Проектирование биореактора для улучшения сбора данных и моделирования пропускной способности инженерных тканей сердца

Summary

Трехмерные сердечные ткани, биоинженерные с использованием кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, стали многообещающими моделями для изучения здорового и больного миокарда человека in vitro , повторяя ключевые аспекты нативной сердечной ниши. В данной статье описывается протокол изготовления и анализа высокосодержательных инженерных тканей сердца, полученных из индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека.

Abstract

Сердечная недостаточность остается основной причиной смерти во всем мире, что создает острую потребность в более совершенных доклинических моделях человеческого сердца. Тканевая инженерия имеет решающее значение для фундаментальных научных исследований в области сердца; Культура клеток человека in vitro устраняет межвидовые различия животных моделей, в то время как более тканеподобная 3D-среда (например, с внеклеточным матриксом и гетероцеллюлярным сопряжением) моделирует условия in vivo в большей степени, чем традиционная двумерная культура на пластиковых чашках Петри. Однако для каждой модельной системы требуется специализированное оборудование, например, специально разработанные биореакторы и устройства функциональной оценки. Кроме того, эти протоколы часто являются сложными, трудоемкими и страдают от отказа маленьких, нежных тканей.

В данной работе описывается процесс создания надежной системы моделирования инженерной ткани сердца человека (hECT) с использованием индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, для лонгитюдного измерения функции тканей. Шесть hECT с линейной геометрией полосы культивируются параллельно, при этом каждый hECT подвешивается к паре чувствительных к силе стойкам из полидиметилсилоксана (PDMS), прикрепленных к стойкам PDMS. Каждый пост увенчан черным трекером стабильных постов PDMS (SPoT), новой функцией, которая повышает простоту использования, пропускную способность, удержание тканей и качество данных. Форма позволяет надежно оптически отслеживать прогибы столбов, обеспечивая улучшенную трассировку силы подергивания с абсолютным активным и пассивным натяжением. Геометрия колпачка исключает разрушение тканей из-за соскальзывания hECT со стоек, а поскольку они включают в себя второй этап после изготовления стойки PDMS, SPoT могут быть добавлены к существующим конструкциям на основе стоек PDMS без существенных изменений в процессе изготовления биореактора.

Система используется для демонстрации важности измерения функции hECT при физиологических температурах и показывает стабильную функцию тканей во время сбора данных. Таким образом, мы описываем современную модельную систему, которая воспроизводит ключевые физиологические условия для повышения биоточности, эффективности и строгости инженерных сердечных тканей для применения in vitro .

Introduction

Инженерные модели сердечной ткани имеют различную геометрию и конфигурацию для повторения различных аспектов нативной сердечной ниши, которые трудно получить с помощью традиционной двумерной клеточной культуры. Одной из наиболее распространенных конфигураций является линейная тканевая полоса с гибкими анкерами на каждом конце^, чтобы вызвать самосборку ткани и обеспечить ткани определенный предварительный натяг и считывание результирующих сил подергивания 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Создаваемая сила может быть надежно определена с помощью оптического отслеживания укорочения ткани и использования теории упругих пучков для расчета силы на основе измеренных прогибов и постоянной пружины анкеров 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Тем не менее, инженерия сердечных тканей все еще является развивающейся областью, и некоторые проблемы остаются. Для каждой модели системы 10,29,30,31 требуется специализированное оборудование, такое как биореакторы, изготовленные по индивидуальному заказу и устройства функциональной оценки. Размер и сложность микроокружения этих конструкций часто ограничены низкой пропускной способностью из-за трудоемких протоколов, большого количества клеток и хрупкости тканей. Чтобы решить эту проблему, некоторые группы обратились к изготовлению микротканей, содержащих только сотни или тысячи клеток, чтобы облегчить высокопроизводительные анализы, которые полезны для разработки лекарств. Однако эта уменьшенная шкала усложняет точную оценку функции¹², устраняет ключевые аспекты нативной сердечной ниши (такие как градиенты диффузии питательных веществ/кислорода и сложная архитектура³⁶) и ограничивает количество материала, доступного для последующего молекулярного и структурного анализа (часто требующего объединения тканей). В таблице 1 обобщены некоторые конфигурации линейных моделей тканевых полос в литературе 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Группа		Количество клеток в ткани	Количество салфеток в пластине	Формат пластины		Функция привязки		Функциональный метод сбора данных		Общая медиа-ванна?	Функциональная мера- В то же время, если вы не знаете, как это сделать, вы можете
Йошида (ECT)38		4 миллиона	6	модифицированная 6-луночная пластина*		Преобразователь силы		Прямое измерение силы		Нет	Нет
Чан (чЭСК-КМ-ЭСТ)26		310 К	6	Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками		Посты PDMS		Прямое измерение силы		да	Нет
Файнберг (dyn-EHT)16		1,5 млн чел.	6	Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками		Провод PDMS		Форма ткани		Нет	да
РАДИСИК (BioWire)39, 40		110 К	8			полимерная проволока		Форма проволоки		да	да
Коста (однократная чЭСТ)1, 2		1-2млн	4**	Чашка Петри 10 см**		Посты PDMS		Оптическое отклонение (слежение за краем/объектом)		да	да
Коста (мульти-чЭСТ)3–9		500 К-1 миллион	6	Чашка Петри 6 см		Посты PDMS		Оптическое отклонение (слежение за краем/объектом)		да	да
Коста (мульти-ЭСТ с СПоТ)		1 миллион	6	Чашка Петри 6 см		Столбы PDMS с черными шапками		оптическое отклонение (слежение за объектом)		да	да
Passier (EHT)17		245 К	36	12-луночная пластина		Столбы PDMS с черными шапками		оптическое отклонение (слежение за объектом)		да	да
Вуньяк-Новакович13, 18		1 миллион	12	Чашка Петри 6 см		Столбы PDMS с заглушками		оптическое отклонение (обнаружение края)		да	да
Вуньяк-Новакович (MilliPillar)14		550 К	6	Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками		Столбы PDMS с заглушками		оптическое отклонение (слежение за объектом); Визуализация кальция		Нет	да
Эшенхаген (EHT)10, 19–21		1 миллион	12	12-луночная пластина		Столбы PDMS с заглушками		оптическое отклонение (определение края постпрогиба); Визуализация кальция		Нет	да
Зандстра (CaMiRi)22		25-150 К	96	96-луночная пластина		Посты PDMS с хуками		оптическое отклонение (обнаружение края)		Нет	да
Марри23, 24		900 К	24	24-луночный планшет		Стойки PDMS с заглушками, встроенный магнит		Магнитный датчик		Нет	да
Рейх (мкТУГ)11, 12, 25		неопределенный	156	Блюдо на 156 лунок		Стойки PDMS с заглушками, встроенный магнит		оптическое слежение (флуоресцентный шарик)		да	да

Таблица 1: Характеристики некоторых линейно-инженерных моделей сердечной ткани в литературе. Линейно-инженерные модели сердечной ткани различаются по размеру, пропускной способности, конструкции элементов закрепления и облегчению использования ванн с общей средой, а также по требованиям к отдельной системе мышечных ванн для функциональной характеристики. * Исследователи использовали коммерчески доступную инженерную тканевую систему, основанную на размерах стандартной 6-луночной пластины. ** Модульная система, в которой однотканевые биореакторы крепятся к любой пластиковой чашке для культур в нужном количестве и месте.

В этой статье описывается новейший протокол для создания нашей установленной модели линейной инженерной сердечной ткани человека (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 методы оценки сократительной функции hECT. Каждый многотканевой биореактор вмещает до шести hECT в общей ванне среды и состоит из двух «стоек» из силиконового эластомера полидиметилсилоксана (PDMS), установленного на жесткой раме из полисульфона. Каждая стойка PDMS содержит шесть гибких интегрированных стоек с датчиком силы диаметром 0,5 мм и длиной 3,25 мм, а вместе две стойки обеспечивают шесть пар стоек, каждая из которых вмещает один hECT. Инверсия биореактора помогает преодолеть любые препятствия для визуализации hECT снизу из-за конденсации воды из питательной среды или искажений от мениска границы раздела воздух-жидкость. Каждое сжатие hECT вызывает отклонение встроенных концевых стоек, и оптическое измерение сигнала отклонения обрабатывается в трассировку зависимости силы от времени, представляющую сократительную функцию hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . По сравнению с однотканевыми биореакторами, обычно используемыми для тканей такого размера, многотканевая конструкция повышает производительность эксперимента и позволяет изучать паракринную передачу сигналов между соседними тканями потенциально различного клеточного состава. Эта система была подтверждена в опубликованных исследованиях, описывающих применение в моделировании заболеваний ^4,8, паракринной сигнализации ^6,7, гетероклеточной культуре ^5,9 и терапевтическом скрининге ^7,9.

В этой системе hECT имеют длину около 6 мм и диаметр 0,5 мм, что обеспечивает надежное оптическое отслеживание измерений силы с низким уровнем шума. Кроме того, аспекты сложности тканей, такие как градиенты диффузии и клеточная организация, уравновешиваются управляемой потребностью в 1 миллион клеток на ткань. При использовании стандартной технологии ПЗС-камеры силы до 1 мкН (что соответствует менее 5 мкм после отклонения) генерируют четкий сигнал, гарантируя, что даже очень слабая сократительная функция, наблюдаемая в некоторых моделях заболевания hECT, может быть точно измерена. Это также облегчает детальный анализ кривой силы подергивания, что позволяет проводить анализ с высоким содержанием до 16 показателей сократимости⁴¹, включая развиваемую силу, скорости сокращения (+dF/dt) и расслабления (−dF/dt), а также вариабельность частоты биений.

Этот протокол начинается с инструкций по изготовлению компонентов биореактора. Особое внимание уделяется шагам по максимизации выхода hECT, снижению технической вариабельности функции тканей и оптимизации качества и глубины оценки тканей. В большинстве исследований в области инженерии сердечной ткани не сообщается о темпах потери тканей во время изготовления и долгосрочного тестирования, хотя это хорошо известная проблема в этой области и снижает пропускную способность и^{эффективность исследований.} Методы тканевой инженерии, описанные здесь, совершенствовались на протяжении многих лет, чтобы обеспечить удержание всех hECT в большинстве биореакторов (независимо от того, как изготовлены стойки PDMS). Тем не менее, даже потеря 5-20% тканей может существенно повлиять на статистическую мощность, особенно в небольших экспериментах, ограниченных количеством доступных кардиомиоцитов (например, из-за проблем с дифференцировкой с некоторыми больными клеточными^{линиями} или из-за высокой стоимости коммерчески закупаемых кардиомиоцитов) или условиями лечения (например, ограниченная доступность или высокая стоимость различных лекарственных препаратов).

В этом протоколе описывается изготовление стабильных пост-трекеров (SPoT), новой функции стоек PDMS, которые функционируют как колпачки на концах постов с датчиком силы, на которых размещаются hECT²⁷. Показано, как геометрия колпачка значительно снижает потери hECT при падении или отрыве от стоек, тем самым открывая новые возможности для культивирования hECT с большим разнообразием жесткостей и напряжений, которые сложно культивировать на незакрытых стойках. Кроме того, SPoT обеспечивают высококонтрастный объект для улучшения оптического отслеживания сокращения hECT за счет последовательной и четко определенной формы²⁷. Далее следует описание культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) и дифференцировки кардиомиоцитов на основе ранее опубликованных протоколов ^3,42,43, а также объяснение производства, культивирования и функциональных измерений hECT.

В этой статье также рассматривается необходимость измерения функции тканей при физиологической температуре. В миокарде человека (как плода, так и взрослых здоровых и больных тканей), а также в сердечной ткани широкого спектра видов животных (включая крыс, кошек, мышей, хорьков и кроликов)^44,45 наблюдается заметное увеличение частотно-согласованной силы подергивания при температурах 28–32 °C по сравнению с физиологической температурой — явление, известное как гипотермическая инотропия^{45, 46}. См. Тем не менее, влияние температуры на функцию искусственной ткани миокарда остается недостаточно изученным. Многие современные модели сердечной ткани, представленные в литературе, предназначены для функциональной оценки при 37 °C, чтобы приблизиться к физиологическим условиям 13,14,37. Однако, насколько нам известно, температурно-зависимое влияние на силу, генерируемую инженерными тканями сердца, систематически не исследовалось. В этом протоколе описывается конструкция электрода с движущейся частотой, которая сводит к минимуму потери тепла во время испытаний, а также позволяет включить изолированный нагревательный элемент в установку для функциональных измерений, который может поддерживать hECT при физиологической температуре без ущерба для стерильности²⁷. Затем мы сообщаем о некоторых наблюдаемых эффектах температуры на функцию hECT, в том числе на развиваемую силу, частоту спонтанного биения, +dF/dt и −dF/dt. В целом, в этой статье представлены детали, необходимые для производства этой многотканевой силочувствительной биореакторной системы для изготовления инженерных тканей сердца человека и оценки их сократительной функции, а также представлен набор данных, обеспечивающих основу для сравнения измерений при комнатной температуре и при 37 °C²⁷.

Protocol

В этом протоколе использовалась обезличенная линия ИПСК SkiPS 31.3 (первоначально перепрограммированная с использованием дермальных фибробластов здорового 45-летнего мужчины)⁴⁷ и, таким образом, он был освобожден от специального одобрения Институционального наблюдательного совета, в соответствии с руководящими принципами комитета по этике исследований на людях. Выполняйте все манипуляции с клетками и hECT в асептических условиях в шкафу биологической безопасности класса II с фильтрацией HEPA или на рабочем столе с ламинарным потоком. Стерилизуйте все нестерильные растворы путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм и поддерживайте все клетки и hECT в инкубаторе при температуре 37 °C, относительной влажности 95% и 5%_CO2.

1. Изготовление биореактора

1. Компоненты биореакторов и изготовление алюминиевых отливок
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы систем автоматизированного проектирования (САПР) приведены в Дополнительном файле 1. Протокол может быть приостановлен в любом месте между этими шагами. Рекомендуется нанять профессионального механика для изготовления основных пресс-форм, описанных в этом разделе, так как для точной геометрии стойки и для правильной запрессовки рам из полисульфона к платным пластинам из политетрафторэтилена (ПТФЭ) (с целью обеспечения плотного прилегания к трению, но не слишком плотного) требуются высокие допуски (≤5 мкм) и гладкая поверхность.
   1. С помощью фрезерного станка с числовым программным управлением (ЧПУ) обработайте опорную плиту из ПТФЭ в соответствии со схемами на рисунке 1A. В шести равномерно расположенных лунках (белые стрелки) будут сформированы hECT.
   2. С помощью фрезерного станка с ЧПУ обработайте штамп из алюминия из полидиметилсилоксана (PDMS) в соответствии со схемами на рисунке 1B, с тремя опорами рамы (зеленые звездочки). Просверлите шесть равномерно расположенных отверстий (пурпурные наконечники стрел) диаметром 0,5 мм для создания стоек PDMS.
   3. С помощью фрезерного станка с ЧПУ изготовьте каркас биореактора из полисульфона в соответствии со схемами на рисунке 1C. Опоры рамы (зеленые звездочки) соответствуют опорам рамы, видимым на отливке стойки (Рисунок 1B, зеленые звездочки).
   4. С помощью фрезерного станка с ЧПУ обработайте алюминиевый литой держатель из алюминия в соответствии со схемами на рисунке 1D. Каждая прорезь содержит треугольную полку (оранжевый треугольник) высотой 0,25 мм, чтобы обеспечить мертвое пространство для протекания PDMS через отверстия в отливках стойки PDMS (рис. 1B, пурпурные стрелки).
2. Отливка стойки ПДМС из алюминиевых негативных мастеров
   1. С помощью 3D-принтера для моделирования методом наплавления термопластов напечатайте два кронштейна для реечного литья PDMS (Дополнительный файл 1). Используйте следующие настройки печати: высота слоя 0,1 мм, толщина стенки/дна/верха 1 мм, плотность заполнения 90% с треугольниками, температура печати 230 °C, температура рабочей формы 70 °C и края для адгезии.
   2. Поместите четыре алюминиевых отрицательных эталонных отливки в литой держатель (Рисунок 2AI) так, чтобы отверстия для стоек совпали с мертвым пространством напротив треугольных полок (см. Рисунок 1D). Оберните аппарат прямоугольным куском силиконовой пленки толщиной 0,5 мм (рис. 2Б, белые стрелки) в качестве прокладки для предотвращения утечки жидкого PDMS и зажмите его между двумя параллельными кронштейнами, напечатанными на 3D-принтере, с помощью винтового зажима.
   3. Добавьте 0,5 мл отвердителя PDMS к 5 мл эластомерной основы PDMS (соотношение 1:10, в соответствии с инструкциями производителя) в неглубоком контейнере и энергично перемешивайте в течение 5 минут. Дегазируют смесь PDMS в вакуумной камере и применяют сильный вакуум (0,1-1 кПа) в течение 20-60 минут при комнатной температуре или до исчезновения пузырьков.
   4. Залейте смесь PDMS на литейный аппарат, переполняя, чтобы обеспечить полное покрытие каждой щели (Рисунок 2AII). При необходимости добавьте маленькие цветные стеклянные шарики на корпус стоек PDMS (Рисунок 2AII), противоположный стороне со стойками (Рисунок 2B), для уникальной идентификации каждой стойки PDMS. Верните литейный аппарат в вакуумную камеру (убедившись, что он горизонтально выровнен) и создайте сильный вакуум не менее чем на 12 часов. Дайте PDMS отверждаться при комнатной температуре в течение примерно 48 часов вдали от пыли, чтобы обеспечить полное отверждение и максимальную прочность деликатных штифтов. Избегайте использования духового шкафа, так как это деформирует компоненты, напечатанные на 3D-принтере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
3. Снятие стойки PDMS с алюминиевых отрицательных мастер-отливок
   1. Снимите зажим, кронштейны и силиконовую пленку с литейного аппарата. С помощью бритвенного лезвия из нержавеющей стали обрежьте пленку PDMS поверх литейного аппарата и опор рамы и осторожно пальцами отделите стойки PDMS от боковых сторон литого держателя. Вставьте затупленное лезвие бритвы из нержавеющей стали в мертвое пространство между гипсом и литым держателем и подденьте их (рис. 2CI, II), убедившись, что PDMS, заполняющий мертвое пространство, остается с литым держателем (так как он прикреплен к стойкам). Острым лезвием из нержавеющей стали отрежьте оставшиеся пленки PDMS и срежьте PDMS с кончиков стоек с мертвым пространством (рис. 2C III-V).
   2. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Освободите стойку PDMS от слепка (рис. 2D). Начиная со стороны, противоположной стойкам, пальцами медленно отделяйте стойку PDMS от гипса, работая с поочередными сторонами, пока стойки не освободятся от мастер-забросов.
   3. Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока не будут освобождены все стойки PDMS и все столбы. Используйте острое бритвенное лезвие, чтобы удалить оставшиеся излишки PDMS со стоек. В результате получилась стойка PDMS (рис. 2E) с шестью неповрежденными стойками (оранжевые наконечники стрелок) и цветными бусинами (синяя стрелка) для идентификации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
4. Изготовление стабильного трекера постов (SPoT)
   1. С помощью 3D-принтера для моделирования методом наплавления термопластов распечатайте компоненты литейного аппарата SPoT (Дополнительный файл 2 и Рисунок 3AI, II). Используйте следующие настройки печати: высота слоя 0,1 мм, толщина стенки/дна/верха 1 мм, плотность заполнения 80% с треугольниками, температура печати 230 °C, температура рабочей пластины 70 °C и край для адгезии.
   2. Обеспечьте надежную посадку между напечатанными на 3D-принтере деталями, а также между стойками PDMS и трехзубым зажимом, и убедитесь, что стойки PDMS плотно прилегают к стойкам, достигающим дна колодцев, не сгибаясь. При необходимости обрежьте/подпилите пластик.
   3. Добавьте 0,5 мл черного PDMS часть A к 0,5 мл части B (соотношение 1:1, в соответствии с инструкциями производителя) в небольшую весовую лодку (или аналогичную маленькую неглубокую емкость) и тщательно перемешайте до однородного цвета. Дегазируют смешанную черную ПДМС в вакуумной камере под сильным вакуумом в течение 20 мин. Вылейте дегазированный черный PDMS на 3D-печатную основу, чтобы заполнить отверстия, и постучите, чтобы убедиться, что не осталось пузырьков. Соскребите как можно больше лишних PDMS с основания.
   4. Защелкните трехзубую деталь на основании и поместите стойки PDMS в пазы на трехзубом приспособлении (рис. 3AII, бирюзовый прямоугольник), убедившись, что концы стоек погружаются в черные PDMS в круглых лунках (рис. 3B, C). Высушить черный PDMS при комнатной температуре и в защищенном от пыли месте в течение 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
   5. Выдвиньте трехзубчатую деталь, минимизировав натяжение на стойках. Используйте маленькие щипцы, чтобы соскрести тонкую пленку черного PDMS, которая окружает каждый SPoT; затем вставьте изогнутые щипцы с тонким наконечником в углубление SPoT, чтобы освободить его от основы, напечатанной на 3D-принтере (рис. 3D).
   6. Осмотрите SPoT (Рисунок 3E) и обрежьте всю оставшуюся черную пленку PDMS в процессе литья, не удаленную на шаге 1.4.5, с помощью тонких ножниц Vannas. Убедитесь, что готовые стойки имеют правильную длину, установив стойки PDMS на раму из полисульфона, а затем надвиньте ее на черную опорную плиту (Рисунок 4A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
   7. Выполните сопряжение стоек PDMS и добавьте их в раму с помощью выступов рамы (рис. 4A) . Автоклав в пакете с опорной плитой из ПТФЭ в течение не менее 30 минут цикла (<122 °C для уменьшения коробления).

Рисунок 1: Компоненты биореактора hECT. (A) Вид сверху (слева) и сбоку (справа) опорной плиты из ПТФЭ с шестью равномерно расположенными лунками для формирования hECT (белые стрелки). (B) Вид сбоку (слева) и вид сверху (справа) алюминиевых отрицательных мастер-литей для стоек PDMS с шестью равномерно расположенными стойками (пурпурные наконечники стрел) и тремя зазорами для крепления к раме биореактора (зеленые звездочки). (C) Вид сбоку (слева) и снизу (справа) рамок из полисульфона для стоек PDMS с тремя равномерно расположенными опорами рамы (зеленые звездочки), соответствующими опорам рамы в стойке PDMS cast (панель B). (D) Вид сверху (сверху) и сбоку (снизу) алюминиевого литого держателя с четырьмя слотами для стоечных отливок PDMS, каждый из которых имеет треугольную полку высотой 0,25 мм (крайняя левая полка выделена оранжевым цветом). Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: hECT = инженерная сердечная ткань человека; Ø = диаметр; ПТФЭ = политетрафторэтилен; ПДМС = полидиметилсилоксан; R = радиус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Изготовление стоек PDMS. (A) Визуализации САПР показывают наклонный вид литейного аппарата. (I) В каждый из четырех пазов литого держателя вставляется отрицательное эталонное литье стойки PDMS с отверстиями, образующими стойки PDMS (пурпурные наконечники стрелок), расположенными над мертвым пространством напротив треугольной полки (рис. 1D, оранжевый треугольник). (II) PDMS заливается в каждую полость отрицательной основной отливки. (III) Цветные шарики добавляются к неотвержденной PDMS в виде системы идентификации с цветовой кодировкой. (B) Фотография, показывающая собранный реечный литейный аппарат PDMS, который зажимается с обеих сторон двумя кронштейнами, напечатанными на 3D-принтере, удерживаемыми на месте винтовым зажимом и обернутыми силиконовой пленкой толщиной 0,5 мм (белые стрелки) для герметизации зажимных сторон. Цветные бусины размещаются так, чтобы они не закрывали отверстия диаметром 0,5 мм, образующие столбы (пурпурные наконечники стрел). (C) После отверждения PDMS гипс извлекается из гипсового держателя. (I) Затупленное бритвенное лезвие из нержавеющей стали или аналогичный тонкий металлический инструмент вставляется между гипсом и литым держателем, чтобы поддеть гипс из литого держателя (II). (III) Пленка (бирюзовые скобки), образованная PDMS, протекающей через отверстия стоек, прикреплена к кончикам стоек и должна быть срезана острым лезвием (IV, V). (D) Стойка PDMS отделена от отливки. (E) Фотографии, показывающие наклонный (сверху), сбоку (посередине) и снизу (снизу) виды стойки PDMS со стеклянной бусиной, встроенной в корпус для идентификации (синяя стрелка). Кончики столбов (оранжевые наконечники стрелок) помечены черными чернилами. Масштабная линейка = 1 см. Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: САПР = системы автоматизированного проектирования; ПДМС = полидиметилсилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изготовление SPoT. (A) Визуализация САПР с указанием основных размеров (I) основания и (II) трехзубой части литейного приспособления SPoT. Размеры круглых форм SPoT (AI, черные стрелки) задаются как 0,2 мм в глубину и 1,2 мм в диаметре, и каждая из них содержит черные PDMS для отдельного SPoT. Полка размером 11,1 мм x 27 мм, видимая на виде сверху (AII, сверху, бирюзовый прямоугольник), нажата на 0,4 мм (как видно на виде сбоку ниже), чтобы удерживать стойку PDMS на месте во время отверждения. (B) Визуализация в САПР, показывающая сборку литейного аппарата SPoT. (C) Фотография собранного литейного аппарата SPoT. (D) После отверждения PDMS трехзубый зажим выдвигается из-под стоек PDMS, и SPoT освобождаются от своих лунок с помощью тонких щипцов. (E) Фотографии стойки PDMS без (вверху) и с (внизу) SPoT. На врезках показаны увеличенные виды записей. Масштабные линейки = 1 см (E), 2,5 см (увеличенные изображения в E). Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: САПР = системы автоматизированного проектирования; Ø = диаметр; ПДМС = полидиметилсилоксан; R = радиус; SPoT = стабильный трекер постов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Клеточная культура

1. Культивирование ИПСК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных клеточных линий может потребоваться корректировка разбавления пассажа и частоты и/или титрования добавок среды.
   1. Обмажьте обработанную клеточной культурой 6-луночную планшет сертифицированной матрицей базальной мембраны (разбавленной в соотношении 1:1 Dulbecco Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12] в соответствии с инструкциями производителя) и инкубируйте планшет при 37 °C не менее 30 минут. Приготовьте 500 мл питательной среды для ИПСК в соответствии с инструкциями производителя и добавьте 5 мл раствора пенициллин-стрептомицина (от 10 000 МЕ/мл до 10 000 мкг/мл).
   2. Для прохождения ИПСК необходимо аспирировать среду из лунок и промыть каждую лунку 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Добавьте 1 мл раствора для диссоциации ИПСК на лунку и инкубируйте в ламинарном колпаке в течение 1 мин.
   3. Отсасывайте раствор для диссоциации ИПСК и инкубируйте клетки при 37 °C (без какой-либо среды) в течение 5 мин. Добавьте 1 мл 2 мкМ тиазовивина в среду ИПСК для нейтрализации раствора диссоциации ИПСК.
   4. Используйте серологическую пипетку объемом 2 мл, чтобы диссоциировать колонии на скопления примерно по 10 клеток, и промыть каждую лунку дополнительным 1 мл тиазовивина 2 мкМ в среде ИПСК. Добавьте 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку планшета, покрытого матрицей базальной мембраны (шаг 2.1.1).
   5. Через 24 ч удалите среду и добавьте свежую среду для ИПСК (без тиазовивина). Каждые 48 ч подавайте ИПСК 2 мл среды ИПСК или каждые 72 ч 4 мл среды. Перекладывайте клетки в разведении 1:6 для пропускания каждые 3 дня или когда они достигнут 80% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных клеточных линий может потребоваться регулировка частоты разведения и пассажа.
2. Дифференцировка кардиомиоцитов
   1. Начинайте дифференцировку, когда монослои ИПСК сливаются на 80%-90%.
   2. Приготовьте дифференцировочную среду, добавив 10 мл добавки B27 без инсулина и 5 мл исходного раствора пенициллина-стрептомицина к 500 мл среды Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI). Приготовьте питательную среду для кардиомиоцитов, добавив 10 мл добавки B27 и 5 мл исходного раствора пенициллина-стрептомицина к 500 мл RPMI 1640.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцировочную среду и среду для поддержания кардиомиоцитов можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
   3. День 0: Промывают клетки 1 мл DMEM/F12 и добавляют 2 мл 10 мкМ CHIR99021 и разбавленный матрицу базальной мембраны в дифференцировочную среду.
   4. День 1: Через 24 ч или когда слияние клеток уменьшится до уровня ниже 70%, промойте клетки 1 мл DMEM/F12, добавьте 2 мл дифференцировочной среды и инкубируйте в течение 48 ч.
   5. Дни 3-4: Промывают клетки 1 мл DMEM/F12 и добавляют 2 мл 5 мкМ IWR-1 в дифференцировочную среду. Повторите на 4-й день.
   6. Дни 5-6: Промыть клетки 1 мл DMEM/F12 и добавить 2 мл дифференцировочной среды. Повторите на 6-й день.
   7. Дни 7-10: Промывают клетки 1 мл DMEM/F12 и добавляют 2 мл поддерживающей среды кардиомиоцитов. Повторять каждые 24 часа.
   8. Дни 11+: Заменяйте среду 4 мл свежей поддерживающей среды кардиомиоцитов каждые 48-72 ч. Медленно аспирируйте и пипетку, чтобы не повредить энергично взбивающиеся монослои.

3. Культура hECT

1. Забор кардиомиоцитов
   1. Собирают монослои кардиомиоцитов для использования в производстве hECT через 8-60 дней после индукции дифференцировки. Ожидайте 2-5 миллионов клеток на скважину.
      Примечание: Если клетки не начали биться к 10-му дню, дифференцировка вряд ли будет успешной. Энергично бьющиеся монослои часто отделяются через 11-15 дней в дифференцировку и уплотняются в плотные ткани. Рекомендуется использовать или перекладывать такие ячейки в это время.
   2. Промыть каждую лунку кардиомиоцитов 2 раза 2 мл PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА комнатной температуры. Инкубируйте при температуре 37 °C в течение 5-10 минут до тех пор, пока клетки не станут округлыми и не отделятся легким постукиванием по планшету.
   3. Добавьте 1 мл 10% FBS в поддерживающую среду кардиомиоцитов в каждую лунку, чтобы нейтрализовать диссоциацию. Осторожно пропипетируйте монослои с помощью серологического наконечника для дозатора объемом 5 мл и переложите в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы разбить гранулы на комки по 10-20 клеток.
   4. Перемешайте клеточную суспензию, перевернув коническую трубку, перед переносом 10 мкл клеток в 10 мкл трипанового синего. Подсчитайте количество клеток с помощью автоматического счетчика клеток или стеклянного гемоцитометра. Отделите клеточную суспензию соответствующим образом, если не все клетки будут использованы или если некоторые клетки отведены для проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе могут быть добавлены дополнительные клетки (например, фибробласты).
   5. Центрифугируют клетки при 250 × г в течение 5 мин. Немедленно отсосите как можно больше надосадочной жидкости, не повредив клеточную гранулу, и держите на льду. Работайте быстро, чтобы свести к минимуму время, которое клетки проводят в гранулах.
2. Изготовление hECT
   1. Используйте объемы, указанные в таблице 2, и отрегулируйте их в соответствии с количеством клеток в грануле так, чтобы каждая hECT содержала 1 миллион клеток. После каждого этапа медленно перемешивайте пипеткой, чтобы избежать пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 3.2.2-3.2.3 в защищенном от прямого света месте, так как некоторые компоненты чувствительны к свету.
   2. Приготовьте раствор коллагена 1-го типа 2,9 г/мл в микропробирке объемом 1,7 мл, добавив 13,442 мкл дистиллированной воды, 4,4 мкл 10-кратного PBS и 0,638 мкл 1М NaOH. Добавьте 25,52 мкл бульонного раствора коллагена 5 мг/мл и медленно перемешайте.
   3. Приготовьте смесь для внеклеточного матрикса (смесь ECM из таблицы 2): добавьте 5,5 мкл 0,2 Н раствора pH 9 HEPES, а затем 5,5 мкл 10x MEM. Тщательно перемешайте до однородного светло-желтого или светло-розового цвета. Перенесите 35,2 мкл раствора смеси ECM в клеточную гранулу и добавьте 4,4 мкл матрицы базальной мембраны.
   4. Откройте автоклавный мешок с деталями биореактора (шаг 1.4.7, рисунок 4A). Надев перчатки, стерилизованные 70% этанолом, извлеките черную опорную пластину из пакета для автоклава и поместите в 60-миллиметровую посуду лунками вверх. Медленно закапывайте пипетку 44 мкл клеточной смеси в каждую лунку, чтобы избежать появления пузырьков. При необходимости используйте пипетку для удаления пузырьков, которые были введены при пипетировании или образовались из-за гидрофобности ПТФЭ. Восстановите объем hECT таким образом, чтобы поверхность жидкости была на одном уровне с кромкой лунки (рис. 4BI).
   5. Наденьте свежую пару стерилизованных перчаток и извлеките из автоклавного мешка рамку из полисульфона со стойками PDMS. Опустите раму на опорную плиту так, чтобы концы рамы вошли в пазы на концах опорной плиты (рисунок 4BII, III). Перед помещением в тарелку диаметром 60 мм осмотрите биореактор, чтобы убедиться, что все стойки прямые, а рама не наклонена.
   6. Добавьте 1 мл 10% FBS в поддерживающую среду кардиомиоцитов в чашку диаметром 60 мм (будьте осторожны, чтобы не потревожить hECT), чтобы увеличить влажность в чашке по мере затвердевания hECT. Поместите чашку диаметром 60 мм без крышки в высокопрофильную (высотой 20 мм) чашку диаметром 100 мм, накройте крышкой 100 мм и верните биореактор в инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 , чтобы коллаген мог образовать гель с клетками во взвешенном состоянии.
   7. Через 2 ч достаньте посуду из инкубатора. Добавьте 13 мл 10% FBS в поддерживающую среду для кардиомиоцитов, наклоняя чашку, чтобы среда протекала между опорной пластиной из ПТФЭ и стойками PDMS.
   8. Осмотрите биореактор сбоку, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха между гидрофобными поверхностями опорной плиты из ПТФЭ и стойками PDMS, и верните чашку в инкубатор. Если в нем застрял воздух, наклоните биореактор из среды, чтобы пузырь лопнул, и медленно опустите его снова, или используйте микропипетку с наконечником для загрузки геля, чтобы откачать воздух, стараясь не потревожить штифты.
3. Демонтаж опорной плиты
   1. Проверьте уплотнение hECT через зазор в раме. В течение 24-96 ч hECT уплотняются и становятся более непрозрачными (рис. 4CI-III). Как только появится видимый зазор между hECT и стенкой опорной пластины (рис. 4CII), выполните две замены среды половинного объема, чтобы заменить среду на поддерживающую среду кардиомиоцитов без FBS. Снимите опорную плиту, когда hECT будут уплотнены не менее чем на 30% по сравнению с исходным диаметром (Рисунок 4CIII). Наполните 60-миллиметровую чашку, содержащую биореактор, средой для поддержания кардиомиоцитов до тех пор, пока жидкость не окажется вровень с краем чашки, и добавьте 14 мл в новую 60-миллиметровую чашку.
   2. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Надев стерильные перчатки, переверните биореактор в чашке так, чтобы опорная пластина оказалась сверху (рис. 4BIV). Проверьте наличие захваченных пузырьков воздуха, как показано в шаге 3.2.8. Медленно поднимите опорную плиту, удерживая ее ровно (Рисунок 4BV).
   3. Если hECT отпадает во время снятия опорной пластины, но остается в базовой пластине, используйте стерильные изогнутые тонкие щипцы для переноса hECT с базовой пластины в чашку диаметром 60 мм. Используйте щипцы, чтобы направить конец hECT к его посту. Используйте вторую пару щипцов, чтобы удерживать штифт устойчиво, и проденьте его через отверстие в hECT. При необходимости повторите то же самое для второго поста.
   4. Прикрепив все hECT к стойкам, перенесите раму с hECT на новую тарелку диаметром 60 мм и поместите раму так, чтобы стойки были направлены вниз (рис. 4BVI). Осмотрите биореактор, чтобы убедиться, что hECT остаются на своих постах в непосредственной близости от SPoT.
   5. Если hECT был прижат поверхностным натяжением к основанию своих штифтов, стабилизируйте раму парой стерильных изогнутых щипцов. Вставьте другую пару щипцов через прорезь в рамке, держа ее закрытой. После того, как кончик щипцов будет опущен за стойки PDMS, поверните его так, чтобы он достиг стойки, и с помощью закрытых кончиков осторожно протолкните hECT к концу штифта, пока он не упрется в SPoT (рис. 4BVI, врезка).
4. Техническое обслуживание hECT
   1. Каждые 24-48 ч следует проводить смену среды с поддержанием кардиомиоцитов (после 2 недель посева частоту можно сократить до двух раз в неделю).
   2. Когда в hECT обнаруживаются кластеры спонтанного биения, как правило, к 3-му дню, и скоординированное биение с видимым отклонением после прогиба к 5-му дню, начинают функциональные измерения и повторяют их так часто, как это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ХЭСТ, которые не начали координированное биение к 7-му дню, вряд ли сделают это вообще.

Компонент			Объем (мкл)
дистиллированныйН2О			13.442			Раствор коллагена 2,9 мг/мл	"ECM mix"	окончательная смесь клеток hECT
NaOH 1N			0.638
ПБС 10х			4.4
5 мг/мл коллагенового бульона			25.52
0,2 N pH 9 HEPES			5.5
10x MEM			5.5
Объем смеси ECM для переноса в гранулы клеток			35.2
Объем Matrigel			4.4

Таблица 2: реагенты hECT. Компоненты следует добавлять в указанном порядке и держать на льду.

Рисунок 4: Сборка биореактора и изготовление hECT. (A) (I) Две стойки PDMS (слева, светло-голубые), установленные на раме из полисульфона (справа, коричневый). (II) Затем опорная плита из ПТФЭ (черная, слева) устанавливается на раму (справа) таким образом, что каждая пара стоек помещается в углубление опорной плиты. (B) (I) Сорок четыре микролитра суспензии кардиомиоцитов во внеклеточном матриксе на основе коллагена добавляют в каждую из шести лунок опорной пластины. (II,III) Рама со стойками PDMS запрессована на опорную плиту. Через 1-4 дня hECT можно снять с базовой пластины. (IV) Сначала биореактор переворачивается перед тем, как (V) опорная плита поднимается с рамы. (VI) Вид сбоку на биореактор с шестью hECT. Врезка: увеличенное изображение, показывающее положение hECT на стойках относительно SPoT (врезка). (C) Визуализация в САПР, показывающая три уровня уплотнения hECT ([I] низкий, [II] средний и [III] высокий), как видно через зазор в раме из полисульфона. Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: САПР = системы автоматизированного проектирования; ПДМС = полидиметилсилоксан; ПТФЭ = политетрафторэтилен; SPoT = стабильный трекер постов; hECT = искусственно созданная человеком сердечная ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

4. Кардиостимуляторы hECT

1. Куртка для сцены с подогревом
   1. Используйте станок для лазерной резки, чтобы вырезать компоненты акриловой изоляционной оболочки из прозрачного акрилового листа толщиной 0,635 см (дополнительный файл 3), по одному на рисунке 5A-D и по два на рисунке 5E, F.
   2. Соберите детали (B), (C), (D) и одну из частей (E) с рисунка 5 и соедините вместе с помощью акрилового клея, как показано на рисунке 5GI. Прикрепите верхнюю панель (рис. 5GII), подождите несколько часов, пока клей схватится, а затем вставьте нагретый столик в боковую часть куртки (рис. 5GIII).
   3. После того, как оболочка будет на месте, используйте ленту, чтобы закрепить вставки между ножками нагреваемого столика, и добавьте переднюю панель (Рисунок 5GIV), чтобы завершить сборку (Рисунок 5GV).
2. Изготовление графитированных электродов
   1. Графитовые прутки толщиной 6,25 мм и шириной 25 мм распиловывают ленточной пилой на блоки длиной 35 мм; Затем разрежьте каждый блок вдоль по изогнутой линии так, чтобы каждый электрод был высотой 13-16 мм с одного конца и 8-10 мм с другого конца. Просверлите два отверстия диаметром 0,7 мм в верхнем углу (рис. 6AI). Отполируйте детали бумажными полотенцами и проведите ультразвуком в воде в течение 20 минут, чтобы удалить графитовую пыль. Убедитесь, что электроды вклиниваются между стенками чашки и биореактора шириной 25 мм, чтобы обеспечить постоянное расстояние между электродами (рис. 6AII).
   2. Проденьте стальную проволоку длиной 150 мм и диаметром 0,25 мм через отверстия электродов и согните ее так, чтобы она подходила к краю чашки диаметром 60 мм и вокруг стенок чашки диаметром 100 мм так, чтобы крышка могла быть закрыта (рис. 6AII).
   3. Очистите электроды, замочив их в дистиллированной воде на 1-2 часа после каждого использования, чтобы удалить абсорбированную среду, дайте высохнуть в течение ночи, а затем автоклавируйте при 132 °C в течение 30 минут. Перед началом измерений поместите по одному электроду с каждой стороны биореактора (рис. 6AII). Расположите провода так, чтобы крышка чашки диаметром 100 мм могла быть закрыта, и верните биореактор в инкубатор для уравновешивания.

Рисунок 5: Акриловая оболочка для изоляции нагретого стеклянного столика. CAD-изображения, показывающие основные размеры деталей акриловой оболочки, предназначенной для стеклянного стола. (A) Верхняя панель имеет вырез в отверстии размером 27 см x 18,5 см, позволяющий установить тарелку биореактора на нагревательный элемент. Оранжевые прямоугольники по углам указывают на предлагаемое размещение небольших распорных элементов, чтобы обеспечить пространство между верхней частью куртки и нагревательным элементом. (B) Нижняя часть куртки имеет два выреза, позволяющих ногам сцены с подогревом скользить внутрь (зеленые звездочки). (К&Д) Две боковые панели помещаются под верхнюю часть. (D) На левой боковой панели имеется вырез (вставка) размером 3 см x 0,3 см для шнура питания сцены. (E) Длинные панели подходят спереди и сзади. (F) Вставки добавляются для заполнения пробелов после того, как стол находится внутри. (G) (I) Боковая и задняя панели крепятся к нижней части, а затем (II) добавляется верхняя панель. (III) Стеклянный стол вставляется в рубашку (пурпурные стрелки). (IV) Вставки крепятся между ножками стола, а задняя часть вставляется в отверстие, закрывающее коробку. (V) Готовая сборка куртки. Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: САПР = системы автоматизированного проектирования; R = радиус; Ø = диаметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Сбор данных о сокращении hECT. (A) (I) Фотографии электродов, вырезанных из графитовых стержней. Пурпурные стрелки обозначают отверстия для крепления проводов из нержавеющей стали. Масштабная линейка = 1 см. (II) Наклонный вид (слева) и вид сверху (справа), показывающие расположение графитированных электродов в биореакторе. Электроды занимают пространство между биореактором шириной 25 мм и стенкой чашки, чтобы обеспечить постоянное расстояние между электродами. Провода изогнуты, чтобы обеспечить закрытие крышки посуды. (B) Фотография установки кардиостимуляции hECT внутри ламинарного настольного чистого стенда - все оборудование размещено на виброизоляционном столе для снижения вибрационного шума от чистого стенда. Биореактор (пурпурный наконечник стрелы) расположен на обогреваемой сцене с рубашкой, освещенной сверху светодиодным источником света. Препарирующий микроскоп направлен горизонтально на прямоугольное зеркало (оранжевая звездочка) для обзора биореактора снизу и оснащен ПЗС-камерой (слева). Бирюзовый кронштейн указывает на водяную баню для непрерывного контроля температуры, чтобы обеспечить обратную связь с контроллером ступени с подогревом с замкнутым контуром. Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: hECT = инженерная сердечная ткань человека; Светодиод = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Функциональные измерения hECT

1. Настройка рабочего пространства для измерения темпа
   1. Включите нагретую ступень до 39,5 °C и установите кардиостимулятор на виброизоляционном столе внутри ламинарного стола для очистки потока в соответствии с рисунком 6B. Установите препарирующий микроскоп на подставку и направьте его на прямоугольное зеркало (рис. 6B, оранжевая звездочка), расположенное на лабораторном гнезде под стеклянным столом, чтобы рассмотреть биореактор снизу. Прикрепите высокоскоростную ПЗС-камеру к микроскопу и подключите к компьютеру. Облучайте установку ультрафиолетовым светом в течение 15 минут, чтобы стерилизовать рабочее место.
   2. Разместите биореактор (рис. 6B, пурпурный наконечник стрелы) на обогреваемую ступень с рубашкой, освещаемую сверху светодиодным источником света с двумя головками на гусиной шее (горловины светодиодных ламп могут быть более надежно прикреплены к основному блоку по сравнению с оптоволоконными лампами). Сведите к минимуму дополнительный шум, убедившись, что кардиостимулятор на вибростоле (и сам стол) не касается какой-либо части стола для очистки ламинарного потока.
   3. Добавьте вторую 60-миллиметровую тарелку, наполненную предварительно подогретой водой, внутри 100-миллиметровой тарелки на нагреваемый стол (рис. 6B, бирюзовый кронштейн), и оснастите датчиком температуры для непрерывного контроля температуры. При необходимости отрегулируйте температуру нагреваемой ступени для поддержания температуры эталонной чашки на уровне 36-37 °C.
   4. Установите увеличение микроскопа на 1,5x (или другое желаемое увеличение, с помощью которого можно визуализировать hECT целиком с соответствующим разрешением).
2. Настройка параметров камеры
   1. Откройте программное обеспечение камеры. Измените размер видеопотока, чтобы максимально обрезать поле зрения, но при этом визуализировать весь hECT. Это максимизирует скорость камеры.
   2. Установите частоту съемки 90 кадров в секунду. Отрегулируйте время экспозиции и положение источника света , чтобы оптимизировать однородность условий освещения по всему полю зрения и максимизировать контрастность SPoT.
3. Настройка программного обеспечения для сбора данных
   1. Включите квадратный стимулятор импульсов и подключите его к компьютеру. Отрегулируйте настройки для подачи двухфазных импульсов с амплитудой 12 В и длительностью 5 мс.
   2. Откройте программное обеспечение для сбора данных, а затем откройте файл «AutomatedPostTracking3.vi» (Дополнительный файл 4). После загрузки нажмите на белую стрелку в левой части панели инструментов, чтобы инициализировать программу (рисунок 7A).
   3. Откалибруйте программное обеспечение с помощью стеклянного гемоцитометра на нагретом столике. На панели инструментов (Рисунок 7B) щелкните инструмент «Линия », чтобы провести линию через 1 мм от маркировки гемоцитометра (не показана). В окне Калибровка расстояния (пиксели/мм) (рис. 7C) установите для параметра Опорная длина (мм) значение 1, а затем нажмите кнопку Вычислить .
   4. Измерьте площадь поперечного сечения hECT с помощью инструмента «Линия», чтобы провести линию по ширине ткани. Нажмите на 1 в поле Площадь поперечного сечения (мм^2) (Рисунок 7D), чтобы рассчитать площадь (предполагая цилиндрическую геометрию линейных полос ткани, как установлено в литературе 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,15,16,18,19,20^,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Повторите эти действия в разных частях hECT и запишите значения под двумя другими кнопками в поле. Файл таблицы выходных данных содержит среднее значение этих трех значений для вычисления диаметра ткани.
4. Функциональная характеристика hECT
   1. Убедитесь, что подсказки по публикациям находятся в фокусе. Включите переключатель пороговых значений (рис. 7E) и отрегулируйте ползунок (рис. 7F) до тех пор, пока SPoT (рис. 7G) не будут четко разграничены и не изменят форму при сокращении hECT.
   2. С помощью инструмента «Прямоугольник » нарисуйте прямоугольник вокруг одного из SpoT (рис. 7, зеленый прямоугольник) и нажмите кнопку «Установить 1 » в окне «Границы столба » (рис. 7H), чтобы задать положение прямоугольника вокруг SPoT, убедившись, что SPoT всегда остается в пределах границы прямоугольника. Повторите то же самое для другого поста и запишите его в Набор 2.
   3. Отрегулируйте параметры размера объекта (Рисунок 7I), чтобы программа не отслеживала объекты меньшего размера. Убедитесь, что количество отслеживаемых объектов в каждом прямоугольнике остается постоянным. Интерфейс (рис. 7J) показывает измеренное расстояние между отслеживаемыми объектами в режиме реального времени. Используйте этот график для мониторинга шума.
   4. Выберите каталог для сохранения файлов (рисунок 7K). Храните данные за разные дни в отдельных папках. Выберите текущий номер ткани и введите необходимые комментарии в поле Комментарии .
   5. Под заголовком Pacing Frequency (Hz) (Рисунок 7L) укажите желаемый диапазон частот (Min и Max) и желаемый интервал шага от Min до Max. Если вы измеряете темп hECT во всем диапазоне захвата, протестируйте различные частоты стимуляции, чтобы найти самую низкую частоту , на которой достигается соотношение стимул:пик 1:1 , и продолжайте увеличивать частоту до тех пор, пока это соотношение не будет потеряно. Измерьте спонтанную функцию , выбрав произвольный диапазон частот (например, от 0,01 Гц до 0,01 Гц) и отключив выход стимулятора прямоугольных импульсов.
   6. В полях справа выберите желаемое время настройки (интервал времени после того, как частота была установлена, но данные не записаны), чтобы позволить hECT приспособиться к новой частоте стимуляции. Укажите время записи (с) и напряжение (В). Запустите программу, нажав кнопку «Запустить программу » (рисунок 7M).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты автоматически сохраняются в выбранном каталоге. После каждой записи обратите внимание, что сценарий отображает преобразование Фурье данных (рис. 7N), где пики соответствуют обнаруженной частоте биений.
   7. При необходимости запустите программу «Определение порога возбуждения», чтобы найти минимальное напряжение, необходимое для стимуляции hECT (рис. 7O). При желании рассчитайте максимальный и минимальный прогибы стоек (рисунок 7П).

Рисунок 7: Интерфейс сбора данных после прогиба. (A) Кнопка запуска программного обеспечения. (B) Панель инструментов, содержащая инструменты «Линия» и «Прямоугольник» для измерения длины и выбора объекта соответственно. (C) Элементы управления калибровкой расстояния. (D) Инструменты для измерения площади поперечного сечения hECT в трех различных точках. (E) Переключатель пороговых значений и ползунок (F) для преобразования видеопотока в высококонтрастные изображения в режиме реального времени. (G) SPoT, видимый в окне предварительного просмотра. (H) Инструменты для выбора SPoT. (I) Ползунок для фильтрации объектов по размеру. (J) График, показывающий измеренное расстояние между отслеживаемыми объектами в режиме реального времени. (K) Параметры выбора каталога для сохранения выходных файлов. (L) Параметры настройки частотного диапазона, частотного интервала, времени записи и установки времени между записями для программы отслеживания постов (M). (N) Вывод графика преобразования Фурье кривой отклонения последней сохраненной записи. (O) Программа для нахождения минимального напряжения, необходимого для стимуляции hECT. (P) Программа для расчета максимальных и минимальных прогибов стоек. Сокращения: hECT = инженерная сердечная ткань человека; SPoT = стабильный трекер постов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

6. Измерения в стойке PDMS

1. Расстояния без нагрузки
   1. Перед изготовлением hECT установите нужную пару стоек PDMS на раму. Для функциональных измерений используйте настройку темпа и программное обеспечение, описанные в шаге 5.1. Выберите стационарные SPoT на концах постов.
   2. При необходимости отрегулируйте источник света и/или пороговое значение, чтобы уменьшить шум до <2 мкм. Запишите среднее динамическое значение y, указанное на графике, в электронную таблицу.
2. Высота столбов и высот hECT
   1. Из настройки темпа, описанной в шаге 5.2, снимите наклонное зеркало и столик с подогревом. Установите биореактор непосредственно на лабораторный домкрат, чтобы получить вид на биореактор сбоку.
   2. Откройте программное обеспечение камеры. Отрегулируйте время экспозиции и положение источника света , чтобы оптимизировать однородность условий освещения по всему полю зрения и максимизировать видимость постов.
   3. Откройте программное обеспечение для сбора данных, а затем откройте файл «PostMeasurement_PB3.vi» (Дополнительный файл 5). После загрузки нажмите на белую стрелку в левой части панели инструментов , чтобы инициализировать программу.
   4. Откалибруйте программное обеспечение с помощью стеклянного гемоцитометра. Нажмите на инструмент «Линия » на вертикальной панели инструментов слева от смотрового окна и проведите линию через 1 мм от маркировки гемоцитометра. В поле Калибровка расстояния (пиксели/мм) в левом нижнем углу экрана установите для параметра Опорная длина (мм) значение 1, а затем нажмите кнопку Рассчитать .
   5. Под полями калибровки задайте желаемый номер ткани (для идентификации) в поле Номер ткани . Сфокусируйте камеру на левой стойке hECT и выберите Left (Влево ) в поле Post Side (Сторона поста ).
   6. С помощью инструмента «Линия » нарисуйте линию от основания столба (вверху) до кончика SPoTs (внизу) и запишите, щелкнув по кнопке «Измерить пост Ht».
   7. Нарисуйте линию от основания столба до дальнего края hECT и запишите, нажав на Measure Tissue Top Ht. Проведите линию от основания стойки до ближайшего края hECT и запишите, щелкнув Измерить основание ткани Ht.
   8. В этот момент поверните биореактор, чтобы измерить правильную высоту столба. Выберите подходящий вариант поста , чтобы записать те же измерения. Нажмите кнопку « Добавить », чтобы заполнить электронную таблицу измеренными значениями и автоматически рассчитать среднюю высоту hECT, которая будет использоваться на шаге 7.
   9. После того, как вы закончите записывать высоту ткани, нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить значения в текстовый файл.

7. Функциональная обработка данных с помощью пользовательских скриптов анализа

1. В табличном редакторе заполните файл сводки, используя шаблон (Дополнительный файл 6). Используйте значения длины стойки и средней высоты ткани , полученные на шагах 6.2. Убедитесь, что все hECT, данные которых находятся в папке, представлены в сводном файле. Назовите файл "summary #.csv", где # обозначает количество дней эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональные данные hECT должны находиться в отдельных папках в соответствии с днем эксперимента.
2. Убедитесь, что папка, содержащая сценарии AnalyzeLogsGUI (дополнительный файл 7), и папка с записями hECT добавлены в путь.
3. Откройте программное обеспечение для анализа данных. Слева от панели каталогов нажмите кнопку Browse for folder , чтобы перейти к родительской папке, содержащей папку AnalyzeLogsGUI и функциональные данные hECT. На боковой панели «Текущее окно » щелкните правой кнопкой мыши по этим папкам, чтобы добавить в путь | Добавьте выбранные папки и вложенные папки.
4. Откройте файл "AnalyzeLogsGui_SC.m". На вкладке «Редактор» нажмите кнопку «Выполнить» и дождитесь появления графического интерфейса пользователя (GUI) в новом окне.
   1. В окне Log Selection (рисунок 8AI) нажмите кнопку Select Directory и перейдите в папку, содержащую функциональные данные hECT. Выберите нужную hECT для обработки в раскрывающемся меню Tissue (Ткани ).
   2. В поле «Входные данные» (рис. 8AII) введите незагруженное расстояние между столбами, записанными на шагах 6.1, в поле «Диастолическое расстояние». Введите 0,25 в поле Радиус поста (мм).
   3. В окне Analysis Constraints (рисунок 8AIII) выберите частоты, которые нужно исключить из анализа, или выберите конкретные частоты для включения (через запятую). Время начала и время окончания по умолчанию установлены в 0 и −1 соответственно для обработки всей длины записей. При необходимости измените эти значения, чтобы обрезать записи.
   4. Измените параметры фильтра (рис. 8AIV) Полиномиальный порядок (Polynomial Order ) и Размер кадра (Frame Size ), чтобы изменить уровень сглаживания в процессе фильтрации, и ползунок Peak Detection Threshold (Порог обнаружения пиков ), чтобы установить минимальный размер пика , который будет распознаваться скриптами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт содержит опцию Удаление шипов, которая обрезает высокие пики, вызванные артефактами; Однако это не рекомендуется, так как это изменяет форму подергиваний. Удалите артефакты, обрезав запись (рис. 8AIII).
   5. Используйте дополнительные параметры (рис. 8AV) для получения дополнительных выходных данных анализа данных: Анализ после прогиба для запуска дополнительного алгоритма обнаружения пиков, Автомасштабирование оси Y на графиках масштабирования для автоматической настройки осей на кривой силы подергивания (Рисунок 8B), Сохранение кривых трассировки силы для сохранения каждой фигуры силы подергивания в файл .fig и Сохранение данных о силе-времени , чтобы сохранить координаты X и Y отфильтрованных данных, нанесенных на рисунок кривой силы Twitch.
   6. Нажмите кнопку Run Analysis , чтобы создать .txt файл, содержащий атрибуты кривой силы подергивания (дополнительный файл 8), усредненные по всей записи.

Рисунок 8: Расчет кривой силы Twitch. (A) Запуск файла "AnalyzeLogsGUI.m" в программном обеспечении для обработки данных открывает окно графического интерфейса. (I) Поле Log Selection позволяет пользователю выбрать каталог для папки, содержащей функциональные данные hECT. Поле Day Num автоматически заполняется из заголовка сводного файла, созданного на шаге протокола 7.1. Обрабатываемый hECT выбирается с помощью выпадающего меню Tissue (Ткань ). (II) Поле Data Inputs содержит информацию о паре постов PDMS, поддерживающих hECT, такую как расстояние без нагрузки (полученное на шаге протокола 6.1) и радиус поста (0,25 мм). (III) Поле Analysis Constraints (Ограничения анализа ) позволяет пользователю выбрать частоты, которые следует опустить, включить и обрезать записи. (IV) Окно параметров фильтра содержит параметры для выбора способа фильтрации необработанной кривой силы подергивания. Полиномиальный порядок и размер кадра изменяют уровень сглаживания в процессе фильтрации. Ползунок Peak Detection Threshold определяет минимальный размер пика, который будет распознаваться скриптами. Параметр «Удаление шипов » обрезает высокие пики, вызванные артефактами. (V) Дополнительные опции включают в себя Анализ после прогиба, который запускает дополнительный алгоритм обнаружения пиков, Автомасштабирование оси Y на графиках масштабирования, которое действует на кривую силы подергивания, Сохранение кривых трассировки силы, которое сохраняет значения силы подергивания, и Сохранение данных о силе-времени, которое сохраняет построенные данные о силе подергивания. (B) Пример кривой силы подергивания 30-секундной записи hECT с частотой 1 Гц, полученной с помощью снимка экрана графического интерфейса с панели A. Красная кривая силы подергивания показывает отфильтрованную силу, создаваемую параметрами в AIV, наложенную на необработанную кривую силы подергивания (темно-синяя кривая, появляется, когда выбран параметр Показать нефильтрованные данные в AV ). Сокращения: hECT = инженерная сердечная ткань человека; GUI = графический пользовательский интерфейс; ПДМС = полидиметилсилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

В соответствии с вышеприведенным протоколом, кардиомиоциты были получены из здоровой линии ИПСК, ранее использовавшейся нашей группой ^9,15, и изготовлены в hECT через 8-61 день в культуре. На рисунке 9A показаны репрезентативные изображения hECT снизу, которые были созданы без (вверху) и с (внизу) SPoT. Функциональные измерения проводили при комнатной температуре (23 °C) и при физиологической температуре (36 °C) в период от 37 до 52 дней после изготовления hECT. При изготовлении стоек PDMS мы задокументировали, что опытный пользователь может рассчитывать на выход 80% в стойках PDMS со всеми шестью неповрежденными стойками и общий выход 95% по крайней мере на пять стоек (на основе данных трех пользователей в нашей лаборатории) с вариабельностью высоты стойки <3%.

SPoT обеспечивали единую определенную форму для отслеживания во время сбора данных (рис. 9B и дополнительное видео S1) по сравнению с фрагментированными формами чернил маркера, которые плохо прилегают к кончикам записей PDMS (дополнительное видео S2)²⁷. В некоторых крайних случаях объект слежения может быть даже скрыт (рис. 9C, верхний ряд). Эти неравномерности вносят много шума, который скрывает кривую силы подергивания, тем самым препятствуя точному измерению развиваемых сил при 10 мкН. Чтобы исправить это и обеспечить последовательное отслеживание этих форм, обычно требуется множество регулировок угла и положения освещения для оптимизации контраста и четкости. Темнота и регулярность форм SPoT оптимизируют этот процесс, тем самым сокращая время сбора данных примерно на 50% (с ~12-30 минут до 5-10 минут на hECT для типичного диапазона захвата от 1 Гц до 4 Гц). Кроме того, в этой работе SPoT обеспечили более надежную форму для оптического отслеживания, а снижение шума позволило измерять слабые ткани с развитой силой до 1 мкН, представляющей собой постпрогиб менее 5 мкм (рис. 9D), а также уменьшить вариабельность между измерениями одного и того же hECT²⁷.

По нашему опыту, потеря образца в продольных экспериментах обычно происходит из-за соскальзывания hECTS с концов перевернутых постов PDMS. Это соскальзывание hECT обычно происходит при извлечении hECT из базовой пластины (рис. 4BV, через 1-4 дня после изготовления hECT) или даже позже в эксперименте (через 1-3 недели после изготовления hECT), поскольку hECT компактны и зрелы. Это созревание hECT иногда оказывает достаточное пассивное и активное натяжение на гибкие штифты, чтобы заставить hECT оторваться от конца штифта, что приводит к бесполезному сгустку ткани, уплотненному вокруг противоположного поста (рис. 9E). SPoT обеспечивают геометрию конденсатора, которая предотвращает потери hECT (рис. 9F), как показано на рисунке 9G. Из 103 биореакторов, созданных в течение 2 лет (каждый из которых имел от трех до шести hECT на старте), стойки PDMS без SPoT сохранили в среднем 95% hECT в 66 биореакторах. Однако, в то время как большинство биореакторов не имели потерь в тканях, некоторые биореакторы теряли 30%-100% hECT (часто когда один биореактор представляет целую экспериментальную группу), что приводило к существенной неэффективности. В этой работе SPoT эффективно устраняли потери hECT, тем самым значительно улучшая коэффициент удержания до 100% в 37 биореакторах (p = 0,038)²⁷.

Рисунок 9: Улучшение качества данных после отклонения и увеличение удержания hECT с добавлением SPoT к постам PDMS. (A) Вид снизу hECT без (вверху) или с (внизу) SPoT. (В,В) Изображения крупным планом одного конца hECT на столбе, видимые снизу биореактора, с настройками порога в правом столбце такими же, как и при сборе данных. Красными прямоугольниками обозначены объекты, отслеживаемые программным обеспечением для отслеживания постов. (B) Сравнение отслеживаемых реперных знаков на столбе с маркерными чернилами и SPoT. (C) Расслабленные и сжатые hECT на столбах с маркерными чернилами (верхние два ряда) или с SPoT (нижние два ряда). (D) Пример трассировки силы подергивания hECT с электрическим темпом на частоте 1 Гц с развитой силой 1 мкН, что соответствует отклонению менее 5 мкм (бирюзовый — нефильтрованный след; пурпурный — отфильтрованный след). (E) Наклонный вид биореактора без SPoT, где hECT соскальзывают с одного из своих постов, в результате чего вокруг противоположного столба образуется комок ткани (бирюзовые наконечники стрел). (F) Фотография биореактора с SPoT, демонстрирующая 100% удержание hECT. (G) Точечная диаграмма, показывающая удержание тканей в каждом биореакторе для стоек PDMS (каждая с тремя-шестью hECT) без SPoT (n = 322 hECT, 66 биореакторов) и стоек PDMS с SPoTs (n = 134 hECT, 37 биореакторов), включая данные из биореакторов с разрушениями тканей во время удаления опорной пластины (дни 1-4) и позже в процессе культивирования (дни 4-15). *р = 0,038; ромб обозначает среднее значение. Масштабные линейки = 1 мм (A,C), 1 см (E). Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Сокращения: hECT = инженерная сердечная ткань человека; SPoT = стабильный трекер постов; GUI = графический пользовательский интерфейс; ПДМС = полидиметилсилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

В качестве примера применения вышеуказанных методов мы также демонстрируем важность измерения функции hECT при физиологической температуре (36 °C), а не при комнатной температуре (23 °C). Было обнаружено, что функция hECT стабильна в течение длительного времени культивирования в текущей установке кардиостимуляции с нагретым этапом (рис. 10A)²⁷. По сравнению с измерениями при физиологической температуре, hECT показали измененную динамику сокращения при комнатной температуре, с более медленными темпами сокращения и расслабления (на что указывают наклоны пиков на рисунке 10B).

В этой работе 1 чЭСТ из 10 продемонстрировал гипотермическую инотропию (где развиваемая сила была выше при 23 °С, чем при 36 °С), но только на низких частотах. При темпе hECT с частотой 1,5 Гц он имел более сильную развиваемую силу при 36 °C (отсутствие гипотермической инотропии) и полное расслабление между подергиваниями (плоские межпиковые области кривой силы подергиваний, правая панель), но неполное расслабление между сокращениями при 23 °C (увеличение пассивной силы между пиками, левая панель) (рис. 10BI). При стимуляции hECT с частотой 0,75 Гц наблюдалась гипотермическая инотропия (рис. 10BII), и наблюдалось, что hECT полностью расслабляется между схватками, даже при 23 °C (левая панель). Тем не менее, окончательные частотно-согласованные сравнения функции hECT были сложными, поскольку диапазон захвата большинства hECT показал минимальное перекрытие по температурам (рис. 10C). Это было в значительной степени связано с низкой максимальной частотой захвата при 23 °C (в основном ≤1,5 Гц) и высокой минимальной частотой захвата hECT при 36 °C (в основном ≥ 1,5 Гц) (рис. 10D); эти ограничения не наблюдаются в нативном миокарде (испытанном при 28 °C и 37 °C), так как нативный миокард желудочков не бьется спонтанно⁴⁶. Только один из hECT с частотным перекрытием показал частотно-согласованную гипотермическую инотропию (рис. 10D). Как видно из кривых силы подергивания на рисунке 10B, hECT с темпом 36 °C показали более высокие величины +dF/dt и −dF/dt (рис. 10E, сплошные линии), чем при темпе 23 °C (пунктирные линии). В hECT с гипотермической инотропией (красная линия) сокращение и расслабление были намного быстрее при 36 °C, несмотря на меньшую силу. При температуре 36 °C у нЭСТ также наблюдалась более высокая частота спонтанных биений (рис. 10F) (n = 10, p = 0,000016 для парного t-критерия) и более широкий диапазон частот захвата (рис. 10G) (n = 9, p = 0,0000061 для парного t-критерия), таким образом, достигая захвата 1:1 на супрафизиологических частотах⁴⁸ от 4,5 Гц до 6,75 Гц (рис. 10C).

Рисунок 10: Сократительная динамика hECT, демонстрирующая температурную зависимость. (A) Трассировка силы Twitch для hECT с частотой 1 Гц в течение 30 минут (вверху), чтобы показать стабильность функции с течением времени, с врезками (внизу), показывающими увеличенный вид верхней части с интервалом в 5 минут. (B) Трассировка силы подергивания hECT в темпе (I) 1,5 Гц и (II) 0,75 Гц без гипотермической инотропии и с гипотермической инотропией, соответственно. Трассировки левой панели были получены при 23 °C, а трассировки правой панели — при 36 °C. (C) Зависимость силы и частоты hECT (n = 6 hECT на 37-й день после изготовления в двух биореакторах, n = 4 на 52-й день после изготовления в двух биореакторах) при 23 °C (пунктирные линии) и при 36 °C (сплошные линии). Каждый цвет соответствует одному hECT. (D) Зависимость силы-частоты трех hECT из панели C, демонстрирующих перекрытие частот при обеих температурах, одна из которых демонстрирует согласованную по частоте гипотермическую инотропию (черная стрелка). (E) +dF/dt и −dF/dt одних и тех же hECT на панели D, построенных по частотам при 23 °C (пунктирные линии) и 36 °C (сплошные линии). (F) Спонтанная частота биений hECT при двух температурных условиях (n = 10, p = 0,000016). (G) Диапазон частот с 1:1 стимуляция:пиковый захват (диапазон частот на этом графике определяется как максимальная частота захвата - минимальная частота захвата) при каждой температуре (n = 9, p = 0,000006,1). p-значения из парного t-критерия Стьюдента. Столбцы погрешности показывают стандартное отклонение. Эта фигура была изменена с van Neste²⁷. Аббревиатура: hECT = инженерная сердечная ткань человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: CAD-файлы для обработанных деталей биореактора. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: CAD-файлы для 3D-печатного литейного оборудования SPoT. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: CAD-файлы для изолирующей акриловой оболочки для сцены с подогревом. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: файл AutomatedPostTracking3.vi для отслеживания отклонений hECT (шаг протокола 5.3). Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 5: файл PostMeasurement_PB3.vi для измерения длины столбов и высоты тканей (шаг протокола 6.2). Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 6: Шаблон для "сводного #.csv" (протокол Шаг 7.1), который используется для обработки данных после отклонения. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 7: Папка AnalyzeLogsGUI, содержащая скрипты MatLab для обработки данных после отклонения (шаг протокола 7). Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 8: Описания переменных в выходном файле сценария MatLab "_datatable.txt". Строки 10-24 представляют собой параметризацию кривой силы подергивания, усредненную по всем пикам на протяжении всей записи (указана в строке 25). Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео S1: Видео спонтанного обыгрывания hECT на постах с SPoT. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео S2: Видео спонтанного избиения hECT на постах без SPoT. Этот файл был адаптирован из van Neste²⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

В литературе опубликовано множество линейно-инженерных моделей сердечной ткани, некоторые из которых описаны в таблице 1. Некоторые модели предполагают непосредственное измерение силы в тканях, но они, как правило, требуют переноса конструкции в отдельную мышечную ванну³⁸. Большинство моделей спроектированы с тканями, постоянно прикрепленными к обоим концам, чаще всего к стойкам PDMS 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^,17,18,19,20,21,
22,25,26 (или провода ³⁹), что устраняет необходимость в манипуляциях с тканями, а сила, создаваемая тканями, может быть точно рассчитана с помощью оптического отслеживания элементов концевого анкера. Штифты PDMS, разработанные нашей группой 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27, были разработаны для поддержки тканей среднего размера, и эти посты уравновешивают пропускную способность, точные функциональные измерения и сохранение ключевых аспектов нативной сердечной ниши. Штифты были слишком малы, чтобы можно было использовать метод разделения 10,13,14,18,19,20,21,24, а встроенные колпачки приводили к разрыву штифтов во время критического шага протокола 1.3.2. Без колпачков hECT могли соскользнуть со стоек. В тех случаях, когда удержание тканей не было 100%, эти биореакторы часто теряли большую часть hECT,^{создавая проблему «}все или ничего». Чаще всего это происходило на критическом этапе протокола 3.3.2, когда hECT извлекались из колодца базовой пластины. Иногда hECT можно было физически манипулировать обратно на штифты, при этом каждый конец штифта осторожно продевался через отверстие в hECT; Это было не только технически сложно, но и являлось существенным источником повреждений, которые могли негативно повлиять на последующую сократительную функцию.

SPoT, добавленные в конструкцию поста PDMS, позволяют проводить культуру hECT с более широким диапазоном натяжения. Таким образом, hECT с фенотипом низкой компактности/пассивного натяжения (например, низкое содержание немиоцитов или модели дилатационной кардиомиопатии⁴), которые в противном случае соскользнули бы с постов, могут быть культивированы и оценены с помощью SPoT. И наоборот, геометрия колпачка гарантирует, что hECT с высоким пассивным натяжением (например, с высоким содержанием немиоцитов или с моделями заболеваний с нарушением диастолической релаксации⁴⁹), которые имеют тенденцию отрывать гладкие посты PDMS, удерживаются на месте²⁷. Кроме того, SPoT относительно уникальны тем, что они добавляются к стойкам PDMS на втором этапе изготовления, что было замечено только в одной другой модели со значительно меньшими тканями¹⁷. Несмотря на то, что SPoT требуют отдельного этапа изготовления, они позволяют одновременно добавлять геометрию колпачка с возможностью включения в колпачок различных материалов, таких как непрозрачный черный цвет, магниты или флуоресцентные шарики; Они были изучены некоторыми другими группами, но также требуют дополнительных этапов изготовления 23,25,26.

Еще одним направлением этой работы было изучение влияния температуры на функцию hECT. Несмотря на то, что кардиоинженерные ткани использовались для моделирования многих аспектов сердечной функции in vivo (например, моделирование заболеваний 4,8,50,51 и реакций на лекарственные препараты 15,21,52), насколько нам известно, температурно-зависимые эффекты систематически не изучались в этих моделях. Частотно-согласованная гипотермическая инотропия выражена (иногда с пятикратным увеличением развитой^{силы) и} повсеместно распространена, как это наблюдается у многих видов млекопитающих (крысы^{46, 53, 54}, хорьки⁵⁴, кролики⁵⁵, кошки⁵⁴), так и у здорового и больного миокарда человека разного возраста⁴⁴. Мы обнаружили, что частота спонтанных биений hECT и диапазон частот захвата были смещены в сторону гораздо более низких частот при более низких температурах, но согласованная по частоте гипотермическая инотропия не всегда присутствовала²⁷. В стремлении улучшить инженерные ткани сердца за счет достижений в области созревания^13,18 и биосложности⁵⁶, гипотермическая инотропия предлагает еще один функциональный фенотип нативной сердечной мышцы, который может быть использован в качестве эталона биодостоверности сердца.

В свете температурной зависимости нативного миокарда и в стремлении повторить среду нативной сердечной ниши, функция инженерных тканей часто характеризуется физиологической температурой. Однако это не всегда возможно, поскольку некоторые системы для получения функциональных данных тканей при сохранении стерильности не способствуют нагреванию. Таким образом, сравнение функций тканей (или моделей тканей), измеренных при разных температурах, может быть неуместным. Действительно, стандартизация условий тестирования для тканевой инженерии in vitro считается необходимой как в регенеративной медицине⁵⁷, так и регулирующими органами, такими как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA)^58,59. Методы, описанные в этой статье, могут помочь достичь такой стандартизации в дополнение к дальнейшим исследованиям влияния температуры на функцию hECT²⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp