Il presente protocollo descrive un metodo ottimizzato per l’osservazione istologica delle galle indotta da Plasmodiophora brassicae. Le sezioni vibratomo degli ipocotili vengono eliminate prima dell’imaging a fluorescenza per studiare il coinvolgimento dei fattori di trascrizione e dei fitormoni durante la progressione della malattia. Questo protocollo supera i limiti di incorporamento della resina, consentendo la visualizzazione nelle piante di proteine fluorescenti.
L’infezione delle colture di Brassica da parte del protista del suolo Plasmodiophora brassicae porta alla formazione di fiele sugli organi sotterranei. La formazione delle galle richiede la riprogrammazione cellulare e cambiamenti nel metabolismo della pianta infetta. Ciò è necessario per stabilire un pozzo fisiologico orientato ai patogeni verso il quale i nutrienti dell’ospite vengono reindirizzati. Per una comprensione completa di questa particolare interazione pianta-patogeno e dei meccanismi attraverso i quali la crescita e lo sviluppo dell’ospite vengono sovvertiti e rimodellati, è essenziale tracciare e osservare i cambiamenti interni che accompagnano la formazione della gallina con risoluzione cellulare. I metodi che combinano coloranti fluorescenti e proteine fluorescenti sono spesso impiegati per studiare le risposte anatomiche e fisiologiche nelle piante. Sfortunatamente, le grandi dimensioni delle galle e la loro bassa trasparenza agiscono come ostacoli principali nell’esecuzione di osservazioni a montaggio intero al microscopio. Inoltre, la bassa trasparenza limita l’impiego della microscopia a fluorescenza per studiare la progressione della malattia clubroot e la formazione di bili. Questo articolo presenta un metodo ottimizzato per fissare e pulire le galle per facilitare l’epifluorescenza e la microscopia confocale per ispezionare le galle infette da P. brassicae. È stato utilizzato un protocollo di pulizia dei tessuti per una rapida pulizia ottica seguito dal sezionamento del vibratomo per rilevare i cambiamenti anatomici e localizzare l’espressione genica con fusioni di promotori e linee reporter etichettate con proteine fluorescenti. Questo metodo si rivelerà utile per studiare le risposte cellulari e fisiologiche in altre strutture innescate da patogeni nelle piante, come la sincizia indotta da nematodi e i nodi radicali, nonché le galle fogliari e le deformazioni causate dagli insetti.
Le piante colpite da agenti patogeni o insetti possono sviluppare strutture anomale (deformazioni d’organo o galle), che consentono all’invasore di ingerire sostanze nutritive e riprodursi1. Qui, è stato intrapreso un efficiente approccio istopatologico per studiare i cambiamenti in atto nelle galle che si sviluppano sulle parti sotterranee delle piante infettate dal protista Plasmodiophora brassicae (Figura 1). Il filo minore associato a questo patogeno emerge dal fatto che le spore a riposo di P. brassicae possono mantenere la loro capacità di invadere le piante per molti anni. Nel caso della coltivazione su larga scala di colza (Brassica napus), questo è un problema serio poiché i fattori economici limitano la rotazione delle colture, portando all’accumulo di spore a riposo nel terreno2. La resistenza della colza alla malattia della radice di clava causata da P. brassicae è geneticamente determinata. Purtroppo, l’agente patogeno spesso supera in astuzia la resistenza a causa della sua biologia e dello stretto pool genetico da cui ha avuto origine la colza. Pertanto, è diventato importante studiare le risposte post-infezione nelle piante ospiti e la loro capacità di rallentare la progressione della malattia o prevenire lo sviluppo di determinati sintomi.
Nella malattia di clubroot, la gravità viene generalmente valutata in base allo sviluppo delle galle e al grado di danno al sistema radicale. Questo è noto come Disease Index-DI3. Tuttavia, non cattura pienamente la vera valutazione di questa interazione pianta-patogeno. In particolare, non affronta il modo in cui l’agente patogeno è distribuito all’interno delle radici e se la pianta può trattenere P. brassicae movimento all’interno dei suoi tessuti. Inoltre, non è facile prevedere fino a che punto P. brassicae riprogramma l’anatomia degli organi sotterranei. Studi sulla pianta modello Arabidopsis thaliana hanno dimostrato che P. brassicae L’infezione porta all’inibizione della xilogenesi (sia la fase di iniziazione che di maturazione) e al miglioramento della differenziazione del floema all’interno delle galle4,5. Inoltre, nelle radici e negli ipocotili delle piante infette, la progenie delle cellule cambiali non abbandona lo stato mitotico e prolifera più a lungo che nelle piante sane.6. Questo processo governa la dimensione finale del fiele e determina il numero di spore patogene a riposo prodotte all’interno della pianta infetta. P. brassicae-la riprogrammazione evolutiva, metabolica e fisiologica nell’ospite è molto complessa7; Pertanto, l’applicazione di strumenti che consentano l’ispezione dei cambiamenti interni all’interno delle galle è fondamentale per valutare correttamente questa interazione. La progressione del ciclo di vita di P. brassicae è accompagnato dalla riprogrammazione del metabolismo delle cellule ospiti, che può essere osservato come deposizione di amido o lipidi7,8. Il principale ostacolo al successo della microscopia delle galle deriva dalla loro bassa trasparenza. A causa di ciò, la maggior parte dei campioni istologici che presentano cambiamenti guidati da clave all’interno delle galle provengono da tecniche di fissazione-incorporazione (cera o resina) seguite da sezionamento di microtomi. Tali approcci sono stati utilizzati con successo per localizzare l’attività del promotore per numerosi geni attivi nelle galle clubroot4,5 o varie tecniche di colorazione che facilitano l’osservazione di P. brassicae Progressione del ciclo di vita9. Tuttavia, va notato che le fasi di fissaggio e incorporamento richiedono molto tempo e comportano il lavaggio parziale o completo di importanti biomolecole (ad esempio, lipidi), ostacolando significativamente alcune osservazioni. Recentemente P. brassicae La progressione del ciclo vitale nell’ospite è stata visualizzata con l’aiuto dell’ibridazione fluorescente in situ (FISH), in cui una metiltransferasi di tipo SABATH (PbBSMT) la sonda gene-specifica è stata utilizzata per marcare la formazione di spore a riposo10. Una buona alternativa è l’uso di altri metodi basati sulla fluorescenza in cui si può vedere l’autofluorescenza di alcuni componenti cellulari, l’attività delle regioni regolatrici 5′- a monte dei geni fusi con marcatori proteici fluorescenti e l’accumulo di particolari proteine marcate con fluorescenza. Tuttavia, oltre alla bassa trasparenza dei campioni, uno dei principali svantaggi associati a tali oggetti è lavorare con campioni non fissi, che riduce significativamente il tempo in cui le immagini di buona qualità possono essere documentate. Nel 2015, Kurihara et al.11 sviluppato un reagente di clearing, che consente la conservazione delle proteine fluorescenti e aumenta la trasparenza dei campioni di tessuto vegetale. Inoltre, è compatibile con numerose macchie istologiche. Recentemente, la stessa tecnica è stata applicata con successo per visualizzare diversi componenti della parete cellulare nei tessuti vegetali.12,13. Qui, questo protocollo è stato utilizzato per analizzare vari aspetti dello sviluppo del fiele clubroot. Il flusso di lavoro inizia con la fissazione delle galle, il sezionamento della vibratomia, la pulizia dei tessuti, la colorazione e l’imaging a fluorescenza. A seconda delle proprie esigenze, direttamente o dopo una particolare colorazione, le sezioni risultanti possono essere sottoposte a ispezione al microscopio epifluorescenza o confocale. Questo metodo fornisce una soluzione efficace per studiare i cambiamenti locali nell’espressione genica e nelle risposte fisiologiche, compreso l’equilibrio e la segnalazione dei fitoormoni. La progressione della malattia può essere monitorata osservando il modello di distribuzione delle spore a riposo e le dinamiche di maturazione. Inoltre, il protocollo può essere facilmente applicato per i cambiamenti caratteristici dell’imaging all’interno P. brassicae piante infette, compresa l’inibizione della xilogenesi o le risposte di difesa della pianta ospite visibili come lignificazione locale in genotipi resistenti. Esempi in questo protocollo provengono dall’imaging condotto sul Arabidopsis thaliana modello; Tuttavia, il protocollo può essere applicato anche ad altre specie di colture appartenenti al Brassicaceae famiglia. Il metodo descritto di seguito faciliterà futuri studi dettagliati delle strutture cellulari e dei cambiamenti molecolari che accompagnano la formazione di fiele in P. brassicae-piante infette.
Il flusso di lavoro generale del protocollo è abbastanza semplice e tutte le fasi dello sviluppo del galle possono essere facilmente visualizzate e caratterizzate (Figura 2). Poiché P. brassicae è un agente patogeno trasmesso dal suolo, tutti gli esperimenti devono essere condotti in sistemi basati sul suolo. L’agente patogeno preferisce condizioni acide; Pertanto, devono essere utilizzati substrati di terreno non trattati con calce. Sebbene P. brassicae non rappresenti una minaccia per l’uomo, è strettamente un patogeno vegetale che può diffondersi attraverso il suolo e l’acqua. Pertanto, tutte le parti della pianta infetta, così come il terreno, devono essere distrutte dopo l’esperimento mediante autoclave o trattamento con candeggina.
L’applicazione della soluzione di clearing su sezioni di galle tagliate a vibratomo migliora sicuramente la capacità di studiare l’interazione biotrofica tra P. brassicae e la pianta ospite. Sebbene il protocollo di compensazione si applichi anche alle sezioni della mano, funziona meglio con le sezioni vibratomo. Il fissaggio dei campioni nel fissativo PFA funge da passaggio critico nel protocollo in quanto i campioni possono essere conservati a 4 °C per alcuni giorni prima di procedere con il sezionamento. Ciò offre la flessibilità di conservare i campioni per un periodo limitato senza compromettere l’espressione e la conservazione delle proteine fluorescenti durante la fissazione.
Il rosso Nilo (in DMSO o metanolo) è incompatibile con le sezioni di resina a causa della sua idrofobicità, che dissolve la resina e distrugge le sezioni incorporate nella resina17. Pertanto, le sezioni di vibratomo si rivelano strumentali per studiare la distribuzione dei patogeni e il suo ciclo di vita all’interno delle galle in via di sviluppo, in cui la colorazione rosso Nilo può essere facilmente utilizzata.
La soluzione di clearing utilizzata in questo protocollo è altamente versatile12, consentendo di utilizzare una varietà di coloranti di fluorescenza in diverse combinazioni per colorare varie biomolecole / componenti delle pareti cellulari (suberina, lignina, cellulosa e chitina nelle interazioni fungine). È anche possibile contrastare sezioni di linee marcatrici fluorescenti GFP e quindi correlare l’attività del promotore o il modello di accumulo proteico con la presenza del patogeno in particolari cellule o regioni del fiele. Tuttavia, l’autofluorescenza di fondo da xilema e cellule giganti piene di agenti patogeni non poteva essere eliminata anche dopo il protocollo di compensazione. Ciò presenta una limitazione per l’osservazione dei marcatori fluorescenti durante le fasi successive della formazione della gallina, specialmente quando si utilizza un microscopio a epifluorescenza e si visualizzano segnali deboli.
A causa dei bassi livelli di espressione/accumulo di segnali fluorescenti, i fattori di trascrizione sono difficili da rilevare, ma, con questa tecnica, è possibile ottenere immagini soddisfacenti per essi. Nel complesso, la combinazione del sezionamento del vibratomo con l’approccio di pulizia dei tessuti espande il toolkit per le osservazioni istologiche di tessuti biliari complessi. La flessibilità di questo protocollo facilita il processo di fissazione dei tessuti e riduce il tempo necessario per il taglio e l’imaging di campioni di tessuto fresco per osservare le proteine fluorescenti e le attività del promotore. Con ulteriori miglioramenti e utilizzando altri coloranti fluorescenti specifici per varie biomolecole, questo metodo segnerà maggiori progressi negli studi istologici e nell’analisi delle immagini di tessuti densi e opachi con un’organizzazione tissutale complessa. In tempi recenti, il metodo di pulizia dei tessuti presentato è emerso come un protocollo popolare e ampiamente utilizzato per combinare e consentire l’acquisizione simultanea di diversi segnali fluorescenti11,12,13. Lo sviluppo futuro e le modifiche in tali tecniche miglioreranno notevolmente la risoluzione dell’immagine per l’osservazione delle interazioni pianta-patogeno a livello cellulare.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione OPUS17 del National Science Centre Poland No. 2019/33/B/NZ9/00751 “Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae“. Ringraziamo il Prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, Università di Cambridge) per aver condiviso la linea proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |