El presente protocolo describe un método optimizado para la observación histológica de agallas inducidas por Plasmodiophora brassicae. Las secciones de vibratomo de los hipocótilos se eliminan antes de las imágenes de fluorescencia para estudiar la participación de factores de transcripción y fitohormonas durante la progresión de la enfermedad. Este protocolo supera las limitaciones de incrustación de resina, permitiendo la visualización en planta de proteínas fluorescentes.
La infección de los cultivos de Brassica por el protista terrestre Plasmodiophora brassicae conduce a la formación de agallas en los órganos subterráneos. La formación de agallas requiere reprogramación celular y cambios en el metabolismo de la planta infectada. Esto es necesario para establecer un sumidero fisiológico orientado a patógenos hacia el cual se redirigen los nutrientes del huésped. Para una comprensión completa de esta interacción planta-patógeno particular y los mecanismos por los cuales el crecimiento y desarrollo del huésped se subvierten y remodelan, es esencial rastrear y observar los cambios internos que acompañan a la formación de agallas con resolución celular. Los métodos que combinan tinciones fluorescentes y proteínas fluorescentes se emplean a menudo para estudiar las respuestas anatómicas y fisiológicas en las plantas. Desafortunadamente, el gran tamaño de las agallas y su baja transparencia actúan como obstáculos importantes para realizar observaciones de montaje completo bajo el microscopio. Además, la baja transparencia limita el empleo de la microscopía de fluorescencia para estudiar la progresión de la enfermedad de la raíz club y la formación de vesículas. Este artículo presenta un método optimizado para fijar y eliminar agallas para facilitar la epifluorescencia y la microscopía confocal para inspeccionar agallas infectadas por P. brassicae. Se utilizó un protocolo de limpieza de tejidos para la limpieza óptica rápida, seguido de una sección de vibratomo para detectar cambios anatómicos y localizar la expresión génica con fusiones de promotores y líneas reporteras marcadas con proteínas fluorescentes. Este método resultará útil para estudiar las respuestas celulares y fisiológicas en otras estructuras desencadenadas por patógenos en las plantas, como la sincitia inducida por nematodos y los nudos de la raíz, así como las agallas de las hojas y las deformaciones causadas por insectos.
Las plantas afectadas por patógenos o insectos pueden desarrollar estructuras anormales (deformaciones de órganos o agallas), que permiten al invasor ingerir nutrientes y reproducirse1. Aquí, se realizó un enfoque histopatológico eficiente para estudiar los cambios que tienen lugar en las agallas que se desarrollan en las partes subterráneas de las plantas infectadas con el protista Plasmodiophora brassicae (Figura 1). El hilo menor asociado con este patógeno surge del hecho de que las esporas en reposo de P. brassicae pueden conservar su capacidad de invadir las plantas durante muchos años. En el caso del cultivo a gran escala de colza (Brassica napus), este es un problema grave ya que los factores económicos restringen la rotación de cultivos, lo que lleva a la acumulación de esporas en reposo en el suelo2. La resistencia de la colza oleaginosa a la enfermedad de la raíz palo causada por P. brassicae está determinada genéticamente. Lamentablemente, el patógeno a menudo supera la resistencia debido a su biología y al estrecho acervo genético del que se originó la colza. Por lo tanto, se ha vuelto relevante estudiar las respuestas posteriores a la infección en las plantas huésped y su capacidad para retrasar la progresión de la enfermedad o prevenir el desarrollo de ciertos síntomas.
En la enfermedad de la raíz club, la gravedad generalmente se evalúa en función del desarrollo de agallas y el grado de daño del sistema radicular. Esto se conoce como el Índice de Enfermedad-DI3. Sin embargo, no captura completamente la verdadera evaluación de esta interacción planta-patógeno. En particular, no aborda cómo se distribuye el patógeno dentro de las raíces y si la planta puede contenerse. P. brassicae movimiento dentro de sus tejidos. Además, no es fácil anticipar hasta qué punto P. brassicae Reprograma la anatomía de órganos subterráneos. Estudios sobre la planta modelo Arabidopsis thaliana han demostrado que P. brassicae La infección conduce a la inhibición de la xilogénesis (tanto en los pasos de inicio como de maduración) y la mejora de la diferenciación del floema dentro de las agallas4,5. Además, en las raíces e hipocótilos de las plantas infectadas, la progenie de las células cambial no abandona el estado mitótico y prolifera más tiempo que en las plantas sanas.6. Este proceso gobierna el tamaño final de la agalla y determina el número de esporas en reposo de patógenos producidas dentro de la planta infectada. P. brassicaeLa reprogramación del desarrollo, metabólica y fisiológica impulsada en el huésped es muy compleja7; Por lo tanto, la aplicación de herramientas que permitan la inspección de los cambios internos dentro de las agallas es crucial para evaluar adecuadamente esta interacción. La progresión del ciclo de vida de P. brassicae se acompaña de la reprogramación del metabolismo de la célula huésped, que se puede observar como deposición de almidón o lípidos7,8. El principal obstáculo para el éxito de la microscopía de agallas proviene de su baja transparencia. Debido a esto, la mayoría de las muestras histológicas que presentan cambios impulsados por la raíz del club dentro de las agallas se originan a partir de técnicas de fijación incrustada (cera o resina) seguidas de la sección de microtomos. Tales enfoques se utilizaron con éxito para localizar la actividad promotora de numerosos genes activos en las agallas de la raíz club.4,5 o diversas técnicas de tinción que faciliten la observación de P. brassicae Progresión del ciclo de vida9. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las etapas de fijación e incrustación requieren mucho tiempo y dan como resultado un lavado parcial o completo de biomoléculas importantes (por ejemplo, lípidos), lo que dificulta significativamente ciertas observaciones. Recientemente P. brassicae La progresión del ciclo de vida en el huésped se visualizó con la ayuda de la hibridación fluorescente in situ (FISH), en la que una metiltransferasa tipo SABATH (PbBSMT) se utilizó una sonda específica del gen para marcar la formación de esporas en reposo10. Una buena alternativa es el uso de otros métodos basados en fluorescencia donde se puede ver la autofluorescencia de algunos componentes celulares, la actividad de las regiones reguladoras 5′- aguas arriba de genes fusionados con marcadores de proteínas fluorescentes y la acumulación de proteínas marcadas con fluorescencia particulares. Sin embargo, además de la baja transparencia de las muestras, un inconveniente importante asociado con tales objetos es trabajar con especímenes no fijados, lo que disminuye significativamente el tiempo en el que se pueden documentar imágenes de buena calidad. En 2015, Kurihara et al.11 desarrolló un reactivo de limpieza, que permite la preservación de proteínas fluorescentes y aumenta la transparencia de las muestras de tejido vegetal. Además, es compatible con numerosas tinciones histológicas. Recientemente, la misma técnica se aplicó con éxito para visualizar diferentes componentes de la pared celular en tejidos vegetales.12,13. Aquí, este protocolo se ha utilizado para analizar varios aspectos del desarrollo de la agalla clubroot. El flujo de trabajo comienza con la fijación de agallas, la sección de vibratomo, la limpieza de tejidos, la tinción y las imágenes de fluorescencia. Dependiendo de las necesidades de cada uno, directamente o después de una tinción particular, las secciones resultantes pueden someterse a inspección bajo un microscopio de epifluorescencia o confocal. Este método proporciona una solución eficaz para estudiar los cambios locales en la expresión génica y las respuestas fisiológicas, incluyendo el equilibrio fitohormonal y la señalización. La progresión de la enfermedad se puede rastrear observando el patrón de distribución de las esporas en reposo y la dinámica de maduración. Además, el protocolo se puede aplicar fácilmente para cambios característicos de imagen dentro de P. brassicae plantas infectadas, incluida la inhibición de la xilogénesis o las respuestas de defensa de la planta huésped visibles como lignificación local en genotipos resistentes. Los ejemplos en este protocolo provienen de imágenes realizadas en el Arabidopsis thaliana modelo; Sin embargo, el Protocolo también puede aplicarse a otras especies de cultivos pertenecientes a la Brassicaceae familia. El método descrito a continuación facilitará futuros estudios detallados de las estructuras celulares y los cambios moleculares que acompañan a la formación de agallas en P. brassicae-plantas infectadas.
El flujo de trabajo general del protocolo es bastante sencillo, y todas las etapas del desarrollo de la agalla se pueden visualizar y caracterizar fácilmente (Figura 2). Dado que P. brassicae es un patógeno transmitido por el suelo, todos los experimentos deben llevarse a cabo en sistemas basados en el suelo. El patógeno prefiere condiciones ácidas; Por lo tanto, se deben utilizar sustratos de suelo no tratados con cal. Aunque P. brassicae no representa una amenaza para los humanos, es estrictamente un patógeno de plantas que puede propagarse a través del suelo y el agua. Por lo tanto, todas las partes de la planta infectada, así como el suelo, deben destruirse después del experimento mediante autoclave o mediante tratamiento con lejía.
La aplicación de la solución de limpieza en secciones de agallas cortadas por vibratomos seguramente mejora la capacidad de estudiar la interacción biotrófica entre P. brassicae y la planta huésped. Aunque el protocolo de limpieza se aplica incluso a las secciones de la mano, funciona mejor con las secciones de vibratomo. La fijación de muestras en fijador de PFA actúa como un paso crítico en el protocolo, ya que las muestras se pueden almacenar a 4 ° C durante unos días antes de proceder con la sección. Esto proporciona flexibilidad para almacenar muestras durante un período limitado sin comprometer la expresión y preservación de proteínas fluorescentes durante la fijación.
El rojo del Nilo (en DMSO o metanol) es incompatible con las secciones de resina debido a su hidrofobicidad, que disuelve la resina y destruye las secciones17 incrustadas en resina. Por lo tanto, las secciones de vibratomo resultan fundamentales para estudiar la distribución de patógenos y su ciclo de vida dentro de las agallas en desarrollo, en las que la tinción de rojo del Nilo se puede usar fácilmente.
La solución de limpieza utilizada en este protocolo es altamente versátil12, lo que permite utilizar una variedad de tinciones fluorescentes en diferentes combinaciones para teñir varias biomoléculas/componentes de las paredes celulares (suberina, lignina, celulosa y quitina en interacciones fúngicas). También es posible contrarrestar secciones de líneas marcadoras fluorescentes de GFP y, por lo tanto, correlacionar la actividad promotora o el patrón de acumulación de proteínas con la presencia del patógeno en células o regiones particulares de la vesícula. Sin embargo, la autofluorescencia de fondo del xilema y las células gigantes llenas de patógenos no se pudo eliminar incluso después del protocolo de limpieza. Esto presenta una limitación para observar los marcadores fluorescentes durante las últimas etapas de la formación de la vesícula, especialmente cuando se usa un microscopio de epifluorescencia y se obtienen imágenes de señales débiles.
Debido a los bajos niveles de expresión/acumulación de señales fluorescentes, los factores de transcripción son difíciles de detectar, pero, con esta técnica, es posible obtener imágenes satisfactorias para ellos. En general, la combinación de la sección de vibratomo con el enfoque de limpieza de tejidos amplía el conjunto de herramientas para observaciones histológicas de tejidos biliares complejos. La flexibilidad de este protocolo facilita el proceso de fijación de tejidos y reduce el tiempo requerido para cortar y obtener imágenes de muestras de tejido fresco para observar proteínas fluorescentes y actividades promotoras. Con mejoras adicionales y mediante la utilización de otros colorantes fluorescentes específicos para diversas biomoléculas, este método marcará mayores avances en estudios histológicos y análisis de imágenes de tejidos densos y opacos con una organización tisular compleja. En los últimos tiempos, el método de depuración tisular presentado se ha convertido en un protocolo popular y ampliamente utilizado para combinar y permitir la adquisición simultánea de diferentes señales fluorescentes11,12,13. El desarrollo futuro y las modificaciones en tales técnicas mejorarán en gran medida la resolución de la imagen para observar las interacciones planta-patógeno a nivel celular.
The authors have nothing to disclose.
El trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia OPUS17 subvención No. 2019/33 / B / NZ9 / 00751 “Coordinación vascular a larga distancia en plantas infectadas por Plasmodiophora brassicae“. Agradecemos al Prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, Universidad de Cambridge) por compartir la línea proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |