Summary
Ett nödvändigt steg i utvecklingen av aptamerer mot cancer är att testa dess bindning till målet. Vi demonstrerar en flödescytometrisk baserad analys för att studera denna bindning, med betoning på vikten av att inkludera en negativ kontrollaptamer och cancerceller som är positiva eller negativa för just det proteinet.
Abstract
En viktig utmaning i att utveckla en aptamer mot cancer är att effektivt bestämma selektiviteten och specificiteten hos den utvecklade aptameren till målproteinet. På grund av dess flera fördelar jämfört med monoklonala antikroppar har aptamerutveckling vunnit enorm popularitet bland cancerforskare. Systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) är den vanligaste metoden för att utveckla aptamerer som är specifika för proteiner av intresse. Efter Selex påskyndar en snabb och effektiv bindningsanalys identifieringsprocessen, vilket bekräftar aptamerens selektivitet och specificitet.
Detta papper förklarar en steg-för-steg-flödescytometrisk baserad bindningsanalys av en aptamer som är specifik för epitelcellulär vidhäftningsmolekyl (EpCAM). Transmembranglykoproteinet EpCAM är överuttryckt i de flesta karcinom och spelar roller i cancerinitiering, progression och metastasering. Därför är det en värdefull kandidat för riktad läkemedelsleverans till tumörer. För att utvärdera aptamerens selektivitet och specificitet till den membranbundna EpCAM krävs EpCAM-positiva och -negativa celler. Dessutom krävs en icke-bindande EpCAM-aptamer med liknande längd och 2-dimensionell (2D) struktur som den EpCAM-bindande aptameren. Bindningsanalysen inkluderar olika buffertar (blockeringsbuffert, tvättbuffert, inkubationsbuffert och FACS-buffert) och inkubationssteg.
Aptameren inkuberas med cellinjerna. Efter inkubations- och tvättstegen kommer cellerna att utvärderas med hjälp av en känslig flödescytometrianalys. Analys av resultaten visar bindningen av den EpCAM-specifika aptameren till EpCAM-positiva celler och inte de EpCAM-negativa cellerna. I EpCAM-positiva celler avbildas detta som en bandförskjutning i bindningen av EpCAM-aptameren till höger jämfört med den icke-bindande aptamerkontrollen. I EpCAM-negativa celler överlappar motsvarande band av EpCAM-bindande och -icke-bindande aptamerer varandra. Detta visar selektiviteten och specificiteten hos EpCAM aptamer. Även om detta protokoll är inriktat på EpCAM-aptamer, är protokollet tillämpligt på andra publicerade aptamerer.
Introduction
Cancer är fortfarande en av de främsta dödsorsakerna i världen1. Trots den betydande förbättringen av cancerbehandling under de senaste decennierna är läkemedelsutveckling mot cancer fortfarande ett mycket debatterat ämne. Detta beror på att kemoterapi, som grundpelaren i cancerbehandling, åtföljs av allvarliga biverkningar som begränsar patientens efterlevnad av behandlingen. Dessutom har kemoterapiinducerad cancerresistens mot behandling begränsat dess tillämpning som det enda valet av medicinsk intervention. Tillämpningen av monoklonala antikroppar (mAbs) introducerade ett förbättrat svar på cancerbehandlingar2. Motiveringen med att använda mAbs var att förbättra effekten av kemoterapeutik och minimera deras biverkningar. Men administrationen av mAbs blev också en utmaning. Detta berodde inte bara på de mAb-inducerade immunologiska reaktionerna utan också på de djurberoende och dyra produktionskostnaderna och svåra lagringsförhållandena3. Introduktion av aptamerer på 1990-talet4 väckte nya förhoppningar om cancerbehandling, eftersom tillämpningen av aptamerer kunde ta itu med de utmaningar som är förknippade med mAbs.
Aptamers är korta nukleinsyrasekvenser som specifikt produceras för ett visst mål. Systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) är en vanlig metod vid aptamerproduktion. I SELEX inkuberas proteinet av intresse med ett bibliotek av slumpmässiga nukleotidsekvenser, och genom en serie iterativa cykler renas den aptamer som är specifik för det proteinet. Aptamers har liknande målselektivitet och specificitet som mAbs, och därför visar läkemedelsutveckling inom detta område lovande framtida tillämpningar. Aptamers specifika för cancerbiomarkörer kan användas som enskilda läkemedel och cancerdiagnostiska verktyg 5,6,7. På grund av sin nanostora struktur kan dessa aptamerer också fungera som läkemedelsbärare för att leverera cytotoxiska medel specifikt till tumören8. Detta skulle öka effekten av riktad läkemedelsleverans och minska kemoterapi-associerade, off-target biverkningar. Dessutom har dessa nanomediciner en hög vävnadspenetration, vilket gör dem till en önskvärd kandidat för djuptumörläkemedelsleverans och behandling. Aptamers kan också utformas för att rikta in sig på transportörerna uttryckta på blod-hjärnbarriären (BBB) för att förbättra läkemedelsleveransen till hjärntumörer9. Ett bra exempel på en sådan aptamer är bifunktionella aptamerer, riktade mot transferrinreceptorn (TfR)10 för att förbättra läkemedelsleveransen över BBB och levererar en cytotoxisk läkemedelsnyttolast till tumörceller11.
Trots alla fördelar med aptamerer har läkemedelsutveckling inom detta område ännu inte gett ett marknadsfört, framgångsrikt läkemedel mot cancer. En anledning till detta kan vara bristen på standard- och reproducerbara metoder som kan följas globalt av forskare inom området. I detta dokument demonstreras ett steg-för-steg-protokoll för en aptamerbindning till ett inbyggt protein uttryckt på cellytan. Detta protokoll är ett försprång i den prekliniska bedömningen av anticanceraptamerer. Analysen utförs för att visa selektiviteten och specificiteten hos den renade aptameren som samlats in från SELEX eller en publicerad aptamersekvens för bekräftelse av selektivitet och specificitet. Denna flödescytometriska baserade analys är en snabb, pålitlig, känslig analys som exakt visar aptamerens selektivitet och specificitet, där aptameren testas mot proteiner på cellytan12,13,14. Denna metod demonstreras med hjälp av bindningen av en aptamer som är specifik för EpCAM som visas i detta dokument15. EpCAM, som ett transmembranglykoprotein, spelar roller i tumörcellssignalering, progression, migration och metastasering16,17. För att visa selektiviteten och specificiteten hos denna aptamer användes EpCAM-positiva och -negativa cancerceller. Den tidigare utvecklade EpCAM-specifika aptameren, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), och en negativ kontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), användes som EpCAM-bindande respektive -icke-bindande aptamerer10. 3'-änden av både TEPP och TENN var märkta med en TYE665-fluorofor.
TEPP är en bifunktionell aptamer som riktar sig mot EpCAM från ena änden och TfR i den andra. Detta har gjort TEPP till en lämplig kandidat för läkemedelsleverans till EpCAM+ hjärntumörer. Med hjälp av sin TfR-specifika ände passerar TEPP blod-hjärnbarriären och med hjälp av den EpCAM-specifika änden hittar TEPP tumören och levererar dess last (t.ex. cytotoxiska läkemedel) till tumören. TENN har en liknande längd och 2D-struktur som TEPP, men den har inte affinitet för EpCAM eller TfR, och är därför en lämplig negativ kontrollaptamer. Med hjälp av TEPP och TENN visas testning av bindningen av en aptamer till målproteinet med hjälp av flödescytometri i detta dokument. Detta protokoll gäller för utveckling av cellspecifika aptamerer. Det är också tillämpligt på ytterligare kompletterande och konfirmationsanalyser av de aptamersekvenser som finns tillgängliga i litteraturen. Protokollet kan också användas av de som är nya inom aptamerområdet och som tittar på att använda en tidigare publicerad aptamer för sina forsknings- och utvecklingsändamål (R&D). I denna uppsats studeras två aptamersekvenser som finns tillgängliga i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Innan du börjar experimentet, använd personlig skyddsutrustning, inklusive en labbrock, handskar och skyddsglasögon. Se materialförteckningen för mer information om material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Buffertar som krävs för testet
- Förbered de buffertar som krävs för detta experiment - SELEX-bufferten som krävs för aptamervikning, blockeringsbuffert (BB), tvättbuffert (WB) och bindningsbuffert (BiB) (tabell 1) - nyligen på experimentdagen och förvara dem på is eller vid 4 ° C.
OBS: Varje aptamer kräver ett unikt vikningsförhållande. Detta inkluderar SELEX-bufferten och vikningstemperaturförhållandena. Försiktighet bör iakttas för att helt replikera metoderna från det ursprungliga papperet som beskriver aptamer10. I detta experiment framställs alla buffertar i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Den buffertvolym som krävs i varje experiment beror på antalet cellinjer, antalet replikat och antalet aptamerkoncentrationer som testas.
| Ingredienser | Volym krävs | ||
| Sak | Koncentration | ||
| SELEX-buffert | MgCl2 | 5 mM | 50 μL per prov + 10% pipetteringsfel |
| Blockerande buffert | MgCl2 | 5 mM | 500 μl per cellinje |
| BSA a | 1 mg/ml | ||
| tRNA b | 0,1 mg/ml | ||
| FBS c | 10 % (v/v) | ||
| Tvätta buffert | MgCl2 | 5 mM | 1 ml för den första tvätten + 100 μL per testprov + 10% pipettfel |
| Bindande buffert | MgCl2 | 5 mM | 50 μL per prov + 10% pipetteringsfel |
| BSA | 2 mg/ml | ||
| tRNA | 0,2 mg/ml | ||
| FBS | 20 % (v/v) | ||
Tabell 1: Buffertar som krävs för bindningsanalysen. en Bovint serumalbumin, böverföring ribonukleinsyra, cfosterbovint serum.
2. Beredning av aptamerer
OBS: Aptamererna som används i analysen är märkta med en fluorescensreportermolekyl, och därför bör man se till att skydda dem från ljus.
- Före experimentet, förbered ett 100 μM stam (stam A) test- och kontrollaptamerer med pyrogen- och RNasfritt ultrarent vatten (figur 1).
OBS: För långvarig konservering bör lager A förvaras i en frys vid -20 °C. - Bered lager B som arbetskoncentration för aptamerer genom att späda ut lager A med hjälp av SELEX-buffert (tabell 1). För att följa detta protokoll, späd bestånd A till ett lager på 1 000 nM för att bereda lager B (figur 1).
- För att göra aptameren redo för bildandet av den 3-dimensionella (3D) strukturen, späd i ett 250 μL rör, späd lager B med SELEX-buffert för att förbereda den önskade volymen och koncentrationen av aptameren för vikning.
OBS: De vikta aptamererna kommer att utsättas för en lika stor volym celler. Därför bör koncentrationen av aptameren som är inställd för vikning vara 2x mer koncentrerad än den önskade slutliga koncentrationen. Använd ekvation (1) för att beräkna de erforderliga volymerna och koncentrationerna. Kom ihåg att överväga en extra volym på 10% för pipetteringsfelet.
Koncentrationslager A × Volymlager A = Koncentrationslager B × Volymlager B (1)
Figur 1: Ett diagram som visar stegen i beredningen av aptamerer. 1 Lager 1förvaras vid -20 °C för långtidskonservering. 2 Arbetskoncentrationer framställs i SELEX-buffert och lagras inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Underhåll av cancerceller
OBS: Innan studien påbörjas, se till att cellerna är vid sina tidiga passagenummer, visar sina typiska morfologiska egenskaper och är mykoplasmafria. För att testa aptamerens selektivitet och specificitet krävs helst cellinjer som är höga, måttliga och låga/negativa expressorer av proteinet av intresse.
- Frö cellerna i en T75-kulturkolv med hjälp av lämpliga odlingsförhållanden. Odla dem i en 5%CO2 fuktad inkubator, vid 37 °C.
OBS: I denna studie användes Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (komplett medium). - När cellerna når ~ 80% sammanflöde, passera dem till en ny kolv som innehåller färskt komplett medium.
OBS: Beroende på proteinet av intresse och cellinjen kan 80% sammanflöde ge en lämplig cellpopulation för bindningsanalysen. För cellinjerna i detta experiment, MDA-MB-231 och HEK 293T, är 80% sammanflöde lämplig. I detta skede, fortsätt till avsnitt 4, den bindande analysen. Kontrollera alltid uttrycket av proteinet av intresse, med hjälp av mAbs specifikt för det proteinet.
4. Bindande analys
OBS: Figur 2 sammanfattar de steg som krävs i bindningsanalysen i vidhäftande celler.
- I ett klass II-skåp för biosäkerhet, samla cellerna i varje kolv i rör enligt följande:
- Samla och kassera mediet i kolven, tillsätt 2 ml PBS, sprid det över cellerna och samla sedan upp och kassera PBS. Upprepa detta steg två gånger till för att ta bort alla spår av media som kan inaktivera trypsin. Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA till varje kolv och inkubera i 5–10 minuter vid 37 oC. Visualisera avlägsnandet av celler under ett mikroskop.
- Tillsätt 1 ml komplett medium till cellerna och pipettera cellerna upp och ner för att göra en encellssuspension. Pipettera cellerna till ett lämpligt rör och centrifugera vid 200 × g i 5 minuter.
OBS: För icke-vidhäftande celler, samla cellerna i ett rör, centrifugera (200 × g, 5 min) och fortsätt till steg 4.1.3. - Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml färskt medium. Räkna cellerna med trypanblå färgning genom att späda en viss volym cellsuspension med trypanblått. Fördela ~ 15 μL av blandningen mellan en hemocytometer och ett täckglas. Räkna cellerna som tidigare beskrivits18, med ekvation (2):
(2)
OBS: Använd minsta möjliga volym cellsuspension och notera utspädningsfaktorn. Till exempel ger blandning av lika stora volymer cellsuspension och 0,04% trypanblå en utspädningsfaktor på 2. Säkerställ hög viabilitet (levande celler / totalt antal celler × 100) på ~ 90% för de flesta vidhäftande cellinjer innan du fortsätter. Döda celler tar icke-specifikt upp aptamerer och ändrar resultaten19. Det är möjligt att använda andra cellräkningstekniker, till exempel att använda en cellräknare. - Samla in det önskade antalet celler och se till att ha 10 × 104 celler per testprov. Tänk på en extra volym på 10% för pipetteringsfel.
OBS: Det är viktigt att alltid hålla samma cellantal mellan experiment och replikat. - Inkubera cellerna vid 37 °C i 2 timmar för att möjliggöra stabilisering av det protein som är av intresse på cellmembranet efter enzymatisk avlossning.
OBS: Denna inkubationsperiod kan variera beroende på proteinet av intresse.
- Under denna 2 h inkubation:
- Ställ in centrifugens temperatur på 4 °C. Låt tRNA och lager av aptamer vid rumstemperatur eller på is tina. För att skydda fluorescensreportermolekylen, skydda aptamerrören från ljus.
OBS: TRNA: s roll är att blockera nukleinsyrabindningsställena. - Förbered SELEX-bufferten, BB, WB och BiB (se avsnitt 1) och förvara dem alla på is eller vid 4 °C. Ställ termocykelmaskinen på en tom cykel. Placera en 96-brunns svart platta och flödescytometrirör på is.
OBS: Att ställa termocykeln på en tom cykel förbereder kyl- och värmesystemet och hjälper till att generera mer reproducerbara resultat.
- Ställ in centrifugens temperatur på 4 °C. Låt tRNA och lager av aptamer vid rumstemperatur eller på is tina. För att skydda fluorescensreportermolekylen, skydda aptamerrören från ljus.
- Efter 2 timmars inkubation centrifugerar du cellerna vid 500 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 μl BB. Inkubera cellerna vid 4 °C i 30 minuter med intermittent blandning.
- Under denna 30 minuters inkubation, utför aptamervikning enligt följande:
- Fyll på 2x koncentrationerna av aptamerer (se avsnitt 2) och blanda och inkubera aptamererna i termocyklerna, enligt de erforderliga vikningsförhållandena. För denna EpCAM-aptamer, använd följande vikningsförhållanden på 95 °C, 5 min, följt av 22 °C, 10 min och 37 °C, 15 min.
OBS: Inkludera alltid en negativ kontroll (dvs. SELEX-buffert utan aptamerer).
- Fyll på 2x koncentrationerna av aptamerer (se avsnitt 2) och blanda och inkubera aptamererna i termocyklerna, enligt de erforderliga vikningsförhållandena. För denna EpCAM-aptamer, använd följande vikningsförhållanden på 95 °C, 5 min, följt av 22 °C, 10 min och 37 °C, 15 min.
- Efter 30 minuters inkubation centrifugerar du cellerna (500 × g, 5 min, 4 °C), avlägsnar supernatanten, tillsätter 1 ml WB och centrifugerar cellerna igen (500 × g, 5 min, 4 °C). Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i en lämplig volym av BiB.
- Pipettera 50 μL av de återsuspenderade cellerna i varje brunn på en iskall svart platta med 96 brunnar. Håll cellerna på is för att hämma internalisering av proteinet av intresse.
- Pipettera över 50 μl av aptamererna på en 50 μl volym celler, blanda och inkubera i mörker vid 4 °C i 30 minuter. Centrifugera plattan vid 500 × g, 5 min, 4 °C och ta försiktigt bort supernatanten.
- Återsuspendera försiktigt pelleten i WB och centrifugera vid 500 × g i 5 minuter. Upprepa tvättsteget (4.7) 2x och återsuspendera i 100 μL WB för flödescytometrisk analys.
OBS: Se figur 3 för ett diagram över interaktioner mellan aptamerer och celler.
(2)
Figur 2: Ett diagram som visar stegen i att utföra en aptamer-proteinbindande analys. Förkortningar: SELEX = Systematisk utveckling av ligander genom EXponential anrikning; BB = Blockerande buffert; WB = Tvätta buffert; BiB = Bindningsbuffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ett diagram som visar de olika typerna av celler och aptamerer som krävs för att utföra aptamerbindningsanalysen. Förkortning: EpCAM = epitelcellulär vidhäftningsmolekyl. Denna siffra skapades med hjälp av Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Flödescytometri och dataanalys
OBS: Innan du slår på flödescytometern, se till att det inte finns några "bubblor" i membranfilterenheterna för avstängningslösningen, rengöringslösningen och mantelvätskan (0,9% NaCl). "Blöda ut" bubblor om det finns bubblor i kapslarna. Se till att avfallsbehållaren är tom och att behållare med mantelvätska, vatten och 1% blekmedel i ultrarent vatten är fulla.
- Slå på flödescytometern och sedan datorn.
OBS: Detaljerna för att köra flödescytometern som förklaras här är specifika för maskinen och programvaran som demonstreras i videon (se Materialförteckning). Annan programvara skulle kräva lämplig utbildning för att kunna användas. - Öppna programvaran för flödescytometrianalys, logga in på programmet och kör Fluidics Start up under fliken Cytometer.
- Om du vill skapa ett nytt experiment klickar du på Ny mapp under fliken Experiment och namnger mappen/experimentet rätt namn.
- Klicka på ny mapp för att markera, klicka sedan på Nytt experiment under experimentfliken igen och namnge experimentet på lämpligt sätt.
- Om du vill lägga till det första provet/provet klickar du på Nytt prov under experimentfliken och namnger det här provet på lämpligt sätt (namn på cellinje/kontrollprov/experimentprov).
- Om du vill lägga till ett rörprov markerar du provet (gruppen) och klickar på Nytt rör under experimentfliken. Lägg till lämpligt antal rör och namn.
- Om du vill förbereda de diagram som krävs öppnar du ett nytt kalkylblad under fliken kalkylblad . När det nya kalkylbladsfönstret dyker upp öppnar du följande med kalkylbladsskärmen (håll musen över logotypen / bilderna för att hitta namnen):
- Förbered en punktfläcksgraf över framåtriktad spridning (FSC) kontra sidospridning (SCC) för att välja den population som är av intresse. Definiera den första grinden genom att identifiera och välja population av intresse (P1) i ett spridningstäthetsdiagram framåt och på sidan. Uteslut skräpet, som utgör populationen med den lägsta spridningssignalen framåt.
FSC-parametern upptäcker celler eller händelser baserat på deras storlek och SCC diskriminerar dem baserat på deras kornighet20. - Förbered en punktfläcksgraf över FSC-area (FSC-A) kontra FSC-höjd (FSC-H) för att välja encellspopulationen. Definiera den andra porten genom att utesluta dubblettcellpopulationer, eftersom dubblettceller avsevärt påverkar resultaten och slutsatserna. Uteslut dubbletter med hjälp av FSC-H jämfört med FSC-A-densitetsdiagram, där celler av samma storlek visar ett liknande område och höjd. Därför blir singletsna grupperade diagonalt och separerade från dubbletter.
OBS: FSC är ungefär proportionell mot cellstorleken. Spänningspulserna definieras som FSC-H, signalens intensitet, FSC-bredd som återspeglar cellstorlek och signalens varaktighet och FSC-A, som är H × W. Dubletter har ett dubbelt bredd- och areavärde; därför är gating för singlets baserad på att detektera disproportioner mellan H, W och A orsakade av dubbletter. - Förbered ett histogram över antalet händelser mot fluoroforen av intresse.
- Förbered en punktfläcksgraf över framåtriktad spridning (FSC) kontra sidospridning (SCC) för att välja den population som är av intresse. Definiera den första grinden genom att identifiera och välja population av intresse (P1) i ett spridningstäthetsdiagram framåt och på sidan. Uteslut skräpet, som utgör populationen med den lägsta spridningssignalen framåt.
- Innan du startar flödescytometri, se till att förvärvspanelen för att kontrollera provförvärvet, inspektören och cytometern för att justera spänningsparametrar, liksom kalkylbladet med alla grafer är öppna.
OBS: Minst 100 μl av en 10 × 10 4-cellssuspension i ett flödescytometrirör behövs för att utföra analysen. Speciellt vid lägre viabilities kan propidiumjodidfärgning utföras för att välja den livskraftiga cellpopulationen21,22. - För att köra det första provet, se till att pilen som pekar på röret är grön till vänster på skärmen. Om den här pilen inte är grön klickar du på pilen för att göra den grön.
- Använd en pipett och överför varje prov från den 96-brunns svarta plattan till ett flödescytometrirör. Kör det obehandlade, ostoppade kontrollprovet på låg hastighet.
- På instrumentpanelen för förvärv väljer du ett lämpligt antal händelser att registrera (30 000), ändrar flödeshastigheten till låg och klickar på Hämta data.
- Justera spänningen för FSC- och SCC-parametrarna. Se till att cellpopulationen är centraliserad i punktdiagrammet och att inga celler vidrör någon av axlarna i diagrammet för att undvika att förlora cellerna av intresse.
- Öka förvärvshastigheten till medel eller hög för att analysera proverna snabbare men överskrid inte mer än 200 händelser / s. Klicka sedan på Spela in data.
- Utför grinden för P1 (figur 4A) och encellspopulationen (figur 4B). Konstruera histogrammet över händelser mot den använda fluorokromen och välj P1 baserat på data (allophycocyanin (APC) i detta fall) (Figur 4C).
- När du har justerat spänningen, gating och registrerat data, ta ut provet och klicka på Nästa rör.
- Infoga nästa prov och upprepa registreringsdata för alla kontroll- och testprover (figur 3).
- När alla data har samlats in, tvätta flödescytometern genom att köra tre rör med 50% blekmedel, FACS-sköljning och ultrarent vatten, var och en i 5 minuter med hög flödeshastighet.
- Klicka sedan på Fluidics Shut Down från rullgardinsmenyn Cytometer.
- Innan du stänger programvaran och stänger av maskinen och datorn, exportera resultaten som .fcs-filer till en USB-enhet för att överföra och analysera dem, enligt följande:
- I analysprogramvaran trycker du på knappen NY för att skapa ett nytt dokument och fönster för att hantera analysen. Dra exempelfilerna till det nya fönstret.
- Dubbelklicka för att öppna det ofärgade provet. Välj P1-populationen, dubbelklicka på P1-populationen för att skapa en FSC-H kontra FSC-A-graf och grinda encellspopulationen.
- Dubbelklicka på de gated single cells för att skapa ett histogram över händelser mot den använda fluorokromen.
- I det ursprungliga fönstret markerar du P1 och enskilda celler och drar dem till Alla exempel så att alla prover nu innehåller samma gating.
- Klicka på knappen Layoutredigerare för att öppna fönstret Layouter . Dra två exempel (kontroll och test) över varandra för att skapa ett överläggshistogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En viktig aspekt av ny läkemedelsupptäckt och utveckling är att säkerställa läkemedelskandidatens selektivitet och specificitet. Detta innebär att läkemedelskandidaten ska kunna skilja mellan olika celler och endast påverka den cellpopulation som är av intresse (selektivitet). Selektivitet studeras med hjälp av cellinjer som skiljer sig åt när det gäller uttryck av proteinet av intresse. I denna studie valdes MDA-MB-231 och HEK 293T cellinjer som EpCAM-positiva och -negativa celler. Specificitet är en annan determinant som visar att proteinet av intresse bara svarar på en enda läkemedelskandidat. Här, genom att använda en EpCAM icke-bindande aptamer, TENN, visades det att endast TEPP var ansluten till EpCAM. I EpCAM-positiva celler (MDA-MB-231) visar överlagring av histogrammen som representerar celler behandlade med TEPP och TENN att de TEPP-behandlade cellerna flyttas åt höger jämfört med de TENN-behandlade cellerna. Detta visar bindningen av aptameren, TEPP, till proteinet av intresse, EpCAM (figur 4D). I HEK 293T-celler med negativ kontroll återspeglar överlagring av histogram av TEPP och TENN inte någon förskjutning (figur 4E). Detta innebär att i EpCAM-uttryckande celler, TEPP som EpCAM-aptamer fäst vid dess receptor, och dessutom observerades ingen bindning i EpCAM-negativa celler. Dessa resultat bekräftar selektiviteten och specificiteten hos den utvecklade aptameren.
Figur 4: Gating och histogram som visar cellernas bindning till aptameren. (A) Val av cellpopulation, (B) de enskilda cellerna och (C) histogrammet för cellerna som är fästa vid aptameren (200 nM). Bindningen av EpCAM-aptamer (TEPP) kontra en icke-EpCAM-bindande aptamer (TENN) i (D) EpCAM+ MDA-MB-231-celler och (E) EpCAM- HEK 293T-celler jämförs. Förkortningar: EpCAM = epitelcellulär vidhäftningsmolekyl; FSC-A = spridningstopparean framåt; SSC-A = sidospridningstopparearea; FSC-H = framåtriktad spridningstopphöjd; APC = allophycocyanin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den största utmaningen med att utveckla nya aptamerer är bristen på standardriktlinjer som gäller för olika steg i denna process. har nyligen visat några av de tillhörande utmaningarna, vilket leder till oklara presentationer av data i publikationer och misslyckande med att replikera forskningen. De föreslog grundläggande riktlinjer som är nödvändiga för övervägande vid karakterisering av aptamerer19. En aptamerbindningsanalys är ett kritiskt steg i screening och / eller karakterisering av aptamerer23, som används ofta av forskare inom området. Eftersom det inte finns någon enda riktlinje för att visa steg-för-steg-protokollet, demonstreras en flödescytometrimetod, som vanligtvis används för att studera aptamer-proteinbindningen, i det medföljande videoprotokollet.
Det finns flera metoder som mäter interaktionen mellan aptameren och dess mål. Flödescytometri är en av dessa metoder. Andra exempel inkluderar fluorescenspolarisering, ytplasmonresonans, kapillärelektrofores och isotermisk titreringskalorimetri24. Att välja rätt metod beror på tillämpningen av aptameren. Det är emellertid viktigt att veta att varje metod har sina begränsningar och att tillämpningen av flera analyser är mer fördelaktig för karakteriseringen av småmolekylära aptamerer24. Metoden som beskrivs här har flera fördelar. Det är en av de mest pålitliga, exakta och exakta metoderna och är också snabb och kostnadseffektiv. Den flödescytometriska analysen av aptamerbindning kan tillämpas i olika steg av aptamerutveckling, inklusive kandidatscreening, trunkering och optimering, karakterisering och validering.
Med fluorescensmärkning finns det val att antingen märka eller använda den inneboende fluorescensen hos målet eller märka aptamer24. Enligt författarnas erfarenhet är det pålitligt och enkelt att använda märkta aptamer. Aptamers kan märkas med en fluorofor i vilken ände som helst (3' eller 5')25; Slutet med mindre guanin är dock mer gynnsamt, eftersom guanin kan släcka fluorescensen och dess detektion26. En nackdel med denna metod är att aptameren ska märkas till en fluorofor. Dessutom, även om denna metod återspeglar bindningen av aptameren till det specifika proteinet, visar den inte platsen för interaktionsstället. Därför kan ytterligare studier, såsom fluorescensmikroskopi, krävas för att bekräfta aptamer-proteininteraktionsplatsen25.
Det finns några kritiska anteckningar att tänka på när du utför denna analys. Det är viktigt att tänka på att varje aptamer har specifika krav för hantering och vikning. Detta inkluderar valet av berednings- och utspädningsbuffertar och vikningsförhållandena. Rekonstituering av frystorkade aptamerer sker i renat sterilt pyrogen- och RNasfritt ultrarent vatten. Detta för att minimera koncentrationen av joner runt nukleotiderna. Jonkoncentrationen påverkar i hög grad bildandet av 2D-strukturer hos aptamerer och deras affinitet och stabilitet. För ytterligare beredning av aptamerbeståndet bör man därför vara noga med att korrekt förbereda andra buffertar och katjoniska lösningar av metall, såsom MgCl225,27. Den optimala koncentrationen av metallkatjonisk lösning skyddar aptamerens negativa laddning ännu, hämmar inte interaktionen mellan aptameren och dess mål.
Dessutom, eftersom aptameren har en potential för en icke-specifik, off-target bindning, spelar tillämpningen av blockerande buffert en kritisk roll i bindningsanalysen. Förutom den negativt laddade BSA, som vanligtvis används för antikroppar, krävs också laxsperma-DNA eller tRNA här. Denna blandning blockerar de positivt laddade proteinerna och nukleinsyrabindningsställena. Detta blockeringsstadium är särskilt viktigt för aptamers selektivitet och specificitet gentemot cancerceller på grund av deras negativa laddning jämfört med neutrala och positivt laddade normala celler28. Dessutom är 3D-vikningen av aptamerer beroende av andra faktorer som temperatur. Betydelsen av förhållanden som påverkar aptamerens 3D-bildning, inklusive valet av rör och varaktigheten av PCR-faser, har granskats25. Dessutom bör inkubationstiden för aptameren med målet optimeras för varje specifik aptamer. Inkubationstemperaturen är också mycket viktig. Underhåll av en temperatur på 4 °C är särskilt viktigt för cellytproteiner som lätt kan internaliseras, såsom EpCAM25.
Den andra viktiga faktorn i denna analys är tillämpningen av korrekta kontroller. Cancerceller som antingen uttrycker eller inte uttrycker målproteinet bör användas för att utvärdera aptamerens selektivitet. I varje experiment krävs, förutom aptameren av intresse, en negativ kontrollaptamer (en slumpmässig sekvens eller en förvrängd sekvens) för att visa aptamerens specificitet. Helst bör denna kontroll ha en liknande längd av nukleotider och genomgå liknande vikning som aptameren. I detta experiment användes en negativ kontroll (TENN), en aptamer med en liknande struktur som TEPP som visat sig ha en låg bindningsaffinitet med EpCAM,10.
Protokollet som presenteras här är en kvalitativ analys och kan vidare användas för kvantitativ bedömning av bindande affinitet och bestämning av dissociationskonstanten (Kd)29,30,31. Det är dock viktigt att visa resultatens reproducerbarhet med hjälp av tekniska och biologiska replikat. För att uppnå detta är det mycket viktigt att överväga viktiga determinanter för att korrekt utföra denna analys. Detta kan inkludera, men är inte begränsat till, att använda ett lågt passageantal mykoplasmafria celler som är korrekt odlade under sina optimala förhållanden, med användning av ett konstant antal celler som ska exponeras med aptameren i varje replikat, tillämpning av korrekta temperatur- och vikningsförhållanden, upprätthållande av liknande experimentella förhållanden för både aptameren och kontrollen, bibehålla minimal exponering av aptamererna för miljöljus, med hjälp av optimerad aptamercellsexponeringstid och -temperatur, bibehålla en temperatur på 4 °C för cellerna, vilket inkluderar förkylning av centrifugen, 96-brunnsplattan och flödescytometrirören, och exakt förbereda buffertarna med en jonkoncentration så nära de påstådda koncentrationerna som möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT) SEED-finansiering, programmet "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" vid Deakin University och "Australian Government Research Training Program Scholarship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al.
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
