágios do desenvolvimento da vesícula podem ser facilmente visualizados e caracterizados (Figura 2). Como P. brassicae é um patógeno transmitido pelo solo, todos os experimentos devem ser realizados em sistemas baseados no solo. O patógeno prefere condições ácidas; por conseguinte, devem ser utilizados substratos de solo não tratados com cal. Embora P. brassicae não represente uma ameaça para os seres humanos, é estritamente um patógeno vegetal que pode se espalhar através do solo e da água. Portanto, todas as partes da planta infectada, bem como o solo, precisam ser destruídos após o experimento por autoclave ou por tratamento com água sanitária.
A aplicação da solução de limpeza em seções de galhas cortadas por vibratomo certamente aumenta a capacidade de estudar a interação biotrófica entre P. brassicae e a planta hospedeira. Embora o protocolo de limpeza se aplique até mesmo a seções manuais, ele funciona melhor com seções de vibratome. A fixação de amostras no fixador de PFA atua como uma etapa crítica no protocolo, pois as amostras podem ser armazenadas a 4 °C por alguns dias antes de prosseguir com a secção. Isso proporciona flexibilidade para armazenar amostras por um período limitado sem comprometer a expressão e a preservação de proteínas fluorescentes durante a fixação.
O Vermelho do Nilo (em DMSO ou metanol) é incompatível com seções de resina devido à sua hidrofobicidade, que dissolve a resina e destrói as seções embutidas em resina17. Assim, as seções de vibratomo mostram-se fundamentais para estudar a distribuição do patógeno e seu ciclo de vida dentro das galhas em desenvolvimento, em que a coloração Vermelho do Nilo pode ser facilmente usada.
A solução de limpeza utilizada neste protocolo é altamente versátil12, permitindo que uma variedade de manchas de fluorescência seja usada em diferentes combinações para corar várias biomoléculas/componentes das paredes celulares (suberina, lignina, celulose e quitina em interações fúngicas). Também é possível contra-manchar seções de linhas de marcadores de GFP fluorescentes e, assim, correlacionar a atividade promotora ou o padrão de acúmulo de proteínas com a presença do patógeno em células ou regiões específicas da galha. No entanto, a autofluorescência de fundo do xilema e das células gigantes cheias de patógenos não pôde ser eliminada mesmo após o protocolo de limpeza. Isso apresenta uma limitação para a observação de marcadores fluorescentes durante os estágios posteriores da formação da galha, especialmente ao usar um microscópio de epifluorescência e a imagem de sinais fracos.
Devido aos baixos níveis de expressão/acúmulo de sinais fluorescentes, os fatores de transcrição são de difícil detecção, mas, com essa técnica, é possível obter imagens satisfatórias para eles. No geral, a combinação da secção do vibratome com a abordagem de limpeza de tecidos expande o kit de ferramentas para observações histológicas de tecidos galares complexos. A flexibilidade deste protocolo facilita o processo de fixação tecidual e reduz o tempo necessário para o corte e a imagem de amostras de tecido fresco para observar proteínas fluorescentes e atividades promotoras. Com novas melhorias e utilizando outros corantes fluorescentes específicos para várias biomoléculas, este método marcará maiores avanços nos estudos histológicos e na análise de imagens de tecidos densos e opacos com organização tecidual complexa. Nos últimos tempos, o método de clareamento tecidual apresentado tem emergido como um protocolo popular e amplamente utilizado para combinar e possibilitar a aquisição simultânea de diferentes sinais fluorescentes 11,12,13. O desenvolvimento futuro e as modificações em tais técnicas melhorarão muito a resolução da imagem para observar as interações planta-patógeno no nível celular.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência da Polónia OPUS17 subvenção No. 2019/33/B/NZ9/00751 “Coordenação Vascular de Longa Distância em Plantas Infectadas por Plasmodiophora brassicae“. Agradecemos ao Prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, Universidade de Cambridge) por compartilhar a linha proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |