Summary
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) erbjuder ett alternativ till att använda djur för preklinisk kardiotoxicitetsscreening. En begränsning för den utbredda användningen av hiPSC-CMs vid preklinisk toxicitetsscreening är cellernas omogna, fosterliknande fenotyp. Här presenteras protokoll för robust och snabb mognad av hiPSC-CM.
Abstract
Humant inducerade stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) används för att ersätta och minska beroendet av djur och djurceller för preklinisk kardiotoxicitetstestning. I tvådimensionella monolagerformat rekapitulerar hiPSC-CMs strukturen och funktionen hos de vuxna mänskliga hjärtmuskelcellerna när de odlas på en optimal extracellulär matris (ECM). En human perinatal stamcellshärledd ECM (mognadsinducerande extracellulär matrix-MECM) mognar hiPSC-CM-strukturen, funktionen och det metaboliska tillståndet inom 7 dagar efter plätering.
Mogna hiPSC-CM-monolager svarar också som förväntat på kliniskt relevanta läkemedel, med en känd risk att orsaka arytmier och kardiotoxicitet. Mognaden av hiPSC-CM-monolager var ett hinder för den utbredda användningen av dessa värdefulla celler för regulatorisk vetenskap och säkerhetsscreening, tills nu. Denna artikel presenterar validerade metoder för plätering, mognad och funktionell fenotypning med hög genomströmning av hiPSC-CM elektrofysiologisk och kontraktil funktion. Dessa metoder gäller kommersiellt tillgängliga renade kardiomyocyter, såväl som stamcellshärledda kardiomyocyter som genereras internt med högeffektiva, kammarspecifika differentieringsprotokoll.
Elektrofysiologisk funktion med hög genomströmning mäts med antingen spänningskänsliga färgämnen (VSDs; emission: 488 nm), kalciumkänsliga fluoroforer (CSF) eller genetiskt kodade kalciumsensorer (GCaMP6). En optisk kartläggningsenhet med hög genomströmning används för optiska inspelningar av varje funktionell parameter, och anpassad dedikerad programvara används för elektrofysiologisk dataanalys. MECM-protokoll tillämpas för läkemedelsscreening med hjälp av en positiv inotrop (isoprenalin) och humana Ether-a-go-go-related gen (hERG) kanalspecifika blockerare. Dessa resurser kommer att göra det möjligt för andra utredare att framgångsrikt använda mogna hiPSC-CMs för hög genomströmning, preklinisk kardiotoxicitetsscreening, hjärtmedicineringseffektivitetstestning och kardiovaskulär forskning.
Introduction
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har validerats på internationell nivå och är tillgängliga för in vitro-kardiotoxicitetsscreening1. Mycket rena hiPSC-CM kan genereras i praktiskt taget obegränsat antal, kryokonserveras och tinas. Vid omplätering återupplivas de också och börjar dra ihop sig med en rytm som påminner om det mänskliga hjärtat 2,3. Anmärkningsvärt är att enskilda hiPSC-CMs kopplas till varandra och bildar funktionell syncytia som slår som en enda vävnad. Numera härrör hiPSC rutinmässigt från patientens blodprover, så vem som helst kan representeras med hjälp av in vitro hiPSC-CM kardiotoxicitetsscreeninganalyser 4,5. Detta skapar möjlighet att utföra "kliniska prövningar i en maträtt", med betydande representation från olika populationer6.
En kritisk fördel jämfört med befintliga screeningmetoder för djur- och djurcellskardiotoxicitet är att hiPSC-CMs använder hela det mänskliga genomet och erbjuder ett in vitro-system med genetiska likheter med det mänskliga hjärtat. Detta är särskilt attraktivt för farmakogenomik och personlig medicin - användningen av hiPSC-CM för medicinering och annan terapiutveckling förutspås ge mer exakta, exakta och säkra läkemedelsrecept. Faktum är att tvådimensionella (2D) hiPSC-CM-monolageranalyser har visat sig vara prediktiva för läkemedelskardiotoxicitet, med hjälp av en panel av kliniskt använda läkemedel med känd risk att orsaka arytmier 1,7,8,9. Trots hiPSC-CMs stora potential och löftet att effektivisera och göra läkemedelsutveckling billigare, har det funnits en motvilja mot att använda dessa nya analyser10,11,12.
Hittills är en stor begränsning av utbredd adoption och acceptans av hiPSC-CM-screeninganalyser deras omogna, fosterliknande utseende, liksom deras funktion. Den kritiska frågan om hiPSC-CM-mognad har granskats och debatterats i den vetenskapliga litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samma sätt har många metoder använts för att främja hiPSC-CM-mognad, inklusive extracellulära matrismanipulationer (ECM) i 2D-monolager och utveckling av 3D-konstruerade hjärtvävnader (EHT)17,18. För närvarande finns det en utbredd tro på att användningen av 3D EHT kommer att ge överlägsen mognad i förhållande till 2D-monolagerbaserade metoder. 2D-monolager ger emellertid en högre effektivitet av cellutnyttjande och ökad framgång vid plätering jämfört med 3D EHT; 3D EHT använder ett större antal celler och kräver ofta inkludering av andra celltyper som kan förvirra resultat. Därför ligger fokus i denna artikel på att använda en enkel metod för att mogna hiPSC-CMs odlade som 2D-monolager av elektriskt och mekaniskt kopplade celler.
Avancerad hiPSC-CM-mognad kan uppnås i 2D-monolager med hjälp av en ECM. 2D-monolagren av hiPSC-CM kan mogna med hjälp av ett mjukt, flexibelt polydimetylsiloxantäckglas, belagt med basalmembranmatris utsöndrad av en Engelbreth-Holm-Swarm-mussarkomcell (mus-ECM). År 2016 visade rapporter att hiPSC-CMs odlade på detta mjuka ECM-tillstånd mognade funktionellt och visade verkningspotentialens ledningshastigheter nära vuxna hjärtvärden (~ 50 cm / s)18. Vidare uppvisade dessa mogna hiPSC-CMs många andra elektrofysiologiska egenskaper som påminner om det vuxna hjärtat, inklusive hyperpolariserad vilomembranpotential och uttryck av Kir2.1. Mer nyligen identifierade rapporter en human perinatal stamcellshärledd ECM-beläggning som främjar strukturell mognad av 2D hiPSC-CMs19. Här presenteras lättanvända metoder för strukturellt mogna 2D hiPSC-CM-monolager för användning i elektrofysiologiska skärmar med hög kapacitet. Vidare tillhandahåller vi validering av ett optiskt kartläggningsinstrument för automatiserad insamling och analys av 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologisk funktion, med hjälp av spänningskänsliga färgämnen (VSDs) och kalciumkänsliga sonder och proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSC-användning i detta protokoll godkändes av University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialförteckningen för en lista över material och utrustning. Se tabell 1 för media och deras sammansättningar.
1. Upptining och plätering av kommersiellt tillgängliga kryokonserverade hiPSC-CM för mognad på en mognadsinducerande extracellulär matris (MECM)
- Värm alla reagens till rumstemperatur och rehydrera MECM-plattorna med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande kalcium och magnesium, i 1 timme före kardiomyocytplätering (200 μL buffert per brunn på en 96-brunnsplatta).
- Tvätta MECM-plattorna 2x med HBSS eller PBS innehållande kalcium och magnesium i 1 timme före kardiomyocytplätering (200 μL buffert per brunn på en 96-brunnsplatta) och håll brunnarna hydratiserade.
- Förbered ett 37 °C vattenbad.
- Ta bort kardiomyocytrören från tanken med flytande kväve, överför rören till torris och öppna rörlocken något för att släppa trycket.
OBS: Att släppa trycket i rören är extremt viktigt! Om för mycket tryck byggs inuti rören kan de explodera. - Sätt tillbaka tublocken och lägg dem i vattenbadet för att tina i 4 minuter.
OBS: Låt dem tina helt, för att undvika cellskador på grund av partiell upptining. - Efter att cellerna tinat, spraya rören med 70% etanol innan de öppnas. Överför cellerna till 15 ml koniska rör med en 1 ml pipett. Droppa långsamt 8 ml pläteringsmedium, omrör röret varje gång 1 ml tillsätts, så att cellerna kan anpassa sig till förändringar i osmolaritet.
- Tvätta kryovialen med 1 ml pl pläteringsmedium med en 1 ml glaspipett. Droppa sedan långsamt tvätten i det 15 ml koniska röret.
- Centrifugera rören vid ~ 300 × g i 5 min. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml pl. Ta bort en alikvot och utför levande cellräkning med en hemocytometer. Tillsätt ytterligare pläteringsmedium för att erhålla 7,5 × 105 celler/ml.
OBS: Cirka 10 ml cellsuspension krävs för att förbereda 96 brunnar. - Fördela 100 μL cellsuspension per brunn på en MECM-belagd platta med 96 brunnar med en flerkanalig pipett.
OBS: Se till att undvika cellutfällning och få enhetlig celldensitet i alla brunnar under plätering. - Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 i 2 dagar innan mediet byts till underhållsmedium (200 μl/brunn). Byt underhållsmedium på dag 5 efter upptining. Utför EP-analyser på dag 7 eller senare, enligt beskrivningen tidigare 8,9. Byt medium varannan dag när du väljer att förlänga cellkulturen.
2. hiPSC-hjärtriktad differentiering och hiPSC-CM-rening
- Varm 1x kommersiellt tillgänglig etylendiamintetraättiksyralösning (EDTA), HBSS utan kalcium och magnesium (HBSS--) och 6-brunnsplattor belagda med solubiliserad basalmembranmatris utsöndrad av en Engelbreth-Holm-Swarm-mussarkomcell (mus-ECM) till rumstemperatur.
- Markera de differentierade kolonierna med faskontrastmikroskopi och aspirera/ablatera. Tvätta varje brunn med 1 ml HBSS--. Utför två tvättar i brunnar som innehåller >10 differentieringsfläckar.
- Aspirera HBSS - och tillsätt 1 ml EDTA-lösning till varje brunn. Inkubera plattorna i upp till 5 minuter vid 37 °C. Kontrollera plattorna efter 3 minuter och leta efter genomskinliga vita, synliga kolonier.
- Aspirera EDTA-lösningen och tillsätt 1 ml till en enda brunn. Avlägsna cellerna med 2 ml hiPSC-medium genom att pipettera suspensionen upp och ner upprepade gånger med en 10 ml glaspipett för att lossa alla stamceller från brunnen och överför cellsuspensionen till ett uppsamlingsrör. Upprepa aspirationen och lossa med efterföljande brunnar.
OBS: Lossa kolonier som är svåra att lyfta med spetsen på glaspipetten. - Räkna stamcellerna och justera volymen till platta 8,0 × 105 celler/brunn. Odla cellerna på hiPSC-medium (2 ml / brunn) tills stamcellerna når 90% sammanflöde (denna tid kallas från och med nu som D0).
- Bered 2 ml basaldifferentieringsmedium kompletterat med 4 μM CHIR99021.
- På D0, tvätta varje brunn av en 6-brunnsplatta med stamceller med 1 ml HBSS per brunn. Ersätt HBSS med basaldifferentieringsmedium kompletterat med 4 μM CHIR99021.
- På D1, gör ingenting.
- På D2 bereds basaldifferentieringsmedium kompletterat med 4 μM IWP4.
- Byt ut mediet mot 2 ml IWP4-kompletterat basaldifferentieringsmedium per brunn.
- På D3, gör ingenting för en ventrikulärspecifik differentiering. För en förmaksspecifik differentiering, aspirera mediet och tillsätt 2 ml basmedium kompletterat med 4 μM IWP4 och 1 μM retinsyralösning (RA) per brunn.
- På D4, aspirera mediet och tillsätt 2 ml basalmedium per brunn för ventrikulär differentiering. För en förmaksdifferentiering, aspirera mediet och tillsätt 2 ml basalmedium kompletterat med 1 μM RA-lösning per brunn.
- På D5, gör ingenting.
- På D6, aspirera mediet och tillsätt 2 ml basalmedium per brunn (för både förmaks- och ventrikulär differentiering).
- På D7, gör ingenting.
- På D8, aspirera mediet och tillsätt 2 ml kardiomyocytunderhållsmedium. Byt medium varannan dag tills cellseparation, eller följ en kronisk läkemedelsexponeringsplan.
3. hiPSC-CM-rening via MACS (magnetaktiverad cellsortering)
- Aspirera cellodlingsmediet och tvätta varje brunn med 1 ml HBSS--. Dissociera cellerna genom att tillsätta 1 ml 0,25% trypsin / EDTA och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 i 10 min. Resuspendera och singularisera cellerna i varje brunn med 2 ml pläteringsmedium för att inaktivera trypsin / EDTA.
- Samla cellerna från de sex brunnarna i ett 50 ml koniskt rör med en sil på 70 μm. Tvätta sedan silen med 3 ml pläteringsmedium. Räkna cellerna.
- Centrifugera suspensionen vid ~300 × g i 5 min. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna med 20 ml iskall MACS-separationsbuffert. Centrifugera sedan igen vid ~ 300 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera pelleten i 80 μL kall MACS-separationsbuffert per 5 × 106 celler. Tillsätt 20 μL kall icke-kardiomyocytutarmningscocktail (human) per 5 × 106 celler. Blanda försiktigt cellsuspensionen och inkubera på is i 10 minuter.
- Tvätta provet genom att tillsätta 4 ml kall MACS-separationsbuffert per 5 × 106 celler. Centrifugera provet vid ~ 300 × g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 80 μL kall MACS-separationsbuffert per 5 × 106 celler. Tillsätt 20 μL kalla anti-biotinmikrokulor per 5 × 106 celler. Blanda försiktigt cellsuspensionen och inkubera i 10 minuter på is.
- Medan proverna inkuberas, placera de positiva tömningskolonnerna (försedda med 30 μm förseparationsfilter) på MACS-separatorn och placera de märkta 15 ml uppsamlingsrören under kolonnerna. En kolumn behövs för varje 5 × 106 celler.
- Fyll varje kolumn med 3 ml kall MACS-separationsbuffert. Blanda den antikroppsbehandlade cellsuspensionen med 2 ml MACS-separationsbuffert per 5 × 106 celler och lägg till i kolonnen.
OBS: Centrifugera inte! Centrifugering vid detta steg har skadliga effekter på kardiomyocytutbytet. - Tillsätt 2 ml MACS-separationsbuffert till varje kolumn och samla upp genomströmningen tills 12 ml genomströmningskardiomyocytsuspension samlas in.
Låt aldrig kolonnerna torka helt. - Centrifugera kardiomyocyterna vid ~ 300 × g i 5 minuter, kassera supernatanten och suspendera kardiomyocyterna i 1 ml pläteringsmedium.
- Räkna cellerna för att bestämma koncentrationen, justera volymen till önskad sådddensitet och platta cellerna. Platta de renade kardiomyocyterna på MECM 96-brunnsplattorna, som beskrivits ovan i steg 1.9-1.11 (7.5 × 105 celler/brunn).
4. Optisk kartläggning med spänningskänsliga färgämnen (VSDs) och kalciumkänsliga fluoroforer (CSF)
- Bered lämplig mängd VSD i HBSS med kalcium och magnesium genom att tillsätta 1 μL VSD-färgämne per ml HBSS och 10 μL laddningsadjuvans per ml HBSS.
OBS: Vanligtvis kräver en platta med 96 brunnar 10 ml VSD-lösning. - Alternativt kan du bereda HBSS med kalcium och magnesium kompletterat med 5 μM CSF. Aspirera kardiomyocytunderhållsmediet och ersätt med 100 μL VSD eller CSF per brunn på en 96-brunnsplatta. Inkubera cellerna i 30 minuter i cellodlingsinkubatorn.
- Ta bort färgämnena och ersätt med analysmedium eller HBSS. Jämvikt vid 37 °C för insamling av optisk kartläggning av baslinjedata med en optisk kartläggningsanordning med hög genomströmning.
- Behandla cellerna med läkemedel för akut exponeringstestning, eller kartlägg de celler som kroniskt exponerades för läkemedel av intresse.
- För kardiotoxicitetstestning i 96-brunnsplattor, använd fyra doser av en förening med minst sex brunnar per dos. Använd doser som sträcker sig från under till över den effektiva terapeutiska plasmakoncentrationen, inklusive en dos av den kliniska effektiva terapeutiska plasmakoncentrationen.
- Späd läkemedlen i dimetylsulfoxid, förvara dem som stamlösningar vid -20 °C och späd dem sedan i HBSS till önskade koncentrationer.
- Gör elektrofysiologiska mätningar före läkemedelsansökan, enligt beskrivningen i avsnitt 5. När läkemedlen har applicerats, gör elektrofysiologiska inspelningar minst 30 minuter senare för kroniska studier. Se följande avsnitt för optisk kartläggning, datainsamling och analysprocedurer.
5. Optisk kartläggning med genetiskt kodad kalciumindikator (GECI)
- Platta kommersiellt tillgänglig eller MACS-renad hiPSC-CM, enligt beskrivningen ovan, med MECM-belagda 96-brunnsplattor för att göra mogna hiPSC-CM. För att bilda sammanflytande monolager, platta 7,5 × 104 CM per brunn av varje 96-brunnsplatta. Använd pläteringsmedium.
- Efter 48 timmar i pläteringsmedium, byt till kardiomyocytunderhållsmedium.
- På dag 4 efter upptining och omplätering, tillsätt rekombinant adenovirus för att uttrycka GCaMP6m (AdGCaMP6m) till celler vid en multiplicitet av infektion (MOI) = 5. Tillsätt viruset med CM-analysmedium.
OBS: Här utfördes experiment med GCaMP6m i iCell 2-kardiomyocyter från en kommersiell leverantör. - På dag 5, ta bort adGCaMP6m-mediet och ersätt med nytt RPMI+B27 (kardiomyocytunderhållsmedium).
- På dag 7, observera CM med mikroskopi eller den optiska kartläggningskameran för att visualisera spontana sammandragningar och motsvarande kalciumtransienter.
- På dag 7 eller senare, för läkemedelsscreening, överför du direkt 96-brunnsplattor av mogna hiPSC-CM-monolager som uttrycker GCaMP6m till den optiska kartläggningskameran från inkubatorn för datainsamling vid baslinjen.
- Efter insamling av elektrofysiologiska data, returnera plattorna på CM till vävnadsodlingsinkubatorn för mätningar vid en efterföljande tidpunkt.
- Efter baslinjeinspelningar, applicera medicinerna, med minst fyra doser av varje medicin och minst sex brunnar per dos. Balansera medicinerna på cellerna i minst 30 minuter före datainsamling. Värm brunnstemperaturen till ~ 37 ° C före och under insamlingen av data.
- Efter baslinjeregistreringar av en hel platta, tillsätt isoproterenol (500 nM) till varje brunn för att möjliggöra robusta läkemedelssvarsdata. Kvantifiera effekterna av isoproterenol på monolagers slagfrekvens, kontraktionsamplitud (transient kalciumamplitud) och transient kalciumvaraktighet (se figur 6), enligt beskrivningen i avsnitt 5.
6. Insamling av optiska kartdata och analys
- Kontrollera att den optiska kartenhetens kamera, transilluminator och plattvärmare är påslagna.
- Öppna förvärvsprogrammet och bestäm platsen för att spara filen.
- Öppna den främre lådan och placera plattan på plattvärmaren.
- Skaffa en mörk ram genom att klicka på knappen Dark Frame .
- Välj Varaktighet (10–30 sekunder) och Bildfrekvens för förvärv (t.ex. 100 fps; 250 fps för högre tidsupplösning) och klicka på Starta förvärv.
- Öppna analysprogrammet och välj antingen Bläddra efter en enskild fil eller Sida vid sida på fliken Importera/filtrera för att rekonstruera en platta.
- Välj Parameterläge (APD eller CaTD), ange Avstånd per pixel och använd brunnsguiden för att bestämma brunnarnas placering i bilden. Klicka på Process Save för att gå till nästa flik.
- Öppna fliken ROI (regioner av intresse) och välj att rita ROI: erna manuellt, automatiskt eller inte använda ROI alls, vilket då skulle överväga hela brunnen för analys. När avkastningen har valts klickar du på knappen Process/Spara för att gå till nästa steg. Markera rutorna Dölj brunnar och Visa endast filtrerade för att visualisera avkastningen.
- Öppna fliken Analys och välj varje brunn eller ROI längst upp till höger på skärmen för att bekräfta noggrannheten för automatisk slagdetektering. Lägg till eller ta bort slag från spåren genom att trycka på Lägg till taktslag/spara taktslag, eller genom att välja ett enskilt slag och trycka på backstegstangenten på tangentbordet.
- Du kan också använda funktionen Genomsnittliga värmekartor för att skapa värmekartor över valda parametrar för plattan.
- Klicka på knappen Tid-rymddiagram på fliken Analys för att visualisera data för varje brunn eller ROI. När du har kontrollerat att taktdetekteringen är korrekt fortsätter du till fliken Exportera och väljer Filformat. Tryck på Exportera och skapa en mapp för de data som ska exporteras till. Fortsätt att öppna datafiler och kör den valda statistiska analysrutinen.
.xlxs-filer föredras eftersom alla parametrar exporteras i en enda fil. Andra format (.csv eller .tsv) genererar en fil per parameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
hiPSC-CM-mognad kännetecknad av faskontrast och immunofluorescerande konfokal avbildning
Tidslinjen för ECM-medierad mognad av kommersiellt tillgängliga hiPSC-CMs med MECM-belagda 96-brunnsplattor presenteras i figur 1A. Dessa data samlas in med hjälp av kommersiellt tillgängliga kardiomyocyter som anländer till laboratoriet som kryokonserverade flaskor av celler. Varje injektionsflaska innehåller >5 × 106 livsdugliga kardiomyocyter. Cellerna är ~ 98% rena och noggrant testade för kvalitetskontroll (analyscertifikat medföljer varje injektionsflaska). Det stora antalet CM möjliggör upptining och plätering av CM på olika ECM-kombinationer med samma cellsats. I figur 1 pläteras hiPSC-CM på antingen ECM- eller MECM-belagda musplattor. HiPSC-CMs pläterade på MECM mognar och blir strukturellt distinkta från samma sats hiPSC-CMs ompläterade på musen ECM. Äldre celler blir nämligen stavformade, medan omogna celler behåller en cirkulär form. Detta kan ses vid faskontrastavbildning och vid färgning av hjärtmyofilamenten (figur 1B; troponin I [TnI], röd). En mer omfattande validering av den strukturella mognaden av hiPSC-CM presenteras i figur 2. Ett stort synfält (20x mål) av CM färgade med α-aktininantikropp visar den typiska formen av cellerna odlade på varje ECM-tillstånd. α-aktinin är ett kritiskt strukturellt protein anordnat med regelbundet avstånd i hjärtmyofilamenten. I överensstämmelse med TnI-färgningen i figur 1 indikerar α-aktininfärgningen ytterligare mognaden av hiPSC-CM odlade på MECM. Förutom att främja en stavformad mogen fenotyp, inducerar MECM också större sarkomerorganisation (60x bilder). Mitokondriellt innehåll och aktivitet skiljer sig också mellan celler odlade på musens ECM och MECM (figur 2B). Fetal-omogna hiPSC-CM mitokondriellt innehåll är begränsat till det perinukleära utrymmet, med lite mitokondrier som finns i cytosolen. Däremot fördelas moget hiPSC-CMs mitokondriellt innehåll i hela cellen. Mitokondriell bedömning använder ett etablerat protokoll19.
hiPSC hjärtriktad differentiering och hjärtkammarspecifikation
Här finns ett protokoll för egen produktion och mognad av renade, kammarspecifika hiPSC-CM (figur 3A). Detta baseras på en tidigare publicerad rapport20. Presenterade är detaljerade procedurer för hiPSC-CM-rening med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt, magnetaktiverat cellsorteringssats (MACS). Vi validerade nyligen användningen av MACS-rening och visade fördelarna med att använda MACS jämfört med metaboliskt baserad hiPSC-CM-rening; typiskt förväntas hiPSC-CM-renhet över 95%21. Det är viktigt att påpeka att om det ursprungliga CM-innehållet är <50%, kan MACS-rening nå endast ~ 85%. I dessa fall kan CM-anrikning vara nödvändig efter uttömning av icke-CM. Om det ursprungliga CM-innehållet från differentiering är >50%, kan utarmning av icke-CM från cellpopulationen med MACS-kit uppnå renhet >95%; i detta fall är ytterligare anrikning eller positivt urval av CM inte nödvändigt. De kammarspecifika hiPSC-CM kan också mogna med MECM-belagda 96-brunnsplattor, som beskrivs ovan och visas i figur 1 och figur 2. Det bör förväntas att de förmaksspecifika cellerna (hiPSC-ACM) har en signifikant snabbare spontan beatrate och kortare verkningspotentialduration 80 (APD80) än de ventrikelspecifika cellerna (hiPSC-VCM). Dessa är typiska elektrofysiologiska data för aktionspotentialer som registrerats med hjälp av varvtalsreglerare och det optiska kartläggningssystemet (figur 3B-D).
Elektrofysiologisk optisk kartläggning med hög genomströmning
Vetenskaplig rigor ökar dramatiskt för varje analys om den kan utföras på ett sätt med hög genomströmning. Screeningdata för kardiotoxicitet presenteras i figur 4, figur 5, figur 6 och figur 7, som visar elektrofysiologisk screening med hög genomströmning med mogna hiPSC-CM-monolager i en 96-brunnsplatta. Hela plattans värmekartor för parametrar som APD80 (figur 4A) avslöjar reproducerbarheten av en given parameter i en platta från brunn till brunn. Dessutom ger värmekartor för hela plattan en snabb undersökning av eventuella avvikande värden i datauppsättningen. Till exempel, i brunn E4 på plattan som presenteras i figur 4A, är det tydligt att denna brunn har ett mycket större APD80-värde, indikerat av den väl förekommande gula, medan de andra brunnarna är indigoblå. Typiska aktionspotentialer för mogna 2D hiPSC-CM-monolager (figur 4B) påminner om verkningspotentialmorfologin hos vuxna kardiomyocyter isolerade och testade i kultur. Dessutom visas en typisk aktionspotential spontan rytm i figur 4C. Data i figur 4C är ett tidsrumsdiagram på rad A, kolumnerna 1–12. Den vita linjen över plattkartan i figur 4A visar detta. Varje ljusfluorescerande blixt över tid i varje brunn representerar en enda spontan aktivering. Figur 5 och figur 6 visar nyttan av att använda GCaMP6m genetiskt kodad kalciumindikator (GECI) för att mäta intracellulära kalciumtransienter; Figur 6 visar också det förväntade svaret på isoproterenol-den klassiska hjärtpositiva inotropen. Som svar på isoproterenol orsakar aktivering av β1-adrenerga receptorer positiv kronotropi (figur 6A), positiv inotropi (figur 6B) och positiv lusitropi (figur 6C). Dessa svar på isoproterenol indikerar signifikant mognad av hiPSC-CM β1-adrenerga receptorer och intracellulära signalkaskader.
I figur 7 visas hiPSC-CM-svar på humana Ether-a-go-go-relaterade genkanalblockerare (hERG), med användning av GCaMP6m kalciumfluorescens för att övervaka rytmen och fungera som en surrogatmarkör för kontraktilitet. E-4031 är en hERG-specifik kanalblockerare som saktar ner den spontana taktfrekvensen och ökar kalciumövergående varaktighet (CaTD80) och triangulering (CaT-triangulering). Figur 7A visar detektering av tidiga efterdepolariseringar orsakade av E-4031 hERG-kanalblockaden. Andra hERG-kanalblockerare, inklusive domperidon, vandetanib och sotalol, testades också, och resultaten visas i figur 7E-G. Dessa föreningar och doser valdes baserat på den senaste hiPSC-CM-valideringsstudien 1,7,9.
Figur 1: Tidslinje för snabb mognad av kommersiellt tillgängliga kryokonserverade hiPSC-CM från andra källor . (A) Upptinade kardiomyocyter suspenderade i pläteringsmedium appliceras på MECM på dag 0. På dag 2 ersätts mediet med underhållsmedium och det använda mediet byts ut på dag 5. Cellerna odlas i ytterligare 2 dagar, och på dag 7 kan den mogna syncytia av hiPSC-CMs laddas med inspelningslösning för nedströmsapplikationer eller odlas under längre perioder. (B) Kontrastfas av syncytia av kardiomyocyter pläterade på musens ECM eller MECM visar att kardiomyocyter pläterade på musens ECM har större cirkularitet jämfört med kardiomyocyter pläterade på MECM; Vidare indikerar immunfärgning för TnI att kardiomyocyter pläterade på musens ECM behåller en radiell symmetrimorfologi och oorganiserade sarkomerer i motsats till dolichomorfa och välstrukturerade hiPSC-CMs pläterade på MECM. Skalstänger = 100 μm (B, övre); 50 μm (B, lägre). Förkortningar: hiPSC-CMs = humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter; ECM = extracellulär matris; MECM = mognadsinducerande ECM; 96wp = 96-brunnsplatta; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TnI = troponin I. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Jämförelse av sarkomerorganisation av hiPSC-CMs pläterade på en mus ECM eller en MECM. (A) Mus ECM-odlade hiPSC-CMs immunfärgade mot α-aktinin indikerar radiell morfologi, med en lägre densitet av sarkomerer dispergerade genom kardiomyocyten i motsats till hiPSC-CMs från samma sats pläterad på matrisen och presenterar stavformad morfologi (20x). (60x) Observation av hiPSC-CM med konfokalmikroskopi visar att hiPSC-CM odlade på en mus ECM har radiell symmetrimorfologi, med en tätare perimetral fördelning av sarkomerer och en låg densitet av radiella sarkomerer i motsats till hiPSC-CM från samma sats som odlades på MECM. De presenterar en homogen fördelning av sarkomerer organiserade längs cellernas längre axel. Skalstänger = 100 μm (övre); 50 μm (lägre). (B) Färgning av hiPSC-CMs odlade på musens ECM eller MECM med ett mitokondriellt färgämne som färgar mitokondrier med hög transmembranpotential visar en lägre intensitet av färgning i kardiomyocyter odlade på mus ECM jämfört med MECM. Dessutom har hiPSC-CMs odlade på MECM mitokondrier homogent fördelade i kardiomyocyterna, i motsats till hiPSC-CMs odlade på mus-ECM som uppvisar en perinukleär ackumulering av mitokondrier. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: hiPSC-CMs = humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter; ECM = extracellulär matris; MECM = mognadsinducerande ECM; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Produktion av kammarspecifika kardiomyocyter. (A) Protokoll för produktion av kammarspecifika kardiomyocyter delar identisk Wnt-signalvägsmanipulation, med thr-stimulering av Wnt-signalering genom hämning av GSK3 från dag 0 till 2, och hämning av denna väg mellan dag 2 och 4. Kammarspecifikation uppnås med aktivering av retinsyravägen och Wnt-signalmanipulation mellan dag 3 och 6. (B) Som ett resultat av kammarspecifikationen uppvisar förmakskardiomyocyter en snabbare hastighet av spontan depolarisering jämfört med ventrikulära kardiomyocyter. (C) Ventrikulära hiPSC-CM har långsammare slagfrekvens jämfört med förmaks hiPSC-CM; därför är den verkningspotentiella varaktigheten vid 80% av repolarisationen kortare i hiPSC-ACM jämfört med hiPSC-VCM. Förkortningar: hiPSC-CMs = humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter; hiPSC-ACM = förmaksinducerade pluripotenta kardiomyocyter från människa; hiPSC-VCM = ventrikulära humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Optisk kartläggning förvärvad med en optisk kartläggningsenhet och analyserad med puls. (A) Exempel på en värmekarta för holistisk observation av parametrar som bedömts i en platta med 96 brunnar efter filmfiltrering och bestämning av intressanta regioner i 96-brunnsplattor, kartlagda med den optiska kartläggningsanordningen. I det här exemplet en APD80% värmekarta som indikerar en avvikande brunn (E4) och brunnar som inte kunde producera data (brunnarna H3, 4 och 5). (B) Dessutom möjliggör det användarvänliga gränssnittet enkel plottning av genomsnittlig verkningspotentialmorfologi från de valda brunnarna. (C) Ytterligare datavisualiseringsverktyg finns tillgängliga; I det här exemplet visar ett tidsrymddiagram som genereras från den horisontella linjen som korsar brunnarna på rad A (panel A) aktivering över en horisontell sektion av varje brunn (vit linje över rad A) under en period av 10 s. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Tidslinje för kartläggning av intracellulära kalciumövergående förändringar med en genetiskt kodad kalciumindikator. På dag 4 efter plätering av kommersiellt tillgängliga kardiomyocyter i en MECM-belagd 96-brunnsplatta, som indikeras i figur 1A, bör cellerna transduceras med 5 MOI virus i CM-analysmedium över natten. Mediet ersätts med CDI-underhållsmedium fram till dag 6 och ändras till CDI-underhållsmedium utan fenolrött mellan dag 7 och 11 för att möjliggöra snabb eller kontinuerlig övervakning av intracellulära kalciumövergående förändringar med Nautilus. (B) hiPSC-CMs transducerade med AdGCaMP6f utvärderade med optisk kartläggning på dag 7, 9 och 10 efter upptining indikerar närvaron av stabila, intracellulära kalciummedierade fluorescensförändringar, som möjliggör daglig optisk kartläggning av samma platta under längre tidsperioder utan behov av återapplicering av kalciumkänsliga färgämnen. Förkortningar: GECI = genetiskt kodad kalciumindikator; CM = kardiomyocyt; MOI = multiplicitet av infektion; 96wp = 96-brunnsplatta; BSA = bovint serumalbumin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Snabb och enkel användning av värmekartor för visuell jämförelse av data som förvärvats från mogen funktionell syncytia av hiPSC-CMs med Nautilus och analyserats med Pulse. (A) hiPSC-CMs behandlade med isoproterenol visar en ökning av taktfrekvensen, vilket observerats vid inspektion av värmekartor och bekräftats med parat t-test. (B) På liknande sätt visar kartläggning av celler före och efter isoproterenolbehandling den inotropa effekten av β-adrenerg stimulering genom visuell jämförelse av värmekartor och med parat t-test. (C) Slutligen visar användning av värmekartor för visuell jämförelse av data lusitropi, en annan kanonisk effekt av β-adrenerg stimulering, bekräftad med parat t-test (p < 0,0001). Frånvaron av en cirkel indikerar fel i datainsamling / analys för den specifika brunnen. Förkortningar: hiPSC-CMs = humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter; ISO = isoproterenol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Validering av GECI kardiotoxicitetsscreeningtest med hjälp av hERG-kanalblockerare. (A) Representativa spontana kalciumflödesspår från baslinjebrunnar i HBSS och i närvaro av 500 nM E-4031. (B-D) Kvantifiering av baslinje- och +E-4031-effekter på beatfrekvens, transient kalciumduration 80 (CaTD80) respektive kalciumtransient triangulering (CaT-triangulering). *,** betecknar signifikant skillnad; oparad t-test; p < 0,01; n = 8 i varje grupp. E) GECI detektion av en annan hERG-blockerare, domperidon. F) GECI-detektion av hERG-block inducerat av vandetanib. (G) GECI-detektion av hERG-block genom hög dos sotalol. Förkortningar: GECI = genetiskt kodad kalciumindikator; hERG = human Ether-a-go-go-relaterad gen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Media och deras kompositioner Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera olika metoder för in vitro kardiotoxicitet screening med hiPSC-CMs. Ett nyligen publicerat "Best Practices" -papper om användningen av hiPSC-CMs presenterade de olika in vitro-analyserna , deras primära avläsningar och viktigare, varje analyss granularitet för att kvantifiera human hjärtelektrofysiologisk funktion20. Förutom att använda membrangenomträngande elektroder tillhandahålls det mest direkta måttet på mänsklig hjärtelektrofysiologisk funktion av VSDs. VSD-analysavläsningar möjliggör direkt visualisering och kvantifiering av kritiska elektrofysiologiska parametrar, inklusive åtgärdspotentialvaraktighet, åtgärdspotentialutbredningshastighet, åtgärdspotentialslag, triangulering av åtgärdspotential, slagfrekvens, slagregelbundenhet och heterogeniteter av åtgärdspotentialvaraktighet. På samma sätt erbjuder kalciumkänsliga sonder information om hiPSC-CM-monolagerrytm, hastighet och händelsevaraktighet. hiPSC-CM kalciumtransienta mätningar gjorda med fluorescerande sonder ger också information om kontraktilitet och kontraktil styrka för varje sammandragning. Detta dokument tillhandahåller metoder för användning av mogna hiPSC-CMs (96-brunnsplattor) i VSD- och kalciumtransienta mätanalyser med hög genomströmning. Förutom metoder för optisk kartläggning presenteras programvara för EP-dataanalys med hög genomströmning.
De metoder som beskrivs här är ett betydande framsteg för kardiotoxicitetsscreening och regulatoriska vetenskapsområden. Här har vi presenterat metoder för snabb mognad och elektrofysiologisk registrering av 2D hiPSC-CM-monolager i screenplattor med hög genomströmning (96-brunnsplattor). Snabb mognad med en MECM (7 dagar) som visas här är ett stort framsteg jämfört med tidigare metoder som kräver mognad under 30-100 dagar22,23. Jämfört med andra ECM, som kräver manuell applicering för varje experiment, är MECM-plattorna förbelagda med ECM och anländer till laboratoriet redo att användas. Denna aspekt av MECM gör det lättare att använda, mindre variabelt och effektivare än att använda andra ECM-beläggningar. Viktigt är att detta tillvägagångssätt kan användas för både kryokonserverade, kommersiellt tillgängliga hiPSC-CM och "hemlagade" hiPSC-CM, som kan vara kammarspecifika. På grund av den distinkta, stavformade strukturen hos mogna hiPSC-CM (figur 1 och figur 2) är det viktigt att påpeka att ett större antal celler krävs för konfluent monolagerbildning här, jämfört med protokoll som använder andra ECM. I synnerhet, när vi använder mus ECM (celler har en kontinuerligt spridande pannkakafenotyp), plåtar vi 50 000 hiPSC-CM per brunn, men när vi använder MECM plåtar vi 75 000 hiPSC-CM per brunn. Antalet CM per brunn kan också minskas om cellerna ska användas för encellsanalys, till exempel patchklämma eller någon annan avbildningsteknik som kräver enstaka celler.
Kommersiellt tillgängliga hiPSC-CMs erbjuder fördelar för regulatorisk vetenskap på grund av den omfattande karakteriseringen av dessa celler av Food and Drug Administration (FDA) -ledda internationella insatser. De kommersiellt tillgängliga cellerna är emellertid en blandning av nodal, förmak och ventrikulär hiPSC-CM, som ger mycket relevant toxicitetsinformation men saknar de kammarspecifika egenskaper som efterliknar det mänskliga hjärtat. Kammarspecifika hiPSC-CMs återskapar de välkända elektrofysiologiska skillnaderna mellan förmaks- och ventrikulära kardiomyocyter och ger en in vitro-analys för utveckling av kammarspecifika antiarytmiska terapier (figur 3B-D). Till exempel kan förmaksflimmerspecifika läkemedel nu testas och utvecklas med hiPSC-ACM-monolager pläterade i 96-brunnsplattor för robust och rigorös datainsamling. På samma sätt, vid screening för att avgöra om en förening orsakar Torsades de Pointes (TdP), en högrisk ventrikulär arytmi-, är det optimalt att inte ha förmaks- och nodala celler som "förorenar" ventrikulära hjärtmonolager. Därför, även om de FDA-ledda hiPSC-CM-valideringsinsatserna hittills har fokuserat på att använda kommersiellt tillgängliga CM, är det troligt att framtida regulatoriska vetenskapliga rekommendationer kommer att vända sig till användningen av kammarspecifika celler för att göra toxicitetsscreeningen ännu mer förutsägbar för det mänskliga hjärttillståndet. De metoder som beskrivs här bygger på tidigare rapporter och ger en robust metod för generering av kammarspecifika kardiomyocyter härledda från pluripotenta stamceller21.
En stor skillnad mellan dessa protokoll och de som vanligtvis används i fältet är reningsmetoden som används. Majoriteten av laboratorier som genererar hiPSC-CM i sina egna laboratorier förlitar sig på metaboliskt medierat urval av kardiomyocyter22. Här förlitar vi oss på att använda MACS för att rena hiPSC-CM, med hjälp av en kliniskt godkänd cellbehandlingsmetod som producerar CM med hälsosammare fenotyper23. Den metaboliska utmaningsmetoden är effektiv, men använder en medieformulering som simulerar myokardischemi24. Vid användning av MACS-rening av hiPSC-CMs är det viktigt att använda icke-CM-utarmningscocktailen, som riktar sig till icke-CM för magnetisk utarmning från cellpopulationen. Användning av icke-CM-utarmningsmetoden minimerar skjuvspänningen som CM: erna upplever i magnetkolonnen och föredras framför direkt magnetisk märkning av CM-populationen. Genom att använda MACS-rening av kammarspecifika celler kan andra laboratorier generera friska CM för forskning och toxicitetstestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TJH är konsult och vetenskaplig rådgivare till StemBioSys, Inc. TB är anställd av StemBioSys, Inc. AMR och JC är tidigare konsulter till StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR och JC är aktieägare i StemBioSys, Inc.
Acknowledgments
Detta arbete har fått stöd av NIH-bidrag HL148068-04 och R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
