본 프로토콜은 플라스모디오포라 브라시카에 의해 유도된 담즙의 조직학적 관찰을 위한 최적화된 방법을 기술한다. 배축의 Vibratome 섹션은 질병 진행 동안 전사 인자와 식물 호르몬의 관여를 연구하기 위해 형광 이미징 전에 제거됩니다. 이 프로토콜은 수지 임베딩 한계를 극복하여 형광 단백질의 플란타 시각화를 가능하게 합니다.
토양 매개 원생 생물 인 Plasmodiophora brassicae 에 의한 브라 시카 작물의 감염은 지하 기관에 담즙 형성을 유도합니다. 담즙의 형성은 세포 재 프로그래밍과 감염된 식물의 신진 대사 변화를 필요로합니다. 이것은 숙주 영양소가 리디렉션되는 병원체 지향적 생리적 싱크를 확립하는 데 필요합니다. 이 특정 식물-병원체 상호 작용과 숙주 성장 및 발달이 전복되고 재 패턴화되는 메커니즘을 완전히 이해하려면 담즙 형성에 수반되는 내부 변화를 세포 분해능으로 추적하고 관찰하는 것이 필수적입니다. 형광 염색과 형광 단백질을 결합하는 방법은 종종 식물의 해부학 적 및 생리적 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 불행히도, 큰 크기의 담즙과 낮은 투명도는 현미경으로 전체 마운트 관찰을 수행하는 데 주요 장애물로 작용합니다. 또한, 낮은 투명성은 뿌리 줄기 질병 진행 및 담즙 형성을 연구하기 위해 형광 현미경의 사용을 제한합니다. 이 기사에서는 P. brassicae에 감염된 담즙을 검사하기 위해 에피형광 및 컨포칼 현미경을 용이하게 하기 위해 담즙을 고정하고 제거하는 최적화된 방법을 제시합니다. 신속한 광학 투명화를 위한 조직 투명화 프로토콜을 사용한 후 비브라톰 절편을 사용하여 해부학적 변화를 감지하고 프로모터 융합체 및 형광 단백질로 태그된 리포터 라인으로 유전자 발현을 국소화했습니다. 이 방법은 선충 유발 세포 융합 및 뿌리 매듭뿐만 아니라 곤충으로 인한 잎 덩어리 및 변형과 같은 식물의 다른 병원체 유발 구조에서 세포 및 생리적 반응을 연구하는 데 유용합니다.
병원균이나 곤충의 영향을받는 식물은 비정상적인 구조 (장기 변형 또는 담즙)를 개발할 수 있으며, 이로 인해 침입자가 영양분을 섭취하고 번식 할 수 있습니다1. 여기에서 원생 생물 Plasmodiophora brassicae 에 감염된 식물의 지하 부분에서 발생하는 담즙에서 일어나는 변화를 연구하기 위해 효율적인 조직 병리학 적 접근이 수행되었습니다 (그림 1). 이 병원체와 관련된 사소한 실은 P. brassicae 휴식 포자가 수년 동안 식물을 침범 할 수있는 능력을 유지할 수 있다는 사실에서 비롯됩니다. 유지 종자 유채 (Brassica napus)의 대규모 재배의 경우, 경제적 요인이 작물 순환을 제한하여 토양에 포자가 축적되기 때문에 심각한 문제입니다2. P. brassicae 로 인한 뿌리 질병에 대한 지방 종자 강간의 내성은 유 전적으로 결정됩니다. 슬프게도, 병원체는 생물학과 지방 종자 강간이 시작된 좁은 유전자 풀 때문에 종종 저항력을 능가합니다. 따라서 숙주 식물의 감염 후 반응과 질병 진행을 늦추거나 특정 증상이 발생하는 것을 예방하는 능력을 연구하는 것이 적절해졌습니다.
뿌리 질환에서 중증도는 일반적으로 담즙의 발달과 뿌리 시스템 손상 정도에 따라 평가됩니다. 이것은 질병 지수-DI로 알려져 있습니다.3. 그러나 이 식물-병원균 상호 작용에 대한 진정한 평가를 완전히 포착하지는 못합니다. 특히 병원균이 뿌리 내에 어떻게 분포되어 있는지, 식물이 억제 할 수 있는지 여부는 다루지 않습니다. P. brassicae 조직 내에서의 움직임. 또한 어느 정도까지 예측하기가 쉽지 않습니다. P. brassicae 지하 장기 해부학을 재 프로그래밍합니다. 모델 플랜트에 관한 연구 Arabidopsis thaliana 그것을 보여주었습니다 P. brassicae 감염은 목공 형성의 억제 (시작 및 성숙 단계 모두)와 담즙 내 체관 분화의 향상으로 이어진다.4,5. 또한, 감염된 식물의 뿌리와 배축에서, cambial 세포 자손은 유사 분열 상태를 종료하지 않고 건강한 식물보다 오래 증식합니다.6. 이 과정은 담즙의 최종 크기를 제어하고 감염된 식물 내에서 생성되는 병원체 휴식 포자의 수를 결정합니다. P. brassicae-숙주에서 주도적 발달, 대사 및 생리 학적 재 프로그래밍은 매우 복잡합니다.7; 따라서 담즙 내의 내부 변화를 검사 할 수있는 도구를 적용하는 것은 이러한 상호 작용을 적절하게 평가하는 데 중요합니다. 의 수명주기 진행 P. brassicae 전분 또는 지질 침착으로 관찰 될 수있는 숙주 세포 대사의 재 프로그래밍이 동반됩니다.7,8. 담즙의 성공적인 현미경 검사의 주요 장애물은 낮은 투명성에서 비롯됩니다. 이로 인해 담즙 내에서 곤봉 뿌리 주도 변화를 나타내는 대부분의 조직 학적 표본은 고정 임베딩 (왁스 또는 수지) 기술과 마이크로 톰 절편에서 비롯됩니다. 이러한 접근법은 곤봉 뿌리 담즙에서 활성인 수많은 유전자에 대한 프로모터 활성을 찾는 데 성공적으로 사용되었습니다.4,5 또는 관찰을 용이하게하는 다양한 염색 기술 P. brassicae 라이프 사이클 진행9. 그러나 고정 및 매립 단계는 시간이 많이 걸리고 중요한 생체 분자 (예 : 지질)가 부분적으로 또는 완전히 씻겨 져 특정 관찰을 크게 방해한다는 점에 유의해야합니다. 요사이 P. brassicae 숙주에서의 생애주기 진행은 형광 현장 혼성화 (FISH)의 도움으로 시각화되었으며, 여기서 SABATH 형 메틸 트랜스퍼 라제 (PbBSMT) 유전자 특이적 프로브를 휴지기 포자 형성을 표시하기 위해 사용하였다.10. 좋은 대안은 일부 세포 성분의 자가형광, 형광 단백질 마커에 융합된 유전자의 5′-상류 조절 영역의 활성, 및 특정 형광 태그된 단백질의 축적이 보일 수 있는 다른 형광 기반 방법의 사용이다. 그러나 샘플의 투명도가 낮을 뿐만 아니라 이러한 개체와 관련된 주요 단점은 고정되지 않은 표본으로 작업하는 것이므로 양질의 이미지를 문서화할 수 있는 시간이 크게 줄어듭니다. 2015 년 구리하라 외.11 형광 단백질을 보존하고 식물 조직 표본의 투명성을 높이는 투명화 시약을 개발했습니다. 또한 수많은 조직 학적 염색과 호환됩니다. 최근에는 식물 조직에서 다른 세포벽 구성 요소를 시각화하기 위해 동일한 기술이 성공적으로 적용되었습니다.12,13. 여기에서 이 프로토콜은 다양한 클럽루트 담즙 발달 측면을 분석하는 데 사용되었습니다. 워크플로우는 담즙 고정, 비브라톰 절편, 조직 투명화, 염색 및 형광 이미징으로 시작됩니다. 필요에 따라 직접 또는 특정 염색 후에 결과 섹션을 에피 형광 또는 컨 포칼 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 이 방법은 식물 호르몬 균형 및 신호 전달을 포함하여 유전자 발현 및 생리적 반응의 국소 변화를 연구하는 효과적인 솔루션을 제공합니다. 질병 진행은 휴지기 포자의 분포 패턴과 성숙 역학을 살펴봄으로써 추적할 수 있습니다. 또한 프로토콜은 이미징 특성 변화에 쉽게 적용할 수 있습니다. P. brassicae 감염된 식물은, 자일로신생의 억제 또는 내성 유전자형에서 국소 발화로서 보이는 숙주 식물 방어 반응을 포함한다. 이 프로토콜의 예는 Arabidopsis thaliana 모델; 그러나 프로토콜은 에 속하는 다른 작물 종에도 적용될 수 있습니다. Brassicaceae 가족. 아래에 설명 된 방법은 담즙 형성에 수반되는 세포 구조 및 분자 변화에 대한 향후 상세한 연구를 용이하게 할 것입니다. P. brassicae-감염된 식물.
프로토콜의 일반적인 워크플로는 매우 간단하며 담즙 발달의 모든 단계를 쉽게 이미지화하고 특성화할 수 있습니다(그림 2). P. brassicae 는 토양 매개 병원체이기 때문에 모든 실험은 토양 기반 시스템에서 수행되어야합니다. 병원체는 산성 조건을 선호합니다. 따라서 석회 처리되지 않은 토양 기질을 사용해야합니다. P. brassicae 는 인간에게 위협이되지 않지만 토양과 물을 통해 퍼질 수있는 식물 병원체입니다. 따라서 토양뿐만 아니라 감염된 식물의 모든 부분은 실험 후 오토 클레이브 또는 표백제로 처리하여 파괴해야합니다.
담즙의 비브라톰 절단 부분에 클리어링 솔루션을 적용하면 P. 브라 시카와 숙주 식물 사이의 생물 영양 상호 작용을 연구하는 능력이 확실히 향상됩니다. 클리어링 프로토콜은 핸드 섹션에도 적용되지만 비브라톰 섹션에서 더 잘 작동합니다. PFA 고정액에 샘플을 고정하는 것은 절편을 진행하기 전에 샘플을 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있기 때문에 프로토콜에서 중요한 단계로 작용합니다. 이는 고정 중에 형광 단백질의 발현 및 보존을 손상시키지 않으면서 제한된 기간 동안 샘플을 저장할 수 있는 유연성을 제공합니다.
나일 레드 (DMSO 또는 메탄올에서)는 소수성으로 인해 수지 섹션과 호환되지 않으며, 이는 수지를 용해시키고 수지 내장 섹션17을 파괴합니다. 따라서 비브라톰 섹션은 발달 중인 담즙 내에서 병원체 분포와 수명 주기를 연구하는 데 도움이 되며, 여기서 나일 레드 염색을 쉽게 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용되는 투명화 용액은 매우 다목적입니다12, 다양한 형광 염색을 다양한 조합으로 사용하여 세포벽의 다양한 생체 분자/구성 요소(곰팡이 상호 작용에서 수베린, 리그닌, 셀룰로오스 및 키틴)를 염색할 수 있습니다. 또한, 형광 GFP 마커 라인의 절편을 대조염색하여 프로모터 활성 또는 단백질 축적 패턴을 특정 세포 또는 담즙 영역에서 병원체의 존재와 상관시킬 수 있습니다. 그러나 목부와 병원체로 채워진 거대 세포의 배경 자가형광은 클리어링 프로토콜 후에도 제거할 수 없었습니다. 이것은 담즙 형성의 후기 단계, 특히 에피 형광 현미경을 사용하고 약한 신호를 이미징 할 때 형광 마커를 보는 데 한계를 나타냅니다.
형광 신호의 발현/축적 수준이 낮기 때문에 전사 인자를 검출하기 어렵지만 이 기술을 사용하면 만족스러운 이미지를 얻을 수 있습니다. 전반적으로 비브라톰 절편과 조직 투명화 접근법을 결합하면 복잡한 담즙 조직의 조직학적 관찰을 위한 툴킷이 확장됩니다. 이 프로토콜의 유연성은 조직 고정 과정을 용이하게 하고 형광 단백질 및 프로모터 활성을 관찰하기 위해 신선한 조직 샘플을 절단하고 이미징하는 데 필요한 시간을 줄입니다. 추가 개선과 다양한 생체 분자에 특이적인 다른 형광 염료를 활용함으로써 이 방법은 조직학 연구 및 복잡한 조직 조직을 가진 조밀하고 불투명한 조직의 이미지 분석에서 더 큰 발전을 가져올 것입니다. 최근에, 제시된 조직 투명화 방법은 상이한 형광 신호(11,12,13)의 동시 획득을 결합하고 가능하게 하기 위해 대중적이고 널리 사용되는 프로토콜로서 등장하였다. 이러한 기술의 향후 개발 및 수정은 세포 수준에서 식물 – 병원체 상호 작용을 관찰하기위한 이미지 해상도를 크게 향상시킬 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 폴란드 국립 과학 센터 OPUS17 보조금 번호 2019/33/B/NZ9/00751 ” Plasmodiophora brassicae에 감염된 식물의 장거리 혈관 조정”의 지원을 받았습니다. proHCA2::erRFP 라인을 공유해 주신 Yrjö Helariutta 교수(케임브리지 대학교 세인즈베리 연구소)에게 감사드립니다.
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |