Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64368
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Abstract

Herzinsuffizienz ist nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit, was einen dringenden Bedarf an besseren präklinischen Modellen des menschlichen Herzens schafft. Das Tissue Engineering ist für die Grundlagenforschung im Herzen von entscheidender Bedeutung. Die In-vitro-Humanzellkultur eliminiert die Unterschiede zwischen den Spezies von Tiermodellen, während eine gewebeähnlichere 3D-Umgebung (z. B. mit extrazellulärer Matrix und heterozellulärer Kopplung) In-vivo-Bedingungen in größerem Maße simuliert als die herkömmliche zweidimensionale Kultur auf Kunststoff-Petrischalen. Jedes Modellsystem erfordert jedoch spezielle Geräte, z. B. maßgeschneiderte Bioreaktoren und Geräte zur Funktionsbewertung. Darüber hinaus sind diese Protokolle oft kompliziert, arbeitsintensiv und durch das Versagen der kleinen, empfindlichen Gewebe geplagt.

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Generierung eines robusten Modellsystems für humanes Herzgewebe (hECT) beschrieben, das induzierte pluripotente Kardiomyozyten aus Stammzellen für die longitudinale Messung der Gewebefunktion verwendet. Sechs hECTs mit linearer Streifengeometrie werden parallel kultiviert, wobei jeder hECT an einem Paar kraftempfindlicher Polydimethylsiloxan (PDMS)-Pfosten aufgehängt ist, die an PDMS-Racks befestigt sind. Jeder Beitrag ist mit einem schwarzen PDMS Stable Post Tracker (SPoT) versehen, einer neuen Funktion, die die Benutzerfreundlichkeit, den Durchsatz, die Geweberetention und die Datenqualität verbessert. Die Form ermöglicht eine zuverlässige optische Nachführung von Pfostenauslenkungen und führt zu verbesserten Zuckungskraftverfolgungen mit absoluter aktiver und passiver Spannung. Die Kappengeometrie eliminiert Gewebeversagen aufgrund von hECTs, die von den Pfosten rutschen, und da sie einen zweiten Schritt nach der Herstellung des PDMS-Racks erfordern, können die SPoTs ohne größere Änderungen am Herstellungsprozess des Bioreaktors zu bestehenden PDMS-Pfostendesigns hinzugefügt werden.

Das System wird verwendet, um die Bedeutung der Messung der hECT-Funktion bei physiologischen Temperaturen zu demonstrieren und zeigt eine stabile Gewebefunktion während der Datenerfassung. Zusammenfassend beschreiben wir ein hochmodernes Modellsystem, das wichtige physiologische Bedingungen reproduziert, um die Biotreue, Effizienz und Strenge von künstlich hergestelltem Herzgewebe für In-vitro-Anwendungen zu verbessern.

Introduction

Technisch hergestellte Herzgewebemodelle gibt es in einer Vielzahl von Geometrien und Konfigurationen, um verschiedene Aspekte der nativen Herznische zu rekapitulieren, die mit herkömmlichen zweidimensionalen Zellkulturen nur schwer zu erreichen sind. Eine der gebräuchlichsten Konfigurationen ist der lineare Gewebestreifen mit flexiblen Ankern an jedem Ende, um die Selbstorganisation des Gewebes zu induzieren und das Gewebe mit einer definierten Vorspannung und einem Auslesen der resultierenden Zuckungskräfte 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 zu versorgen. 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. Die erzeugte Kraft kann durch die optische Nachführung der Gewebeverkürzung und unter Verwendung der elastischen Strahltheorie zur Berechnung der Kraft aus den gemessenen Durchbiegungen und der Federkonstante der Anker 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 robust bestimmt werden. 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.

Das kardiale Tissue Engineering ist jedoch immer noch ein sich entwickelndes Feld, und einige Herausforderungen bleiben bestehen. Für jedes Modellsystem sind spezielle Geräte, wie z. B. maßgeschneiderte Bioreaktoren und Funktionsbewertungsgeräte, erforderlich 10,29,30,31. Die Größe und Komplexität der Mikroumgebung dieser Konstrukte wird oft durch einen geringen Durchsatz aufgrund arbeitsintensiver Protokolle, einer hohen Anzahl von Zellen und der Zerbrechlichkeit des Gewebes begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben sich einige Gruppen der Herstellung von Mikrogeweben zugewandt, die nur Hunderte oder Tausende von Zellen enthalten, um Hochdurchsatz-Assays zu ermöglichen, die für die Arzneimittelforschung nützlich sind. Diese reduzierte Skala erschwert jedoch die genaue Beurteilung der Funktion12, eliminiert Schlüsselaspekte der nativen kardialen Nische (wie Nährstoff-/Sauerstoffdiffusionsgradienten und komplexe Architektur36) und begrenzt die Menge an Material, die für die anschließende molekulare und strukturelle Analyse zur Verfügung steht (was oft eine Bündelung der Gewebe erfordert). Tabelle 1 fasst einige der Konfigurationen von linearen Gewebestreifenmodellen in der Literatur zusammen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe Zellen pro Gewebe Gewebe pro Platte Plattenformat Verankerungsfunktion Verfahren zur funktionalen Datenerfassung Geteilte Medienbad? Funktionelle Maßnahme-
ment in situ?
Yoshida (ECT)38 4 Millionen 6 Modifizierte 6-Well-Platte* Kraftaufnehmer Direkte Kraftmessung Nein Nein
Chan (hESC-CM-ECTs)26 310 Tsd. 6 Benutzerdefinierte 6-Well-Schale PDMS-Beiträge Direkte Kraftmessung ja Nein
Feinberg (dyn-EHT)16 1,5 Millionen 6 Benutzerdefinierte 6-Well-Schale PDMS-Draht Form des Gewebes Nein ja
RADISIC (BioWire)39, 40 110 Tsd. 8 Polymer-Draht Form des Drahtes ja ja
Costa (einzelne hECT)1, 2 1-2 Millionen 4** 10 cm Petrischale** PDMS-Beiträge Optische Ablenkung (Kanten-/Objektverfolgung) ja ja
Costa (multi-hECT)3–9 500 Tsd.-1 Mio. 6 6 cm Petrischale PDMS-Beiträge Optische Ablenkung (Kanten-/Objektverfolgung) ja ja
Costa (Multi-hECT mit SPoT) 1 Million 6 6 cm Petrischale PDMS-Pfosten mit schwarzen Kappen Optische Ablenkung (Objektverfolgung) ja ja
Passier (EHT)17 245 Tsd. 36 12-Well-Platte PDMS-Pfosten mit schwarzen Kappen Optische Ablenkung (Objektverfolgung) ja ja
Vunjak-Novakovic13, 18 1 Million 12 6 cm Petrischale PDMS-Pfosten mit Kappen Optische Ablenkung (Kantenerkennung) ja ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 550 Tsd. 6 Benutzerdefinierte 6-Well-Schale PDMS-Pfosten mit Kappen optische Ablenkung (Objektverfolgung); Kalzium-Bildgebung Nein ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 1 Million 12 12-Well-Platte PDMS-Pfosten mit Kappen optische Durchbiegung (Kantenerkennung der Nachbiegung); Kalzium-Bildgebung Nein ja
Zandstra (CaMiRi)22 25-150 Tsd. 96 96-Well-Platte PDMS-Pfosten mit Haken Optische Ablenkung (Kantenerkennung) Nein ja
Murry23, 24 900 Tsd. 24 24-Well-Platte PDMS-Pfosten mit Kappen, integrierter Magnet Magnetischer Sensor Nein ja
Reich (μTUG)11, 12, 25 undefiniert 156 156-Well-Schale PDMS-Pfosten mit Kappen, integrierter Magnet Optisches Tracking (fluoreszierende Perle) ja ja

Tabelle 1: Charakteristika einiger linear konstruierter kardialer Gewebemodelle in der Literatur. Linear konstruierte kardiale Gewebemodelle unterscheiden sich in Größe, Durchsatz, Verankerungsmerkmalsdesign und der Erleichterung gemeinsamer Medienbäder sowie in den Anforderungen an ein separates Muskelbadsystem zur funktionellen Charakterisierung. * Die Forscher verwendeten ein kommerziell erhältliches Gewebesystem, das auf den Abmessungen einer Standard-6-Well-Platte basiert. ** Ein modulares System, bei dem Einzelgewebe-Bioreaktoren in der gewünschten Anzahl und an der gewünschten Stelle an jeder Kunststoffkulturschale verankert werden.

In diesem Artikel wird das neueste Protokoll für die Herstellung unseres etablierten Modells des linearen humanen Herzgewebes (hECT) beschrieben1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 und Methoden zur Beurteilung der kontraktilen hECT-Funktion. Jeder Multi-Tissue-Bioreaktor beherbergt bis zu sechs hECTs in einem gemeinsamen Mediumbad und besteht aus zwei "Rack"-Stücken aus dem Silikonelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS), die auf einem starren Polysulfonrahmen montiert sind. Jedes PDMS-Rack enthält sechs flexible, integrierte Force-Sensing-Pfosten mit einem Durchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 3,25 mm, und zusammen bieten zwei Racks sechs Pfostenpaare, von denen jedes einen hECT fasst. Die Inversion des Bioreaktors trägt dazu bei, jegliche Behinderung der Visualisierung der hECTs von unten durch Wasserkondensation aus dem Nährmedium oder Verzerrungen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche durch den Meniskus zu überwinden. Jede Kontraktion eines hECT bewirkt eine Auslenkung der integrierten Endpfosten, und die optische Messung des Auslenkungssignals wird zu einer Kraft-Zeit-Verfolgung verarbeitet, die die kontraktile Funktion des hECTdarstellt 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Im Vergleich zu den Einzelgewebe-Bioreaktoren, die typischerweise für Gewebe dieser Größe verwendet werden, verbessert das Multi-Gewebe-Design den experimentellen Durchsatz und ermöglicht die Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen benachbarten Geweben mit potenziell unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzung. Dieses System wurde in veröffentlichten Studien validiert, die Anwendungen in der Krankheitsmodellierung 4,8, der parakrinen Signaltransduktion 6,7, der heterozellulären Kultur 5,9 und dem therapeutischen Screening 7,9 beschreiben.

In diesem System sind die hECTs auf eine Länge von ca. 6 mm und einen Durchmesser von 0,5 mm ausgelegt, um eine robuste optische Verfolgung von Kraftmessungen mit geringem Rauschen zu ermöglichen. Darüber hinaus werden Aspekte der Gewebekomplexität, wie z.B. Diffusionsgradienten und zelluläre Organisation, mit einem überschaubaren Bedarf von 1 Million Zellen pro Gewebe ausgeglichen. Mit der Standard-CCD-Kameratechnologie erzeugen Kräfte von nur 1 μN (d. h. weniger als 5 μm nach der Ablenkung) ein klares Signal, das sicherstellt, dass selbst eine extrem schwache kontraktile Funktion, wie sie bei einigen hECT-Krankheitsmodellen beobachtet wurde, genau gemessen werden kann. Dies erleichtert auch die detaillierte Analyse der Zuckungskraftkurve und ermöglicht so die High-Content-Analyse von bis zu 16 Kontraktilitätsmetriken41, einschließlich der entwickelten Kraft, der Kontraktionsraten (+dF/dt) und der Relaxationsraten (−dF/dt) sowie der Schwebungsratenvariabilität.

Dieses Protokoll beginnt mit einer Anleitung zur Herstellung der Bioreaktorkomponenten. Besonderes Augenmerk wird auf die Schritte zur Maximierung der hECT-Ausbeute, zur Reduzierung der technischen Variabilität in der Gewebefunktion und zur Optimierung der Qualität und Tiefe der Gewebebeurteilung gelegt. Die meisten kardialen Tissue-Engineering-Studien berichten nicht über Raten von Gewebeverlusten während der Herstellung und Langzeittests, obwohl dies eine bekannte Herausforderung auf diesem Gebiet darstellt und den Durchsatz und die Effizienz der Studien verringert27. Die hier beschriebenen Tissue-Engineering-Methoden wurden im Laufe der Jahre verfeinert, um sicherzustellen, dass alle hECTs in den meisten Bioreaktoren erhalten bleiben (unabhängig davon, wie die PDMS-Racks hergestellt werden). Allerdings kann selbst ein Gewebeverlust von 5%-20% die statistische Aussagekraft signifikant beeinflussen, insbesondere in kleineren Experimenten, die durch die Anzahl der verfügbaren Kardiomyozyten begrenzt sind (z. B. aufgrund von Differenzierungsproblemen mit einigen erkrankten Zelllinien4 oder aufgrund der hohen Kosten kommerziell erworbener Kardiomyozyten) oder durch den Behandlungszustand (z. B. begrenzte Verfügbarkeit oder hohe Kosten verschiedener Behandlungsverbindungen).

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von stabilen Post-Trackern (SPoTs), ein neues Merkmal der PDMS-Racks, die als Kappen an den Enden der Kraftmesspfosten fungieren, die die hECTs27 halten. Es wird gezeigt, wie die Kappengeometrie den hECT-Verlust durch Herunterfallen oder Abziehen der Pfosten signifikant reduziert und so neue Möglichkeiten für die Kultivierung von hECTs mit einer größeren Vielfalt an Steifigkeiten und Spannungen eröffnet, die für die Kultivierung auf unverschlossenen Pfosten eine Herausforderung darstellen. Zusätzlich stellen die SPoTs ein kontrastreiches Objekt bereit, um die optische Verfolgung der hECT-Kontraktion durch eine konsistente und gut definierte Form27 zu verbessern. Darauf folgt eine Beschreibung der Kultivierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und der Kardiomyozytendifferenzierung auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Protokolle 3,42,43 sowie eine Erläuterung der hEKT-Herstellung, Kultur und funktionellen Messungen.

Dieser Artikel befasst sich auch mit der Notwendigkeit, die Gewebefunktion bei physiologischer Temperatur zu messen. Menschliches Myokard (sowohl fötales als auch adultes gesundes und krankes Gewebe) sowie Herzgewebe einer Vielzahl von Tierarten (einschließlich Ratten, Katzen, Mäusen, Frettchen und Kaninchen)44,45 zeigt einen deutlichen Anstieg der frequenzangepassten Zuckungskraft bei Temperaturen von 28 °C bis 32 °C im Vergleich zur physiologischen Temperatur - ein Phänomen, das als hypotherme Inotropie bekannt ist45, 46. S. Die Auswirkungen der Temperatur auf die Funktion des künstlich hergestellten Myokardgewebes sind jedoch noch nicht ausreichend untersucht. Viele neuere kardiale Gewebemodelle in der Literatur sind so konzipiert, dass sie bei 37 °C funktionell beurteilt werden können, um sich den physiologischen Bedingungen anzunähern 13,14,37. Unseres Wissens sind die temperaturabhängigen Auswirkungen auf die Kraft, die von künstlich hergestelltem Herzgewebe erzeugt wird, jedoch nicht systematisch untersucht worden. Dieses Protokoll beschreibt ein Stimulationselektrodendesign, das den Wärmeverlust während der Prüfung minimiert und den Einbau eines isolierten Heizelements in den Aufbau für Funktionsmessungen ermöglicht, das die hECTs auf physiologischer Temperatur halten kann, ohne die Sterilität zu beeinträchtigen27. Wir berichten dann über einige der beobachteten Auswirkungen der Temperatur auf die hEKT-Funktion, einschließlich der entwickelten Kraft, der spontanen Schlagfrequenz, +dF/dt und −dF/dt. Insgesamt enthält diese Arbeit die Details, die für die Herstellung dieses Multi-Gewebe-Kraftsensor-Bioreaktorsystems zur Herstellung von humanem Herzgewebe und zur Bewertung ihrer kontraktilen Funktion erforderlich sind, und es wird ein Datensatz präsentiert, der eine Vergleichsgrundlage für Messungen bei Raumtemperatur und bei 37 °C bietet27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieses Protokoll verwendete eine anonymisierte iPSC-Linie, SkiPS 31.3 (ursprünglich mit dermalen Fibroblasten eines gesunden 45-jährigen Mannes umprogrammiert)47 und war daher in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung der Institution von der spezifischen Genehmigung durch das Institutional Review Board ausgenommen. Führen Sie die gesamte Zell- und hECT-Manipulation unter aseptischen Bedingungen in einer HEPA-gefilterten biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II oder einer Laminar-Flow-Werkbank durch. Sterilisieren Sie alle unsterilen Lösungen durch Filtration durch einen 0,22-μm-Filter und halten Sie alle Zellen und hECTs in einem Inkubator bei 37 °C, 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 .

1. Herstellung von Bioreaktoren

  1. Bioreaktorkomponenten und Aluminium-Fertigguss
    HINWEIS: CAD-Dateien (Computer-Aided Design) sind in der Zusatzdatei 1 enthalten. Das Protokoll kann zwischen diesen Schritten angehalten werden. Es wird empfohlen, einen professionellen Maschinisten mit der Herstellung der in diesem Abschnitt beschriebenen Urformen zu beauftragen, da hohe Toleranzen (≤5 μm) und eine glatte Oberfläche für eine genaue Pfostengeometrie und für eine ordnungsgemäße Einpressmontage der Polysulfonrahmen an die Grundplatten aus Polytetrafluorethylen (PTFE) erforderlich sind (mit dem Ziel einer festen Reibpassung, aber nicht zu fest).
    1. Bearbeiten Sie die Grundplatte mit einer CNC-Fräse (Computer Numerical Control) aus PTFE gemäß dem Schaltplan in Abbildung 1A. Die hECTs werden in den sechs gleichmäßig verteilten Vertiefungen (weiße Pfeile) gebildet.
    2. Bearbeiten Sie mit einer CNC-Fräse das aus Aluminium gegossene Polydimethylsiloxan (PDMS)-Rack-Negativ gemäß dem Schema in Abbildung 1B mit drei Rahmenstützen (grüne Sternchen). Bohren Sie sechs gleichmäßig verteilte Löcher (magentafarbene Pfeilspitzen) mit einem Durchmesser von 0,5 mm, um die PDMS-Stifte herzustellen.
    3. Mit einer CNC-Fräse wird der Bioreaktorrahmen aus Polysulfon gemäß dem Schema in Abbildung 1C gefertigt. Die Rahmenstützen (grüne Sternchen) entsprechen den Rahmenstützen im Gestellguss (Bild 1B, grüne Sternchen).
    4. Bearbeiten Sie mit einer CNC-Fräse den Aluminiumgusshalter aus Aluminium gemäß dem Schaltplan in Abbildung 1D. Jeder Steckplatz enthält eine dreieckige Ablage (orangefarbenes Dreieck), die 0,25 mm hoch ist, um einen Totraum für das PDMS zu schaffen, damit es durch die Löcher in den PDMS-Rack-Gussteilen fließen kann (Abbildung 1B, magentafarbene Pfeilspitzen).
  2. Gießen des PDMS-Racks aus den Aluminium-Negativ-Mastern
    1. Drucken Sie mit einem 3D-Drucker für die Modellierung von thermoplastischen Schmelzabscheidungen zwei PDMS-Halterungen für Zahnstangengießapparate (Ergänzungsdatei 1). Verwenden Sie die folgenden Druckeinstellungen: eine Schichthöhe von 0,1 mm, eine Wand-/Boden-/Oberteildicke von 1 mm, eine Fülldichte von 90 % mit Dreiecken, eine Drucktemperatur von 230 °C, eine Bauplattentemperatur von 70 °C und eine Krempe für die Haftung.
    2. Legen Sie vier Aluminium-Negativ-Mastergussteile so in den Gusshalter (Abbildung 2AI), dass die Pfostenlöcher mit dem Totraum gegenüber den dreieckigen Einlegeböden ausgerichtet sind (siehe Abbildung 1D). Wickeln Sie das Gerät in ein rechteckiges Stück aus 0,5 mm dicker Silikonfolie (Abbildung 2B, weiße Pfeile) als Dichtung, um ein Auslaufen des flüssigen PDMS zu verhindern, und klemmen Sie es mit einer Schraubzwinge zwischen zwei parallele 3D-gedruckte Halterungen.
    3. 0,5 ml PDMS-Härter zu 5 ml PDMS-Elastomerbasis (Verhältnis 1:10, gemäß Herstellerangaben) in einen flachen Behälter geben und 5 Minuten lang kräftig mischen. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einer Vakuumkammer und legen Sie ein starkes Vakuum (0,1-1 kPa) für 20-60 Minuten bei Raumtemperatur an oder bis die Blasen verschwunden sind.
    4. Gießen Sie das PDMS-Gemisch auf die Gießapparatur und füllen Sie es auf, um die vollständige Abdeckung jedes Schlitzes sicherzustellen (Abbildung 2AII). Falls gewünscht, fügen Sie kleine, farbige Glasperlen auf den Körper der PDMS-Racks (Abbildung 2AII) gegenüber der Seite mit den Pfosten (Abbildung 2B) ein, um jedes PDMS-Rack eindeutig zu identifizieren. Bringen Sie das Gießgerät wieder in die Vakuumkammer (achten Sie darauf, dass sie waagerecht ist) und legen Sie mindestens 12 h lang ein starkes Vakuum an. Lassen Sie das PDMS bei Raumtemperatur ca. 48 h staubfern aushärten, um die vollständige Aushärtung und maximale Festigkeit der empfindlichen Stifte zu ermöglichen. Vermeiden Sie die Verwendung eines Ofens, da sich die 3D-gedruckten Komponenten dadurch verziehen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  3. PDMS-Rack-Entnahme von den Aluminium-Negativ-Mastergussteilen
    1. Entfernen Sie die Klemme, die Halterungen und die Silikonfolie vom Gießapparat. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge aus Edelstahl die PDMS-Folie auf der Oberseite des Gießapparats und der Rahmenstützen ab und trennen Sie die PDMS-Racks vorsichtig mit den Fingern von den Seiten des Gipshalters. Führen Sie eine stumpfe Rasierklinge aus Edelstahl in den Totraum zwischen dem Gips und dem Gipshalter ein und hebeln Sie sie auseinander (Abbildung 2CI, II), wobei Sie darauf achten müssen, dass das PDMS, das den Totraum ausfüllt, mit dem Gipshalter (da dieser an den Pfosten befestigt ist) verbleibt. Schneiden Sie mit einer scharfen Edelstahlklinge die restlichen PDMS-Folien ab und schneiden Sie das Totraum-PDMS von den Spitzen der Stifte ab (Abbildung 2C III-V).
    2. KRITISCHER SCHRITT: Befreien Sie das PDMS-Rack vom Guss (Abbildung 2D). Beginnen Sie mit der Seite, die den Pfosten gegenüberliegt, und trennen Sie das PDMS-Gestell mit den Fingern langsam vom Gips, indem Sie abwechselnd auf den Seiten arbeiten, bis die Pfosten frei von den Urgipsen sind.
    3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis alle PDMS-Racks und alle Pfosten freigegeben sind. Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um überschüssiges PDMS von den Racks zu entfernen. Das Ergebnis ist ein PDMS-Rack (Abbildung 2E) mit sechs intakten Pfosten (orangefarbene Pfeilspitzen) und farbigen Perlen (blauer Pfeil) zur Identifikation.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  4. Herstellung von stabilen Post-Trackern (SPoT)
    1. Drucken Sie mit einem thermoplastischen 3D-Drucker zur Modellierung der schmelzenden Abscheidung die Komponenten der SPoT-Gießapparatur (Zusatzdatei 2 und Abbildung 3AI, II). Verwenden Sie die folgenden Druckeinstellungen: eine Schichthöhe von 0,1 mm, eine Wand-/Boden-/Oberteildicke von 1 mm, eine Fülldichte von 80 % mit Dreiecken, eine Drucktemperatur von 230 °C, eine Bauplattentemperatur von 70 °C und eine Krempe für die Haftung.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Presssitz zwischen den 3D-gedruckten Teilen sowie zwischen den PDMS-Racks und der dreizackigen Vorrichtung sicher ist, und vergewissern Sie sich, dass die PDMS-Racks eng mit den Pfosten sitzen, die gerade den Boden der Wells erreichen, ohne verbogen zu werden. Trimmen/feilen Sie den Kunststoff bei Bedarf.
    3. Geben Sie 0,5 ml schwarzes PDMS Teil A zu 0,5 ml Teil B (Verhältnis 1:1, gemäß den Anweisungen des Herstellers) in ein kleines Wägeschiffchen (oder einen ähnlichen kleinen, flachen Behälter) und mischen Sie es gründlich, bis die Farbe gleichmäßig ist. Entgasen Sie das gemischte schwarze PDMS in einer Vakuumkammer unter starkem Vakuum für 20 min. Gießen Sie das entgaste schwarze PDMS auf die 3D-gedruckte Basis, um die Löcher zu füllen, und klopfen Sie, um sicherzustellen, dass keine Blasen zurückbleiben. Kratzen Sie so viel überschüssiges PDMS wie möglich von der Basis ab.
    4. Befestigen Sie das dreizackige Stück an der Basis und platzieren Sie die PDMS-Racks in den Nuten der dreizackigen Vorrichtung (Abbildung 3AII, türkisfarbenes Rechteck), wobei Sie darauf achten, dass die Enden der Pfosten in das schwarze PDMS in den kreisförmigen Vertiefungen eintauchen (Abbildung 3B, C). Härten Sie das schwarze PDMS bei Raumtemperatur und staubgeschützt für 48 h aus.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
    5. Schieben Sie das dreizackige Stück heraus, um die Spannung auf den Pfosten zu minimieren. Verwenden Sie eine kleine Pinzette, um den dünnen Film aus schwarzem PDMS abzukratzen, der jeden SPoT umgibt. Führen Sie dann eine fein gebogene Pinzette in die SPoT-Vertiefung ein, um sie von der 3D-gedruckten Basis zu befreien (Abbildung 3D).
    6. Untersuchen Sie die SPoTs (Abbildung 3E) und schneiden Sie alle verbleibenden schwarzen PDMS-Folien aus dem Gießprozess mit einer feinen Vannas-Schere ab, die nicht in Schritt 1.4.5 entfernt wurden. Stellen Sie sicher, dass die fertigen Pfosten die richtige Länge haben, indem Sie die PDMS-Racks auf den Polysulfonrahmen montieren und diesen dann auf die schwarze Grundplatte schieben (Abbildung 4A).
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
    7. Koppeln Sie die PDMS-Racks, und fügen Sie sie mithilfe der Rahmenlaschen zum Rahmen hinzu (Abbildung 4A). Autoklavieren Sie in einem Beutel mit einer PTFE-Grundplatte für einen Zyklus von mindestens 30 Minuten (<122 °C, um den Verzug zu reduzieren).

Figure 1
Abbildung 1: Komponenten des hECT-Bioreaktors. (A) Draufsicht (links) und Seitenansicht (rechts) der PTFE-Grundplatte mit sechs gleichmäßig verteilten Vertiefungen zur Bildung von hECTs (weiße Pfeile). (B) Seitenansicht (links) und Draufsicht (rechts) der Aluminium-Negativ-Urabgüsse für die PDMS-Racks mit sechs gleichmäßig verteilten Pfosten (magentafarbene Pfeilspitzen) und drei Lücken zur Befestigung am Bioreaktorrahmen (grüne Sternchen). (C) Seitenansicht (links) und Unteransicht (rechts) der Polysulfonrahmen für die PDMS-Racks mit drei gleichmäßig verteilten Rahmenstützen (grüne Sternchen), die den Rahmenstützen im PDMS-Rack-Guss entsprechen (Tafel B). (D) Draufsicht (oben) und Seitenansicht (unten) des Aluminium-Gusshalters mit vier Schlitzen für die PDMS-Rack-Gussteile mit jeweils einem 0,25 mm hohen dreieckigen Regal (Regal ganz links orange hervorgehoben). Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue; Ø = Durchmesser; PTFE = Polytetrafluorethylen; PDMS = Polydimethylsiloxan; R = Radius. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Herstellung der PDMS-Racks. (A) CAD-Renderings zeigen eine Schrägansicht der Gießapparatur. (I) In jeden der vier Schlitze des Gusshalters wird ein negativer PDMS-Rack-Masterguss eingesetzt, wobei die Löcher, die die PDMS-Pfosten (magentafarbene Pfeilspitzen) bilden, über dem Totraum gegenüber dem dreieckigen Regal platziert werden (Abbildung 1D, orangefarbenes Dreieck). (II) PDMS wird in jede Kavität des negativen Urgusses gegossen. (III) Farbige Kügelchen werden dem nicht ausgehärteten PDMS als farbcodiertes Identifikationssystem hinzugefügt. (B) Foto zeigt die montierte PDMS-Rack-Gießapparatur, die auf beiden Seiten mit zwei 3D-gedruckten Halterungen eingespannt ist, die von einer Schraubzwinge gehalten und mit einer 0,5 mm dicken Silikonfolie (weiße Pfeile) umwickelt sind, um die eingespannten Seiten abzudichten. Die farbigen Perlen werden so platziert, dass sie die Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 mm, die die Pfosten bilden (magentafarbene Pfeilspitzen), nicht verdecken. (C) Sobald das PDMS ausgehärtet ist, wird der Gips aus dem Gipshalter entfernt. (I) Eine stumpfe Rasierklinge aus Edelstahl oder ein ähnliches dünnes Metallwerkzeug wird zwischen den Gips und den Gipshalter eingeführt, um den Gips aus dem Gipshalter (II) zu hebeln. (III) Die Folie (türkisfarbene Klammern), die durch das PDMS gebildet wird, das durch die Löcher der Pfosten fließt, ist an den Spitzen der Pfosten befestigt und muss mit einer scharfen Klinge (IV,V) abgeschnitten werden. (D) Das PDMS-Rack ist vom Guss getrennt. (E) Fotos, die schräge (oben), seitliche (mittlere) und untere (unten) Ansichten des PDMS-Racks mit einer Glasperle zeigen, die zur Identifizierung in das Gehäuse eingebettet ist (blauer Pfeil). Die Spitzen der Pfosten (orangefarbene Pfeilspitzen) sind mit schwarzer Tinte markiert. Maßstabsleiste = 1 cm. Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; PDMS = Polydimethylsiloxan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: SPoT-Herstellung. (A) CAD-Renderings, die die Schlüsselabmessungen der (I) Basis und (II) des dreizackigen Teils der SPoT-Gussvorrichtung angeben. Die Abmessungen der kreisförmigen SPoT-Formulare (AI, schwarze Pfeile) sind auf 0,2 mm Tiefe x 1,2 mm Durchmesser festgelegt und enthalten jeweils das schwarze PDMS für ein einzelnes SPoT. Das 11,1 mm x 27 mm große Regal in der Draufsicht (AII, oben, türkisfarbenes Rechteck) wird um 0,4 mm eingedrückt (wie in der Seitenansicht unten zu sehen), um das PDMS-Gestell während der Aushärtung an Ort und Stelle zu halten. (B) CAD-Rendering, das den Zusammenbau der SPoT-Gießvorrichtung zeigt. (C) Ein Foto der zusammengebauten SPoT-Gießapparatur. (D) Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, wird die dreizackige Vorrichtung unter den PDMS-Racks herausgeschoben und die SPoTs werden mit einer feinen Pinzette aus ihren Vertiefungen befreit. (E) Fotos des PDMS-Racks ohne (oben) und mit (unten) SPoTs. Einschübe zeigen vergrößerte Ansichten der Beiträge. Maßstabsleisten = 1 cm (E), 2,5 cm (vergrößerte Bilder in E). Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; Ø = Durchmesser; PDMS = Polydimethylsiloxan; R = Radius; SPoT = stabiler Post-Tracker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Zellkultur

  1. Kultivierung der iPS-Zellen
    HINWEIS: Unterschiedliche Zelllinien können Anpassungen der Durchgangsverdünnung und -frequenz und/oder der Titration der Mediumadditive erfordern.
    1. Beschichten Sie eine zellkulturbehandelte 6-Well-Platte mit qualifizierter Basalmembranmatrix (verdünnt in 1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nährlösung [DMEM/F12] gemäß den Anweisungen des Herstellers) und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 30 Minuten. Bereiten Sie 500 ml iPSC-Nährmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und fügen Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin-Stammlösung (10.000 IE/ml bis 10.000 μg/ml) hinzu.
    2. Um die iPS-Zellen zu passieren, saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen ab und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 1 ml iPSC-Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang in einer Laminar-Flow-Haube.
    3. Die iPSC-Dissoziationslösung wird abgesaugt und die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C (ohne Medium) inkubiert. 1 ml 2 μM Thiazovivin in iPSC-Medium zugeben, um die iPSC-Dissoziationslösung zu neutralisieren.
    4. Verwenden Sie eine serologische 2-ml-Pipette, um die Kolonien in Klumpen von etwa 10 Zellen zu dissoziieren, und waschen Sie jede Vertiefung mit zusätzlichen 1 ml 2 μM Thiazovivin in iPSC-Medium. 2 ml Zellsuspension in jede Vertiefung der neu mit Basalmembranmatrix beschichteten Platte geben (Schritt 2.1.1).
    5. Nach 24 Stunden entfernen Sie das Medium und fügen Sie frisches iPSC-Medium (ohne Thiazovivin) hinzu. Füttern Sie die iPS-Zellen alle 48 Stunden mit 2 ml iPSC-Medium oder alle 72 Stunden mit 4 ml Medium. Die Zellen werden alle 3 Tage oder wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, mit einer Verdünnung von 1:6 neu beschichtet.
      HINWEIS: Unterschiedliche Zelllinien können eine Anpassung der Verdünnungs- und Durchgangsfrequenz erfordern.
  2. Differenzierung von Kardiomyozyten
    1. Beginnen Sie mit der Differenzierung, wenn die iPSC-Monolagen zu 80 % bis 90 % konfluent sind.
    2. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium vor, indem Sie 10 ml B27-Präparat ohne Insulin und 5 ml Penicillin-Streptomycin-Stammlösung zu 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) hinzufügen. Bereiten Sie das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium vor, indem Sie 10 ml B27-Präparat und 5 ml Penicillin-Streptomycin-Stammlösung zu 500 ml RPMI 1640 hinzufügen.
      HINWEIS: Das Differenzierungsmedium und das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium können bei 4 °C bis zu 2 Wochen gelagert werden.
    3. Tag 0: Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM/F12 und fügen Sie 2 ml 10 μM CHIR99021 und verdünnte Basalmembranmatrix in Differenzierungsmedium hinzu.
    4. Tag 1: Nach 24 Stunden oder wenn die Zellkonfluenz auf unter 70 % gesunken ist, waschen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM/F12, fügen Sie 2 ml Differenzierungsmedium hinzu und inkubieren Sie 48 Stunden lang.
    5. Tage 3-4: Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM/F12 und fügen Sie 2 ml 5 μM IWR-1 in das Differenzierungsmedium ein. Wiederholen Sie dies an Tag 4.
    6. Tag 5-6: Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM/F12 und fügen Sie 2 ml Differenzierungsmedium hinzu. Wiederholen Sie dies an Tag 6.
    7. Tage 7-10: Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM/F12 und fügen Sie 2 ml Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium hinzu. Wiederholen Sie dies alle 24 Stunden.
    8. Tage 11+: Ersetzen Sie das Medium alle 48-72 h durch 4 ml frisches Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium. Saugen und pipettieren Sie langsam, um die heftig schlagenden Monolagen nicht zu beschädigen.

3. hECT-Kultur

  1. Entnahme der Kardiomyozyten
    1. Ernten Sie die Kardiomyozyten-Monoschichten für die Verwendung in der hEKT-Herstellung 8-60 Tage nach der Differenzierungsinduktion. Rechnen Sie mit 2-5 Millionen Zellen pro Well.
      HINWEIS: Wenn die Zellen bis zum 10. Tag nicht zu schlagen begonnen haben, ist es unwahrscheinlich, dass die Differenzierung erfolgreich ist. Kräftig schlagende Monolagen lösen sich oft nach 11-15 Tagen in der Differenzierung ab und verdichten sich zu dichtem Gewebe. Es wird empfohlen, solche Zellen zu diesem Zeitpunkt zu verwenden oder neu zu beschichten.
    2. Spülen Sie jede Vertiefung der Kardiomyozyten 2x mit 2 ml PBS. 1 ml 0,25%iges Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur hinzufügen. Bei 37 °C 5-10 min inkubieren, bis die Zellen rund erscheinen und sich bei leichtem Klopfen auf die Platte lösen.
    3. Geben Sie 1 ml 10% FBS in Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium in jede Vertiefung, um die Dissoziation zu neutralisieren. Pipettieren Sie die Monoschichten vorsichtig mit einer serologischen 5-ml-Pipettenspitze und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen, um das Pellet in Klumpen von 10-20 Zellen aufzubrechen.
    4. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das konische Röhrchen umdrehen, bevor Sie 10 μl Zellen in 10 μl Trypanblau überführen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler oder einem Glashämozytometer. Trennen Sie die Zellsuspension entsprechend, wenn nicht alle Zellen verwendet werden oder wenn einige Zellen für die Durchflusszytometrie reserviert werden.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können zusätzliche Zellen (z. B. Fibroblasten) hinzugefügt werden.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 5 min. Saugen Sie sofort so viel Überstand wie möglich an, ohne das Zellpellet zu stören, und lassen Sie es auf Eis. Arbeiten Sie schnell, um die Zeit, die die Zellen im Pellet verbringen, zu minimieren.
  2. hECT-Herstellung
    1. Verwenden Sie die Volumina in Tabelle 2 und passen Sie sie entsprechend der Anzahl der Zellen im Pellet so an, dass jeder hECT 1 Million Zellen enthält. Nach jedem Schritt langsam pipettieren, um Blasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.2.2-3.2.3 vor direktem Licht geschützt durch, da einige Komponenten lichtempfindlich sind.
    2. Bereiten Sie eine 2,9 g/ml Typ-1-Kollagenlösung in einem 1,7-ml-Mikroröhrchen vor, indem Sie 13,442 μl destilliertes Wasser, 4,4 μl 10x PBS und 0,638 μl 1 M NaOH hinzufügen. Fügen Sie 25,52 μl 5 mg/ml Kollagenstammlösung hinzu und mischen Sie sie langsam.
    3. Extrazelluläre Matrixmischung vorbereiten (ECM-Mischung aus Tabelle 2): 5,5 μl 0,2 N pH 9 HEPES-Lösung gefolgt von 5,5 μl 10x MEM hinzufügen. Gründlich mischen, bis eine gleichmäßige hellgelbe bis hellrosa Farbe zu sehen ist. 35,2 μl der ECM-Mischlösung in das Zellpellet überführen und 4,4 μl Basalmembranmatrix hinzufügen.
    4. Öffnen Sie den autoklavierten Beutel mit den Bioreaktorteilen (Schritt 1.4.7, Abbildung 4A). Tragen Sie Handschuhe, die mit 70%igem Ethanol sterilisiert sind, entfernen Sie die schwarze Grundplatte aus dem Autoklavenbeutel und stellen Sie sie mit den Vertiefungen nach oben in eine 60-mm-Schale. Pipettieren Sie 44 μl der Zellmischung langsam in jede Vertiefung, um das Eindringen von Blasen zu vermeiden. Verwenden Sie ggf. die Pipette, um Blasen zu entfernen, die durch das Pipettieren entstanden sind oder sich aufgrund der Hydrophobizität des PTFE gebildet haben. Stellen Sie das Volumen des hECT so wieder her, dass die Oberfläche der Flüssigkeit bündig mit der Lippe der Vertiefung abschließt (Abbildung 4BI).
    5. Ziehen Sie ein frisches Paar sterilisierter Handschuhe an und entfernen Sie den Polysulfonrahmen mit PDMS-Racks aus dem Autoklavenbeutel. Senken Sie den Rahmen so auf die Grundplatte, dass die Enden des Rahmens in die Nuten an den Enden der Grundplatte passen (Abbildung 4BII, III). Überprüfen Sie den Bioreaktor, um sicherzustellen, dass die Pfosten alle gerade sind und der Rahmen nicht gekippt ist, bevor Sie ihn in eine 60-mm-Schale stellen.
    6. Geben Sie 1 ml 10 % FBS in Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium in die 60-mm-Schale (achten Sie darauf, die hECTs nicht zu stören), um die Luftfeuchtigkeit in der Schale zu erhöhen, während sich die hECTs verfestigen. Stellen Sie die 60-mm-Schale ohne Deckel in eine 100-mm-Schale mit hohem Profil (20 mm hoch), decken Sie sie mit einem 100-mm-Schalendeckel ab und stellen Sie den Bioreaktor wieder in den 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator, damit das Kollagen mit den Zellen in Suspension ein Gel bilden kann.
    7. Nach 2 h nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator. Geben Sie 13 ml 10 % FBS in das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium und kippen Sie die Schale, damit das Medium zwischen der PTFE-Grundplatte und den PDMS-Racks fließen kann.
    8. Untersuchen Sie den Bioreaktor von der Seite, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen den hydrophoben Oberflächen der PTFE-Grundplatte und den PDMS-Racks eingeschlossen sind, und legen Sie die Schale wieder in den Inkubator zurück. Wenn Luft eingeschlossen ist, kippen Sie den Bioreaktor aus dem Medium, um die Blase platzen zu lassen, und senken Sie ihn langsam wieder ab, oder verwenden Sie eine Mikropipette mit einer Gelspitze, um die Luft abzusaugen, wobei Sie darauf achten sollten, die Pfosten nicht zu stören.
  3. Entfernen der Grundplatte
    1. Untersuchen Sie die hECT-Verdichtung durch den Spalt im Rahmen. Im Laufe von 24-96 h verdichten sich die hECTs und werden undurchsichtiger (Abbildung 4CI-III). Sobald ein sichtbarer Spalt zwischen den hECTs und der Wand der Grundplatte vorhanden ist (Abbildung 4CII), führen Sie zwei halbvolumige Medienwechsel durch, um das Medium ohne FBS in ein Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium umzuwandeln. Entfernen Sie die Grundplatte, wenn die hECTs um mindestens 30 % gegenüber dem ursprünglichen Durchmesser verdichtet sind (Abbildung 4CIII). Füllen Sie die 60-mm-Schale mit dem Bioreaktor mit Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium, bis die Flüssigkeit bündig mit dem Rand der Schale ist, und geben Sie 14 ml in eine neue 60-mm-Schale.
    2. KRITISCHER SCHRITT: Drehen Sie den Bioreaktor mit sterilen Handschuhen in seiner Schale um, so dass die Grundplatte oben liegt (Abbildung 4BIV). Auf eingeschlossene Luftblasen wie in Schritt 3.2.8 prüfen. Heben Sie die Grundplatte langsam an und halten Sie sie waagerecht (Abbildung 4BV).
    3. Wenn ein hECT beim Entfernen der Grundplatte abfällt, aber in der Grundplatte verbleibt, verwenden Sie eine sterile, gebogene feine Pinzette, um das hECT von der Grundplatte in die 60-mm-Schale zu übertragen. Verwenden Sie die Pinzette, um das Ende des hECT zu seinem Stift zu führen. Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um den Stift ruhig zu halten, und fädeln Sie ihn durch das Loch im hECT. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für den zweiten Beitrag.
    4. Wenn alle hECTs an den Pfosten befestigt sind, übertragen Sie den Rahmen mit den hECTs auf die neue 60-mm-Schüssel und platzieren Sie den Rahmen mit den Pfosten nach unten (Abbildung 4BVI). Inspizieren Sie den Bioreaktor, um sicherzustellen, dass die hECTs auf ihren Pfosten in der Nähe der SPoTs verbleiben.
    5. Wenn ein hECT durch die Oberflächenspannung an die Basis seiner Pfosten gedrückt wurde, stabilisieren Sie den Rahmen mit einer sterilen, gebogenen Pinzette. Führe die andere Pinzette durch den Schlitz im Rahmen und halte ihn geschlossen. Sobald die Spitze der Pinzette an den PDMS-Racks vorbeigesenkt wurde, drehen Sie sie so, dass sie den Stift erreicht, und drücken Sie den hECT mit den geschlossenen Spitzen vorsichtig in Richtung des Endes des Stifts, bis er auf dem SPoT aufliegt (Abbildung 4BVI, Einschub).
  4. hECT-Wartung
    1. Führen Sie alle 24-48 Stunden einen halbvolumigen Mediumwechsel mit Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium durch (nach 2 Wochen Kultur kann die Häufigkeit auf zweimal pro Woche reduziert werden).
    2. Wenn die hECTs Cluster von spontanem Schlagen zeigen, typischerweise an Tag 3, und koordiniertes Schlagen mit sichtbarer Nachablenkung an Tag 5, beginnen Sie mit den funktionellen Messungen und wiederholen Sie sie so oft wie gewünscht.
      HINWEIS: Es ist unwahrscheinlich, dass hECTs, die bis zum 7. Tag mit dem koordinierten Schlagen begonnen haben, dies überhaupt tun.
Bestandteil Volumen (μl)
destilliertH2O 13.442 2,9 mg/ml Kollagenlösung "ECM-Mix" Endgültige hECT-Zellmischung
NaOH 1N 0.638
PBS 10x 4.4
5 mg/ml Kollagen-Brühe 25.52
0,2 N pH 9 HEPES 5.5
10x MEM 5.5
Volumen der ECM-Mischung, die auf das Zellpellet übertragen werden soll 35.2
Volumen von Matrigel 4.4

Tabelle 2: hECT-Reagenzien. Die Komponenten sollten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt und auf Eis gelegt werden.

Figure 4
Abbildung 4: Bioreaktor-Montage und hECT-Herstellung. (A) (I) Zwei PDMS-Racks (links, hellblau), die auf dem Polysulfonrahmen (rechts, hellbraun) montiert sind. (II) Die PTFE-Grundplatte (schwarz, links) passt dann so auf den Rahmen (rechts), dass jedes Pfostenpaar in eine Vertiefung der Grundplatte passt. (B) (I) Vierundvierzig Mikroliter Kardiomyozytensuspension in kollagenbasierter extrazellulärer Matrix werden zu jeder der sechs Grundplattenvertiefungen hinzugefügt. (II,III) Der Rahmen mit PDMS-Racks wird auf die Grundplatte eingepresst. Nach 1-4 Tagen können die hECTs von der Grundplatte entfernt werden. (IV) Zuerst wird der Bioreaktor umgedreht, bevor (V) die Grundplatte vom Rahmen abgehoben wird. (VI) Seitenansicht des Bioreaktors mit sechs hECTs. Einschub: Vergrößerte Ansicht, die die hECT-Position auf den Pfosten relativ zu den SPoTs anzeigt (Einschub). (C) CAD-Rendering, das drei Stufen der hECT-Verdichtung ([I] niedrig, [II] mittel und [III] hoch) zeigt, wie sie durch die Lücke im Polysulfonrahmen gesehen werden. Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; PDMS = Polydimethylsiloxan; PTFE = Polytetrafluorethylen; SPoT = stabiler Post-Tracker; hECT = menschlich hergestelltes Herzgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. hECT-Stimulationsgeräte

  1. Jacke für die beheizte Bühne
    1. Schneiden Sie mit einer Laserschneidmaschine die Bestandteile des Acryl-Isoliermantels aus einer 0,635 cm dicken durchsichtigen Acrylplatte (Ergänzungsdatei 3), je eine von Abbildung 5A-D und je zwei von Abbildung 5E, F.
    2. Bauen Sie die Teile (B), (C), (D) und eines von (E) aus Abbildung 5 zusammen und kleben Sie sie mit Acrylkleber zusammen, wie in Abbildung 5GI gezeigt. Befestigen Sie die obere Platte (Abbildung 5GII), warten Sie einige Stunden, bis der Kleber ausgehärtet ist, und schieben Sie dann den beheizten Tisch in die Seite des Mantels (Abbildung 5GIII).
    3. Sobald der Mantel angebracht ist, befestigen Sie die Einsätze mit Klebeband zwischen den Beinen der beheizten Bühne und fügen Sie die Frontplatte hinzu (Abbildung 5GIV), um die Montage abzuschließen (Abbildung 5GV).
  2. Herstellung von Graphitelektroden
    1. 6,25 mm dicke, 25 mm breite Graphitstäbe mit einer Bandsäge in 35 mm lange Blöcke schneiden; Schneiden Sie dann jeden Block der Länge nach in einer gekrümmten Linie ab, so dass jede Elektrode an einem Ende 13-16 mm und am anderen Ende 8-10 mm hoch ist. Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von 0,7 mm in die obere Ecke (Abbildung 6AI). Polieren Sie die Stücke mit Papiertüchern und beschallen Sie sie 20 Minuten lang in Wasser, um Graphitstaub zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass sich die Elektroden zwischen den Wänden der Schale und dem 25 mm breiten Bioreaktor verkeilen, um einen gleichmäßigen Abstand zwischen den Elektroden zu gewährleisten (Abbildung 6AII).
    2. Fädeln Sie einen 150 mm langen Stahldraht mit einem Durchmesser von 0,25 mm durch die Löcher der Elektroden und biegen Sie ihn so, dass er über den Rand der 60-mm-Schale und um die Wände der 100-mm-Schale passt, so dass der Deckel geschlossen werden kann (Abbildung 6AII).
    3. Reinigen Sie die Elektroden, indem Sie sie nach jedem Gebrauch 1-2 Stunden lang in destilliertem Wasser einweichen, um das absorbierte Medium zu entfernen, lassen Sie sie über Nacht trocknen und autoklavieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei 132 °C. Bevor Sie mit den Messungen beginnen, platzieren Sie eine Elektrode auf jeder Seite des Bioreaktors (Abbildung 6AII). Positionieren Sie die Drähte so, dass der 100-mm-Schalendeckel geschlossen werden kann, und setzen Sie den Bioreaktor zum Ausgleich in den Inkubator zurück.

Figure 5
Abbildung 5: Acrylmantel zur Isolierung der beheizten Glasbühne. CAD-Bilder, die die wichtigsten Abmessungen der Teile des Acrylmantels zeigen, der für den Glastisch entworfen wurde. (A) Die obere Platte hat einen 27 cm x 18,5 cm großen Lochausschnitt, damit die Bioreaktorschale auf dem Heizelement sitzen kann. Die orangefarbenen Rechtecke in den Ecken weisen auf die vorgeschlagene Platzierung kleiner Abstandsstücke hin, um Platz zwischen der Oberseite des Mantels und dem Heizelement zu schaffen. (B) Das untere Teil der Jacke hat zwei Aussparungen, damit die Beine der beheizten Bühne hineingleiten können (grüne Sternchen). (C&D) Unter das Oberteil passen zwei Seitenteile. (D) Auf der linken Seitenwand befindet sich ein 3 cm x 0,3 cm großer Ausschnitt (Einschub) für das Netzkabel der Bühne. (E) Lange Paneele passen auf die Vorder- und Rückseite. (F) Einsätze werden hinzugefügt, um die Lücken zu füllen, sobald sich der Tisch im Inneren befindet. (G) (I) Die Seiten- und Rückwände werden am unteren Teil befestigt und dann (II) die obere Platte hinzugefügt. (III) Der Glastisch wird in den Mantel geschoben (magentafarbene Pfeile). (IV) Die Einsätze werden zwischen den Beinen des Tisches befestigt, und die Rückseite passt auf die Öffnung, um die Box zu schließen. (V) Die fertige Mantelbaugruppe. Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; R = Radius; Ø = Durchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Datenerfassung der hECT-Kontraktion. (A) (I) Fotos der Elektroden, die aus Graphitstäben geschnitten wurden. Die magentafarbenen Pfeile zeigen Löcher für die Befestigung der Edelstahldrähte an. Maßstabsbalken = 1 cm. (II) Schrägansicht (links) und Draufsicht (rechts) zeigt die Platzierung der Graphitelektroden im Bioreaktor. Die Elektroden nehmen den Raum zwischen dem 25 mm breiten Bioreaktor und der Wand der Schale ein, um einen gleichmäßigen Abstand zwischen den Elektroden zu gewährleisten. Die Drähte sind gebogen, um das Schließen des Schalendeckels zu ermöglichen. (B) Foto des hECT-Stimulationsaufbaus in der sauberen Laminar-Flow-Bank - alle Geräte werden auf dem Schwingungsisolationstisch platziert, um Vibrationsgeräusche von der sauberen Bank zu reduzieren. Der Bioreaktor (magentafarbene Pfeilspitze) sitzt auf der ummantelten beheizten Bühne, die von einer LED-Lichtquelle von oben beleuchtet wird. Das Präpariermikroskop ist horizontal auf einen rechtwinkligen Spiegel (orangefarbenes Sternchen) gerichtet, um den Bioreaktor von unten zu betrachten, und ist mit einer CCD-Kamera (links) ausgestattet. Die türkisfarbene Halterung zeigt ein Wasserbad für die kontinuierliche Temperaturüberwachung an, um eine Rückmeldung an den beheizten Tischregler mit geschlossenem Regelkreis zu geben. Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue; LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. hECT-Funktionsmessungen

  1. Einrichten des Pacing-Arbeitsbereichs
    1. Schalten Sie den beheizten Tisch auf 39,5 °C ein und stellen Sie das Schrittmachergerät auf einem Schwingungsisolationstisch in einer Laminar-Flow-Reinbank gemäß Abbildung 6B auf. Montieren Sie das Präpariermikroskop auf einem Auslegerstativ und richten Sie es auf einen rechtwinkligen Spiegel (Abbildung 6B, orangefarbenes Sternchen), der sich auf einer Laborbuchse unter dem Glastisch befindet, um den Bioreaktor von unten zu betrachten. Befestigen Sie eine Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera am Mikroskop und schließen Sie sie an den Computer an. Bestrahlen Sie das Setup 15 Minuten lang mit UV-Licht, um den Arbeitsbereich zu sterilisieren.
    2. Platzieren Sie den Bioreaktor (Abbildung 6B, magentafarbene Pfeilspitze) auf der ummantelten beheizten Bühne, die von einer LED-Lichtquelle mit zwei Köpfen beleuchtet wird (die Hälse von LED-Lampen können im Vergleich zu den Glasfaserlampen sicherer an der Haupteinheit befestigt werden). Minimieren Sie zusätzliche Geräusche, indem Sie sicherstellen, dass die Schrittmacherausrüstung auf dem Vibrationstisch (und der Tisch selbst) keinen Teil der Laminar-Flow-Reinigungsbank berührt.
    3. Stellen Sie eine zweite 60-mm-Schale mit vorgewärmtem Wasser in einer 100-mm-Schale auf den beheizten Tisch (Abbildung 6B, türkisfarbene Klammer) und statten Sie sie mit einem Temperaturfühler zur kontinuierlichen Temperaturüberwachung aus. Passen Sie die Temperatureinstellung des beheizten Tisches nach Bedarf an, um die Temperatur der Referenzschale bei 36-37 °C zu halten.
    4. Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops auf 1,5x ein (oder eine andere gewünschte Vergrößerung, mit der ein hECT in seiner Gesamtheit mit ausreichender Auflösung visualisiert werden kann).
  2. Anpassen der Kameraeinstellungen
    1. Öffnen Sie die Kamerasoftware. Ändern Sie die Größe des Video-Feeds, um das Sichtfeld so weit wie möglich zuzuschneiden und gleichzeitig ein ganzes hECT zu visualisieren. Dadurch wird die Kamerageschwindigkeit maximiert.
    2. Stellen Sie die Aufnahmerate auf 90 Bilder pro Sekunde ein. Passen Sie die Belichtungszeit und die Position der Lichtquelle an, um die Gleichmäßigkeit der Lichtverhältnisse über das gesamte Sichtfeld zu optimieren und den Kontrast der SPoTs zu maximieren.
  3. Einrichtung der Erfassungssoftware
    1. Schalten Sie den Rechteckimpulsstimulator ein und schließen Sie ihn an den Computer an. Passen Sie die Einstellungen so an, dass zweiphasige Impulse mit einer Amplitude von 12 V und einer Dauer von 5 ms geliefert werden.
    2. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware, und öffnen Sie dann die Datei "AutomatedPostTracking3.vi" (Zusatzdatei 4). Klicken Sie nach dem Laden auf den weißen Pfeil auf der linken Seite der Symbolleiste, um das Programm zu initialisieren (Abbildung 7A).
    3. Kalibrieren Sie die Software mit einem Glashämozytometer auf dem beheizten Tisch. Klicken Sie in der Symbolleiste (Abbildung 7B) auf das Linienwerkzeug, um eine Linie über 1 mm der Hämozytometermarkierungen zu ziehen (nicht dargestellt). Legen Sie im Feld Abstandskalibrierung (Pixel/mm) (Abbildung 7C) die Referenzlänge (mm) auf 1 fest, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Berechnen.
    4. Messen Sie die hECT-Querschnittsfläche, indem Sie mit dem Linienwerkzeug eine Linie über die Breite des Gewebes ziehen. Klicken Sie auf die 1 im Feld Querschnittsfläche (mm^2) (Abbildung 7D), um die Fläche zu berechnen (unter der Annahme einer zylindrischen Geometrie der linearen Gewebestreifen, wie sie in der Literatur festgelegt ist 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Wiederholen Sie den Vorgang an verschiedenen Stellen des hECT und notieren Sie die Werte unter den beiden anderen Schaltflächen im Feld. Die Ausgabedatentabellendatei gibt den Durchschnitt dieser drei Werte an, um den Durchmesser des Gewebes zu berechnen.
  4. hECT-Funktionscharakterisierung
    1. Stellen Sie sicher, dass die Beitragstipps im Fokus sind. Schalten Sie den Schwellenwertschalter ein (Abbildung 7E), und passen Sie den Schieberegler (Abbildung 7F) an, bis die SPoTs (Abbildung 7G) gut abgegrenzt sind und ihre Form nicht ändern, wenn sich der hECT zusammenzieht.
    2. Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug , um ein Rechteck um eines der SpoTs zu zeichnen (Abbildung 7, grünes Rechteck), und klicken Sie auf die Schaltfläche Set 1 im Feld Postbegrenzungen (Abbildung 7H), um die Rechteckposition um das SPoT festzulegen und sicherzustellen, dass das SPoT jederzeit innerhalb der Begrenzung des Rechtecks bleibt. Wiederholen Sie den Vorgang für den anderen Beitrag und zeichnen Sie ihn unter Satz 2 auf.
    3. Passen Sie die Einstellungen für die Objektgröße an (Abbildung 7I), um zu verhindern, dass das Programm kleinere Objekte verfolgt. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Objekte, die in jedem Rechteck verfolgt werden, konstant bleibt. Die Schnittstelle (Abbildung 7J) zeigt den gemessenen Abstand zwischen den verfolgten Objekten in Echtzeit an. Verwenden Sie dieses Diagramm, um das Rauschen zu überwachen.
    4. Wählen Sie ein Verzeichnis aus, in dem die Dateien gespeichert werden sollen (Abbildung 7K). Speichern Sie Daten von verschiedenen Tagen in separaten Ordnern. Wählen Sie die aktuelle Tissue-Nummer aus und schreiben Sie die gewünschten Kommentare in das Feld Kommentare .
    5. Geben Sie unter der Überschrift Stimulationsfrequenz (Hz) (Abbildung 7L) den gewünschten Frequenzbereich (Min und Max) und das gewünschte Intervall für den Schritt von Min zu Max an. Wenn Sie die hECTs über ihren gesamten Erfassungsbereich takten, testen Sie verschiedene Stimulationsfrequenzen, um die niedrigste Frequenz zu finden, bei der ein Stimulus-Spitze-Verhältnis von 1:1 erreicht wird, und erhöhen Sie die Frequenz weiter, bis dieses Verhältnis verloren geht. Messen Sie die spontane Funktion , indem Sie einen beliebigen Frequenzbereich wählen (z. B. 0,01 Hz bis 0,01 Hz) und den Ausgang des Rechteckimpulsstimulators ausgeschaltet lassen.
    6. Wählen Sie in den Feldern auf der rechten Seite die gewünschte(n) Einstellzeit(en) aus (ein Zeitintervall nach dem Einstellen der Frequenz, aber es werden keine Daten aufgezeichnet), damit sich der hECT an die neue Schrittfrequenz anpassen kann. Geben Sie die Aufnahmezeit(en) und die Stimulationsspannung (V) an. Starten Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Programm starten klicken (Abbildung 7M).
      HINWEIS: Die Ergebnisse werden automatisch im ausgewählten Verzeichnis gespeichert. Beachten Sie, dass das Skript nach jeder Aufnahme die Fourier-Transformation der Daten anzeigt (Abbildung 7N), wobei die Spitzen der erkannten Schwebungsfrequenz entsprechen.
    7. Falls gewünscht, führen Sie das Programm "Excitation Threshold Finding" aus, um die Mindestspannung zu ermitteln, die erforderlich ist, um das angezeigte hECT zu stimulieren (Abbildung 7O). Falls gewünscht, berechnen Sie die maximale und minimale Durchbiegung der Pfosten (Abbildung 7P).

Figure 7
Abbildung 7: Schnittstelle zur Datenerfassung nach der Ablenkung. (A) Schaltfläche zum Ausführen der Software. (B) Symbolleiste mit den Linien- und Rechteckwerkzeugen für die Längenmessung bzw. Objektauswahl. (C) Steuerung der Abstandskalibrierung. (D) Werkzeuge zur Messung der hECT-Querschnittsfläche an drei verschiedenen Punkten. (E) Schwellwertschalter und (F) Schieberegler zum Umwandeln des Video-Feeds in kontrastreiche Bilder in Echtzeit. (G) Ein SPoT, der im Vorschaufenster sichtbar ist. (H) Werkzeuge zur Auswahl der SPoTs. (I) Schieberegler zum Filtern der Objekte nach Größe. (J) Diagramm, das den gemessenen Abstand zwischen den verfolgten Objekten in Echtzeit anzeigt. (K) Optionen zur Auswahl des Verzeichnisses, in dem die Ausgabedateien gespeichert werden sollen. (L) Optionen zum Einstellen des Frequenzbereichs, des Frequenzintervalls, der Aufnahmezeit und der Einstellzeit zwischen den Aufnahmen für das Post-Tracking-Programm (M). (N) Graphische Ausgabe der Fourier-Transformation der Auslenkungskurve der zuletzt gespeicherten Aufnahme. (O) Programm zur Ermittlung der Mindestspannung, die zur Stimulation der hECTs erforderlich ist. (P) Programm zur Berechnung der maximalen und minimalen Durchbiegungen der Pfosten. Abkürzungen: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue; SPoT = stabiler Post-Tracker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. PDMS-Rack-Messungen

  1. Unbelastete Strecken
    1. Montieren Sie vor der hECT-Fertigung das gewünschte Paar PDMS-Racks auf einem Rahmen. Verwenden Sie das in Schritt 5.1 beschriebene Pacing-Setup und die Software für die funktionellen Messungen. Wählen Sie die stationären SPoTs an den Enden der Pfosten aus.
    2. Passen Sie bei Bedarf die Lichtquelle und/oder den Schwellwert an, um das Rauschen auf <2 μm zu reduzieren. Notieren Sie den durchschnittlichen Live-y-Wert, der im Diagramm angezeigt wird, in einer Tabelle.
  2. Pfostenhöhen und hECT-Höhen
    1. Entfernen Sie aus dem in Schritt 5.2 beschriebenen Stimulations-Setup den abgewinkelten Spiegel und den beheizten Tisch. Platzieren Sie den Bioreaktor direkt auf der Laborbuchse, um eine Seitenansicht des Bioreaktors zu erhalten.
    2. Öffnen Sie die Kamerasoftware. Passen Sie die Belichtungszeit und die Position der Lichtquelle an, um die Gleichmäßigkeit der Lichtverhältnisse im gesamten Sichtfeld zu optimieren und die Sichtbarkeit der Beiträge zu maximieren.
    3. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware, und öffnen Sie dann die Datei "PostMeasurement_PB3.vi" (Zusatzdatei 5). Sobald es geladen ist, klicken Sie auf den weißen Pfeil auf der linken Seite der Symbolleiste , um das Programm zu initialisieren.
    4. Kalibrieren Sie die Software mit einem Glashämozytometer. Klicken Sie auf das Linienwerkzeug in der vertikalen Symbolleiste links neben dem Anzeigefenster und ziehen Sie eine Linie über 1 mm der Hämozytometermarkierungen. Legen Sie im Feld Entfernungskalibrierung (Pixel/mm) unten links auf dem Bildschirm die Referenzlänge (mm) auf 1 fest, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Berechnen .
    5. Stellen Sie unterhalb der Kalibrierungsfelder die gewünschte Gewebenummer (zur Identifikation) im Feld Gewebenummer ein. Fokussieren Sie die Kamera auf den linken Pfosten des hECT, und wählen Sie Links im Feld Pfostenseite aus.
    6. Verwenden Sie das Linienwerkzeug , um eine Linie von der Basis des Pfostens (oben) bis zur Spitze des SPoTs (unten) zu ziehen, und zeichnen Sie auf, indem Sie auf Measure Post Ht klicken.
    7. Ziehen Sie eine Linie von der Basis des Pfostens bis zum äußersten Rand des hECT und zeichnen Sie auf, indem Sie auf Measure Tissue Top Ht klicken. Ziehen Sie eine Linie von der Basis des Stifts bis zum nahen Rand des hECT, und zeichnen Sie auf, indem Sie auf Measure Tissue Base Ht klicken.
    8. Drehen Sie an dieser Stelle den Bioreaktor um, um die richtige Pfostenhöhe zu messen. Wählen Sie die richtige Post-Option , um die gleichen Messungen aufzuzeichnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen , um die Tabelle mit den gemessenen Werten zu füllen und automatisch die durchschnittliche Höhe des hECT zu berechnen, die in Schritt 7 verwendet wird.
    9. Wenn Sie mit der Aufzeichnung der Gewebehöhen fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern, um die Werte in einer Textdatei zu speichern.

7. Funktionale Datenverarbeitung mit benutzerdefinierten Analyseskripten

  1. Füllen Sie in einem Tabellenkalkulationseditor die Zusammenfassungsdatei mithilfe der Vorlage (Ergänzungsdatei 6) aus. Verwenden Sie die in Schritt 6.2 ermittelten Werte für die Stiftlänge und die durchschnittliche Gewebehöhe . Stellen Sie sicher, dass alle hECTs, die Daten im Ordner enthalten, in der Zusammenfassungsdatei dargestellt werden. Nennen Sie die Datei "Zusammenfassung #.csv", wobei # sich auf die Anzahl der Tage nach Beginn des Experiments bezieht.
    HINWEIS: Die hECT-Funktionsdaten müssen sich je nach Versuchstag in separaten Ordnern befinden.
  2. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Ordner mit den AnalyzeLogsGUI-Skripten (Ergänzungsdatei 7) als auch der Ordner mit den hECT-Aufzeichnungen dem Pfad hinzugefügt werden.
  3. Öffnen Sie die Datenanalyse-Software. Klicken Sie links neben der Verzeichnisleiste auf die Schaltfläche Ordner suchen , um zum übergeordneten Ordner zu navigieren, der sowohl den Ordner AnalyzeLogsGUI als auch die hECT-Funktionsdaten enthält. Klicken Sie in der Seitenleiste des aktuellen Fensters mit der rechten Maustaste auf diese Ordner, um zu Pfad hinzufügen | Fügen Sie ausgewählte Ordner und Unterordner hinzu.
  4. Öffnen Sie die Datei "AnalyzeLogsGui_SC.m". Klicken Sie auf der Registerkarte Editor auf die Schaltfläche Ausführen und warten Sie, bis die grafische Benutzeroberfläche (GUI) in einem neuen Fenster angezeigt wird.
    1. Klicken Sie im Feld Protokollauswahl (Abbildung 8AI) auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen , und navigieren Sie zu dem Ordner, der die hECT-Funktionsdaten enthält. Wählen Sie den gewünschten hECT, der verarbeitet werden soll, aus dem Dropdown-Menü Gewebe aus.
    2. Geben Sie im Feld Dateneingaben (Abbildung 8AII) den unbelasteten Abstand zwischen den in Schritt 6.1 aufgezeichneten Pfosten in das Feld Diastolische Entfernung ein. Geben Sie 0,25 in das Feld Pfostenradius (mm) ein.
    3. Wählen Sie im Feld Analyseeinschränkungen (Abbildung 8AIII) die Häufigkeiten aus, die aus der Analyse ausgeschlossen werden sollen , oder wählen Sie bestimmte Häufigkeiten aus, die einbezogen werden sollen (durch Kommas getrennt). Die Start- und Endzeit sind standardmäßig auf 0 bzw. −1 gesetzt, um die gesamte Länge der Aufnahmen zu verarbeiten. Ändern Sie diese Werte, um die Aufzeichnungen bei Bedarf zu kürzen.
    4. Ändern Sie die Filterparameter (Abbildung 8AIV) von Polynomiale Ordnung und Framegröße , um den Grad der Glättung während des Filtervorgangs zu ändern, und den Schieberegler Peak-Erkennungsschwellenwert , um die minimale Peakgröße festzulegen, die von den Skripten erkannt wird.
      HINWEIS: Das Skript enthält die Option "Spike Removal", mit der hohe Spitzen abgeschnitten werden, die durch Artefakte verursacht wurden. Dies wird jedoch nicht empfohlen, da es die Form der Zuckungen verändert. Entfernen Sie stattdessen Artefakte, indem Sie die Aufzeichnung zuschneiden (Abbildung 8AIII).
    5. Verwenden Sie zusätzliche Optionen (Abbildung 8AV) für zusätzliche Datenanalyseausgaben: Analyse nach der Durchbiegung , um einen zusätzlichen Algorithmus zur Erkennung von Spitzenwerten auszuführen, automatische Skalierung der y-Achse in Zoomdiagrammen , um die Achsen auf der Zuckungskraftkurve automatisch anzupassen (Abbildung 8B), Speichern von Kraft-Spur-Kurven , um jede Zuckungskraftfigur in einer .fig-Datei zu speichern, und Speichern von Kraft-Zeit-Daten , um die X- und Y-Koordinaten der gefilterten Daten zu speichern, die in der Abbildung "Twitch Force Curve" dargestellt sind.
    6. Klicken Sie auf Analyse ausführen , um eine .txt Datei zu generieren, die die Attribute der Zuckungskraftkurve (Ergänzungsdatei 8) enthält, gemittelt über eine gesamte Aufzeichnung.

Figure 8
Abbildung 8: Berechnung der Twitch-Kraftkurve. (A) Wenn Sie die Datei "AnalyzeLogsGUI.m" in der Datenverarbeitungssoftware ausführen, wird das GUI-Fenster geöffnet. (I) Das Feld "Protokollauswahl " ermöglicht es dem Benutzer, das Verzeichnis für den Ordner auszuwählen, der die hECT-Funktionsdaten enthält. Das Feld "Day Num " wird automatisch aus dem Titel der Zusammenfassungsdatei ausgefüllt, die in Protokollschritt 7.1 erstellt wurde. Der zu verarbeitende hECT wird über das Dropdown-Menü Gewebe ausgewählt. (II) Das Feld "Dateneingaben " enthält Informationen über das Paar von PDMS-Pfosten, die das hECT unterstützen, wie z. B. den unbelasteten Abstand (ermittelt in Protokollschritt 6.1) und den Pfostenradius (0,25 mm). (III) Das Feld "Analysis Constraints" ermöglicht es dem Benutzer, die Frequenzen auszuwählen, die weggelassen oder eingeschlossen und gekürzt werden sollen. (IV) Das Feld "Filterparameter " enthält die Optionen, mit denen Sie auswählen können, wie die rohe Zuckungskraftkurve gefiltert wird. Die Polynomordnung und die Rahmengröße ändern den Grad der Glättung während des Filtervorgangs. Der Schieberegler Peak Detection Threshold bestimmt die minimale Peakgröße, die von den Skripten erkannt wird. Mit der Option "Stachel entfernen " werden hohe Spitzen abgeschnitten, die durch Artefakte verursacht werden. (V) Zu den zusätzlichen Optionen gehören die Analyse nach der Durchbiegung, die einen zusätzlichen Algorithmus zur Erkennung von Spitzenwerten ausführt, die automatische Skalierung der y-Achse in Zoom-Diagrammen, die auf die Zuckungskraftkurve wirkt, das Speichern von Kraft-Spur-Kurven, das die Zuckkraftzahlen speichert, und das Speichern von Kraft-Zeit-Daten, das die geplotteten Zuckungskraftdaten speichert. (B) Beispiel für die Zuckungskraftkurve einer 30-s-Aufzeichnung eines hECT mit einer Geschwindigkeit von 1 Hz, die durch den GUI-Screenshot von Panel A erzeugt wird. Die rote Zuckungskraftkurve zeigt die gefilterte Kraft, die von den Parametern in AIV erzeugt wird, überlagert mit der rohen Zuckungskraftkurve (dunkelblaue Kurve, wird angezeigt, wenn die Option "Ungefilterte Daten anzeigen " in AV ausgewählt ist). Abkürzungen: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue; GUI = grafische Benutzeroberfläche; PDMS = Polydimethylsiloxan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nach dem oben genannten Protokoll wurden Kardiomyozyten aus einer gesunden iPSC-Linie generiert, die zuvor von unserer Gruppe 9,15 verwendet wurde, und nach 8-61 Tagen in Kultur zu hECTs fabriziert. Abbildung 9A zeigt repräsentative Bilder von hECTs von unten, die ohne (oben) und mit (unten) SPoTs erstellt wurden. Die funktionellen Messungen wurden bei Raumtemperatur (23 °C) und bei physiologischer Temperatur (36 °C) zwischen 37 und 52 Tagen nach der hECT-Herstellung durchgeführt. Bei der Herstellung der PDMS-Racks haben wir dokumentiert, dass ein erfahrener Benutzer eine Ausbeute von 80 % in PDMS-Racks erwarten kann, wenn alle sechs Pfosten intakt sind, und eine Gesamtausbeute von 95 % von mindestens fünf Pfosten (basierend auf drei Benutzern in unserem Labor), mit einer Variabilität von <3 % in der Pfostenhöhe.

Die SPoTs lieferten eine einzige definierte Form, die während der Datenerfassung verfolgt werden sollte (Abbildung 9B und ergänzendes Video S1), im Vergleich zu den fragmentierten Formen der Markertinte, die nicht gut an den Spitzen der PDMS-Pfosten haftet (ergänzendes Video S2)27. In einigen extremen Fällen kann das Tracking-Objekt sogar verdeckt sein (Abbildung 9C, obere Reihe). Diese Unregelmäßigkeiten führen zu einem starken Rauschen, das die Zuckkraftkurve verdeckt und so die genaue Messung der entwickelten Kräfte unter 10 μN verhindert. Um dies zu korrigieren und eine konsistente Verfolgung dieser Formen zu gewährleisten, sind in der Regel viele Anpassungen des Beleuchtungswinkels und der Beleuchtungsposition erforderlich, um den Kontrast und die Klarheit zu optimieren. Die Dunkelheit und Regelmäßigkeit der SPoT-Formen rationalisieren diesen Prozess und reduzieren so die Erfassungszeit um ca. 50 % (von ~12-30 min auf 5-10 min pro hECT für einen typischen Erfassungsbereich von 1 Hz bis 4 Hz). Darüber hinaus lieferten die SPoTs in dieser Arbeit eine zuverlässigere Form für die optische Nachführung, und die Reduzierung des Rauschens ermöglichte die Messung von schwachen Geweben mit einer entwickelten Kraft von nur 1 μN, was einer Nachablenkung von weniger als 5 μm entspricht (Abbildung 9D), sowie die Verringerung der Variabilität zwischen den Messungen desselben hECT27.

Unserer Erfahrung nach tritt der Probenverlust in Längsschnittexperimenten typischerweise durch das Abrutschen der hECTS von den Enden der invertierten PDMS-Stifte auf. Dieses Abrutschen der hECTs tritt in der Regel auf, wenn die hECTs von der Grundplatte entfernt werden (Abbildung 4BV, 1-4 Tage nach der hECT-Herstellung) oder sogar später im Experiment (1-3 Wochen nach der hECT-Herstellung), wenn die hECTs kompakt und reif sind. Diese Reifung der hECTs übt manchmal genug passive und aktive Spannung auf die flexiblen Stifte aus, so dass sich die hECTs vom Ende eines Stifts abziehen, was zu einem nutzlosen Gewebeklumpen führt, der um den gegenüberliegenden Stift herum verdichtet ist (Abbildung 9E). Die SPoTs bieten eine Kappengeometrie, die hECT-Verluste verhindert (Abbildung 9F), wie in Abbildung 9G quantifiziert. Bei den 103 Bioreaktoren, die im Laufe von 2 Jahren (jeweils mit drei bis sechs hECTs zu Beginn) erstellt wurden, behielten die PDMS-Racks ohne SPoTs durchschnittlich 95 % der hECTs in 66 Bioreaktoren. Während die meisten Bioreaktoren jedoch keinen Gewebeverlust aufwiesen, verloren einige Bioreaktoren 30 % bis 100 % der hECTs (oft, wenn ein einzelner Bioreaktor eine ganze Versuchsgruppe repräsentiert), was zu einer erheblichen Ineffizienz führte. In dieser Arbeit eliminierten die SPoTs effektiv den hECT-Verlust und verbesserten so die Retentionsrate signifikant auf 100 % über 37 Bioreaktoren (p = 0,038)27.

Figure 9
Abbildung 9: Verbesserung der Qualität der Post-Deflection-Daten und Erhöhung der hECT-Retention durch Hinzufügen von SPoTs zu den PDMS-Posts. (A) Unteransicht von hECTs ohne (oben) oder mit (unten) SPoTs. (B,C) Nahaufnahmen eines Endes eines hECT auf einem Pfosten, von unterhalb des Bioreaktors betrachtet, wobei die Schwellenwerteinstellungen in der rechten Spalte die gleichen wie bei der Datenerfassung sind. Die roten Kästchen zeigen Objekte an, die von der Post-Tracking-Software verfolgt werden können. (B) Vergleich der verfolgbaren Rahmenmarken auf einem Pfosten mit Markertinte im Vergleich zu SPoT. (C) Entspannte und kontrahierte hECTs an Pfosten mit Markertinte (obere zwei Zeilen) oder mit SPoTs (untere zwei Zeilen). (D) Beispiel für die Zugkraftverfolgung eines hECT, das elektrisch bei 1 Hz mit einer entwickelten Kraft von 1 μN schlägt, was einer Auslenkung von weniger als 5 μm entspricht (blaugrün: ungefilterte Leiterbahn; magenta: gefilterte Leiterbahn). (E) Schrägansicht eines Bioreaktors ohne SPoT, bei dem hECTs von einem ihrer Pfosten rutschten, was zu einem Gewebeklumpen führte, der sich um den gegenüberliegenden Pfosten bildete (türkisfarbene Pfeilspitzen). (F) Foto eines Bioreaktors mit SPoTs, die eine 100%ige hECT-Retention zeigen. (G) Punktdiagramm der Geweberetention pro Bioreaktor für PDMS-Racks (mit jeweils drei bis sechs hECTs) ohne SPoTs (n = 322 hECTs, 66 Bioreaktoren) und PDMS-Racks mit SPoTs (n = 134 hECTs, 37 Bioreaktoren), einschließlich Daten von Bioreaktoren mit Gewebeversagen während der Basisplattenentfernung (Tage 1-4) und später im Kulturprozess (Tage 4-15). *p = 0,038; Diamant gibt den Mittelwert an. Maßstabsbalken = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzungen: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue; SPoT = stabiler Post-Tracker; GUI = grafische Benutzeroberfläche; PDMS = Polydimethylsiloxan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Als Beispiel für die Anwendung der oben genannten Methoden zeigen wir auch, wie wichtig es ist, die hECT-Funktion bei physiologischer Temperatur (36 °C) und nicht bei Raumtemperatur (23 °C) zu messen. Es wurde festgestellt, dass die hECT-Funktion über eine längere Kulturzeit im aktuellen Stimulationsaufbau mit dem beheizten Tisch stabil ist (Abbildung 10A)27. Im Vergleich zu Messungen bei physiologischer Temperatur zeigten hECTs eine veränderte Kontraktionsdynamik bei Raumtemperatur mit langsameren Kontraktions- und Relaxationsraten (dargestellt durch die Steigungen der Peaks in Abbildung 10B).

In dieser Arbeit zeigte 1 von 10 hECT eine hypothermische Inotropie (bei der die entwickelte Kraft bei 23 °C höher war als bei 36 °C), jedoch nur bei niedrigen Frequenzen. Wenn die hECT mit 1,5 Hz getaktet wurde, hatte sie eine stärker entwickelte Kraft bei 36 °C (keine hypotherme Inotropie) und eine vollständige Entspannung zwischen den Zuckungen (flache Interpeak-Bereiche der Zuckungskraftkurve, rechtes Bild), aber eine unvollständige Entspannung zwischen den Kontraktionen bei 23 °C (erhöhte passive Kraft zwischen den Peaks, linkes Bild) (Abbildung 10BI). Wenn die hECT mit 0,75 Hz beschleunigt wurde, lag eine hypotherme Inotropie vor (Abbildung 10BII), und es wurde beobachtet, dass sich die hECT zwischen den Kontraktionen vollständig entspannte, selbst bei 23 °C (linkes Bild). Definitive frequenzangepasste Vergleiche der hECT-Funktion waren jedoch schwierig, da der Erfassungsbereich der meisten hECTs eine minimale Überlappung über die Temperaturen hinweg aufwies (Abbildung 10C). Dies war vor allem auf die niedrige maximale Erfassungsfrequenz bei 23 °C (meist ≤1,5 Hz) und die hohe minimale Erfassungsfrequenz von hECTs bei 36 °C (meist ≥ 1,5 Hz) zurückzuführen (Abbildung 10D); Diese Einschränkungen sind beim nativen Myokard (getestet bei 28 °C und 37 °C) nicht zu beobachten, da das native ventrikuläre Myokard nicht spontan schlägt46. Nur einer der hECTs mit Frequenzüberlappung zeigte eine frequenzangepasste hypothermische Inotropie (Abbildung 10D). Wie aus den Zuckungskraftkurven in Abbildung 10B hervorgeht, zeigten hECTs bei 36 °C höhere Magnituden von +dF/dt und −dF/dt (Abbildung 10E, durchgezogene Linien) als bei 23 °C (gestrichelte Linien). In der hEKT, die eine hypotherme Inotropie (rote Linie) zeigte, waren die Kontraktion und Relaxation bei 36 °C trotz der geringeren Kraft viel schneller. Bei einer Stimulation bei 36 °C hatten hECTs auch eine höhere spontane Schwebungsrate (Abbildung 10F) (n = 10, p = 0,000016 für einen gepaarten t-Test) und einen größeren Bereich von Aufnahmefrequenzen (Abbildung 10G) (n = 9, p = 0,0000061 für einen gepaarten t-Test), wodurch eine 1:1-Erfassung bei supraphysiologischen Frequenzen48 von 4,5 Hz bis 6,75 Hz erreicht wurde (Abbildung 10C).

Figure 10
Abbildung 10: hECT-kontraktile Dynamik, die die Temperaturabhängigkeit zeigt. (A) Twitch-Force-Tracing eines hECT mit 1 Hz für 30 min (oben), um die Stabilität der Funktion über die Zeit zu zeigen, mit Einsätzen (unten), die eine vergrößerte Ansicht der Oberseite in 5-Minuten-Intervallen zeigen. (B) Zuckungskraftverfolgung eines hECT mit einer Geschwindigkeit von (I) 1,5 Hz und (II) 0,75 Hz ohne bzw. mit hypothermer Inotropie. Die Abtastung des linken Panels wurde bei 23 °C und die des rechten Panels bei 36 °C aufgenommen. (C) Kraft-Frequenz-Beziehung der hECTs (n = 6 hECTs am Tag 37 nach der Herstellung über zwei Bioreaktoren, n = 4 am Tag 52 nach der Herstellung über zwei Bioreaktoren) bei 23 °C (gestrichelte Linien) und bei 36 °C (durchgezogene Linien). Jede Farbe steht für einen hECT. (D) Kraft-Frequenz-Beziehungen von drei hECTs aus Panel C , die eine Frequenzüberlappung bei beiden Temperaturen zeigen, von denen eine frequenzangepasste hypothermische Inotropie zeigt (schwarze Pfeilspitze). (E) +dF/dt und −dF/dt der gleichen hECTs in Tafel D , aufgetragen über Frequenzen bei 23 °C (gestrichelte Linien) und 36 °C (durchgezogene Linien). (F) Spontane Schlagrate von hECTs unter den beiden Temperaturbedingungen (n = 10, p = 0,000016). (G) Frequenzbereich mit 1:1 Stimulation:Peak-Erfassung (Frequenzbereich in diesem Diagramm definiert als maximale Erfassungsfrequenz - minimale Erfassungsfrequenz) bei jeder Temperatur (n = 9, p = 0,000006,1). p-Werte aus dem gepaarten t-Test des Schülers. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Diese Zahl wurde gegenüber van Neste27 modifiziert. Abkürzung: hECT = Human Engineered Cardiac Tissue. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: CAD-Dateien für die bearbeiteten Bioreaktorteile. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: CAD-Dateien für die 3D-gedruckte SPoT-Gießapparatur. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: CAD-Dateien für den isolierenden Acrylmantel für die beheizte Stufe. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 4: AutomatedPostTracking3.vi Datei zur Verfolgung von hECT-Auslenkungen (Protokollschritt 5.3). Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 5: PostMeasurement_PB3.vi-Datei zur Messung von Stiftlängen und Gewebehöhen (Protokollschritt 6.2). Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 6: Vorlage für "Zusammenfassung #.csv" (Protokoll Schritt 7.1), die für die Verarbeitung der Nachablenkungsdaten verwendet wird. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: AnalyzeLogsGUI-Ordner mit MatLab-Skripten zur Verarbeitung der Nachablenkungsdaten (Protokollschritt 7). Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 8: Beschreibungen der Variablen in der "_datatable.txt"-Ausgabedatei des MatLab-Skripts. Die Zeilen 10-24 sind Parametrisierungen der Zuckungskraftkurve, die über alle Peaks über die Dauer der Aufzeichnung gemittelt wird (angegeben in Zeile 25). Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S1: Video von spontan schlagenden hECTs in Beiträgen mit SPoTs. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Video von spontan schlagenden hECTs auf Beiträgen ohne SPoTs. Diese Datei wurde von van Neste27 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In der Literatur sind zahlreiche linear hergestellte kardiale Gewebemodelle veröffentlicht, von denen einige in Tabelle 1 beschrieben sind. Einige Modelle beinhalten die direkte Messung der Gewebekraft, aber diese erfordern typischerweise die Übertragung des Konstrukts in ein separates Muskelbad38. Bei den meisten Modellen ist das Gewebe an beiden Enden dauerhaft verankert, am häufigsten an den PDMS-Pfosten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17,18,19,20,21,
22, 25, 26 (oder Drähte39), wodurch die Notwendigkeit einer Gewebemanipulation entfällt, und die von den Geweben erzeugte Kraft kann durch die optische Verfolgung der Endankermerkmale genau berechnet werden. Die PDMS-Stifte, die von unserer Gruppe 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 entwickelt wurden, wurden entwickelt, um mittelgroße Gewebe zu unterstützen, und diese Stifte balancieren Durchsatz, präzise funktionelle Messungen und die Aufrechterhaltung wichtiger Aspekte der nativen Herznische. Die Pfosten waren zu klein, um eine geteilte Gussmethode 10,13,14,18,19,20,21,24 zu ermöglichen, und integrierte Kappen führten dazu, dass die Pfosten während des kritischen Protokollschritts 1.3.2 brachen. Ohne Kappen könnten die hECTs von den Pfosten rutschen. In Fällen, in denen die Geweberetention nicht 100 % betrug, verloren diese Bioreaktoren oft einen großen Teil der hECTs, was zu einem Alles-oder-Nichts-Problem führte27. Dies geschah am häufigsten während des kritischen Protokollschritts 3.3.2, als die hECTs aus ihrer Grundplattenvertiefung entfernt wurden. Die hECTs konnten manchmal physisch auf die Pfosten zurückgelenkt werden, wobei jedes Ende des Stifts vorsichtig durch das Loch im hECT gefädelt wurde. Dies war nicht nur eine technische Herausforderung, sondern auch eine erhebliche Schadensquelle, die sich negativ auf die spätere kontraktile Funktion auswirken konnte.

SPoTs, die dem PDMS-Postdesign hinzugefügt wurden, ermöglichen eine hECT-Kultur mit einem breiteren Spannungsbereich. So können hECTs mit einem Phänotyp geringer Verdichtung/passiver Spannung (z.B. niedriger Nicht-Myozytengehalt oder Modelle der dilatativen Kardiomyopathie4), die sonst von den Pfosten rutschen würden, mit den SPoTs kultiviert und ausgewertet werden. Umgekehrt stellt die Kappengeometrie sicher, dass hECTs mit hoher passiver Spannung (z. B. hoher Nicht-Myozytengehalt oder Krankheitsmodelle mit beeinträchtigter diastolischer Relaxation49), die dazu neigen, glatte PDMS-Stifte abzuziehen, an Ort und Stellegehalten werden 27. Darüber hinaus sind die SPoTs relativ einzigartig, da sie in einem zweiten Herstellungsschritt zu den PDMS-Stiften hinzugefügt werden, was bisher nur bei einem anderen Modell mit deutlich kleineren Geweben beobachtet wurde17. Während die SPoTs diesen separaten Herstellungsschritt erfordern, ermöglichen sie das gleichzeitige Hinzufügen einer Kappengeometrie mit der Möglichkeit, verschiedene Materialien in die Kappe einzuarbeiten, wie z. B. eine undurchsichtige schwarze Farbe, Magnete oder fluoreszierende Kügelchen; Diese wurden von einigen anderen Gruppen erforscht, erfordern aber auch zusätzliche Herstellungsschritte23, 25 und 26.

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der Temperatur auf die hECT-Funktion zu untersuchen. Während kardiale Gewebe verwendet wurden, um viele Aspekte der in vivo Herzfunktion zu modellieren (z. B. Krankheitsmodellierung 4,8,50,51 und Arzneimittelreaktionen 15,21,52), wurden temperaturabhängige Effekte unseres Wissens in diesen Modellen nicht systematisch untersucht. Die frequenzangepasste hypothermische Inotropie ist sowohl ausgeprägt - manchmal mit einem fünffachen Anstieg der entwickelten Kraft - als auch ubiquitär45, wie sie bei zahlreichen Säugetierarten (Ratten 46,53,54, Frettchen54, Kaninchen 55 und Katzen54) sowie bei gesunden und versagenden menschlichen Myokardarten unterschiedlichen Alters beobachtetwerden 44. Wir fanden heraus, dass die spontane HECT-Beat-Rate und der Bereich der Aufnahmefrequenzen bei niedrigeren Temperaturen auf viel niedrigere Frequenzen verschoben waren, aber eine frequenzangepasste hypothermische Inotropie war nicht immer vorhanden27. In dem Bestreben, künstlich hergestelltes Herzgewebe durch Fortschritte bei der Reifung13,18 und der Biokomplexität56 zu verbessern, bietet die hypotherme Inotropie einen weiteren funktionellen Phänotyp des nativen Herzmuskels, der als Maßstab für die kardiale Biotreue verwendet werden kann.

Angesichts der Temperaturabhängigkeit des nativen Myokards und in dem Bemühen, die native kardiale Nischenumgebung zu rekapitulieren, wird die Funktion des künstlich hergestellten Gewebes häufig bei physiologischer Temperatur charakterisiert. Dies ist jedoch nicht immer möglich, da einige Systeme zur Erfassung von Gewebefunktionsdaten bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Sterilität nicht erhitzungsfördernd sind. Daher sind Funktionsvergleiche zwischen Geweben (oder Gewebemodellen), die bei unterschiedlichen Temperaturen gemessen wurden, möglicherweise nicht geeignet. In der Tat wird die Standardisierung der Testbedingungen für In-vitro-Tissue-Engineering-Assays sowohl in der regenerativenMedizin als auch von Regulierungsbehörden wie der Food and Drug Administration58,59 als notwendig erachtet. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können dazu beitragen, eine solche Standardisierung zu erreichen und weitere Studien über die Auswirkungen der Temperatur auf die hECT-Funktion zu ermöglichen27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

K.D.C. ist Mitbegründer und Chief Scientific Officer von Novoheart und hält Anteile an der Holdinggesellschaft Medera Biopharmaceutical. Novoheart hat nicht zur Finanzierung, Planung oder Durchführung dieser Studie beigetragen; Die Studienergebnisse könnten jedoch möglicherweise finanzielle Auswirkungen auf Novoheart und Medera haben. Die anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Timothy Cashman für seine früheren Arbeiten zu dieser Methode. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 und K01 HL133424) und dem Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire McMaster Carr 6517K61 
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.7 mL Microtubes Axygen MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall) Corning 353003
10 mL Serological Pipette Drummond 6-000-010
10 N NaOH Fisher Scientific SS225-1 dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium Sigma Aldrich M0275
20 - 200 μL Micropipette Eppendorf 3123000055
200 μL MicroPipette Tips VWR 76322-150
5 mL Serological Pipette Drummond 6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 352070
6 cm Petri Dish Corning 353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator AmScope  LED-6W 
6-Well Plates Corning 353046
90 degree angle mirror Edmund Optics 45-594
Acrylic bonding glue SCIGRIP #4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack Fisher Scientific 14-673-50
Aluminum 6061 McMaster Carr 9008K82
A-Plan 10X Objective Lens ZEISS 1020-863
Autoclave Bags Propper 21002
B-27 supplement ThermoFisher 17504044
B-27 supplement (without insulin) ThermoFisher A1895601
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810 R
Black ABS Ultimaker 2.85 mm wide
Bovine Collagen I Gibco A1064401
CHIR99021 Tocris 4423
Class II Biosafety Cabinet Labconco 3430009
Clear Acrylic Sheeting estreetplastics 1002502436 6.25 mm thick
CNC Vertical Mill Haas VF-1
Conductive Graphite Bars McMaster Carr 1763T33
Dissection microscope Olympus SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix ThermoFisher 11330032
Ethanol Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter NanoEntek E1000
EVE Cell Counting Slide NanoEntek EVS-050
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10438026
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Electron Corporation 3110 AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software Autodesk AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer Reichert 1475 0.1 mm deep
HEPES Sigma Aldrich H3784
hESC qualified matrigel Corning 354277 AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera PixelLINK P7410
Inverted Microscope Carl Zeiss Werk Axiovert 40 CFL 10X phase contrast objective
IWR-1 Selleck Chem S7086
LabView Software National Instruments 2016
Laminar flow clean bench NuAire NU-201-330 necessary for hECT functional analysis
Laptop AsusTek Strix Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine Epilog Helix 24
Magnification headset ExcelBlades 70020 Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab Mathworks Version 2019b or later AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade WPI Instruments 501839
Microscope Boom Stand Olympus SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution ThermoFisher 15140122 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations Sigma Aldrich P3813 Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller Drummond 4-000-100
PixelLINK Capture OEM PixelLINK 10.2.1.6 AKA "Camera Software"
Polysulfone McMaster Carr 86735K73 translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE) McMaster Carr 8545K176  Black, molded
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media ThermoFisher 11875135
Silicone Sheeting SMI manufacturing glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads Michael's color should withstand autoclaving
Spatula Fisher Scientific 14-373 used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator  Astro-Med / Grass Technologies S88X
Stainless Steel Razoblades GEM 62-0179-CTN preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex ThermoFisher A3349401 AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water ThermoFisher 5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit Dow DOWSIL 170 2LB KIT AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit Dow DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage Okolab H401-HG-SMU Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer Ultimaker Ultimaker 3
Thiazovivin Selleck Chem S1459
Trypan Blue NanoEntek EBT-001
Vacuum Chamber Bel-Art Parts F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw Micro-Mark 82203
Variable Speed Miniature Drill Press Micro-Mark 82959
Vibration Isolation Table Labconco 3618000
Weighing Boats VWR 10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp VWR 97035-528 AKA screw clamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
  3. Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447 (2016).
  4. Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
  5. Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
  6. Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
  7. Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
  8. Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
  9. Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373 (2019).
  10. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
  14. Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
  15. Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
  16. Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
  17. Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214 (2022).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  19. Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  20. Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
  21. Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
  22. Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919 (2020).
  23. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  24. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  25. Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
  26. Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
  27. van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
  28. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  29. Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
  30. Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931 (2019).
  31. Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
  32. Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
  33. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  34. Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14 (2020).
  35. Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
  36. Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
  37. Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
  38. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
  39. Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
  40. Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
  41. Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
  42. Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
  43. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  44. Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
  45. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
  46. Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
  47. Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
  48. Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
  49. Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
  50. Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
  51. Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
  52. de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
  53. Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
  54. Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
  55. Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
  56. Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
  57. Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
  58. Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
  59. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).

Tags

Bioreaktor Datenerfassung Künstlich hergestelltes Herzgewebe Menschliches Herz Tissue Engineering 3D-Umgebung Extrazelluläre Matrix Heterozelluläre Kopplung kundenspezifische Bioreaktoren Geräte zur Funktionsbewertung robustes Modellsystem für humanes Herzgewebe (hECT) induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten Längsschnittmessung der Gewebefunktion Force-Sensing-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stifte Stable Post Tracker (SPoT) Optisches Tracking

Erratum

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 01/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Neste, C. C., Wiley, K. A.,… More

van Neste, C. C., Wiley, K. A., Chang, S. W., Borrello, J., Turnbull, I. C., Costa, K. D. Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues. J. Vis. Exp. (196), e64368, doi:10.3791/64368 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter