Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64363
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3, 1
1Cell Biology and Biophysics, European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University, Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Abstract

Tijdens meiose moeten homologe chromosomen elkaar herkennen en aan elkaar hechten om hun juiste segregatie mogelijk te maken. Een van de belangrijkste gebeurtenissen die de interactie van homologe chromosomen veilig stelt, is de assemblage van het synaptonemale complex (SC) in meiotische profase I. Hoewel er weinig sequentie homologie is tussen eiwitcomponenten binnen de SC bij verschillende soorten, is de algemene structuur van de SC sterk bewaard gebleven tijdens de evolutie. In elektronenmicrografieën verschijnt de SC als een drieledige, ladderachtige structuur die bestaat uit laterale elementen of assen, dwarsfilamenten en een centraal element.

Het nauwkeurig identificeren van de lokalisatie van individuele componenten binnen het complex door elektronenmicroscopie om de moleculaire structuur van de SC te bepalen, blijft echter een uitdaging. Fluorescentiemicroscopie daarentegen maakt de identificatie van individuele eiwitcomponenten binnen het complex mogelijk. Omdat de SC echter slechts ~ 100 nm breed is, kan de substructuur niet worden opgelost door diffractiebeperkte conventionele fluorescentiemicroscopie. Het bepalen van de moleculaire architectuur van de SC vereist dus superresolutie lichtmicroscopietechnieken zoals gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie of lokalisatiemicroscopie met één molecuul (SMLM).

Om de structuur en interacties van individuele componenten binnen de SC te behouden, is het belangrijk om het complex te observeren in een omgeving die dicht bij zijn oorspronkelijke omgeving in de geslachtscellen ligt. Daarom demonstreren we een immunohistochemie- en beeldvormingsprotocol dat de studie van de onderstructuur van de SC in intact, geëxtrudeerd Caenorhabditis elegans kiembaanweefsel met SMLM- en STED-microscopie mogelijk maakt. Het direct fixeren van het weefsel aan de coverslip vermindert de beweging van de monsters tijdens beeldvorming en minimaliseert aberraties in het monster om de hoge resolutie te bereiken die nodig is om de substructuur van de SC in zijn biologische context te visualiseren.

Introduction

Het halveren van het aantal chromosomen tijdens meiose is de sleutel tot het genereren van gezonde nakomelingen in seksueel reproducerende organismen. Om deze vermindering van het aantal chromosomen te bereiken, moeten homologe chromosomen paren en scheiden tijdens meiose I. Om de nauwkeurige segregatie van homologe chromosomen te garanderen, ondergaan geslachtscellen een uitgebreide profase I, waarbij homologe chromosomen paren, synapsen en recombineren om fysieke verbindingen tussen homologen te genereren1. De SC is naar voren gekomen als de centrale structuur die de sleutel is tot het reguleren van de juiste progressie door meiotische profase2.

De SC is een complex waarvan de algemene structuur evolutionair geconserveerd is, ook al is er weinig homologie tussen de eiwitcomponenten. De SC werd voor het eerst geïdentificeerd in elektronenmicrografieën als een drietiende, ladderachtige structuur bestaande uit twee laterale elementen of assen, een centraal gebied gevormd door dwarsfilamenten en een centraal element 3,4. Het bepalen van de organisatie van individuele componenten binnen het complex is de sleutel tot het bevorderen van ons begrip van de rol van de SC tijdens de meiotische profase.

Het modelorganisme C. elegans is bij uitstek geschikt om de structuur en functie van de SC te bestuderen, omdat de kiembanen een groot aantal meiotische kernen met volledig geassembleerde SC'sbevatten 5. Genetische en biochemische studies hebben aangetoond dat de chromosoomassen worden gevormd door drie verschillende cohesinecomplexen 6,7 en vier HORMA-domeineiwitten genaamd HTP-1/2/3 en HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans. In het centrale gebied van de SC zijn tot op heden zes eiwitten met coiled-coil-domeinen geïdentificeerd 12,13,14,15,16,17. Om de afstand tussen de twee assen te overbruggen, dimmen SYP-1, -5 en -6 op een head-to-head manier (figuur 1), terwijl drie extra eiwitten hun interactie stabiliseren in het centrale element 16,17,18,19.

Het verkrijgen van gedetailleerd inzicht in de organisatie van deze eiwitten is essentieel bij het begrijpen van de vele functies van de SC tijdens meiose. Aangezien de breedte van het centrale gebied van de SC slechts ~ 100 nm is, kan de substructuur niet worden opgelost door diffractie-beperkte fluorescentiemicroscopie. Het visualiseren van componenten binnen een structuur van deze grootte is echter gemakkelijk haalbaar door microscopie met superresolutie. Inderdaad, gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), expansiemicroscopie20, gestimuleerde-emissiedepletie (STED) microscopie21 en single-molecule lokalisatiemicroscopie (SMLM)22,23 zijn naar voren gekomen als essentiële hulpmiddelen om de moleculaire architectuur van de SC te bestuderen over soorten 16,24,25,26,27,28,29, 30.

Om de resolutielimiet te overwinnen, vertrouwt STED-microscopie op het bedekken van de diffractie-beperkte plek van het emissielicht met een donutvormige straal van de STED-laser, die theoretisch de puntspreidingsfunctie beperkt tot moleculaire dimensies 31,32. De resolutie die praktisch haalbaar is door STED binnen biologische monsters blijft echter in het bereik van enkele tientallen nanometers in xy33.

Een nog hogere resolutie in biologische monsters kan worden verkregen met SMLM-technieken. SMLM maakt gebruik van de knipperende eigenschappen van specifieke fluoroforen om objecten op subdiffractieniveau op te lossen door ruimtelijk overlappende fluoroforen in de tijd te scheiden. Het monster wordt vervolgens herhaaldelijk in beeld gebracht om verschillende subsets van fluoroforen vast te leggen. De positie van de fluoroforen in het monster wordt vervolgens bepaald door de puntspreidingsfunctie (PSF) aan te passen aan de verkregen signalen over alle beelden, die structuren tot 15 nm23,34 kunnen oplossen.

Samen coderen de gelokaliseerde afbeeldingen de posities van alle fluoroforen. De resolutie van SMLM wordt bepaald door de labelingdichtheid en de knipperende eigenschappen van de fluorofoor. Volgens het Nyquist-Shannon-criterium is het onmogelijk om objecten betrouwbaar op te lossen die minder dan twee keer de gemiddelde label-to-label afstand hebben. Er is dus een hoge labelingsdichtheid nodig voor beeldvorming met hoge resolutie. Voor de SC in C. elegans kan een hoge labelingsdichtheid worden bereikt door epitooptags te gebruiken die zijn bevestigd aan specifieke plaatsen van endogene eiwitten met behulp van genoombewerking. De epitooptags kunnen vervolgens met een hoge dichtheid worden gekleurd met behulp van specifieke monoklonale antilichamen met hoge affiniteiten19,30. Tegelijkertijd moet de on-cycle van individuele fluoroforen kort genoeg zijn om ervoor te zorgen dat ruimtelijk overlappende fluoroforen niet tegelijkertijd worden opgevangen35.

Vanwege deze twee vereisten vereist het oplossen van de structuur van grote macromoleculaire complexen zoals de SC het afbeelden van een voldoende groot aantal afbeeldingen en kan dus enkele uren duren. De valkuil van lange beeldvormingstijden is dat monsters de neiging hebben om te drijven als gevolg van beweging van het stadium of kleine stromen binnen de monsterbuffer; zelfs kleine bewegingen in de orde van grootte van 10 nm zijn schadelijk bij nm-resolutie en moeten worden gecorrigeerd. De meest gebruikte driftcorrectiemethoden zijn echter niet robuust genoeg om afbeeldingen van twee kanalen die achtereenvolgens zijn afgebeeld nauwkeurig te bedekken36. Dit is problematisch omdat biologische vragen vaak vragen om nauwkeurige detectie en lokalisatie van meerdere doelen binnen dezelfde steekproef. Om deze problemen te omzeilen, zijn methoden zoals ratiometrische beeldvorming ontwikkeld. Ratiometrische beeldvorming maakt de gelijktijdige beeldvorming van meerdere fluoroforen met overlappende excitatie- en emissiespectra mogelijk, met een daaropvolgende toewijzing van elk gedetecteerd signaal aan zijn respectieve fluorofoor op basis van de verhouding van intensiteiten in spectraal verschillende kanalen37,38.

Bovendien vereist het bestuderen van de organisatie van macromoleculaire complexen zoals de SC driedimensionale (3D) informatie. Om een superresolutie in drie dimensies (3D-SMLM) te bereiken, is een cilindrische lens opgenomen in het optische pad van het uitgezonden licht dat de vorm van de PSF van een fluorofoor vervormt, afhankelijk van de afstand tot het brandpuntsvlak. Daarom kan de precieze positie van een fluorofoor in het z-vlak worden geëxtrapoleerd door de vorm van zijn emissiesignaal35,39 te analyseren. Het combineren van deze vooruitgang in SMLM maakt beeldvorming mogelijk van de 3D-organisatie van macromoleculaire complexen, inclusief de SC.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen en coverslips

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor details met betrekking tot alle materialen en reagentia en tabel 1 voor de samenstelling van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Poly-L-lysine-gecoate coverslips
    1. Bereid 0,01% (w/v) poly-L-lysine (zie tabel 1).
    2. Was een precisie coverslip (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1.5) in ethanol gedurende 10-30 min. Spoel de coverslip af met ddH2O om ethanol te verwijderen en laat de coverslip drogen bij kamertemperatuur.
    3. Plasma reinig de coverslip met een plasmareiniger.
      OPMERKING: Plasmareiniging verhoogt de hydrofilie van de coverslip en vergemakkelijkt de volgende stappen. Als er geen plasmareiniger beschikbaar is, kan deze stap worden overgeslagen, hoewel dit mogelijk een aanpassing van het volume en/of de concentratie van de poly-L-lysine-oplossing vereist. Deze wijziging is niet getest.
    4. Plaats één druppel (120 μL) van 0,01% (w/v) poly-L-lysine op de coverslip. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Spoel na incubatie de coverslip af in ddH2O en droog op kamertemperatuur. Bewaren bij 4 °C tot 1 maand.
  2. F(ab')2 fragmenten geconjugeerd met fluorescerende organische kleurstoffen
    1. Voeg in de volgende volgorde toe aan een PCR-buis: 10 μL van 0,6-0,7 mg/ml F(ab')2 fragment in PBS, 1 μL van 0,1 M NaHCO3 (pH 8,3) en 1 μL van 1 mM succinimidyl (NHS) ester reactieve fluorofoor in DMSO (molaire verhouding van F(ab')2:kleurstof is ~1:17). Meng goed door op en neer te pipetteren.
    2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Scheid het F(ab')2-fragment van de resterende vrije reactieve kleurstof met behulp van een ontziltingskolom (7K MWCO) volgens de specificaties van de fabrikant. Gebruik 1x PBS voor equilibratie van de kolom en elutie van het gelabelde F(ab')2 fragment.
    4. Bewaar het gelabelde F(ab')2 fragment bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
      LET OP: Bewaartijden van langer dan 3 maanden zijn niet getest.

2. Dissectie en fixatie

OPMERKING: De dissectie- en fixatieprocedures zijn gewijzigd ten opzichte van eerder aanbevolen procedures16,40 om optimale monsters te verkrijgen voor superresolutiemicroscopie.

  1. Sectie
    1. Kies leeftijdsgebonden C. eleganswormen (gekweekt bij 20 °C voor dit onderzoek) in een EBTT-druppel van 30 μL (1x Eibuffer41 met 0,2% niet-ionisch wasmiddel, Tabel 1) op een deklip (22 mm x 22 mm, nr. 1). Plaats de afdeksel op een glazen schuif voor eenvoudigere manipulatie. Was met 30 μL EBTT door meerdere keren op en neer te pipetteren. Verwijder 30 μL van de oplossing om een druppel van 30 μL op de coverslip achter te laten.
      OPMERKING: Kleine hoeveelheden niet-ionisch reinigingsmiddel moeten worden toegevoegd aan alle oplossingen waarin wormen worden gepipetteerd om te voorkomen dat de wormen aan de plastic uiteinden blijven kleven.
    2. Gebruik een scalpelmes om de koppen en/of de staarten van de wormen af te snijden om de geslachtsklier te extruderen (figuur 2A).
  2. Fixatie
    1. Pipetteer 30 μL fixatieve oplossing (tabel 1) in de druppel van de ontlede wormen en pipetteer op en neer om te mengen.
      OPMERKING: Een paar keer op en neer pipetteren kan helpen om meer geslachtsklieren los te laten.
    2. Fix gedurende precies 1 min na het toevoegen van de fixatieve oplossing.
    3. Stop de fixatie door de wormen over te brengen in een PCR-buis gevuld met TBST (tabel 1). Breng de wormen over in zo min mogelijk volume (~15 μL).
    4. Draai de PCR-buis af op een mini-benchtopcentrifuge (2.000 × g, 10 s). Verwijder het supernatant en was 2x met elk 200 μL TBST.
    5. Wassen met 200 μL PBST (tabel 1) gedurende 5-10 min. Herhaal stap 2.1.1 tot en met 2.2.5 voor maximaal vier monsters terwijl u de ontleedde monsters op ijs bewaart.
      OPMERKING: Als u meer dan vier monsters verwerkt, gaat u na elke vier monsters verder met stap 2.2.6 tot en met 2.2.7 om ervoor te zorgen dat de fixatie van het monster consistent blijft in alle monsters.
    6. Draai de ontleedde monsters op een mini-benchtopcentrifuge (2.000 × g, 10 s), verwijder de PBST en voeg 50-100 μL koude methanol (-20 °C) toe.
      LET OP: Methanol is giftig. Draag beschermende uitrusting en vermijd inademing.
    7. Meng door op en neer te pipetteren en laat de monsters 30-60 s in methanol staan. Was de monsters 2x in 200 μL PBST.
      OPMERKING: Als u meer dan vier monsters verwerkt, gaat u verder met het dissectien van de resterende monsters (stappen 2.1.1 tot en met 2.2.7).
    8. Was de monsters een derde keer met 200 μL PBST.

3. Antilichaam incubaties

  1. Blokkeren
    1. Blokkeer de monsters in 1x blokkeringsoplossing (tabel 1) gedurende 45-60 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De incubatietijd kan variëren van 30 minuten bij kamertemperatuur tot enkele dagen bij 4 °C (testen werden uitgevoerd tot 3 dagen).
  2. Primaire antilichaamoplossing
    1. Verdun anti-HTP-3 (kip42) en anti-HA (muis) antilichamen (of de antilichamen van keuze) naar de werkoplossingen (1:250 voor SMLM en 1:1.000 voor STED-microscopiemonsters) in 1x Blokkeringsoplossing.
      OPMERKING: Antilichamen die worden gebruikt om SMLM-monsters te labelen, zijn geconcentreerder dan voor SOA-monsters, omdat een hogere etiketteringsdichtheid wordt aanbevolen voor SMLM-microscopie.
    2. Draai de monsters op een mini-benchtopcentrifuge (2.000 × g, 10 s), verwijder de blokkerende buffer en voeg 30-50 μL van de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer 's nachts bij 4 °C (bij voorkeur) of gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
    3. Na incubatie, wassen 3 x 5-15 min met PBST.
  3. Werkoplossing van F(ab')2 fragmenten geconjugeerd tot fluorescerende kleurstof
    1. Verdun de gelabelde F(ab')2 fragmenten (stap 1.2.4) tot de werkoplossingen (1:100 voor SMLM en 1:1.000 voor STED-microscopiemonsters) in 1x Blokkeringsoplossing.
      OPMERKING: Voor beide superresolutietechnieken werden eerder gerapporteerde fluorofoorparen gebruikt, namelijk AlexaFluor647 / CF680 voor SMLM en AlexaFluor594 / Abberior STAR635P voor STED. AlexaFluor647 en STAR645P werden gebruikt om anti-muis (Fab')2 fragmenten te labelen om de C-terminus van SYP-5 te targeten, en CF680/AlexaFluor594-gelabelde anti-kip (Fab')2 fragmenten om HTP-3 te targeten.
    2. Draai de monsters op een mini-benchtopcentrifuge (2.000 × g, 10 s), verwijder de PBST en voeg 30-50 μL secundaire antilichaamoplossing toe. Incubeer gedurende 30 min tot 2 uur bij kamertemperatuur (bij voorkeur) of een nacht bij 4 °C. Was 3 x 5-15 min met PBST.

4. Monsters monteren op een coverslip

  1. Postfixatie
    OPMERKING: Verwerk monsters afzonderlijk via de stappen 4.1.1-4.2.1.
    1. Draai de gekleurde monsters naar beneden en verwijder het supernatant. Voeg 50 μL PBST0,2 toe en breng de gekleurde wormen over op een 22 mm x 22 mm No. 1 coverslip.
      OPMERKING: Gebruik verse PBST0,2 met 0,2% niet-ionisch reinigingsmiddel (tabel 1) voor deze stap om te voorkomen dat de wormen zich aan de coverslip hechten.
    2. Pipetteer 5,7-6,3 μL postfixatieve oplossing op een poly-L-lysine coverslip.
      OPMERKING: Poly-L-lysine coverslips die bij 4 °C worden bewaard, moeten eerst op kamertemperatuur worden gebracht.
    3. Pipetteer de ontlede wormen in hetzelfde volume (5,7-6,3 μL) en breng over in de druppel fixatief op de poly-L-lysine coverslip (figuur 2B).
      OPMERKING: In deze en de volgende stap is het erg belangrijk om het ontleedde weefsel in het midden van de poly-L-lysine-gecoate coverslip te behouden. Dit is vooral belangrijk als u de monsters in een aangepaste houder monteert om te passen op de op maat gemaakte SMLM-microscoop die hier wordt gebruikt (zie stap 5.1, figuur 2B).
    4. Bedek het monster met een kleine deklip (12 mm diameter, figuur 2B). Verwijder overtollige vloeistof met een klein stukje filtreerpapier (figuur 2B). Fix gedurende 3-5 minuten in een donkere kamer.
  2. "Vriesbreken"
    1. Vries de monsters in door ze op een aluminium blok in droogijs te plaatsen (figuur 2B).
      OPMERKING: Het aluminium blok moet goed worden gekoeld in het droogijs voordat de monsters erop worden geplaatst. Ga verder met de postfixatie van de resterende monsters (stappen 4.1.1 tot en met 4.2.1). Het monster moet ten minste 20 minuten of maximaal 1 uur op droogijs liggen voordat de volgende stap wordt uitgevoerd (4.2.2).
    2. Verwijder de kleinere coverslip met een scheermes (figuur 2B).
      OPMERKING: Ga voor STED verder met stap 5.2.1. Ga voor SMLM verder met stap 4.2.3.
    3. Dompel de dekselslip in een conische buis van 50 ml met ijskoude PBS (voorkeur) of -20 °C methanol gedurende ongeveer 10 s.
      OPMERKING: Temperatuur is een zeer belangrijke factor voor deze stap. Gebruik daarom PBS dat vers is ontdooid of bewaard in een ijs/ ethanolbad.
    4. Plaats de dekselplaat in een putje van een plaat met zes putten gevuld met PBST-buffer. Haal de PBST uit de putjes en voeg verse PBS toe. Laat de monsters gedurende 5 minuten in PBS staan.
      OPMERKING: Pipetteer de PBS op de zijkant van de put om beschadiging en ontkoppeling van de monsters te voorkomen.
    5. Wassen met verse PBS en laat de monsters op 4 °C staan totdat ze in beeld zijn gebracht.
      OPMERKING: Monsters zijn stabiel voor maximaal 2 weken, maar de beste resultaten worden bereikt als de monsters binnen 2 dagen worden afgebeeld.
    6. Beoordeel vóór de beeldvorming de kwaliteit van de monstermontage onder een stereomicroscoop.
      OPMERKING: Succesvol gemonteerde kiembanen zijn stabiel bevestigd zonder waarneembare beweging ten opzichte van de coverslip. Slecht bevestigde kiembanen zullen in de bufferoplossing flappen.

5. Beeldvorming

  1. Lokalisatiemicroscopie met één molecuul
    OPMERKING: Beelden werden verkregen in het EMBL Imaging Centre met behulp van een op maat gemaakte lokalisatiemicroscoop met één molecuul die was opgebouwd rond een aangepast lichaam, zoals eerder gemeld38,43, met de unieke kenmerken die zijn gespecificeerd in de Materiaaltabel; zie https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
    1. 3D-kraalkalibratie aanschaffen
      1. Bereid een precisie coverslip (24 mm diameter; 0,17 ± 0,005 mm, nr. 1,5) met aanhangende 100 nm fluorescerende kralen zoals eerder beschreven38,44.
      2. Plaats het kalibratiemonster uit stap 5.1.1.1 op een monsterhouder.
      3. Voeg een druppel dompelolie toe aan het schone 100x/1.5 olieobjectief en monteer het kalibratiemonster op de microscoop.
      4. Geef binnen MicroManager 2 45,46 15-20 posities op in het kalibratiemonster.
      5. Stel in het EMU-plug-invenster47 de verwerving van een z-stack-afbeelding in voor elk van de posities uit stap 5.1.1.5.
        OPMERKING: Hier biedt een samengestelde cilindrische lens het astigmatisme dat nodig is voor 3D-beeldvorming, en 201 z-slices werden verkregen voor elke positie die het bereik tussen -1 μm tot 1 μm beslaat, met een toename van 10 nm. Een 2 kW/cm2 640 nm laserverlichting werd gebruikt voor 25 ms voor elke z-slice.
      6. Verkrijg de z-stack-afbeeldingen van de 100 nm fluorescerende kralen via een identiek optisch pad dat zal worden gebruikt om voorbeeldafbeeldingen te verkrijgen in stap 5.1.11.
      7. Genereer met behulp van het superresolutiemicroscopie-analyseplatform (SMAP48) een csplinemodel van de experimentele puntspreidingsfunctie (PSF) dat zal worden gebruikt om de 3D-SMLM-gegevens in stap 5.1.13 te passen.
    2. Bereid de monsterhouder voor. Voor de op maat gemaakte houder die hier wordt gebruikt en die een magnetische ring gebruikt om de beeldkamer te maken (figuur 2B), omwikkelt u de magnetische ring met parafilm.
      OPMERKING: Als alternatief kan een microscoopglaasje met een concave depressieholte worden gebruikt om monsters voor microscopen met diahouders te monteren.
    3. Bereid 1 ml beeldvormende buffer44 voor (tabel 1).
    4. Neem een coverslip uit stap 4.2.6 en plaats deze in de op maat gemaakte houder. Bevestig de coverslip in de houder met de met parafilm omwikkelde magnetische ring (stap 5.1.2).
    5. Pipetteer de beeldbuffer (stap 5.1.3) voorzichtig in de kamer die door de magnetische ring bovenop het monster is gemaakt (figuur 2B). Sluit de kamer af met een stuk parafilm.
    6. Om het monster te monteren, voegt u één druppel dompelolie toe aan het schone 100x / 1.5 olieobjectief. Zonder lucht in de dompelolie te brengen, plaatst u de monsterhouder met het gemonteerde monster (stap 5.1.5) voorzichtig op het microscoopstadium.
      OPMERKING: Voordat u het monster op de microscoop plaatst, reinigt u de onderkant van de deklip met weefsel en 70% ethanol.
    7. Gebruik het EMU-plug-invenster47 in MicroManager 245,46 om de piëzofase te verplaatsen totdat het signaal van de focusvergrendelingslaser wordt gedetecteerd bij het kwadrantfotodiode (QPD).
      OPMERKING: Om een vaste focus gedurende de beeldtijd te behouden, wordt focusvergrendeling bereikt door totale interne reflectie van een nabij-infrarode vezelgekoppelde laser van de coverslip en daaropvolgende hoogtegevoelige detectie op een kwadrantfotodiode (QPD). Het QPD-signaal zorgde voor closed-loop controle van de objectieve lens piëzovatting.
    8. Verkrijg een back focal plane-afbeelding met een 640 nm excitatielaser bij laag vermogen (d.w.z. 1-5%) om de afwezigheid van luchtbellen in de dompelolie te bevestigen.
      OPMERKING: Verwijder het monster uit het stadium als er een luchtbel wordt gedetecteerd. Reinig de onderkant van de afdekplaat en het objectief en herhaal stap 5.1.6-5.1.8. Ga anders verder met het vergrendelen van de focus binnen de EMU-software47.
    9. Lokaliseer het geslachtsklierweefsel met behulp van de brightfield-verlichting. Gebruik een lage intensiteit van 640 nm verlichting, focus op het deel van het weefsel dat veel SC-stretches bevat.
      OPMERKING: Richt u niet op structuren die zich meer dan 2 μm van de coverslip bevinden. Gebruik geen hoger laservermogen om het monster te lokaliseren, omdat dit sommige fluoroforen voortijdig in een knipperende toestand kan veranderen. Hier werd 1 kW/cm2 gebruikt in stijgende modus met een puls ingesteld op 1.000.
    10. Ga verder met het belichten van het monster met 640 nm verlichting bij hoge bestralingssterkte (27 kW/cm2) gedurende ~30 s totdat een geschikte knippersnelheid is bereikt (aanvullende video 1).
    11. Verkrijg 200.000 frames met een belichtingstijd van 20 ms met behulp van de multidimensionale acquisitietool in MicroManager 2 45,46.
    12. Stel ondertussen de UV-activering in met behulp van de activeringsoptie van de EMU-plug-in38,47 om de gewenste knippersnelheid te behouden.
      OPMERKING: Gebruik de UV-laser bij een bestralingssterkte van 3 kW/cm2 in stijgende modus met een maximale pulslengte ingesteld op 10.000.
    13. Voer SMLM-beeldreconstructie en -nabewerking uit.
      OPMERKING: Als u afbeeldingen wilt reconstrueren uit onbewerkte SMLM-gegevens, raadpleegt u gepubliceerde methoden. De hier gepresenteerde gegevens werden verwerkt met behulp van de SMAP 48,49-software. Super-opgeloste beeldreconstructie, kanaaltoewijzing, driftcorrectie en filtering van lokalisaties met slechte lokalisatieprecisie en een maximale waarschijnlijkheidsfilter werden uitgevoerd in de SMAP48-software.
  2. Gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie
    OPMERKING: Beelden werden verkregen op het geïntegreerde STED-microscopische systeem uitgerust met een witlichtlaser, een 775 nm gepulseerde STED-laser en de FALCON F-luorescence L ifetime IM-verouderingsmodule(Materiaaltabel) in het EMBL Imaging Centre (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
    1. Plaats een druppel van 20 μL montagemedium (Table of Materials) op een microscoopglaasje. Neem een coverslip uit stap 4.2.2 en plaats het monster voorzichtig op de schuif die naar het montagemedium is gericht (figuur 2B).
      OPMERKING: Vermijd het plaatsen van luchtzakken in het montagemedium.
    2. Laat het montagemedium een nacht uitharden.
      OPMERKING: Breng de monsters de volgende dag in beeld of bewaar ze op 4 °C totdat ze worden afgebeeld.
    3. Voeg voor het samenstellen van het monster één druppel dompelolie toe aan de afdekplaat van het monster uit stap 5.2.2. Plaats het monster voorzichtig op de microscooptrap met behulp van een olieobjectief van 100x/1,40.
    4. Focus op het monster en lokaliseer het kiembaanweefsel met behulp van de heldere veldverlichting.
    5. Geef met behulp van de microscoopsoftware het interessegebied op waarvoor het TauSTED-beeld zal worden verkregen.
    6. Selecteer de excitatielasers en hun juiste vermogen dat wordt gebruikt om de fluoroforen die in het monster worden gebruikt, te exciteren.
      OPMERKING: Hier werd de 580 nm-laser met 4% vermogen gebruikt om AlexaFluor 594-geconjugeerde F (ab') 2 secundaire antilichaamfragmenten in beeld te brengen, en 635 nm bij 3% vermogen om STAR 635P-geconjugeerde F (ab') 2-fragmenten in beeld te brengen.
    7. Selecteer met behulp van de microscoopsoftware een geschikt STED-depletielaservermogen en stel de beelddetectie in.
      OPMERKING: Hier werd het 775 nm STED-depletielaservermogen ingesteld op 40%. De detector werd gebruikt in de telmodus met een versterkingswaarde van 10 voor fotonendetectie, met een scansnelheid van 100 Hz en met een pixelgrootte van 17 nm. Vierregelige accumulatie werd gebruikt voor tausted acquisitie.

Representative Results

Om de SC in beeld te brengen in het C. elegans kiembaanweefsel door SMLM, hebben we 2-kleuren ratiometrische 3D-SMLM gebruikt om HTP-3, een component van de chromosoomassen, en de C-terminus van het transversale filament SYP-5 endogeen gelabeld met een hemagglutinine (HA) tag te lokaliseren. De locatie van beide eiwitten binnen de SC van C. elegans werd eerder bepaald door andere studies16,30.

Om lichtverstrooiing en optische aberraties die inherent zijn aan dikke biologische monsters te minimaliseren, hebben we de onderste z-sectie van meiotische kernen afgebeeld die de SC's bevatten (figuur 3, gele lijnen). Voor elk verkregen beeld werd de piëzotrappositie van het beeldvlak gemarkeerd ten opzichte van de piëzotrappositie wanneer het doel op de coverslip werd gericht. Hierdoor kon de piëzo-afstand tot de coverslip worden berekend. Succesvol gemonteerde monsters worden stabiel dicht bij de coverslip bevestigd en behouden de gonadevorm (d.w.z. het weefsel wordt niet geplet tussen de twee coverslips tijdens de postfixatiestap). De kwaliteit van de monstermontage kan gemakkelijk worden beoordeeld onder een stereomicroscoop, aangezien goed bevestigde geslachtsklieren geen beweging in oplossing vertonen (stap 4.2.6). Niettemin, vanwege de stochasticiteit van het montageproces, zal het geslachtsklierweefsel niet noodzakelijkerwijs volledig plat op de deklip worden gelegd. Daarom kan het onderste vlak van de kernen die SC's bevatten, zich op verschillende afstanden ten opzichte van de coverslip binnen dezelfde geslachtsklier bevinden.

Om te illustreren hoe de resolutie verandert afhankelijk van de hechting van het weefsel aan de coverslip, hebben we afbeeldingen verkregen op verschillende piëzo-afstanden tot de coverslip. Om de kwaliteit van een individueel beeld te beoordelen, werden Fourier ring correlatie (FRC) curves50,51 berekend en de resolutie werd bepaald met behulp van de FRCResolution plugin binnen de SMAP software48. Twee representatieve kernen geëxtraheerd uit twee afzonderlijke 3D-SMLM-beelden die op verschillende afstanden tot de coverslip zijn genomen, worden weergegeven in figuur 4. In SC's die zich dicht bij de coverslip bevinden, zijn de chromosoomassen en de C-terminus van SYP-5::HA goed opgelost in alle drie de dimensies (figuur 4A, 0,8 μm van de coverslip). Om twee structuren gescheiden door een bepaalde afstand op te lossen, moet de bereikte FRC-resolutie over het algemeen kleiner zijn dan de helft van deze afstand in de axiale resolutie.

Om dezelfde structuren zijdelings te scheiden, moeten nog kleinere FRC-resolutiewaarden worden bereikt. Inderdaad, in monsters die zich in de nabijheid van de coverslip bevinden, is de FRC-resolutie 38 nm voor het AlexaFluor 647-kanaal en 34 nm voor het CF680-kanaal, en dus ruim onder de verwachte afstand van 84 nm tussen de C-termini van SYP-516. Deze resolutie lost de organisatie van de SC dus gemakkelijk op, niet alleen in frontale maar ook in zijdelingse weergaven (figuur 4B i,ii). Daarentegen verslechtert de resolutie in SC's op een afstand van 5 μm van de coverslip als gevolg van lichtverstrooiing en bolvormige aberraties (figuur 4B). De FRC-resoluties op deze afstand dalen tot 47 nm (AlexaFluor 647) en 41 nm (CF680), die de C-termini van SYP-5 niet volledig kunnen oplossen. Aangezien de optische aberraties de laterale resolutie ernstiger beïnvloeden dan de axiale resolutie, worden HTP-3- en SYP-5-banden niet langer duidelijk opgelost in de doorsnede van het zijdelingse zicht in monsters op een afstand van 5 μm van de coverslip (figuur 4B ii). Uit een vergelijking van de FRC-resolutie van beelden die op verschillende piëzo-afstanden van de coverlip zijn verkregen, bleek dat het afgebeelde weefsel zich niet verder dan 2 μm van de coverslip mag bevinden (figuur 5). Dit resultaat benadrukt het belang van een correcte uitvoering van de postfixatiestap, waarbij het weefsel met succes moet worden gekruist met de poly-L-lysine coating van de coverslip.

Om de haalbare resolutie met een andere superresolutietechniek te demonstreren, hebben we ook SC's in vast intact kiembaanweefsel in beeld gebracht met TauSTED-microscopie. Figuur 6A toont TauSTED-beelden met de hoogste en laagste resolutie die binnen dit onderzoek is bereikt, zoals geschat op basis van lijnprofielen van de SC in frontaal zicht (figuur 6B). In beide kernen konden we de twee lokalisatiebanden van HTP-3 in de chromosoomassen en de C-termini van SYP-5 in het centrale gebied oplossen, wat aantoont dat de resolutie die haalbaar is in TauSTED met behulp van dit geoptimaliseerde protocol lager is dan 84 nm. Onder optimale omstandigheden (figuur 6A, boven) konden we de C-termini oplossen in licht gekantelde weergaven van de SC die slechts 50 nm van elkaar verwijderd waren (figuur 6A, gele rechthoek en 6C).

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van de organisatie van het synaptonemale complex bij Caenorhabditis elegans. De cartoon toont een vereenvoudigde structuur van de SC in C. elegans die twee homologe chromosomen (grijs) overbrugt. De structuur wordt weergegeven in frontale, laterale en dwarsdoorsnede. Chromosoomassen worden weergegeven als rode balken, terwijl transversale filamenten worden weergegeven in cyaan. Transversale filamenteiwitten (SYP-1, 5, 6 in C. elegans) zijn op een head-to-head manier georiënteerd (cyaan ball-stick graphics) in het centrale gebied om de afstand tussen de twee assen te overbruggen. De verwachte afstanden tussen assen en de C-termini van dwarsfilamenten worden aangegeven. Afkorting: SC = synaptonemaal complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Illustratie van het monsterpreparaat dat in het onderzoek is gebruikt. (A) Jonge C. elegans volwassenen worden ontleed aan hun kop of staart (groene, stippellijnen) en verwerkt zoals beschreven in het protocol. (B) Afzonderlijke stappen van de methode worden aangegeven met afbeeldingen die zijn verbonden met grijze pijlen. Afkortingen: STED = gestimuleerde-emissiedepletie; SMLM = lokalisatiemicroscopie met één molecuul; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Locatie van het weefselgedeelte dat kan worden waargenomen door lokalisatiemicroscopie met één molecuul. MIP van een draaiende schijf confocale afbeelding van een hele mount C. elegans gonad. Het weefsel werd gekleurd voor HTP-3 en de C-terminus van SYP-5 (SYP-5: : HA), en het gecombineerde signaal wordt weergegeven in grijs. Individuele confocale afbeeldingen werden gestikt met behulp van de Grid / Collection stitching Fiji plugin52 om een afbeelding van de hele geslachtsklier te creëren. De inzet toont een xy-weergave van het onderste z-vlak met de SC's. De lokalisatie van dit vlak wordt weergegeven in orthogonale weergaven van het weefselgedeelte aangegeven door een rechthoek in de MIP-afbeelding van de geslachtsklier (gele lijnen). Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: MIP = maximale intensiteit projectie; SC's = synaptonemale complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Single-molecule lokalisatiemicroscopie van HTP-3 en de C-termini van de SYP-5. (A,B) Links: SMLM-beelden met pachyteenkernen gekleurd voor HTP-3 (rood) en de C-terminus van SYP-5 (SYP-5::HA, cyaan) (schaalbalk = 1 μm). Middelpunt: Ingezoomde afbeeldingen van interessegebieden die worden aangegeven in A en B met overeenkomstige dwarsdoorsnedeweergaven onder elke afbeelding (i, ii; schaalbalk = 100 nm). De stukken van de SC in ingezoomde afbeeldingen worden gedraaid om de chromosoomassen parallel aan de y-as te oriënteren. Rechts: Grafische weergave van de lokalisatie van de eiwitten van belang binnen de SC die de oriëntatie van de SC weergeven in de ingezoomde gebieden die in het midden van de figuur worden weergegeven. Afkortingen: SMLM = single-molecule localization microscopy; SC = synaptonaal complex. Ruwe gegevens om SMLM-beelden te reconstrueren zijn beschikbaar via de BioStudies-database60 (Accession ID: S-BIAD504). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: De Fourierringcorrelatieresolutie van lokalisatiemicroscopiebeelden met één molecuul hangt af van de afstand van het afgebeelde z-vlak tot het vlak van de coverslip. Gekleurde lijnen tonen FRC-curven van afbeeldingen die op verschillende afstanden zijn verkregen (zoals weergegeven door de kleurenbalk) van de coverslip. De drempel van 1/7 die wordt gebruikt om de FRC-resolutie te bepalen, wordt aangegeven door een zwarte horizontale lijn. Inzetstukken tonen de afhankelijkheid van de FRC-resolutie van de piëzo-afstand tot de coverslip. Plotten werd uitgevoerd door een op maat geschreven R-script (versie 4.1.2, Aanvullend bestand 1) waarin originele curven werden afgevlakt met functies uit het pakket "ggplot2". Afkortingen: FRC = Fourier ring correlation; SMLM = lokalisatiemicroscopie met één molecuul; SC = synaptonaal complex. Gegevens voor FRC-curven en SMLM-gegevens zijn beschikbaar via de BioStudies-database60 (Accession ID: S-BIAD504). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie versterkt door fluorescentielevensduurgebaseerde informatie (TauSTED) lost twee lokalisatiebanden op voor zowel HTP-3 als de C-terminus van SYP-5. (A) Twee representatieve TauSTED-beelden tonen pachyteenkernen gekleurd voor HTP-3 (rood) en de C-terminus van SYP-5 (SYP-5::HA, cyaan) met een hogere (boven) en lagere (onderste) structurele definitie (schaalbalk = 1 μm). De rechthoeken markeren gebieden met de opgeloste C-termini van SYP-5 in frontaal (wit) en een licht gekantelde weergave (geel) van de SC. (B,C) Verdeling van de HTP-3 (rood) en de C-terminus van SYP-5 (cyaan) signaal opgelost door TauSTED. Lijnprofielen van interessante regio's die de SC in frontale (B) of licht gekantelde (C) weergaven bevatten, worden weergegeven als volledige lijnen met een intensiteit die is genormaliseerd tot de maximale waarde. Lijnprofielen werden gegenereerd met Fiji ImageJ. Stippellijnen in B tonen de gemiddelde gegevens voor elk eiwit. De dikke cyaanlijn in C komt overeen met het lijnprofiel met de kortste opgeloste afstand tussen de C-termini van SYP-5. Om de afstanden tussen de antilichamen gericht op specifieke eiwitten te bepalen, werden de lijnprofielen (n = 9 (B), n = 7 (C)) uitgerust met dubbele gaussians met behulp van een op maat geschreven R-script (versie 4.1.2, Aanvullend bestand 1). De gemiddelde afstand ± standaarddeviatie (B) en het bereik met de minimumwaarde vetgedrukt (C) worden respectievelijk boven op elke grafiek aangegeven. Afkortingen: STED = gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie; SC = synaptonaal complex. Weergegeven afbeeldingen en gegevenspunten van uitgezette lijnprofielen zijn beschikbaar via de BioStudies-database60 (Accession ID: S-BIAD504). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van buffers en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende video 1: Lokalisatie van één molecuul microscopie. Video waarop fluoroforen met een gepaste snelheid knipperen (er worden 50 frames getoond, schaalbalk = 5 μm, 20 ms/frame). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Data-analysescript. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De ladderachtige organisatie van de SC, die essentieel is voor de juiste recombinatie en segregatie van homologe chromosomen, werd bijna 70 jaar geleden voor het eerst waargenomen in elektronenmicroscopie 3,4. Hoewel de algehele organisatie van de SC gemakkelijk wordt opgelost in elektronenmicroscopie, vereist de lokalisatie van individuele componenten binnen dit complex een meer gerichte aanpak. Met zijn breedte van slechts ~ 100 nm kan de onderbouw van de SC niet worden opgelost door conventionele fluorescentiemicroscopie. Superresolutiemicroscopie is echter een belangrijke drijfveer geworden voor nieuwe ontdekkingen over de structuur en functie van het synaptonemale complex 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Om dit onderzoek te vergemakkelijken, hebben we een montageprocedure gedemonstreerd die het mogelijk maakt om de architectuur van de SC in C. elegans gonadweefsel te bestuderen met SMLM en STED-microscopie.

Een cruciale stap om de resolutie in SMLM-beeldvorming te optimaliseren, is het direct koppelen van het kiembaanweefsel aan een poly-L-lysine gecoate coverslip (stap 4). De covalente hechting van het weefsel aan de coverslip is essentieel om bewegingen in het monster te verminderen die zouden resulteren in grote driften en beeldvorming gedurende lange perioden voor SMLM onmogelijk zouden maken. Bovendien leidt zelfs een suboptimale hechting die de kernen met SC's op een afstand van de coverslip verlaat, tot een aanzienlijke daling van de haalbare resolutie als gevolg van bolvormige aberraties (figuur 4). Als alternatief voor de hier gebruikte covalente aanhechting, kan gekleurd kiembaanweefsel ook worden geïmmobiliseerd tussen twee verzegelde coverslips in een kleine druppel beeldvormingsbuffer19,30. Deze immobilisatiemethode vermindert echter het volume van de beeldvormingsbuffer in het monster ernstig van 1 ml die hier in het geoptimaliseerde protocol wordt gebruikt tot slechts enkele μL, wat zal resulteren in een verzuring van de beeldvormingsbuffer en de tijd waarvoor het monster kan worden afgebeeld ernstig verkort 38,53,54.

Lange acquisitietijden voor zowel SMLM- als STED-microscopie beperken het gebruik van deze methoden tot beeldvorming van chemisch vaste monsters. Hier zorgt paraformaldehydefixatie ervoor dat de structuur van de SC behouden blijft tijdens de monstervoorbereiding en beeldvorming. Ondanks de voorzorgsmaatregelen die hier zijn genomen om de SC in intact weefsel in beeld te brengen, is de resulterende structuur van de SC na fixatie echter niet noodzakelijkerwijs identiek aan de structuur in zijn oorspronkelijke staat in een levend organisme. Bovendien, aangezien een enkele afbeelding van de vaste SC een enkele "momentopname" van de biologische structuur vertegenwoordigt, blijft deze benadering blind voor de dynamiek van de inheemse structuur in vivo.

Informatie over de dynamiek en variabiliteit van macromoleculaire structuren kan echter ook worden verkregen door niet slechts één maar vele "snapshots" te verkrijgen. Hoewel deze aanpak veranderingen in de structuur van de SC tijdens pachyteen19 kan oplossen, zijn er verschillende factoren die het aantal afbeeldingen beperken dat kan worden verkregen uit een enkel monster dat met behulp van dit protocol is voorbereid. Ten eerste leiden de hoge laservermogens die worden gebruikt tijdens beeldacquisitie tot permanent bleken van de fluoroforen en sluiten ze beeldvorming van aangrenzende interessegebieden of meerdere z-vlakken uit, waardoor het aantal beelden dat uit een enkel monster kan worden verkregen, aanzienlijk wordt verminderd. Ten tweede is de monster-/weefseldichtheid op de coverslip die met deze methode is voorbereid laag, wat het aantal afbeeldingen dat kan worden verkregen uit een enkele coverslip aanzienlijk beperkt. De lage monsterdichtheid verbiedt ook het gebruik van geautomatiseerde beeldacquisitiepijplijnen die licht hebben geworpen op andere biologische vragen 34,55,56,57,58,59. De monsterdichtheid kan echter iets worden verhoogd door een ervaren gebruiker.

Het hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd om een hoge labelingsdichtheid te verkrijgen die nodig is om een optimale resolutie in SMLM35 te bereiken. Terwijl eerdere protocollen het weefsel covalent hechten aan de coverslip vóór immunostaining16, koppelt dit nieuwe protocol het weefsel pas aan de coverslip nadat de monsters in oplossing zijn gekleurd. Deze modificatie zorgt ervoor dat de antilichamen die worden gebruikt voor immunolabeling van alle kanten vrij toegang hebben tot het weefsel, terwijl de covalente hechting van het weefsel aan de coverslip kan voorkomen dat antilichamen de kernen bereiken die zich het dichtst bij de coverslip bevinden, waardoor de mate van etikettering wordt verminderd. Samen verbeteren de hier beschreven wijzigingen de resolutie van 40-50 nm (FRC-resolutie)16 tot 30-40 nm (dit protocol).

Belangrijk is dat, hoewel een hoge labelingsdichtheid en een hoge concentratie antilichamen essentieel is voor SMLM, we ontdekten dat betere STED-microscopiebeelden worden verkregen met behulp van lagere antilichaamconcentraties (stap 3). Met een resolutie van tientallen nanometers wordt de grootte van de moleculen die worden gebruikt om het eiwit van belang te labelen steeds belangrijker. We gebruikten daarom F(ab')2-fragmenten die half zo groot zijn als antilichamen over de volledige lengte. De verbetering van het lokale contrast als gevolg van een kleinere signaalbron, en dus de resolutie die door deze wijziging werd verkregen in vergelijking met het gebruik van secundaire antilichamen over de volledige lengte, maakte de resolutie van de twee C-termini van SYP-5 binnen het centrale gebied door TauSTED mogelijk, die niet worden opgelost door conventionele STED met behulp van antilichamen over de volledige lengte (16 en gegevens niet getoond). We verwachten dat dit geoptimaliseerde protocol voor het in beeld brengen van SC's in intacte C. elegan-kiembanenhet onderzoeken van de structuur-functierelatie van de SC tijdens meiose zal vergemakkelijken.

Disclosures

Auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen Jonas Ries en het Ries-lab bedanken voor het delen van imagingbuffers voor SMLM-beeldvorming. We bedanken ook Yumi Kim voor de C. elegans-stam die in dit protocol wordt gebruikt en Abby F. Dernburg voor het kip-anti-HTP-3-antilichaam. We bedanken Marko Lampe en Stefan Terjung van de Advanced Light Microscopy Facility bij EMBL Heidelberg voor hun steun bij het gebruik van de Olympus iXplore SPIN SR confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door het European Molecular Biology Laboratory en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation - 452616889, SK). We erkennen de toegang en diensten van het Imaging Centre van het European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), genereus ondersteund door de Boehringer Ingelheim Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm - Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm - 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 - 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

Biologie Nummer 187 C. elegans meiose synaptonemaal complex immunohistochemie superresolutiemicroscopie lokalisatiemicroscopie met één molecuul gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie
Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de <em>Caenorhabditis elegans</em> kiembaan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, … More

Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter