Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superopløsningsmikroskopi af det synaptonemale kompleks inden for Caenorhabditis elegans Germline

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64363
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3, 1
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Superopløsningsmikroskopi kan give et detaljeret indblik i organiseringen af komponenter inden for det synaptonemale kompleks i meiose. Her demonstrerer vi en protokol til at løse individuelle proteiner af Caenorhabditis elegans synaptonemale kompleks.

Abstract

Under meiose skal homologe kromosomer genkende og klæbe til hinanden for at muliggøre deres korrekte adskillelse. En af de vigtigste begivenheder, der sikrer interaktionen mellem homologe kromosomer, er samlingen af det synaptonemale kompleks (SC) i meiotisk profase I. Selvom der er lidt sekvenshomologi mellem proteinkomponenter inden for SC blandt forskellige arter, er SC's generelle struktur blevet stærkt bevaret under evolutionen. I elektronmikrografer fremstår SC som en tredelt, stigelignende struktur sammensat af laterale elementer eller akser, tværgående filamenter og et centralt element.

Imidlertid er det fortsat udfordrende at identificere lokaliseringen af individuelle komponenter i komplekset ved elektronmikroskopi for at bestemme SC's molekylære struktur. I modsætning hertil giver fluorescensmikroskopi mulighed for identifikation af individuelle proteinkomponenter i komplekset. Men da SC kun er ~ 100 nm bred, kan dens understruktur ikke løses ved diffraktionsbegrænset konventionel fluorescensmikroskopi. Således kræver bestemmelse af SC's molekylære arkitektur superopløsningslysmikroskopiteknikker såsom struktureret belysningsmikroskopi (SIM), STED-mikroskopi (Stimulated-emission Depletion) eller enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM).

For at opretholde strukturen og interaktionerne mellem individuelle komponenter inden for SC er det vigtigt at observere komplekset i et miljø, der er tæt på dets oprindelige miljø i kimcellerne. Derfor demonstrerer vi en immunohistokemi og billeddannelsesprotokol, der muliggør undersøgelse af SC's understruktur i intakt, ekstruderet Caenorhabditis elegans kimlinjevæv med SMLM- og STED-mikroskopi. Direkte fastgørelse af vævet til dækslippet reducerer prøvens bevægelse under billeddannelse og minimerer afvigelser i prøven for at opnå den høje opløsning, der er nødvendig for at visualisere SC's understruktur i dens biologiske sammenhæng.

Introduction

At reducere antallet af kromosomer med halvdelen under meiose er nøglen til at generere sunde afkom i seksuelt reproducerende organismer. For at opnå denne reduktion i kromosomantal skal homologe kromosomer parres og adskilles under meiose I. For at sikre nøjagtig adskillelse af homologe kromosomer gennemgår kimceller en udvidet profase I, hvor homologe kromosomer parres, synaps og rekombineres for at generere fysiske forbindelser mellem homologer1. SC er opstået som den centrale struktur, der er nøglen til at regulere den korrekte progression gennem meiotisk profase2.

SC er et kompleks, hvis generelle struktur er evolutionært bevaret, selvom der er lidt homologi mellem dets proteinkomponenter. SC blev først identificeret i elektronmikrografer som en tredelt, stigelignende struktur bestående af to laterale elementer eller akser, en central region dannet af tværgående filamenter og et centralt element 3,4. Bestemmelse af organisationen af individuelle komponenter inden for komplekset er nøglen til at fremme vores forståelse af SC's rolle under meiotisk profase.

Modelorganismen C. elegans er ideel til at studere SC's struktur og funktion, da dens kimlinjer indeholder et stort antal meiotiske kerner med fuldt samlede SC'er5. Genetiske og biokemiske undersøgelser har afsløret, at kromosomakserne er dannet af tre forskellige cohesinkomplekser6,7 og fire HORMA-domæneproteiner kaldet HTP-1/2/3 og HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den centrale region af SC er seks proteiner indeholdende spolede domæner blevet identificeret til dato 12,13,14,15,16,17. For at bygge bro over afstanden mellem de to akser dimeriserer SYP-1, -5 og -6 på en head-to-head måde (figur 1), mens tre yderligere proteiner stabiliserer deres interaktion i det centrale element16,17,18,19.

At opnå detaljeret indsigt i organiseringen af disse proteiner er afgørende for at forstå SC's mange funktioner under meiose. Da bredden af det centrale område af SC kun er ~ 100 nm, kan dens understruktur ikke løses ved diffraktionsbegrænset fluorescensmikroskopi. Imidlertid kan visualisering af komponenter inden for en struktur af denne størrelse let opnås ved mikroskopi med superopløsning. Faktisk er struktureret belysningsmikroskopi (SIM), ekspansionsmikroskopi 20, STED-mikroskopi (stimuleret-emissionsudtømning) 21 og enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 dukket op som vigtige værktøjer til at studere SC's molekylære arkitektur på tværs af arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.

For at overvinde opløsningsgrænsen er STED-mikroskopi afhængig af at overlejre det diffraktionsbegrænsede sted for emissionslyset med en doughnutformet stråle fra STED-laseren, som teoretisk indsnævrer punktspredningsfunktionen ned til molekylære dimensioner31,32. Den opløsning, der praktisk talt kan opnås af STED inden for biologiske prøver, forbliver imidlertid inden for et par titalls nanometer i xy33.

Endnu højere opløsning i biologiske prøver kan opnås med SMLM-teknikker. SMLM udnytter de blinkende egenskaber ved specifikke fluorophorer til at løse objekter på subdiffraktionsniveau ved at adskille rumligt overlappende fluorophorer i tide. Prøven afbildes derefter gentagne gange for at fange forskellige delmængder af fluorophorer. Fluoroforernes position i prøven bestemmes derefter ved at tilpasse punktspredningsfunktionen (PSF) til de opnåede signaler på tværs af alle billeder, som kan løse strukturer ned til 15 nm23,34.

Samlet set koder de lokaliserede billeder positionerne for alle fluorophorer. Opløsningen af SMLM bestemmes af mærkningstætheden og fluorophorens blinkende egenskaber. Ifølge Nyquist-Shannon-kriteriet er det umuligt pålideligt at løse objekter, der er mindre end det dobbelte af den gennemsnitlige etiket-til-etiket-afstand. Således er der brug for en høj mærkningstæthed til billeddannelse i høj opløsning. For SC i C. elegans kan en høj mærkningstæthed opnås ved at bruge epitopmærker knyttet til specifikke steder af endogene proteiner ved hjælp af genomredigering. Epitopmærkerne kan derefter farves ved en høj densitet ved hjælp af specifikke monoklonale antistoffer med høje affiniteter19,30. Samtidig skal on-cycle af individuelle fluorophorer være korte nok til at sikre, at rumligt overlappende fluorophorer ikke fanges på samme tid35.

På grund af disse to krav kræver løsning af strukturen af store makromolekylære komplekser som SC billeddannelse et tilstrækkeligt stort antal billeder og kan således tage flere timer. Faldgruben ved lange billeddannelsestider er, at prøver har tendens til at drive på grund af bevægelse af scenen eller små strømme inden for prøvebufferen; Selv små bevægelser i størrelsesordenen 10 nm er skadelige ved NM-opløsning og skal korrigeres for. De ofte anvendte driftkorrektionsmetoder er imidlertid ikke robuste nok til nøjagtigt at overlejre billeder af to kanaler, der er afbildet sekventielt36. Dette er problematisk, fordi biologiske spørgsmål ofte beder om præcis detektion og lokalisering af flere mål inden for samme prøve. For at omgå disse problemer er der udviklet metoder som ratiometrisk billeddannelse. Ratiometrisk billeddannelse muliggør samtidig billeddannelse af flere fluorophorer med overlappende excitations- og emissionsspektre med en efterfølgende tildeling af hvert detekteret signal til dets respektive fluorofor baseret på forholdet mellem intensiteter i spektralt forskellige kanaler37,38.

Derudover kræver undersøgelse af organiseringen af makromolekylære komplekser som SC tredimensionel (3D) information. For at opnå superopløsning i tre dimensioner (3D-SMLM) er en cylindrisk linse indbygget i den optiske bane for det udsendte lys, der forvrænger formen af PSF af en fluorophore afhængigt af dens afstand fra brændplanet. Derfor kan den præcise position af en fluorophore i z-planet ekstrapoleres ved at analysere formen på dets emissionssignal35,39. Kombination af disse fremskridt inden for SMLM giver mulighed for billeddannelse af 3D-organisationen af makromolekylære komplekser, herunder SC.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger og dækslips

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer og reagenser og tabel 1 for sammensætningen af opløsninger, der anvendes i denne protokol.

  1. Poly-L-lysinbelagte dæksler
    1. Tilbered 0,01% (w/v) poly-L-lysin (se tabel 1).
    2. Vask en præcisionsdæksel (24 mm i diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) i ethanol i 10-30 min. Skyl dækslippen med ddH2O for at fjerne ethanol, og lad dækslikket tørre ved stuetemperatur.
    3. Plasma rengør dækslen ved hjælp af en plasmarenser.
      BEMÆRK: Plasmarensning øger dækslipens hydrofilicitet og letter følgende trin. Hvis en plasmarenser ikke er tilgængelig, kan dette trin springes over, selv om dette kan kræve justering af volumen og / eller koncentration af poly-L-lysin opløsning. Denne ændring er ikke blevet testet.
    4. Placer en dråbe (120 μL) af 0,01% (w / v) poly-L-lysin på dækslippen. Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
    5. Efter inkubation skylles dækslippet i ddH2O og tørres ved stuetemperatur. Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
  2. F(ab')2 fragmenter konjugeret med fluorescerende organiske farvestoffer
    1. Følgende rækkefølge tilsættes til et PCR-rør: 10 μL på 0,6-0,7 mg/ml F(ab')2 fragment i PBS, 1 μL af 0,1 M NaHCO 3 (pH8,3 ) og 1 μL af 1 mM succinimidyl (NHS) esterreaktiv fluorophore i DMSO (molært forhold mellem F(ab')2:farvestof er ~1:17). Bland godt ved at pipettere op og ned.
    2. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    3. Adskil F(ab')2-fragmentet fra det resterende frie reaktive farvestof ved hjælp af en afsaltningskolonne (7K MWCO) i overensstemmelse med producentens specifikationer. Brug 1x PBS til ækvilibrering af kolonnen og eluering af det mærkede F (ab')2 fragment.
    4. Det mærkede F(ab')2-fragment opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
      BEMÆRK: Opbevaringstider på længere end 3 måneder er ikke blevet testet.

2. Dissektion og fiksering

BEMÆRK: Dissektions- og fikseringsprocedurerne er ændret fra tidligere anbefalede procedurer16,40 for at opnå optimale prøver til superopløsningsmikroskopi.

  1. Dissektion
    1. Vælg aldersmatchede C. elegans orme (dyrket ved 20 °C til denne undersøgelse) til en 30 μL dråbe EBTT (1x ægbuffer41 med 0,2% nonionisk vaskemiddel, tabel 1) på en dækslip (22 mm x 22 mm, nr. 1). Placer dækselsedlen på et glasglas for lettere manipulation. Vask med 30 μL EBTT ved at pipettere op og ned flere gange. Fjern 30 μL af opløsningen for at efterlade en dråbe på 30 μL på dækslip.
      BEMÆRK: Små mængder nonionisk vaskemiddel skal tilsættes til alle opløsninger, hvor orme pipetteres for at forhindre ormene i at klæbe til plastspidserne.
    2. Brug et skalpelblad til at skære hovedet og/eller halerne af ormene for at ekstrudere gonaden (figur 2A).
  2. Fiksation
    1. Der pipetteres 30 μL fikseringsopløsning (tabel 1) i dråben af de dissekerede orme og pipet op og ned for at blande.
      BEMÆRK: Pipetting op og ned et par gange kan hjælpe med at frigive flere gonader.
    2. Fix i nøjagtigt 1 minut efter tilsætning af fikseringsopløsningen.
    3. Stop fikseringen ved at overføre ormene til et PCR-rør fyldt med TBST (tabel 1). Overfør ormene i så lille volumen som muligt (~ 15 μL).
    4. Drej PCR-røret ned på en mini bordcentrifuge (2.000 × g, 10 s). Fjern supernatanten og vask 2x med 200 μL TBST hver.
    5. Der vaskes med 200 μL PBST (tabel 1) i 5-10 min. Trin 2.1.1 til 2.2.5 gentages for op til fire prøver, mens de dissekerede prøver holdes på is.
      BEMÆRK: Hvis der behandles mere end fire prøver, skal du fortsætte med trin 2.2.6 til 2.2.7 efter hver fjerde prøve for at sikre, at prøvefiksering forbliver konsistent på tværs af alle prøver.
    6. Centrifugering af de dissekerede prøver på en mini-bordcentrifuge (2.000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsæt 50-100 μL kold methanol (-20 °C).
      FORSIGTIG: Methanol er giftigt. Brug beskyttelsesudstyr og undgå indånding.
    7. Bland ved at pipettere op og ned og lad prøverne stå i metanol i 30-60 sek. Prøverne vaskes 2x i 200 μL PBST.
      BEMÆRK: Hvis der behandles mere end fire prøver, skal du fortsætte med dissektionen af de resterende prøver (trin 2.1.1 til 2.2.7).
    8. Prøverne vaskes en tredje gang med 200 μL PBST.

3. Inkubationer af antistoffer

  1. Blokering
    1. Prøverne blokeres i 1x blokeringsopløsning (tabel 1) i 45-60 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere fra 30 minutter ved stuetemperatur til flere dage ved 4 °C (test blev udført op til 3 dage).
  2. Primær antistofopløsning
    1. Fortynd anti-HTP-3 (kylling42) og anti-HA (mus) antistoffer (eller de valgte antistoffer) til arbejdsløsningerne (1:250 for SMLM og 1:1.000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x blokeringsopløsning.
      BEMÆRK: Antistoffer, der bruges til at mærke SMLM-prøver, er mere koncentrerede end for STED-prøver, da en højere mærkningstæthed anbefales til SMLM-mikroskopi.
    2. Centrifugering af prøverne på en mini-centrifuge (2.000 × g, 10 s), fjern blokeringsbufferen, og tilsæt 30-50 μL af den primære antistofopløsning. Inkuberes natten over ved 4 °C (foretrækkes) eller i 1-2 timer ved stuetemperatur.
    3. Efter inkubation vaskes 3 x 5-15 min med PBST.
  3. Arbejdsløsning af F(ab')2 fragmenter konjugeret til fluorescerende farvestof
    1. De mærkede F(ab')2-fragmenter (trin 1.2.4) fortyndes til arbejdsløsningerne (1:100 for SMLM og 1:1.000 for STED-mikroskopiprøver) i 1x blokeringsopløsning.
      BEMÆRK: For begge superopløsningsteknikker blev tidligere rapporterede fluorophorepar anvendt, nemlig AlexaFluor647/CF680 til SMLM og AlexaFluor594/Abberior STAR635P til STED. AlexaFluor647 og STAR645P blev brugt til at mærke anti-mus (Fab')2 fragmenter til at målrette C-terminalen af SYP-5, og CF680 / AlexaFluor594-mærket anti-kylling (Fab')2 fragmenter til at målrette HTP-3.
    2. Centrifugering af prøverne på en mini-bordcentrifuge (2.000 × g, 10 s), fjern PBST, og tilsæt 30-50 μL sekundær antistofopløsning. Inkuberes i 30 minutter til 2 timer ved stuetemperatur (foretrækkes) eller natten over ved 4 °C. Vask 3 x 5-15 min med PBST.

4. Montering af prøver på en dækseddel

  1. Efterfiksering
    BEMÆRK: Behandle prøver individuelt gennem trin 4.1.1-4.2.1.
    1. Drej de farvede prøver ned og fjern supernatanten. Der tilsættes 50 μL PBST0,2 , og de farvede orme overføres til en 22 mm x 22 mm nr. 1 dækslip.
      BEMÆRK: Brug frisk PBST 0,2 med0,2 % nonionisk vaskemiddel (tabel 1) til dette trin for at forhindre ormene i at klæbe til dækslippet.
    2. Pipet 5,7-6,3 μL postfiksativ opløsning på en poly-L-lysin dæksel.
      BEMÆRK: Poly-L-lysindæksler opbevaret ved 4 °C skal først bringes til stuetemperatur.
    3. Pipet af de dissekerede orme i samme volumen (5,7-6,3 μL) og overførsel til dråben af fikseringsmiddel på poly-L-lysindækslet (figur 2B).
      BEMÆRK: I dette og følgende trin er det meget vigtigt at bevare det dissekerede væv i midten af poly-L-lysinbelagt dækslip. Dette er især vigtigt, hvis prøverne monteres i en brugerdefineret holder, så de passer til det specialbyggede SMLM-mikroskop, der anvendes her (se trin 5.1, figur 2B).
    4. Prøven dækkes med en lille dæksel (12 mm i diameter, figur 2B). Fjern overskydende væske ved hjælp af et lille stykke filterpapir (figur 2B). Fix i 3-5 min i et mørkt kammer.
  2. "Fryse-revner"
    1. Prøverne fryses ved at placere dem på en aluminiumsblok i tøris (figur 2B).
      BEMÆRK: Aluminiumsblokken skal være godt afkølet i tørisen, inden prøverne placeres på den. Fortsættelse med efterfiksering af de resterende prøver (trin 4.1.1 til 4.2.1). Prøven skal være på tøris i mindst 20 minutter eller op til 1 time før næste trin (4.2.2).
    2. Fjern den mindre dæksel med en barbermaskine (figur 2B).
      BEMÆRK: For STED skal du fortsætte til trin 5.2.1. For SMLM skal du fortsætte med trin 4.2.3.
    3. Dyp dækslippen i et 50 ml konisk rør indeholdende iskold PBS (foretrukket) eller -20 ° C methanol i ca. 10 s.
      BEMÆRK: Temperatur er en meget vigtig faktor for dette trin. Brug derfor PBS, der er friskoptøet eller opbevares i et is-/ethanolbad.
    4. Anbring dækslikket i en brønd på en seks-brønds plade fyldt med PBST-buffer. Fjern PBST fra brøndene og tilsæt frisk PBS. Lad prøverne stå i PBS i 5 min.
      BEMÆRK: Pipet PBS'en på siden af brønden for at undgå at beskadige og løsne prøverne.
    5. Der vaskes med frisk PBS, og prøverne efterlades ved 4 °C, indtil de er afbildet.
      BEMÆRK: Prøverne er stabile i op til 2 uger, men de bedste resultater opnås, hvis prøverne afbildes inden for 2 dage.
    6. Før billeddannelse skal du vurdere kvaliteten af prøvemonteringen under et stereomikroskop.
      BEMÆRK: Succesfuldt monterede kimlinjer er stabilt fastgjort uden nogen mærkbar bevægelse i forhold til dækslip. Dårligt vedhæftede kimlinjer vil klappe i bufferopløsningen.

5. Billedbehandling

  1. Mikroskopi af enkeltmolekylelokalisering
    BEMÆRK: Billeder blev erhvervet på EMBL Imaging Center ved hjælp af et specialbygget enkeltmolekylelokaliseringsmikroskop, der blev konstrueret omkring en brugerdefineret krop, som tidligere rapporteret38,43med de unikke egenskaber, der er angivet i Tabel over materialer; Der henvises til https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
    1. Anskaffelse af 3D-perlekalibrering
      1. Der fremstilles en præcisionsdæksel (24 mm i diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) med klæbende 100 nm fluorescerende perler som tidligere beskrevet38,44.
      2. Kalibreringsprøven anbringes fra trin 5.1.1.1 på en prøveholder.
      3. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie på det rene 100x/1,5 oliemål, og monter kalibreringsprøven på mikroskopet.
      4. Inden for MicroManager 2 45,46 angives15-20 positioner i kalibreringsprøven.
      5. Inden for EMU-plugin-vinduet47 skal du konfigurere erhvervelsen af et z-stack-billede for hver af positionerne fra trin 5.1.1.5.
        BEMÆRK: Her giver en sammensat cylindrisk linse den astigmatisme, der kræves til 3D-billeddannelse, og 201 z-skiver blev erhvervet for hver position, der spænder over området mellem -1 μm til 1 μm, med en stigning på 10 nm. En 2 kW/cm2 640 nm laserbelysning blev brugt til 25 ms for hver z-skive.
      6. Anskaf z-stack-billederne af de 100 nm fluorescerende perler gennem en identisk optisk sti, der vil blive brugt til at erhverve prøvebilleder i trin 5.1.11.
      7. Ved hjælp af superopløsningsmikroskopianalyseplatformen (SMAP48) genereres en cspline-model af den eksperimentelle punktspredningsfunktion (PSF), der vil blive brugt til at passe til 3D-SMLM-dataene i trin 5.1.13.
    2. Forbered prøveholderen. For den specialbyggede holder, der bruges her, der bruger en magnetisk ring til at skabe billedkammeret (figur 2B), skal du pakke den magnetiske ring med parafilm.
      BEMÆRK: Alternativt kan et mikroskopglas med et konkavt depressionshulrum bruges til at montere prøver til mikroskoper med glideholdere.
    3. Forbered 1 ml billedbuffer44 (tabel 1).
    4. Tag en dæksel fra trin 4.2.6, og læg den i den specialfremstillede holder. Fastgør dækslikket i holderen med den magnetiske parafilmindpakkede magnetring (trin 5.1.2).
    5. Billedbufferen (trin 5.1.3) pipetteres forsigtigt i kammeret skabt af magnetringen oven på prøven (figur 2B). Forsegl kammeret med et stykke parafilm.
    6. For at montere prøven tilsættes en dråbe nedsænkningsolie på det rene 100x/1,5 oliemål. Uden at tilføre luft i nedsænkningsolien anbringes prøveholderen forsigtigt med den monterede prøve (trin 5.1.5) på mikroskoptrinnet.
      BEMÆRK: Før prøven placeres på mikroskopet, skal du rengøre bunden af dækslippet med væv og 70% ethanol.
    7. Brug EMU-plugin-vinduet47 i MicroManager 245,46 til at flytte piezo-trinnet, indtil signalet fra fokuslåslaseren registreres ved kvadrantfotodioden (QPD).
      BEMÆRK: For at opretholde et fast fokus over billedtiden opnås fokuslåsning ved total intern refleksion af en nær-infrarød fiberkoblet laser fra dækslippet og efterfølgende højdefølsom detektion på en kvadrantfotodiode (QPD). QPD-signalet gav lukket kredsløbskontrol af objektivlinsens piezo-montering.
    8. Få et bagsidefokalplanbillede med en 640 nm excitationslaser ved lav effekt (dvs. 1-5%) for at bekræfte fraværet af luftbobler i nedsænkningsolien.
      BEMÆRK: Fjern prøven fra scenen, hvis der opdages en luftboble. Rengør bunden af dækslikket og målet, og gentag trin 5.1.6-5.1.8. Ellers skal du fortsætte med at låse fokus i EMU-softwaren47.
    9. Lokaliser gonadvævet ved hjælp af brightfield-belysningen. Ved hjælp af en lavintensiv 640 nm belysning skal du fokusere på den del af vævet, der indeholder mange SC-strækninger.
      BEMÆRK: Fokuser ikke på strukturer, der er mere end 2 μm fra dækslip. Brug ikke en højere lasereffekt til at lokalisere prøven, da dette kan gøre nogle fluorophorer til en blinkende tilstand for tidligt. Her blev 1 kW/cm2 brugt i stigende tilstand med en puls indstillet til 1.000.
    10. Prøven udsættes med 640 nm belysning ved høj bestråling (27 kW/cm2) i ~30 s, indtil der opnås en passende blinkhastighed (supplerende video 1).
    11. Anskaf 200.000 billeder med en eksponeringstid på 20 ms ved hjælp af det flerdimensionelle anskaffelsesværktøj i MicroManager 245,46.
    12. I mellemtiden skal du konfigurere UV-aktivering ved hjælp af aktiveringsmuligheden for EMU-plugin38,47 for at opretholde den ønskede blinkhastighed.
      BEMÆRK: Brug UV-laseren ved en 3 kW/cm2 bestråling i stigende tilstand med maksimal pulslængde indstillet til 10.000.
    13. Udfør SMLM-billedrekonstruktion og efterbehandling.
      BEMÆRK: Hvis du vil rekonstruere billeder fra rå SMLM-data, skal du se publicerede metoder. De data, der præsenteres her, blev behandlet ved hjælp af SMAP48,49-softwaren. Superopløst billedrekonstruktion, kanaltildeling, driftkorrektion og filtrering af lokaliseringer med dårlig lokaliseringspræcision og et filter med maksimal sandsynlighed blev udført i SMAP48-softwaren.
  2. Stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi
    BEMÆRK: Billeder blev erhvervet på det integrerede STED-mikroskopiske system udstyret med en hvid lyslaser, en 775 nm pulserende STED-laser og FALCON Fluorescence Lifetime IM-aldringsmodulet (Table of Materials) på EMBL Imaging Center (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
    1. Placer en 20 μL dråbe monteringsmedium (Materialetabel) på et mikroskopglas. Der tages en dæksel fra trin 4.2.2, og prøveemnet anbringes forsigtigt på glideapparatet mod monteringsmediet (figur 2B).
      BEMÆRK: Undgå at indføre luftlommer i monteringsmediet.
    2. Lad monteringsmediet hærde natten over.
      BEMÆRK: Billede prøverne den følgende dag, eller hold dem ved 4 ° C indtil billeddannelse.
    3. For at montere prøven tilsættes en dråbe nedsænkningsolie på prøvens dæksel fra trin 5.2.2. Prøven anbringes forsigtigt på mikroskoptrinnet ved hjælp af et 100x/1,40 oliemål.
    4. Fokuser på prøven og find kimvævet ved hjælp af lysfeltbelysningen.
    5. Brug mikroskopsoftwaren til at angive det interesseområde, som TauSTED-billedet vil blive erhvervet for.
    6. Vælg excitationslaserne og deres passende effekt, der bruges til at ophidse de fluorophorer, der anvendes i prøven.
      BEMÆRK: Her blev 580 nm laseren ved 4% effekt brugt til at afbilde AlexaFluor 594-konjugerede F (ab')2 sekundære antistoffragmenter og 635 nm ved 3% effekt til billede af STAR 635P-konjugerede F (ab')2 fragmenter.
    7. Brug mikroskopsoftwaren til at vælge en passende STED-udtømningslasereffekt og konfigurere billeddetekteringen.
      BEMÆRK: Her blev 775 nm STED-udtømningslasereffekten indstillet til 40%. Detektoren blev brugt i tælletilstand med en forstærkningsværdi på 10 til fotondetektion, med en scanningshastighed på 100 Hz og ved en pixelstørrelse på 17 nm. Fire-line akkumulering blev brugt til TauSTED erhvervelse.

Representative Results

For at afbilde SC i C. elegans kimlinjevæv af SMLM har vi anvendt 2-farveforholdmetrisk 3D-SMLM til at lokalisere HTP-3, en komponent i kromosomakserne og C-terminalen af den tværgående filament SYP-5 endogent mærket med et hæmagglutinin (HA) tag. Placeringen af begge proteiner i SC af C. elegans blev tidligere bestemt af andre undersøgelser16,30.

For at minimere lysspredning og optiske afvigelser, der er forbundet med tykke biologiske prøver, afbildede vi det nederste z-snit af meiotiske kerner, der indeholder SC'erne (figur 3, gule linjer). For hvert erhvervet billede blev piezo-scenepositionen for billedplanet markeret i forhold til piezo-scenepositionen, når målet var fokuseret på dækslippet. Dette tillod beregningen af piezoafstanden fra dækslippen. Succesmonterede prøver fastgøres stabilt tæt på dækslippet og bevarer gonadformen (dvs. vævet knuses ikke mellem de to dækslips under efterfikseringstrinnet). Kvaliteten af prøvemonteringen kan let vurderes under et stereomikroskop, da velfastgjorte gonader ikke viser nogen bevægelse i opløsning (trin 4.2.6). På grund af monteringsprocessens stokasticitet vil gonadvævet ikke nødvendigvis blive lagt helt fladt på dækslippen. Derfor kan bundplanet af kernerne indeholdende SC'er findes i varierende afstande i forhold til dækslippet inden for samme gonade.

For at illustrere, hvordan opløsningen ændrer sig afhængigt af vævets fastgørelse til dækslippen, erhvervede vi billeder i forskellige piezo-afstande til dækslippen. For at vurdere kvaliteten af et individuelt billede blev Fourier-ringkorrelationskurver (FRC)50,51 beregnet, og opløsningen blev bestemt ved hjælp af FRCResolution-pluginet i SMAP-softwaren 48. To repræsentative kerner udvundet af to separate 3D-SMLM-billeder taget i forskellige afstande til dækslippet vises i figur 4. I SC'er, der er placeret tæt på dækslippet, er kromosomakserne og C-terminalen på SYP-5::HA godt løst i alle tre dimensioner (figur 4A, 0,8 μm fra dækslip). For at løse to strukturer adskilt af en given afstand skal den opnåede FRC-opløsning generelt være mindre end halvdelen af denne afstand i den aksiale opløsning.

For at adskille de samme strukturer sideværts skal der opnås endnu mindre FRC-opløsningsværdier. I prøver, der er placeret i nærheden af dækslippet, er FRC-opløsningen faktisk 38 nm for AlexaFluor 647-kanalen og 34 nm for CF680-kanalen og dermed langt under den forventede afstand på 84 nm mellem C-terminalerne på SYP-516. Denne resolution løser derfor let SC's organisation ikke kun i frontal, men også i laterale synspunkter (figur 4B i, ii). I modsætning hertil forringes opløsningen i SC'er, der er placeret i en afstand af 5 μm fra dækslippet på grund af lysspredning og sfæriske afvigelser (figur 4B). FRC-opløsningerne på denne afstand falder til 47 nm (AlexaFluor 647) og 41 nm (CF680), hvilket ikke fuldt ud kan løse C-terminalerne for SYP-5. Da de optiske afvigelser forringer den laterale opløsning mere alvorligt end den aksiale opløsning, er HTP-3- og SYP-5-båndene ikke længere klart løst i tværsnittet af det laterale billede i prøver placeret i en afstand af 5 μm fra dækslippet (figur 4B ii). Sammenligning af FRC-opløsningen af billeder erhvervet i forskellige piezoafstande fra coverslippet afslørede, at det afbildede væv ikke måtte være længere end 2 μm fra coverslippet (figur 5). Dette resultat fremhæver vigtigheden af korrekt udførelse af postfikseringstrinnet, hvor vævet med succes skal krydsbindes til poly-L-lysinbelægningen på dækslippet.

For at demonstrere den opnåelige opløsning med en anden superopløsningsteknik afbildede vi også SC'er i fast intakt kimlinjevæv med TauSTED-mikroskopi. Figur 6A viser TauSTED-billeder med den højeste og laveste opløsning, der er opnået i denne undersøgelse, som estimeret ud fra SC's linjeprofiler i frontal visning (figur 6B). I begge kerner kunne vi løse de to lokaliseringsbånd af HTP-3 i kromosomakserne og C-termini for SYP-5 i den centrale region, hvilket viser, at den opløsning, der kan opnås i TauSTED ved hjælp af denne optimerede protokol, er under 84 nm. Under optimale forhold (figur 6A, øverst) kunne vi løse C-terminalerne i let vippede visninger af SC, der kun var adskilt af 50 nm (figur 6A, gult rektangel og 6C).

Figure 1
Figur 1: Skematisk for organisationen af det synaptonemale kompleks i Caenorhabditis elegans. Tegneserien viser en forenklet struktur af SC i C. elegans , der bygger bro mellem to homologe kromosomer (grå). Strukturen er vist i frontal, lateral og tværsnit. Kromosomakser vises som røde bjælker, mens tværgående filamenter vises i cyan. Tværgående filamentproteiner (SYP-1, 5, 6 i C. elegans) er orienteret på en head-to-head måde (cyan ball-stick grafik) i det centrale område for at bygge bro over afstanden mellem de to akser. De forventede afstande mellem akser og C-termini for tværgående filamenter er angivet. Forkortelse: SC = synaptonemalt kompleks. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration af prøvepræparatet, der blev anvendt i undersøgelsen . (A) Unge C. elegans voksne dissekeres ved deres hoved eller hale (grønne, stiplede linjer) og behandles som beskrevet i protokollen. (B) Individuelle trin i metoden er angivet med grafik, der er forbundet med grå pile. Forkortelser: STED = udtømning af stimuleret emission SMLM = enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi; PBS = fosfatbufferet saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Placering af vævsafsnittet, der kan observeres ved enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi. MIP af en roterende disk konfokal billede af en hel mount C. elegans gonad. Vævet blev farvet for HTP-3 og C-terminalen af SYP-5 (SYP-5::HA), og det kombinerede signal er vist i gråt. Individuelle konfokale billeder blev syet ved hjælp af Grid / Collection-syning Fiji-plugin52 for at skabe et billede af hele gonaden. Indsatsen viser en xy-visning af det nederste z-plan, der indeholder SC'erne. Lokaliseringen af dette plan er vist i ortogonale visninger af vævsafsnittet angivet med et rektangel i MIP-billedet af gonaden (gule linjer). Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: MIP = maksimal intensitetsprojektion; SC'er = synaptonemale komplekser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi af HTP-3 og C-termini af SYP-5. (A,B) Til venstre: SMLM-billeder, der viser pachytenkerner farvet til HTP-3 (rød) og C-terminalen af SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) (skalabjælke = 1 μm). Midte: Indzoomede billeder af interesseområder, der er angivet i A og B, med tilsvarende tværsnitsvisninger, der vises under hvert billede (i, ii; skalalinje = 100 nm). Strækningerne af SC inden for zoomede billeder roteres for at orientere kromosomakserne parallelt med y-aksen. Højre: Grafisk repræsentation af lokaliseringen af de proteiner, der er af interesse inden for SC, der skildrer SC's orientering i de zoomede regioner, der vises i midten af figuren. Forkortelser: SMLM = enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemalt kompleks. Rådata til rekonstruktion af SMLM-billeder er tilgængelige via BioStudies database60 (Tiltrædelses-ID: S-BIAD504). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Fourier-ringkorrelationsopløsningen af enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopibilleder afhænger af afstanden mellem det afbildede z-plan og dækslipens plan. Farvede linjer viser FRC-kurver af billeder erhvervet på forskellige afstande (som afbildet af farvebjælken) fra dækslippen. 1/7-tærsklen, der bruges til at bestemme FRC-opløsningen, er angivet med en sort vandret linje. Indsatser viser afhængigheden af FRC-opløsningen af piezoafstanden fra dækslip. Plotting blev udført af et specialskrevet R-script (version 4.1.2, Supplementary File 1), hvor originale kurver blev udjævnet med funktioner fra "ggplot2" -pakken. Forkortelser: FRC = Fourier ring korrelation; SMLM = enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi; SC = synaptonemalt kompleks. Data for FRC-kurver og SMLM-data er tilgængelige via BioStudies database60 (Tiltrædelses-ID: S-BIAD504). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi forbedret af fluorescenslevetidsbaseret information (TauSTED) løser to lokaliseringsbånd for både HTP-3 og C-terminalen for SYP-5. (A) To repræsentative TauSTED-billeder viser pachytenkerner farvet til HTP-3 (rød) og C-terminalen for SYP-5 (SYP-5::HA, cyan) med højere (øverst) og lavere (nederste) strukturelle definition (skalabjælke = 1 μm). Rektanglerne markerer regioner med de opløste C-termini for SYP-5 i frontal (hvid) og en let vippet visning (gul) af SC. (B, C) Fordeling af HTP-3 (rød) og C-terminalen af SYP-5 (cyan) signal løst af TauSTED. Linjeprofiler af interesseområder, der indeholder visningerne SC i frontal (B) eller let vippet (C), vises som fulde linjer med intensitet normaliseret til den maksimale værdi. Linjeprofiler blev genereret ved hjælp af Fiji ImageJ. Stiplede linjer i B viser de gennemsnitlige data for hvert protein. Den tykke cyanlinje i C svarer til linjeprofilen med den kortest opløste afstand mellem C-terminalerne i SYP-5. For at bestemme afstandene mellem antistofferne rettet mod specifikke proteiner blev linjeprofilerne (n = 9 (B), n = 7 (C)) udstyret med dobbelt gaussians ved hjælp af et specialskrevet R-script (version 4.1.2, supplerende fil 1). Middelafstand ± standardafvigelse (B) og intervallet med minimumsværdi fremhævet med fed (C) er angivet oven på hver graf. Forkortelser: STED = stimuleret mikroskopi af emissionsudtømning; SC = synaptonemalt kompleks. Viste billeder og datapunkter for afbildede linjeprofiler er tilgængelige via BioStudies database60 (Tiltrædelses-ID: S-BIAD504). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af buffere og opløsninger anvendt i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende video 1: Erhvervelse af mikroskopi af enkeltmolekyle. Video, der viser fluorophorer, der blinker med en passende hastighed (50 billeder vises, skalabjælke = 5 μm, 20 ms / ramme). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Dataanalysescript. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den stigelignende organisation af SC, som er afgørende for korrekt rekombination og adskillelse af homologe kromosomer, blev først observeret for næsten 70 år siden i elektronmikroskopi 3,4. Mens den overordnede organisation af SC let løses i elektronmikroskopi, kræver lokaliseringen af individuelle komponenter inden for dette kompleks en mere målrettet tilgang. Med sin bredde på kun ~ 100 nm kan understrukturen af SC ikke løses ved konventionel fluorescensmikroskopi. Imidlertid er superopløsningsmikroskopi blevet en vigtig drivkraft for nye opdagelser om strukturen og funktionen af det synaptonemale kompleks 16,19,24,25,26,27,28,29,30. For at lette denne forskning har vi demonstreret en monteringsprocedure, der gør det muligt at studere arkitekturen af SC inden for C. elegans gonadvæv med SMLM og STED-mikroskopi.

Et kritisk skridt til at optimere opløsningen i SMLM-billeddannelse er direkte tværbinding af kimlinjevævet til en poly-L-lysinbelagt dækslip (trin 4). Den kovalente fastgørelse af vævet til dækslippet er afgørende for at reducere bevægelser i prøven, hvilket ville resultere i store drifter og gøre billeddannelse over lange perioder umulig for SMLM. Derudover fører selv en suboptimal fastgørelse, der efterlader kernerne indeholdende SC'er i en afstand fra dækslippet, til et betydeligt fald i den opnåelige opløsning som følge af sfæriske afvigelser (figur 4). Alternativt til den kovalente fastgørelse, der anvendes her, kan farvet kimlinjevæv også immobiliseres mellem to forseglede dækslips i en lille dråbe billedbuffer19,30. Imidlertid reducerer denne immobiliseringsmetode alvorligt mængden af billedbuffer i prøven fra 1 ml, der anvendes i den optimerede protokol her, til blot et par μL, hvilket vil resultere i en forsuring af billedbufferen og alvorligt reducere den tid, som prøven kan afbildes 38,53,54.

Lange anskaffelsestider for både SMLM- og STED-mikroskopi begrænser brugen af disse metoder til billeddannelse af kemisk fikserede prøver. Her sikrer paraformaldehydfiksering, at SC's struktur bevares under prøveforberedelse og billeddannelse. På trods af de forholdsregler, der er taget her for at afbilde SC i intakt væv, er den resulterende struktur af SC efter fiksering ikke nødvendigvis identisk med strukturen i sin oprindelige tilstand i en levende organisme. Da et enkelt billede af den faste SC repræsenterer et enkelt "øjebliksbillede" af den biologiske struktur, forbliver denne tilgang desuden blind for dynamikken i den oprindelige struktur in vivo.

Imidlertid kan information om dynamikken og variabiliteten af makromolekylære strukturer også opnås ved at erhverve ikke kun en enkelt, men mange "snapshots". Selvom denne tilgang kan løse ændringer i SC's struktur under pachyten19, er der flere faktorer, der begrænser antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt prøve udarbejdet ved hjælp af denne protokol. For det første fører de høje laserkræfter, der anvendes under billedoptagelse, til permanent blegning af fluorophorerne og udelukker billeddannelse af tilstødende områder af interesse eller flere z-planer, hvorved antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt prøve, reduceres betydeligt. For det andet er prøve-/vævstætheden på den dækslip, der er udarbejdet ved denne metode, lav, hvilket væsentligt begrænser antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt coverslip. Den lave prøvetæthed forbyder også brugen af automatiserede billedoptagelsesrørledninger, der hjalp med at kaste lys over andre biologiske spørgsmål 34,55,56,57,58,59. Prøvetætheden kan dog øges lidt af en erfaren bruger.

Protokollen, der præsenteres her, er optimeret til at opnå en høj mærkningstæthed, der er nødvendig for at opnå optimal opløsning i SMLM35. Mens tidligere protokoller kovalent binder vævet til dækslippet før immunostaining16, krydsbinder denne nye protokol vævet til dækslippet først, efter at prøverne blev farvet i opløsning. Denne ændring gør det muligt for de antistoffer, der anvendes til immunmærkning, frit at få adgang til vævet fra alle sider, mens vævets kovalente fastgørelse til dækslippet kan begrænse antistoffer fra at nå kernerne tættest på dækslippet og derved reducere graden af mærkning. Sammen forbedrer de ændringer, der er beskrevet her, opløsningen fra 40-50 nm (FRC-opløsning)16 til 30-40 nm (denne protokol).

Det er vigtigt, at mens en høj mærkningstæthed og en høj koncentration af antistoffer er afgørende for SMLM, fandt vi, at bedre STED-mikroskopibilleder opnås ved hjælp af lavere antistofkoncentrationer (trin 3). Ved en opløsning på snesevis af nanometer bliver størrelsen af de molekyler, der bruges til at mærke proteinet af interesse, stadig vigtigere. Vi anvendte derfor F(ab')2 fragmenter, der er halvt så store som antistoffer i fuld længde. Forbedringen i lokal kontrast på grund af en mindre signalkilde og derfor opløsning opnået ved denne ændring sammenlignet med anvendelse af sekundære antistoffer i fuld længde tillod opløsningen af de to C-termini af SYP-5 inden for den centrale region af TauSTED, som ikke løses af konventionel STED ved hjælp af antistoffer i fuld længde (16 og data ikke vist). Vi forventer, at denne optimerede protokol til billeddannelse af SC'er i intakte C. eleganskimlinjer vil lette undersøgelsen af SC's struktur-funktionsforhold under meiose.

Disclosures

Forfattere erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Jonas Ries og Ries-laboratoriet for at dele billedbuffere til SMLM-billeddannelse. Vi takker også Yumi Kim for C. elegans-stammen, der anvendes i denne protokol, og Abby F. Dernburg for kylling-anti-HTP-3-antistoffet. Vi takker Marko Lampe og Stefan Terjung fra Advanced Light Microscopy Facility hos EMBL Heidelberg for deres støtte til brugen af Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Dette arbejde blev støttet af European Molecular Biology Laboratory og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). Vi anerkender adgangen og tjenesterne fra Imaging Centre ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), generøst støttet af Boehringer Ingelheim Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm - 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

Biologi udgave 187 C. elegans meiose synaptonemalt kompleks immunohistokemi superopløsningsmikroskopi enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi
Superopløsningsmikroskopi af det synaptonemale kompleks inden for <em>Caenorhabditis elegans</em> Germline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, … More

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter