Summary
קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.
Abstract
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) משמשים להחליף ולהפחית את התלות בבעלי חיים ובתאי בעלי חיים לצורך בדיקות קרדיוטוקסיות פרה-קליניות. בפורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים, hiPSC-CMs משחזרים את המבנה והתפקוד של תאי שריר הלב האנושיים הבוגרים כאשר הם מאורגנים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית אופטימלית (ECM). ECM אנושי הנגזר מתאי גזע פרינטליים (מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות) מבשיל את המבנה, התפקוד והמצב המטבולי hiPSC-CM תוך 7 ימים לאחר הציפוי.
חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות מגיבות כצפוי גם לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית, עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב ורעילות לב. ההבשלה של חד-שכבות hiPSC-CM היוותה מכשול לאימוץ נרחב של תאים יקרי ערך אלה למדע רגולטורי וסינון בטיחות, עד כה. מאמר זה מציג שיטות מאומתות עבור ציפוי, הבשלה ופנוטיפ פונקציונלי בתפוקה גבוהה של תפקוד אלקטרופיזיולוגי והתכווצות hiPSC-CM. שיטות אלה חלות על קרדיומיוציטים מטוהרים הזמינים באופן מסחרי, כמו גם קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע שנוצרו בתוך החברה באמצעות פרוטוקולי התמיינות יעילים ביותר, ספציפיים לחדר.
תפקוד אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה נמדד באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD; פליטה: 488 ננומטר), פלואורופורים רגישים לסידן (CSFs), או חיישני סידן מקודדים גנטית (GCaMP6). מכשיר מיפוי אופטי בתפוקה גבוהה משמש להקלטות אופטיות של כל פרמטר פונקציונלי, ותוכנה ייעודית מותאמת אישית משמשת לניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים. פרוטוקולי MECM מיושמים לבדיקת תרופות באמצעות אינוטרופ חיובי (איזופרנלין) וחוסמי תעלות ספציפיים לערוץ Ether-a-go-go-go (hERG). משאבים אלה יאפשרו לחוקרים אחרים להשתמש בהצלחה ב- hiPSC-CMs בוגרים לבדיקות סקר פרה-קליניות פרה-קליניות לקרדיוטוקסיות, בדיקות יעילות של תרופות לב וכלי דם ומחקר קרדיווסקולרי.
Introduction
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) אומתו בקנה מידה בינלאומי, והם זמינים לבדיקת רעילות לב חוץ גופית 1. ניתן לייצר hiPSC-CMs טהורים במיוחד במספרים כמעט בלתי מוגבלים, לשמר בהקפאה ולהפשיר. עם הציפוי מחדש, הם גם מתעוררים לחיים ומתחילים להתכווץ בקצב המזכיר את הלב האנושי 2,3. למרבה הפלא, hiPSC-CMs בודדים מתחברים זה לזה ויוצרים סינסיטיה פונקציונלית שפועמת כרקמה אחת. כיום, hiPSCs נגזרים באופן שגרתי מדגימות דם של מטופלים, כך שכל אדם יכול להיות מיוצג באמצעות בדיקות בדיקת רעילות לב במבחנה hiPSC-CM 4,5. כך נוצרת הזדמנות לבצע "ניסויים קליניים בצלחת", עם ייצוג משמעותי מאוכלוסיות מגוונות6.
יתרון קריטי אחד על פני גישות קיימות לבדיקת רעילות לב של תאי בעלי חיים ובעלי חיים הוא ש- hiPSC-CMs מנצלים את הגנום האנושי המלא ומציעים מערכת במבחנה עם דמיון גנטי ללב האנושי. זה אטרקטיבי במיוחד עבור פרמקוגנומיקה ורפואה מותאמת אישית - השימוש hiPSC-CMs עבור תרופות ופיתוח טיפול אחר צפוי לספק מרשמים מדויקים, מדויקים ובטוחים יותר לתרופות. ואכן, בדיקות חד-שכבתיות hiPSC-CM דו-ממדיות (2D) הוכיחו את עצמן כמנבאות רעילות לב-ריאוקסית של תרופות, באמצעות פאנל של תרופות בשימוש קליני עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב 1,7,8,9. למרות הפוטנציאל העצום של hiPSC-CMs וההבטחה לייעל ולהפוך את פיתוח התרופות לזול יותר, הייתה רתיעה משימוש בבדיקות חדשניות אלה10,11,12.
עד כה, מגבלה מרכזית אחת של אימוץ וקבלה נרחבים של בדיקות סקר hiPSC-CM היא המראה הלא בוגר והעוברי שלהם, כמו גם תפקודם. הנושא הקריטי של הבשלת hiPSC-CM נבדק ונידון בספרות המדעית ad nauseum13,14,15,16. כמו כן, גישות רבות שימשו לקידום הבשלת hiPSC-CM, כולל מניפולציות מטריצה חוץ-תאית (ECM) בחד-שכבות דו-ממדיות ופיתוח רקמות לב מהונדסות-תלת-ממדיות (EHTs)17,18. כרגע, קיימת אמונה רווחת כי השימוש ב- EHTs תלת ממדיים יספק התבגרות מעולה ביחס לגישות מבוססות חד-שכבות דו-ממדיות. עם זאת, חד-שכבות דו-ממדיות מספקות יעילות גבוהה יותר של ניצול תאים והצלחה מוגברת בציפוי בהשוואה ל-EHTs תלת-ממדיים; EHTs תלת-ממדיים משתמשים במספר גדול יותר של תאים, ולעתים קרובות דורשים הכללה של סוגי תאים אחרים שיכולים לבלבל תוצאות. לכן, במאמר זה, ההתמקדות היא בשימוש בשיטה פשוטה להבשלת hiPSC-CMs בתרבית כמונושכבות דו-ממדיות של תאים מצומדים חשמלית ומכנית.
ניתן להשיג הבשלה מתקדמת של hiPSC-CM בחד-שכבות דו-ממדיות באמצעות ECM. ניתן להבשיל את החד-שכבות הדו-ממדיות של hiPSC-CMs באמצעות כיסוי פולידימתילסילוקסאן רך וגמיש, המצופה במטריצת קרום מרתף המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר). בשנת 2016, דיווחים הראו כי hiPSC-CMs בתרבית על מצב ECM רך זה הבשילו פונקציונלית, והציגו מהירויות הולכה פוטנציאליות פעולה ליד ערכי לב בוגר (~ 50 ס"מ לשנייה)18. יתר על כן, hiPSC-CMs בוגרים אלה הציגו מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים רבים אחרים המזכירים את הלב הבוגר, כולל פוטנציאל קרום מנוחה היפרפולרי וביטוי של Kir2.1. לאחרונה, דיווחים זיהו ציפוי ECM אנושי שמקורו בתאי גזע פרינטליים המקדם את ההבשלה המבנית של hiPSC-CMsדו-ממדיים 19. כאן, שיטות קלות לשימוש מוצגות למונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בשלות מבחינה מבנית לשימוש במסכים אלקטרופיזיולוגיים בעלי תפוקה גבוהה. יתר על כן, אנו מספקים אימות של מכשיר מיפוי אופטי לרכישה וניתוח אוטומטיים של פונקציה אלקטרופיזיולוגית חד-שכבתית דו-ממדית hiPSC-CM, תוך שימוש בצבעים רגישים למתח (VSD) ובבדיקות וחלבונים רגישים לסידן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ב-hiPSC בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת HPSCRO של אוניברסיטת מישיגן (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים וציוד. ראו טבלה 1 למדיה והרכביה.
1. הפשרה וציפוי hiPSC-CMs בהקפאה זמינים מסחרית להבשלה על מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות (MECM)
- חממו את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר והחזירו לחות לצלחות MECM עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) או מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל סידן ומגנזיום, למשך שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים (200 מיקרוליטר חיץ לכל באר של צלחת 96 באר).
- שטפו את צלחות MECM 2x עם HBSS או PBS המכילות סידן ומגנזיום במשך שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים (200 מיקרוליטר חיץ לכל באר של צלחת 96 בארות) ושמרו על בארות לחות.
- הכינו אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את צינורות קרדיומיוציטים ממיכל החנקן הנוזלי, העבר את הצינורות לקרח יבש ופתח מעט את מכסי הצינור כדי לשחרר לחץ.
הערה: שחרור לחץ בצינורות חשוב ביותר ! אם יותר מדי לחץ מצטבר בתוך הצינורות, הם עלולים להתפוצץ. - אטמו מחדש את מכסי הצינור והכניסו אותם לאמבט המים להפשרה למשך 4 דקות.
הערה: לאפשר להם להפשיר לחלוטין, כדי למנוע נזק לתאים עקב הפשרה חלקית. - לאחר הפשרת התאים, רססו את הצינורות באתנול 70% לפני הפתיחה. מעבירים את התאים לתוך צינורות חרוטיים 15 מ"ל עם פיפטה 1 מ"ל. לטפטף באיטיות 8 מ"ל של מדיום ציפוי, מתסיס את הצינור בכל פעם 1 מ"ל מתווסף, כדי לאפשר לתאים להסתגל לשינויים באוסמולריות.
- לשטוף את cryovial עם 1 מ"ל של בינוני ציפוי באמצעות פיפטה זכוכית 1 מ"ל. לאחר מכן, לטפטף באיטיות את הכביסה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינורות ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום ציפוי. הסר aliquot ולבצע ספירת תאים חיים עם hemocytometer. הוסף אמצעי ציפוי נוסף כדי לקבל 7.5 × 105 תאים / מ"ל.
הערה: כ-10 מ"ל של תרחיף תאים נדרש להכנת 96 בארות. - יש להוציא 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 96 בארות מצופת MECM באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
הערה: יש להקפיד להימנע ממשקעים בתאים ולקבל צפיפות תאים אחידה בכל הבארות בזמן הציפוי. - יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך יומיים לפני שינוי המדיום למדיום תחזוקה (200 μL/well). החליפו את אמצעי התחזוקה ביום 5 לאחר ההפשרה. בצע בדיקות EP ביום 7 ואילך, כפי שתואר קודם לכן 8,9. שנה את המדיום כל יומיים כאשר בוחרים להרחיב את תרבית התא.
2. הבחנה מכוונת לב hiPSC וטיהור hiPSC-CM
- תמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) חמה 1x זמינה מסחרית, HBSS ללא סידן ומגנזיום (HBSS--), וצלחות 6 בארות מצופות במטריצת קרום מרתף מסיסה המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר) לטמפרטורת החדר.
- סמן את המושבות המובחנות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה ושואף/אבלאט. לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של HBSS--. יש לבצע שתי שטיפות בבארות המכילות >10 נקודות בידול.
- שאפו את HBSS - והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת EDTA לכל באר. לדגור על הצלחות עד 5 דקות ב 37 ° C. בדקו את הצלחות לאחר 3 דקות וחפשו מושבות לבנות שקופות וגלויות.
- שאפו את פתרון ה-EDTA והוסיפו 1 מ"ל לבאר אחת. עקרו את התאים עם 2 מ"ל של תווך hiPSC על ידי צנרת התרחיף למעלה ולמטה שוב ושוב, באמצעות פיפטה זכוכית 10 מ"ל כדי לנתק את כל תאי הגזע מהבאר, ולהעביר את תרחיף התא לצינור איסוף. חזור על השאיפה והעקירה עם הבארות הבאות.
הערה: יש לעקור מושבות קשות להרמה בעזרת קצה פיפטת הזכוכית. - לספור את תאי הגזע ולהתאים את נפח צלחת 8.0 × 105 תאים / טוב. תרבית את התאים בתווך hiPSC (2 מ"ל/באר) עד שתאי הגזע מגיעים למפגש של 90% (הפעם נקרא מעתה D0).
- הכינו 2 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של CHIR99021.
- על D0, לשטוף כל באר של צלחת 6-באר של תאי גזע עם 1 מ"ל של HBSS לכל באר. החלף את HBSS במדיום התמיינות בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של CHIR99021.
- על D1, לא לעשות כלום.
- על D2, להכין בינוני התמיינות בסיסית בתוספת 4 מיקרומטר של IWP4.
- החלף את המדיום עם 2 מ"ל של IWP4-בתוספת מדיום התמיינות בסיסית לכל באר.
- ב-D3, אל תעשו דבר עבור הבחנה ספציפית חדרית. להבחנה ספציפית לפרוזדורים, שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של IWP4 ותמיסת חומצה רטינואית (RA) 1 מיקרומטר לכל באר.
- על D4, שואפים את המדיום ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום בסיסי לכל באר עבור הבחנה חדרית. עבור הבחנה פרוזדורים, לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת 1 מיקרומטר תמיסת RA לכל באר.
- ב-D5, אל תעשו כלום.
- על D6, שואפים את המדיום ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום בסיסי לכל באר (הן להבדיל פרוזדורים והן לחדרים).
- ב-D7, אל תעשה דבר.
- על D8, לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה cardiomyocyte. החליפו את המדיום כל יומיים עד להפרדת תאים, או עקבו אחר תוכנית חשיפה כרונית לתרופות.
3. טיהור hiPSC-CM באמצעות MACS (מיון תאים המופעל על ידי מגנטית)
- שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו כל באר עם 1 מ"ל HBSS--. נתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA ודגירה ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 10 דקות. השהה מחדש ויחיד את התאים בכל באר עם 2 מ"ל של מדיום ציפוי כדי להשבית את טריפסין/EDTA.
- לאסוף את התאים משש הבארות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם מסננת 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לשטוף את המסננת עם 3 מ"ל של ציפוי בינוני. ספור את התאים.
- צנטריפוגה את המתלה ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים עם 20 מ"ל של חיץ הפרדת MACS קר כקרח. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות.
- השהה מחדש את הגלולה ב 80 μL של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. הוסף 20 μL של קוקטייל דלדול קר שאינו קרדיומיוציטים (אנושי) לכל 5 × 106 תאים. מערבבים בעדינות את תרחיף התא ודגורים על קרח במשך 10 דקות.
- שטפו את הדגימה על ידי הוספת 4 מ"ל של מאגר הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. צנטריפוגה את הדגימה ב~ 300 × גרם למשך 5 דקות ושאפו את הסופרנטנט.
- השהה מחדש את הגלולה ב 80 μL של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. הוסף 20 μL של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין קרות לכל 5 × 106 תאים. מערבבים בעדינות את תרחיף התא ודוגרים במשך 10 דקות על קרח.
- בזמן הדגירה, הניחו את עמודות הדלדול החיובי (המצוידות במסנני קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר) על מפריד MACS, והניחו את צינורות האיסוף המסומנים של 15 מ"ל מתחת לעמודות. עמודה אחת נדרשת עבור כל 5 × 106 תאים.
- רכז כל עמודה עם 3 מ"ל של מאגר הפרדת MACS קר. ערבבו את תרחיף התאים שטופל בנוגדנים עם 2 מ"ל של חיץ הפרדת MACS לכל 5 × 106 תאים, והוסיפו לעמודה.
הערה: אין לבצע צנטריפוגה! לצנטריפוגה בשלב זה יש השפעות מזיקות על תשואת קרדיומיוציטים. - הוסף 2 מ"ל של מאגר הפרדת MACS לכל עמודה, ואסוף את הזרימה עד לאיסוף 12 מ"ל של תרחיף קרדיומיוציטים זורם.
הערה: לעולם אל תאפשר לעמודות להתייבש לחלוטין. - צנטריפוגה את cardiomyocytes ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשעות את cardiomyocytes ב 1 מ"ל של מדיום ציפוי.
- ספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז, התאימו את הנפח לצפיפות הזריעה הרצויה ולוחמו את התאים. צלחת את cardiomyocytes מטוהרים על לוחות MECM 96-well, כמתואר לעיל בשלבים 1.9-1.11 (7.5 × 105 תאים / טוב).
4. מיפוי אופטי באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD) ופלואורופורים רגישים לסידן (CSFs)
- הכן את הכמות המתאימה של VSD ב- HBSS עם סידן ומגנזיום, על ידי הוספת 1 μL של צבע VSD לכל מ"ל של HBSS ו- 10 μL של טעינת אדג'ובנט לכל מ"ל של HBSS.
הערה: בדרך כלל, צלחת 96 בארות דורשת 10 מ"ל של פתרון VSD. - לחלופין, הכינו HBSS עם סידן ומגנזיום בתוספת 5 מיקרומטר CSF. לשאוף את אמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים ולהחליף עם 100 μL של VSD או CSF לכל באר של צלחת 96 באר. דוגרים על התאים למשך 30 דקות באינקובטור תרבית התא.
- הסר את הצבעים והחלף במדיום בדיקה או HBSS. שיווי משקל ב- 37°C לרכישת מיפוי אופטי של נתונים בסיסיים באמצעות התקן מיפוי אופטי בעל תפוקה גבוהה.
- לטפל בתאים עם תרופות לבדיקת חשיפה חריפה, או למפות את התאים שנחשפו באופן כרוני לתרופות מעניינות.
- לבדיקת רעילות לב בצלחות של 96 בארות, השתמש בארבע מנות של תרכובת עם לפחות שש בארות בכל מנה. השתמש במינונים הנעים מלמטה ומעלה ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה, כולל מנה של ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה הקלינית.
- לדלל את התרופות בדימתיל סולפוקסיד, לאחסן אותם כתמיסות מלאי ב -20 ° C, ולאחר מכן לדלל אותם HBSS לריכוזים הרצויים.
- בצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות בסיסיות לפני יישום התרופה, כמתואר בסעיף 5. לאחר יישום התרופות, בצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לפחות 30 דקות מאוחר יותר עבור מחקרים כרוניים. עיין בסעיפים הבאים לקבלת מיפוי אופטי, הליכי רכישה וניתוח של נתונים.
5. מיפוי אופטי באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית (GECI)
- לוחות זמינים מסחרית או hiPSC-CMs מטוהרים MACS, כמתואר לעיל, באמצעות לוחות 96 בארות מצופות MECM כדי ליצור hiPSC-CMs בוגרים. כדי ליצור חד-שכבות מתמזגות, צלחת 7.5 × 104 ס"מ לכל באר מכל צלחת 96 באר. יש להשתמש באמצעי ציפוי.
- לאחר 48 שעות בציפוי בינוני, לעבור למדיום תחזוקת קרדיומיוציטים.
- ביום 4 לאחר הפשרה וציפוי מחדש, הוסף אדנווירוס רקומביננטי לביטוי GCaMP6m (AdGCaMP6m) לתאים בריבוי זיהומים (MOI) = 5. הוסף את הנגיף באמצעות מדיום בדיקת CM.
הערה: כאן, ניסויים באמצעות GCaMP6m בוצעו בקרדיומיוציטים iCell2 מספק מסחרי. - ביום 5, הסר את מדיום adGCaMP6m והחלף בסל"ד טרי + B27 (מדיום תחזוקת קרדיומיוציטים).
- ביום השביעי, התבוננו ב-CMs באמצעות מיקרוסקופ או מכונת המיפוי האופטית, כדי לדמיין התכווצויות ספונטניות ומעברי סידן תואמים.
- ביום 7 ואילך, לבדיקת תרופות, העבירו ישירות לוחות 96 בארות של חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות המבטאות GCaMP6m למצלמת המיפוי האופטית מהאינקובטור לאיסוף נתונים בסיסיים.
- לאחר איסוף נתונים אלקטרופיזיולוגיים, יש להחזיר את לוחות ה-CMs לאינקובטור תרביות הרקמה, לצורך מדידות בנקודת זמן עוקבת.
- לאחר הרישומים הבסיסיים, יש למרוח את התרופות, תוך שימוש בלפחות ארבע מנות של כל תרופה ולפחות שש בארות בכל מנה. אזנו את התרופות על התאים למשך 30 דקות לפחות לפני איסוף הנתונים. חממו את טמפרטורת הבאר ל~ 37 מעלות צלזיוס לפני ובמהלך רכישת הנתונים.
- לאחר הקלטות בסיסיות של צלחת שלמה, הוסף איזופרוטרנול (500 ננומטר) לכל באר כדי לאפשר נתוני תגובה חזקים לתרופות. כמת את ההשפעות של איזופרוטרנול על קצב פעימות חד-שכבתיות, משרעת התכווצות (משרעת מעבר סידן) ומשך מעבר הסידן (ראה איור 6), כמתואר בסעיף 5.
6. רכישת נתוני מיפוי אופטי וניתוח
- ודא שהמצלמה של התקן המיפוי האופטי, הטרנסילטור ומחמם הלוחות מופעלים.
- פתח את תוכנת הרכישה וקבע את מיקום שמירת הקבצים.
- פתחו את המגירה הקדמית ומקמו את הצלחת על מחמם הצלחות.
- רכוש מסגרת כהה על ידי לחיצה על כפתור מסגרת כהה .
- בחר משך זמן (10-30 שניות) וקצב פריימים של רכישה (לדוגמה, 100 פריימים לשנייה; 250 פריימים לשנייה לרזולוציה זמנית גבוהה יותר) ולחץ על התחל רכישה.
- פתח את תוכנת הניתוח ובכרטיסייה ייבוא/סינון , בחר אתר קובץ בודד או פרוס מרובים כדי לבנות מחדש לוחית.
- בחר Parameter Mode (APD או CaTD), הזן Distance per Pixel והשתמש באשף הבארות כדי לקבוע את מיקום הבארות בתמונה. לחץ על עבד שמירה כדי לעבור לכרטיסיה הבאה.
- פתח את הכרטיסיה ROI (אזורי עניין) ובחר לצייר את החזר ההשקעה באופן ידני, אוטומטי או לא להשתמש בהחזר השקעה כלל, אשר לאחר מכן ישקול את כל הבאר לניתוח. לאחר בחירת החזר ההשקעה, לחץ על הלחצן תהליך/שמירה כדי לעבור לשלב הבא. סמן את התיבות הסתר בארות והצג רק מסוננים כדי להציג באופן חזותי את החזר ההשקעה.
- פתח את הכרטיסיה ניתוח ובפינה השמאלית העליונה של המסך, בחר כל באר או החזר השקעה כדי לאשר את הדיוק של זיהוי פעימות אוטומטי. הוסף או הסר פעימות מהעקבות על-ידי הקשה על Add Beat/ Save Beats, או על-ידי בחירת Individual Beat והקשה על Delete במקלדת.
- לחלופין, השתמש בתכונה מפות חום ממוצעות כדי ליצור מפות חום של פרמטרים נבחרים עבור הצלחת.
- לחץ על הלחצן Time-Space Plot בכרטיסייה Analysis כדי להציג נתונים באופן חזותי עבור כל באר או החזר השקעה. לאחר שווידאת שזיהוי הפעימות מדויק, המשך אל יצוא הכרטיסייה ובחר תבנית קובץ. הקש Export וצור תיקייה שאליה הנתונים ייוצאו. המשך לפתיחת קבצי נתונים והפעל את שגרת הניתוח הסטטיסטי שנבחרה.
הערה: קובצי .xlxs מועדפים מכיוון שכל הפרמטרים מיוצאים בקובץ יחיד; תבניות אחרות (.csv או .tsv) מייצרות קובץ אחד לכל פרמטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבשלת hiPSC-CM המאופיינת בניגודיות פאזה והדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית
ציר הזמן להבשלה בתיווך ECM של hiPSC-CMs הזמינים מסחרית באמצעות לוחות 96 בארות מצופות MECM מוצג באיור 1A. נתונים אלה נאספים באמצעות קרדיומיוציטים זמינים מסחרית המגיעים למעבדה כמו בקבוקונים cryopreserved של תאים. כל בקבוקון מכיל >5 × 106 קרדיומיוציטים ברי קיימא. התאים הם ~ 98% טהורים ונבדקים בקפדנות לבקרת איכות (תעודת ניתוח מסופקת עם כל בקבוקון). המספר הגבוה של CMs מאפשר הפשרה וציפוי CMs על שילובי ECM שונים באמצעות אותה אצווה של תאים. באיור 1, hiPSC-CMs מצופים על לוחות מצופים ECM או MECM של עכבר. ה-hiPSC-CMs המצופים ב-MECM מתבגרים ונבדלים מבחינה מבנית מאותה אצווה של hiPSC-CMs המצופים מחדש ב-ECM של העכבר. כלומר, תאים בוגרים הופכים לצורת מוט, בעוד תאים לא בוגרים שומרים על צורה מעגלית. ניתן לראות זאת בהדמיית ניגודיות פאזה ובצביעת שרירי הלב (איור 1B; טרופונין I [TnI], אדום). תיקוף נרחב יותר של ההבשלה המבנית של hiPSC-CMs מוצג באיור 2. שדה ראייה גדול (20x אובייקטיבי) של CMs מוכתמים בנוגדן α-אקטינין מראה את הצורה האופיינית של התאים בתרבית בכל תנאי ECM. α-אקטינין הוא חלבון מבני קריטי המסודר עם ריווח קבוע בשרירי הלב. בהתאם לצביעת TnI באיור 1, צביעת α-אקטינין מצביעה עוד יותר על הבשלה של hiPSC-CMs בתרבית על MECM. מלבד קידום פנוטיפ בוגר בצורת מוט, MECM גם גורם לארגון סרקומר גדול יותר (60x תמונות). התוכן והפעילות של המיטוכונדריה נבדלים גם הם בין תאים שגודלו בתרבית ב-ECM של עכבר לבין MECM (איור 2B). תכולת המיטוכונדריה hiPSC-CM העוברית אינה בשלה מוגבלת לחלל הפרי-גרעיני, כאשר מעט מיטוכונדריה נמצאים בציטוזול. לעומת זאת, תכולת המיטוכונדריה של hiPSC-CMs בוגרים מופצת ברחבי התא. הערכה מיטוכונדריאלית משתמשת בפרוטוקולמבוסס 19.
התמיינות מכוונת לב hiPSC ומפרט חדר הלב
הנה פרוטוקול לייצור והבשלה פנימיים של hiPSC-CMs מטוהרים וספציפיים לתא (איור 3A). זה מבוסס על דוח20 שפורסם בעבר. מוצגים נהלים מפורטים לטיהור hiPSC-CM באמצעות ערכת מיון תאים (MACS) המופעלת באמצעות מגנט (MACS) הזמינה מסחרית. לאחרונה אימתנו את השימוש בטיהור MACS והראינו את היתרונות של שימוש ב- MACS בהשוואה לטיהור hiPSC-CM מבוסס מטבולית; בדרך כלל, טוהר hiPSC-CM מעל 95% צפוי21. חשוב לציין כי אם תוכן CM הראשוני הוא <50%, טיהור MACS עשוי להגיע רק ~ 85%. במקרים אלה, העשרת CM עשויה להיות נחוצה בעקבות דלדול של שאינם CMs. אם תכולת ה-CM הראשונית מההתמיינות היא >50%, דלדול של לא-CMs מאוכלוסיית התאים באמצעות ערכת MACS יכול להשיג טוהר >95%; במקרה זה, העשרה נוספת או בחירה חיובית של CMs אינו הכרחי. ניתן גם להבשיל את לוחות hiPSC-CM הספציפיים לתא באמצעות לוחות 96 בארות מצופי MECM, כפי שתואר לעיל ומוצג באיור 1 ובאיור 2. יש לצפות שלתאים הספציפיים לפרוזדורים (hiPSC-ACM) יש קצב פעימות ספונטני מהיר יותר באופן משמעותי ומשך פוטנציאל פעולה קצר יותר 80 (APD80) מאשר התאים הספציפיים לחדרים (hiPSC-VCM). אלה נתונים אלקטרופיזיולוגיים טיפוסיים עבור פוטנציאלי פעולה שתועדו באמצעות VSD ומערכת המיפוי האופטי (איור 3B-D).
מיפוי אופטי אלקטרופיזיולוגי לבבי בתפוקה גבוהה
קפדנות מדעית מוגברת באופן דרמטי עבור כל בדיקה אם זה יכול להתבצע בצורה תפוקה גבוהה. נתוני בדיקת רעילות הלב מוצגים באיור 4, איור 5, איור 6 ואיור 7, ומראים סינון אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה באמצעות חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות בלוח של 96 בארות. מפות חום של לוחות שלמים עבור פרמטרים כגון APD80 (איור 4A) חושפות את יכולת השחזור של פרמטר נתון בתוך לוח מבאר לבאר. יתר על כן, מפות חום של לוחות שלמים מספקות בדיקה מהירה של כל חריגה בערכת הנתונים. לדוגמה, בבאר E4 של הלוח המוצג באיור 4A, ברור שלבאר זו יש ערך APD80 גדול בהרבה, המסומן על-ידי הבאר הנראית צהובה, בעוד שהבארות האחרות כחולות-אינדיגו. פוטנציאלי פעולה אופייניים של חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בוגרות (איור 4B) מזכירים את המורפולוגיה של פוטנציאל הפעולה של קרדיומיוציטים בוגרים שבודדו ונבדקו בתרבית. יתר על כן, מקצב ספונטני אופייני של פוטנציאל פעולה מוצג באיור 4C. הנתונים באיור 4C הם תרשים זמן-מרחב של שורות A, עמודות 1-12. הקו הלבן על פני מפת הלוחות באיור 4A מתאר זאת. כל הבזק פלואורסצנטי בהיר לאורך זמן בכל באר מייצג הפעלה ספונטנית אחת. איור 5 ואיור 6 מראים את התועלת של שימוש במחוון סידן מקודד גנטית GCaMP6m (GECI) למדידת מעברי סידן תוך-תאיים; איור 6 מראה גם את התגובה הצפויה לאיזופרוטרנול – האינוטרופ החיובי הקלאסי ללב. בתגובה לאיזופרוטרנול, הפעלה של קולטני β1-אדרנרגיים גורמת לכרונוטרופיה חיובית (איור 6A), אינוטרופיה חיובית (איור 6B) ולוזיטרופיה חיובית (איור 6C). תגובות אלה לאיזופרוטרנול מצביעות על הבשלה משמעותית של קולטני hiPSC-CM β1-אדרנרגיים ומפל איתות תוך-תאי.
באיור 7 מוצגת תגובת hiPSC-CM לחוסמי תעלות של גנים הקשורים לאתר (hERG) אנושיים, תוך שימוש בפלואורסצנטיות סידן GCaMP6m כדי לנטר קצב ולשמש סמן חלופי להתכווצות. E-4031 הוא חוסם תעלות ספציפי ל-hERG, שמאט את קצב הפעימות הספונטניות ומגביר את משך מעבר הסידן (CaTD80) והטריאנגולציה (טריאנגולציית CaT). איור 7A מראה את הזיהוי של פוסט-דפולריזציה מוקדמת שנגרמה על-ידי חסימת ערוץ E-4031 hERG. חוסמי תעלות hERG אחרים, כולל דומפרידון, ונדטניב וסוטלול, נבדקו גם הם, והתוצאות מוצגות באיור 7E-G. תרכובות ומינונים אלה נבחרו בהתבססעל מחקר אימות hiPSC-CM שנערך לאחרונה 1,7,9.
איור 1: ציר זמן להבשלה מהירה של hiPSC-CMs זמינים מסחרית או ממקור אחר . (A) קרדיומיוציטים מופשרים המרחפים בתווך ציפוי מוחלים על MECM ביום 0. ביום 2, המדיום מוחלף במדיום תחזוקה, והמדיום המושקע משתנה ביום 5. תאים מתורבתים במשך יומיים נוספים, וביום 7, הסינקיטיה הבוגרת של hiPSC-CMs עשויה להיטען עם פתרון הקלטה עבור יישומים במורד הזרם או בתרבית לפרקי זמן ארוכים יותר. (B) שלב הניגוד של סינסיטיה של קרדיומיוציטים המצופים ב-ECM של העכבר או ב-MECM מראים שלקרדיומיוציטים המצופים ב-ECM של העכבר יש מעגליות גדולה יותר בהשוואה לקרדיומיוציטים המצופים ב-MECM; יתר על כן, אימונוסטיין עבור TnI מצביע על כך שקרדיומיוציטים המצופים על ECM העכבר שומרים על מורפולוגיה של סימטריה רדיאלית וסרקומרים לא מאורגנים בניגוד ל- hiPSC-CMs דוליכומורפיים ומובנים היטב המצופים על MECM. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (B, עליון); 50 מיקרומטר (B, תחתון). קיצורים: hiPSC-CMs = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים; ECM = מטריצה חוץ-תאית; MECM = ECM גורם להתבגרות; 96wp = צלחת 96 באר; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TnI = טרופונין I. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואה של ארגון סרקומר של hiPSC-CMs המצופים על ECM עכבר או MECM. (A) hiPSC-CMs בתרבית ECM של עכבר המוכתמים כנגד α-אקטינין מצביעים על מורפולוגיה רדיאלית, עם צפיפות נמוכה יותר של סרקומרים המפוזרים דרך הקרדיומיוציטים בניגוד ל-hiPSC-CMs מאותה אצווה המצופה על המטריצה ומציגה מורפולוגיה בצורת מוט (20x). (60x) תצפית על hiPSC-CMs במיקרוסקופ קונפוקלי מראה כי hiPSC-CMs בתרבית על ECM עכבר הם בעלי מורפולוגיה של סימטריה רדיאלית, עם התפלגות היקפית צפופה יותר של סרקומרים וצפיפות נמוכה של סרקומרים רדיאליים בניגוד ל- hiPSC-CMs מאותה אצווה שגודלו בתרבית על MECM. הם מציגים התפלגות הומוגנית של סרקומרים המאורגנים לאורך הציר הארוך יותר של התאים. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (עליון); 50 מיקרומטר (תחתון). (B) צביעה של hiPSC-CMs בתרבית על ECM עכבר או MECM עם צבע מיטוכונדריאלי שמכתים מיטוכונדריה עם פוטנציאל טרנסממברנה גבוה מראה עוצמה נמוכה יותר של כתמים בקרדיומיוציטים בתרבית על ECM העכבר בהשוואה ל- MECM. יתר על כן, hiPSC-CMs בתרבית על MECM יש מיטוכונדריה מפוזרים הומוגנית בקרדיומיוציטים, בניגוד hiPSC-CMs בתרבית על ECM עכבר המציגים הצטברות perinuclear של מיטוכונדריה. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: hiPSC-CMs = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים; ECM = מטריצה חוץ-תאית; MECM = ECM גורם להתבגרות; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצור קרדיומיוציטים ספציפיים לחדר. (A) פרוטוקולים לייצור קרדיומיוציטים ספציפיים לתא חולקים מניפולציה זהה של מסלול איתות Wnt, עם גירוי thr של איתות Wnt על ידי עיכוב של GSK3 מיום 0 עד 2, ועיכוב של מסלול זה בין יום 2 ליום 4. מפרט התא מושג עם הפעלת מסלול החומצה הרטינואית ומניפולציית איתות Wnt בין הימים 3 ו -6. (B) כתוצאה ממפרט החדר, קרדיומיוציטים פרוזדוריים מציגים קצב מהיר יותר של דפולריזציה ספונטנית בהשוואה לקרדיומיוציטים חדריים. (C) ל-hiPSC-CMs חדריים יש קצב פעימות איטי יותר בהשוואה ל-hiPSC-CMs פרוזדורים; לכן, משך הפעולה הפוטנציאלי ב-80% מהרפולריזציה קצר יותר ב-hiPSC-ACMs בהשוואה ל-hiPSC-VCMs. קיצורים: hiPSC-CMs = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים; hiPSC-ACM = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע פרוזדוריים; hiPSC-VCM = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע חדריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיפוי אופטי שנרכש באמצעות מכשיר מיפוי אופטי ונותח באמצעות פולס. (A) דוגמה למפת חום לתצפית הוליסטית של פרמטרים המוערכים בלוח של 96 בארות לאחר סינון סרט וקביעת אזורי עניין בלוחות 96 בארות, הממופים באמצעות מכשיר המיפוי האופטי. בדוגמה זו, מפת חום APD80% המציינת באר חריגה (E4) ובארות שלא הצליחו להפיק נתונים (בארות H3, 4 ו-5). (B) יתר על כן, הממשק הידידותי למשתמש מאפשר שרטוט קל של מורפולוגיית פוטנציאל פעולה ממוצע מהבארות שנבחרו. (ג) כלים נוספים לתצוגה חזותית של נתונים זמינים; בדוגמה זו, תרשים זמן-מרחב שנוצר מהקו האופקי החוצה את הבארות בשורה A (לוח A) מראה הפעלה על פני קטע אופקי של כל באר (קו לבן על פני שורה A) על פני פרק זמן של 10 שניות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ציר זמן למיפוי שינויים חולפים בסידן תוך-תאי באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית. ביום ה-4 לאחר ציפוי קרדיומיוציטים זמינים מסחרית בצלחת מצופה MECM של 96 בארות, כפי שמצוין באיור 1A, התאים צריכים לעבור טרנספורמציה עם 5 MOI של וירוס בבדיקת CM בינונית למשך הלילה. המדיום מוחלף במדיום תחזוקת CDI עד יום 6, ומשתנה למדיום תחזוקת CDI ללא פנול אדום בין הימים 7 ל -11 כדי לאפשר ניטור מהיר או רציף של שינויים חולפים בסידן תוך תאי עם נאוטילוס. (B) hiPSC-CMstransduced with AdGCaMP6f המוערך באמצעות מיפוי אופטי בימים 7, 9 ו-10 לאחר ההפשרה מצביע על נוכחות של שינויים פלואורסצנטיים יציבים בתיווך סידן תוך תאי, המאפשרים מיפוי אופטי יומי של אותה צלחת לאורך זמן ממושך ללא צורך בשימוש חוזר של צבעים רגישים לסידן. קיצורים: GECI = מחוון סידן מקודד גנטית; CM = קרדיומיוציטים; MOI = ריבוי זיהום; 96wp = צלחת 96 באר; BSA = אלבומין בסרום בקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניצול מהיר וקל של מפות חום להשוואה חזותית של נתונים המתקבלים מסנכרון פונקציונלי בוגר של hiPSC-CMs עם Nautilus ומנותחים באמצעות Pulse. (A) hiPSC-CMs שטופלו באיזופרוטרנול מראים עלייה בקצב הפעימה, כפי שנצפה על ידי בדיקת מפות חום ואושר עם מבחן t זוגי. (B) באופן דומה, מיפוי של תאים לפני ואחרי טיפול באיזופרוטרנול מראה את ההשפעה האינוטרופית של גירוי β-אדרנרגי על ידי השוואה חזותית של מפות חום ועם מבחן t זוגי. (C) לבסוף, שימוש במפות חום להשוואה חזותית של נתונים מראה לוזטרופיה, השפעה קנונית נוספת של גירוי β-אדרנרגי, שאושרה עם מבחן t זוגי (p < 0.0001). היעדר מעגל מעיד על כשל ברכישת / ניתוח נתונים עבור אותה באר ספציפית. קיצורים: hiPSC-CMs = קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים; ISO = isoproterenol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אימות בדיקת GECI cardiotoxicity screening באמצעות חוסמי תעלות hERG. (A) עקבות שטף סידן ספונטני מייצג מבארות בסיס ב-HBSS ובנוכחות 500 ננומטר E-4031. (ב-ד) כימות ההשפעות הבסיסיות וה- +E-4031 על קצב הפעימה, משך מעבר הסידן 80 (CaTD80) וטריאנגולציה חולפת סידן (טריאנגולציית CaT) בהתאמה. *,** מציין הבדל משמעותי; מבחן t לא מזווג; עמ' < 0.01; n = 8 בכל קבוצה. (E) זיהוי GECI של חוסם hERG אחר, דומפרידון. (F) זיהוי GECI של בלוק hERG המושרה על ידי vandetanib. (G) זיהוי GECI של חסימת hERG על ידי מינון גבוה של סוטלול. קיצורים: GECI = מחוון סידן מקודד גנטית; hERG = גן אנושי הקשור לאתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מדיה והרכביה לחץ כאן להורדת טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנן מספר גישות שונות לבדיקת רעילות לב חוץ גופית באמצעות hiPSC-CMs. מאמר "שיטות עבודה מומלצות" שפורסם לאחרונה על השימוש ב- hiPSC-CMs הציג את מבחני המבחנה השונים, את הקריאות העיקריות שלהם, וחשוב מכך, את הפירוט של כל בדיקה לכימות תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי20. בנוסף לשימוש באלקטרודות חודרות ממברנה, המדד הישיר ביותר של תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי מסופק על ידי VSDs. קריאות בדיקת VSD מאפשרות הדמיה ישירה וכימות של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים קריטיים, כולל משך פוטנציאל פעולה, מהירות התפשטות פוטנציאל פעולה, עלייה בפוטנציאל פעולה, טריאנגולציה של פוטנציאל פעולה, קצב פעימה, סדירות פעימה והטרוגניות משך פוטנציאל פעולה. באופן דומה, בדיקות רגישות לסידן מציעות מידע על קצב, קצב ומשך אירוע חד-שכבתי hiPSC-CM. מדידות סידן חולפות hiPSC-CM שבוצעו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות מספקות גם מידע על ההתכווצות וחוזק ההתכווצות של כל התכווצות. מאמר זה מספק שיטות לשימוש ב- hiPSC-CMs בוגרים (לוחות 96 בארות) במבחני מדידה ארעיים VSD וסידן בעלי תפוקה גבוהה. בנוסף לשיטות למיפוי אופטי, מוצגת תוכנה לניתוח נתוני EP בתפוקה גבוהה.
השיטות המתוארות כאן מהוות התקדמות משמעותית בתחומי בדיקות הלב ומדעי הרגולציה. כאן, הצגנו שיטות להבשלה מהירה ורישום אלקטרופיזיולוגי של חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בלוחות סינון בעלי תפוקה גבוהה (לוחות 96 באר). הבשלה מהירה באמצעות MECM (7 ימים) המוצגת כאן היא התקדמות משמעותית לעומת גישות קודמות הדורשות הבשלה להתרחש על פני 30-100 ימים22,23. בהשוואה למכשירי ECM אחרים, הדורשים יישום ידני עבור כל ניסוי, לוחות MECM מצופים מראש ב-ECM ומגיעים למעבדה מוכנים לשימוש. היבט זה של MECM הופך אותו לקל יותר לשימוש, פחות משתנה ויעיל יותר מאשר שימוש בציפויי ECM אחרים. חשוב לציין, גישה זו יכולה לשמש הן עבור hiPSC-CMs משומרים בהקפאה, הזמינים מסחרית והן עבור hiPSC-CMs "תוצרת בית", אשר יכולים להיות ספציפיים לחדר. בשל המבנה הייחודי בצורת מוט של hiPSC-CMs בוגרים (איור 1 ואיור 2), חשוב לציין כי נדרש מספר גדול יותר של תאים ליצירת חד-שכבות קונפלואנטיות כאן, בהשוואה לפרוטוקולים המשתמשים ב-ECM אחרים. יש לציין כי בעת שימוש ב-ECM עכברי (לתאים יש פנוטיפ פנוטיפ פנקייק המתפשט ללא הרף), אנו מקבלים 50,000 hiPSC-CMs לכל באר, אך כאשר משתמשים ב-MECM, אנו משתמשים ב-75,000 hiPSC-CMs לכל באר. מספר CMs לכל באר יכול גם להיות מופחת אם התאים ישמשו לניתוח תא בודד, כגון מהדק טלאי או כל טכניקת הדמיה אחרת הדורשת תאים בודדים.
hiPSC-CMs הזמינים מסחרית מציעים יתרונות למדע הרגולציה בשל האפיון הנרחב של תאים אלה על ידי מאמצים בינלאומיים בהובלת מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA). עם זאת, התאים הזמינים מסחרית הם תערובת של nodal, פרוזדורים, hiPSC-CMs חדריים, אשר מספקים מידע רעילות רלוונטי מאוד, אבל חסרים את התכונות הספציפיות לחדר המחקות את הלב האנושי. hiPSC-CMs ספציפיים לתא משחזרים את ההבדלים האלקטרופיזיולוגיים הידועים בין קרדיומיוציטים פרוזדוריים וחדריים, ומספקים בדיקה חוץ גופית לפיתוח טיפולים אנטי-אריתמיים ספציפיים לתא (איור 3B-D). לדוגמה, תרופות ספציפיות לפרפור פרוזדורים יכולות כעת להיבדק ולפתח באמצעות חד-שכבות hiPSC-ACM מצופות בלוחות של 96 בארות לאיסוף נתונים חזק וקפדני. כמו כן, בעת הקרנה כדי לקבוע אם תרכובת גורמת Torsades de Pointes (TdP), הפרעת קצב חדרית בסיכון גבוה -, זה אופטימלי לא יש תאים פרוזדורים nodal "מזהמים" monolayers לב חדרי. לכן, למרות שמאמצי אימות hiPSC-CM בהובלת ה- FDA עד כה התמקדו בשימוש ב- CMs זמינים מסחרית, סביר להניח שהמלצות מדעיות רגולטוריות עתידיות יפנו לשימוש בתאים ספציפיים לתא כדי להפוך את בדיקת הרעילות למנבאת עוד יותר של מצב הלב האנושי. השיטות המתוארות כאן מבוססות על דוחות קודמים, ומספקות גישה חזקה ליצירת קרדיומיוציטים ספציפיים לתא הנגזרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים21.
הבדל עיקרי בין פרוטוקולים אלה לבין אלה המשמשים בדרך כלל בתחום הוא גישת הטיהור בשימוש. רוב המעבדות המייצרות hiPSC-CMs במעבדות שלהן מסתמכות על ברירה בתיווך מטבולי של קרדיומיוציטים22. כאן, אנו מסתמכים על שימוש ב- MACS כדי לטהר hiPSC-CMs, באמצעות גישת עיבוד תאים שאושרה קלינית המייצרת CMs עם פנוטיפים בריאים יותר23. גישת האתגר המטבולי יעילה, אך משתמשת בניסוח מדיה המדמה איסכמיה של שריר הלב24. בעת שימוש בטיהור MACS של hiPSC-CMs, חשוב להשתמש בקוקטייל דלדול שאינו CM, המכוון ל- non-CMs לדלדול מגנטי מאוכלוסיית התאים. השימוש בגישת הדלדול שאינו CM ממזער את לחץ הגזירה שחווים ה-CMs בטור המגנטי, והוא מועדף על פני תיוג מגנטי ישיר של אוכלוסיית ה-CM. שימוש בטיהור MACS של תאים ספציפיים לתא יאפשר למעבדות אחרות לייצר CMs בריאים למחקר ובדיקת רעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TJH הוא יועץ ויועץ מדעי ל- StemBioSys, Inc. שחפת היא עובדת של StemBioSys, Inc. AMR ו- JC הם יועצים לשעבר ל- StemBioSys, Inc. . TJH, TB, AMR ו- JC הם בעלי מניות ב- StemBioSys, Inc. .
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL148068-04 ו- R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
