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Bioengineering

इंजीनियर कार्डियक ऊतकों के डेटा अधिग्रहण और मॉडल थ्रूपुट में सुधार के लिए एक बायोरिएक्टर डिजाइन करना

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64368
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

स्टेम-सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके बायोइंजीनियर किए गए त्रि-आयामी कार्डियक ऊतक इन विट्रो में स्वस्थ और रोगग्रस्त मानव मायोकार्डियम का अध्ययन करने के लिए आशाजनक मॉडल के रूप में उभरे हैं, जबकि देशी कार्डियक आला के प्रमुख पहलुओं को पुन: प्रस्तुत करते हैं। यह पांडुलिपि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से उत्पन्न उच्च-सामग्री इंजीनियर कार्डियक ऊतकों के निर्माण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

दिल की विफलता दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण बनी हुई है, जिससे मानव हृदय के बेहतर प्रीक्लिनिकल मॉडल की आवश्यकता पैदा होती है। बुनियादी विज्ञान हृदय अनुसंधान के लिए ऊतक इंजीनियरिंग महत्वपूर्ण है; इन विट्रो में मानव कोशिका संस्कृति पशु मॉडल के अंतर-अंतर अंतर को समाप्त करती है, जबकि एक अधिक ऊतक की तरह 3 डी वातावरण (जैसे, बाह्य मैट्रिक्स और विषम युग्मन के साथ) प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों पर पारंपरिक दो आयामी संस्कृति की तुलना में अधिक हद तक विवो स्थितियों में अनुकरण करता है। हालांकि, प्रत्येक मॉडल प्रणाली को विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, कस्टम-डिज़ाइन किए गए बायोरिएक्टर और कार्यात्मक मूल्यांकन उपकरण। इसके अतिरिक्त, ये प्रोटोकॉल अक्सर जटिल, श्रम-गहन और छोटे, नाजुक ऊतकों की विफलता से ग्रस्त होते हैं।

यह पत्र ऊतक समारोह के अनुदैर्ध्य माप के लिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम-सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके एक मजबूत मानव इंजीनियर कार्डियक टिशू (एचसीईटी) मॉडल प्रणाली उत्पन्न करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। रैखिक पट्टी ज्यामिति के साथ छह एचसीटी समानांतर में सुसंस्कृत हैं, प्रत्येक एचसीटी पीडीएमएस रैक से जुड़े बल-संवेदन पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) पदों की एक जोड़ी से निलंबित है। प्रत्येक पोस्ट को एक काले पीडीएमएस स्थिर पोस्ट ट्रैकर (एसपीओटी) के साथ छाया हुआ है, एक नई सुविधा जो उपयोग में आसानी, थ्रूपुट, ऊतक प्रतिधारण और डेटा गुणवत्ता में सुधार करती है। आकार पोस्ट विक्षेपण के विश्वसनीय ऑप्टिकल ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, पूर्ण सक्रिय और निष्क्रिय तनाव के साथ बेहतर चिकोटी बल अनुरेखण देता है। टोपी ज्यामिति पदों से फिसलने वाले एचसीटी के कारण ऊतक विफलता को समाप्त करती है, और जैसा कि वे पीडीएमएस रैक निर्माण के बाद दूसरा चरण शामिल करते हैं, एसपीओटी को बायोरिएक्टर निर्माण प्रक्रिया में बड़े बदलाव के बिना मौजूदा पीडीएमएस पोस्ट-आधारित डिजाइनों में जोड़ा जा सकता है।

प्रणाली का उपयोग शारीरिक तापमान पर एचईसीटी फ़ंक्शन को मापने के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है और डेटा अधिग्रहण के दौरान स्थिर ऊतक फ़ंक्शन दिखाता है। संक्षेप में, हम एक अत्याधुनिक मॉडल प्रणाली का वर्णन करते हैं जो इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियर कार्डियक ऊतकों की बायोफिडेलिटी, दक्षता और कठोरता को आगे बढ़ाने के लिए प्रमुख शारीरिक स्थितियों को पुन: पेश करता है।

Introduction

इंजीनियर कार्डियक टिशू मॉडल देशी कार्डियक आला के विभिन्न पहलुओं को पुन: प्राप्त करने के लिए ज्यामिति और विन्यास की एक विविध सरणी में आते हैं जो पारंपरिक दो-आयामी सेल संस्कृति के साथ प्राप्त करना मुश्किल है। सबसे आम विन्यासों में से एक रैखिक ऊतक पट्टी है, ऊतक स्व-विधानसभा को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक छोर पर लचीले एंकर के साथ और ऊतक को एक परिभाषित प्रीलोड और परिणामी चिकोटी बलों 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 का एक रीडआउट प्रदान करता है, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. उत्पन्न बल को ऊतक को छोटा करने के ऑप्टिकल ट्रैकिंग के माध्यम से मजबूती से निर्धारित किया जा सकता है और लोचदार बीम सिद्धांत का उपयोग करके मापा विक्षेपण से बल की गणना करने के लिए और एंकर 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 के वसंत स्थिरांक की गणना की जा सकती है, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.

हालांकि, कार्डियक टिशू इंजीनियरिंग अभी भी एक उभरता हुआ क्षेत्र है, और कुछ चुनौतियां बनी हुई हैं। प्रत्येक मॉडल प्रणाली10,29,30,31 के लिए कस्टम-निर्मित बायोरिएक्टर और कार्यात्मक मूल्यांकन उपकरणों जैसे विशिष्ट उपकरण आवश्यक हैं। इन निर्माणों के माइक्रोएन्वायरमेंट का आकार और जटिलता अक्सर श्रम-गहन प्रोटोकॉल, कोशिकाओं की उच्च संख्या और ऊतक नाजुकता के कारण कम थ्रूपुट द्वारा सीमित होती है। इसे संबोधित करने के लिए, कुछ समूहों ने उच्च-थ्रूपुट परख की सुविधा के लिए केवल सैकड़ों या हजारों कोशिकाओं वाले सूक्ष्म ऊतकों के निर्माण की ओर रुख किया है जो दवा की खोज के लिए उपयोगी हैं। हालांकि, यह कम पैमाने समारोह12 के सटीक मूल्यांकन को जटिल बनाता है, देशी हृदय आला (जैसे पोषक तत्व / ऑक्सीजन प्रसार ढाल और जटिल वास्तुकला36) के प्रमुख पहलुओं को समाप्त करता है, और बाद में आणविक और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपलब्ध सामग्री की मात्रा को सीमित करता है (अक्सर ऊतकों के पूलिंग की आवश्यकता होती है)। तालिका 1 साहित्य 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 में रैखिक ऊतक पट्टी मॉडल के कुछ विन्यासों को सारांशित करती है, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

समूह ऊतक प्रति कोशिकाएं प्लेट प्रति ऊतक प्लेट प्रारूप एंकरिंग सुविधा कार्यात्मक डेटा अधिग्रहण विधि साझा मीडिया स्नान? कार्यात्मक उपाय-
सीटू में ment?
योशिदा (ईसीटी)38 4 मिलियन 6 संशोधित 6-वेल प्लेट* बल ट्रांसड्यूसर प्रत्यक्ष बल माप नहीं नहीं
चान (एचईएससी-सीएम-ईसीटी)26 310 के 6 कस्टम 6-वेल डिश पीडीएमएस पोस्ट प्रत्यक्ष बल माप हाँ नहीं
फीनबर्ग (डायन-ईएचटी)16 1.5 मिलियन 6 कस्टम 6-वेल डिश पीडीएमएस तार ऊतक का आकार नहीं हाँ
रेडिसिक (बायोवायर)39, 40 110 के 8 पॉलिमर तार तार का आकार हाँ हाँ
कोस्टा (एकल एचईसीटी)1, 2 1-2 मिलियन 4** 10 सेमी पेट्री डिश** पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (किनारे/ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग) हाँ हाँ
कोस्टा (मल्टी-एचईसीटी)3–9 500 K-1 मिलियन 6 6 सेमी पेट्री डिश पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (किनारे/ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग) हाँ हाँ
कोस्टा (मल्टी-एचईसीटी डब्ल्यू / 1 मिलियन 6 6 सेमी पेट्री डिश काली टोपी के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग) हाँ हाँ
पासियर (ईएचटी)17 245 कश्मीर 36 12-अच्छी तरह से प्लेट काली टोपी के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग) हाँ हाँ
वुंजक-नोवाकोविच13, 18 1 मिलियन 12 6 सेमी पेट्री डिश कैप के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (किनारे का पता लगाने) हाँ हाँ
वुंजक-नोवाकोविच (मिलीपिलर)14 550 के 6 कस्टम 6-वेल डिश कैप के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग); कैल्शियम इमेजिंग नहीं हाँ
एस्चेनहेगन (ईएचटी)10, 19–21 1 मिलियन 12 12-अच्छी तरह से प्लेट कैप के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (पोस्ट विक्षेपण के किनारे का पता लगाने); कैल्शियम इमेजिंग नहीं हाँ
ज़ैंडस्ट्रा (CaMiRi)22 25-150 के 96 96-अच्छी तरह से प्लेट हुक के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल विक्षेपण (किनारे का पता लगाने) नहीं हाँ
मरी23, 24 900 के 24 24-अच्छी तरह से प्लेट कैप्स, एकीकृत चुंबक के साथ पीडीएमएस पोस्ट चुंबकीय सेंसर नहीं हाँ
रीच (μTUG)11, 12, 25 अपरिभाषित 156 156-अच्छी तरह से पकवान कैप्स, एकीकृत चुंबक के साथ पीडीएमएस पोस्ट ऑप्टिकल ट्रैकिंग (फ्लोरोसेंट मनका) हाँ हाँ

तालिका 1: साहित्य में कुछ रैखिक इंजीनियर कार्डियक ऊतक मॉडल के लक्षण। रैखिक इंजीनियर कार्डियक ऊतक मॉडल आकार, थ्रूपुट, एंकरिंग फीचर डिजाइन, और साझा मध्यम स्नान की सुविधा के साथ-साथ कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक अलग मांसपेशी स्नान प्रणाली की आवश्यकताओं में भिन्न होते हैं। * शोधकर्ताओं ने एक मानक 6-अच्छी प्लेट के आयामों के आधार पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इंजीनियर ऊतक प्रणाली का उपयोग किया। ** एक मॉड्यूलर प्रणाली जिसमें एकल-ऊतक बायोरिएक्टर वांछित संख्या और स्थान में किसी भी प्लास्टिक कल्चर डिश से जुड़े होते हैं।

यह पत्र रैखिक मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतक (एचसीईटी) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 के हमारे स्थापित मॉडल को बनाने के लिए नवीनतम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और hECT सिकुड़ा समारोह का आकलन करने के तरीके। प्रत्येक बहु-ऊतक बायोरिएक्टर एक साझा मध्यम स्नान में छह एचसीटी तक समायोजित करता है और एक कठोर पॉलीसल्फोन फ्रेम पर घुड़सवार सिलिकॉन इलास्टोमेर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) से बने दो "रैक" टुकड़े से बना होता है। प्रत्येक पीडीएमएस रैक में छह लचीले एकीकृत बल-संवेदन पोस्ट होते हैं जो व्यास में 0.5 मिमी और 3.25 मिमी लंबे होते हैं, और साथ में, दो रैक छह जोड़े पोस्ट प्रदान करते हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक एचसीईटी होता है। बायोरिएक्टर का उलटा संस्कृति माध्यम से पानी के संघनन या वायु-तरल इंटरफ़ेस के मेनिस्कस से विकृतियों के कारण नीचे से एचसीटी के दृश्य में किसी भी बाधा को दूर करने में मदद करता है। एक hECT का प्रत्येक संकुचन एकीकृत अंत-पदों के विक्षेपण का कारण बनता है, और विक्षेपण संकेत के ऑप्टिकल माप को hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 के सिकुड़ा समारोह का प्रतिनिधित्व करने वाले बल बनाम समय अनुरेखण में संसाधित किया जाता है . आमतौर पर इस आकार के ऊतकों के लिए उपयोग किए जाने वाले एकल-ऊतक बायोरिएक्टर की तुलना में, बहु-ऊतक डिजाइन प्रयोगात्मक थ्रूपुट में सुधार करता है और संभावित रूप से विभिन्न सेलुलर संरचना के आसन्न ऊतकों के बीच पैराक्राइन सिग्नलिंग के अध्ययन को सक्षम बनाता है। इस प्रणाली को रोग मॉडलिंग 4,8, पैराक्राइन सिग्नलिंग 6,7, विषम संस्कृति 5,9, और चिकित्सीय स्क्रीनिंग 7,9 में अनुप्रयोगों का वर्णन करने वाले प्रकाशित अध्ययनों में मान्य किया गया है।

इस प्रणाली में, एचईसीटी को कम शोर के साथ बल माप के मजबूत ऑप्टिकल ट्रैकिंग की सुविधा के लिए लगभग 6 मिमी लंबा और 0.5 मिमी व्यास के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, प्रसार ढाल और सेलुलर संगठन जैसे ऊतक जटिलता के पहलुओं को प्रति ऊतक 1 मिलियन कोशिकाओं की प्रबंधनीय आवश्यकता के साथ संतुलित किया जाता है। मानक सीसीडी कैमरा प्रौद्योगिकी के साथ, 1 माइक्रोन (5 माइक्रोन पोस्ट विक्षेपण से कम का प्रतिनिधित्व) के रूप में कमजोर बलों को एक स्पष्ट संकेत उत्पन्न होता है, यह सुनिश्चित करता है कि कुछ एचईसीटी रोग मॉडल के साथ देखे गए बेहद कमजोर सिकुड़ा समारोह को भी सटीक रूप से मापा जा सकता है। यह चिकोटी बल वक्र के विस्तृत विश्लेषण की सुविधा भी प्रदान करता है, इस प्रकार विकसित बल, संकुचन की दर (+ डीएफ / डीटी) और विश्राम (-डीएफ / डीटी), और बीट दर परिवर्तनशीलता सहित 16 सिकुड़न मेट्रिक्स41 तक के उच्च-सामग्री विश्लेषण को सक्षम करता है।

यह प्रोटोकॉल बायोरिएक्टर घटकों के निर्माण के निर्देशों के साथ शुरू होता है। एचईसीटी उपज को अधिकतम करने, ऊतक समारोह में तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने और ऊतक मूल्यांकन की गुणवत्ता और गहराई को अनुकूलित करने के चरणों पर विशेष ध्यान दिया जाता है। अधिकांश हृदय ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन निर्माण और दीर्घकालिक परीक्षण के दौरान ऊतक हानि की दर की रिपोर्ट नहीं करते हैं, हालांकि यह क्षेत्र में एक प्रसिद्ध चुनौती है और अध्ययन के थ्रूपुट और दक्षता को कम कर देता है27. यहां वर्णित ऊतक इंजीनियरिंग विधियों को अधिकांश बायोरिएक्टर में सभी एचसीटी के प्रतिधारण को सुनिश्चित करने के लिए वर्षों से परिष्कृत किया गया है (भले ही पीडीएमएस रैक कैसे निर्मित हों)। हालांकि, यहां तक कि ऊतकों का 5% -20% नुकसान सांख्यिकीय शक्ति को काफी प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से उपलब्ध कार्डियोमायोसाइट्स की संख्या से सीमित छोटे प्रयोगों में (उदाहरण के लिए, कुछ रोगग्रस्त सेल लाइनों4 के साथ भेदभाव चुनौतियों के कारण या व्यावसायिक रूप से खरीदे गए कार्डियोमायोसाइट्स की उच्च लागत के कारण), या उपचार की स्थिति (जैसे, सीमित उपलब्धता या विभिन्न उपचार यौगिकों की उच्च लागत) द्वारा।

यह प्रोटोकॉल स्थिर पोस्ट ट्रैकर्स (एसपीओटी) के निर्माण का वर्णन करता है, पीडीएमएस रैक की एक नई विशेषता, जो एचसीटी27 रखने वाले बल-संवेदन पदों के सिरों पर कैप के रूप में कार्य करती है। यह प्रदर्शित किया जाता है कि कैसे कैप ज्यामिति पदों को गिरने या खींचने से एचईसीटी नुकसान को काफी कम कर देती है, इस प्रकार अधिक से अधिक कठोरता और तनाव के साथ एचईसीटी को संवर्धित करने के नए अवसर खोलती है, जो अनकैप्ड पोस्ट पर संस्कृति के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, एसपीओटी एक सुसंगत और अच्छी तरह से परिभाषित आकार27के माध्यम से एचईसीटी संकुचन की ऑप्टिकल ट्रैकिंग में सुधार करने के लिए एक उच्च-विपरीत वस्तु प्रदान करते हैं। इसके बाद मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) और पूर्व प्रकाशित प्रोटोकॉल 3,42,43 के आधार पर कार्डियोमायोसाइट भेदभाव और एचईसीटी निर्माण, संस्कृति और कार्यात्मक माप का स्पष्टीकरण दिया गया है।

यह लेख शारीरिक तापमान पर ऊतक समारोह को मापने की आवश्यकता को भी संबोधित करता है। मानव मायोकार्डियम (भ्रूण के साथ-साथ वयस्क स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक), साथ ही पशु प्रजातियों (चूहों, बिल्लियों, चूहों, फेरेट्स और खरगोशों सहित) 44,45 की एक विस्तृत श्रृंखला से हृदय के ऊतक, आवृत्ति-मिलान चिकोटी बल में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करता है शारीरिक तापमान की तुलना में 28 डिग्री सेल्सियस-32 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर-हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी45 के रूप में जानी जाने वाली घटना, 46. हालांकि, इंजीनियर मायोकार्डियल ऊतक समारोह पर तापमान के प्रभाव का अध्ययन नहीं किया जाता है। साहित्य में कई हाल ही में इंजीनियर हृदय ऊतक मॉडल कार्यात्मक शारीरिक शर्तों 13,14,37 के अनुमानित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मूल्यांकन किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं. हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, इंजीनियर कार्डियक ऊतकों द्वारा उत्पन्न बल पर तापमान-निर्भर प्रभावों की व्यवस्थित रूप से जांच नहीं की गई है। यह प्रोटोकॉल एक पेसिंग इलेक्ट्रोड डिज़ाइन का वर्णन करता है जो परीक्षण के दौरान गर्मी के नुकसान को कम करता है, साथ ही कार्यात्मक माप के लिए सेटअप में एक अछूता हीटिंग तत्व को शामिल करने की अनुमति देता है, जो बाँझपन27 से समझौता किए बिना शारीरिक तापमान पर एचईसीटी को बनाए रख सकता है। फिर हम hECT फ़ंक्शन पर तापमान के कुछ देखे गए प्रभावों की रिपोर्ट करते हैं, जिसमें विकसित बल, सहज धड़कन आवृत्ति, +dF/dt, और -dF/dt शामिल हैं। कुल मिलाकर, यह पत्र मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतकों को बनाने और उनके सिकुड़ा समारोह का आकलन करने के लिए इस बहु-ऊतक बल-संवेदन बायोरिएक्टर प्रणाली के निर्माण के लिए आवश्यक विवरण प्रदान करता है, और डेटा का एक सेट प्रस्तुत किया जाता है जो माप के लिए तुलना के लिए आधार प्रदान करता है कमरे के तापमान पर और 37 डिग्री सेल्सियस27 पर।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल ने एक डी-आइडेंटिफाइड आईपीएससी लाइन, स्किप्स 31.3 (मूल रूप से एक स्वस्थ 45 वर्षीय पुरुष से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके पुन: प्रोग्राम किया गया)47का उपयोग किया, और इस प्रकार, संस्था के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुरूप विशिष्ट संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी से छूट दी गई थी। HEPA-फ़िल्टर्ड क्लास II जैविक सुरक्षा कैबिनेट या लामिना प्रवाह कार्य बेंच में सड़न रोकनेवाला स्थितियों में सभी सेल और hECT हेरफेर करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा सभी गैर-बाँझ समाधानों को जीवाणुरहित करें, और 37 डिग्री सेल्सियस, 95% सापेक्ष आर्द्रता और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में सभी कोशिकाओं और एचईसीटी को बनाए रखें।

1. बायोरिएक्टर निर्माण

  1. बायोरिएक्टर घटकों और एल्यूमीनियम मास्टर कास्ट निर्माण
    नोट: कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) फाइलें पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की जाती हैं। प्रोटोकॉल इन चरणों के बीच कहीं भी रोका जा सकता है। इस खंड में वर्णित मास्टर मोल्ड्स के निर्माण के लिए एक पेशेवर मशीनिस्ट को सूचीबद्ध करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि उच्च सहिष्णुता (≤5 माइक्रोन) और सटीक पोस्ट ज्यामिति के लिए और पॉलीसल्फोन फ्रेम के उचित प्रेस-फिटिंग के लिए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) बेसप्लेट (एक सुखद घर्षण फिट के लिए लक्ष्य, लेकिन बहुत तंग नहीं) के लिए एक चिकनी खत्म की आवश्यकता होती है।
    1. एक कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) मिल का उपयोग करना, चित्रा 1 ए में योजनाबद्ध के अनुसार पीटीएफई से बेसप्लेट मशीन। एचईसीटी का गठन छह समान रूप से दूरी वाले कुओं (सफेद तीर) में किया जाएगा।
    2. एक सीएनसी मिल का उपयोग करना, मशीन polydimethylsiloxane (PDMS) रैक नकारात्मक मास्टर चित्रा 1B में schematics के अनुसार एल्यूमीनियम से बाहर डाली, तीन फ्रेम का समर्थन करता है (हरी तारांकन) के साथ. पीडीएमएस पोस्ट बनाने के लिए व्यास में 0.5 मिमी के छह समान रूप से दूरी वाले छेद (मैजेंटा एरोहेड्स) ड्रिल करें।
    3. एक सीएनसी मिल का उपयोग करके, चित्रा 1 सी में योजनाबद्ध के अनुसार पॉलीसल्फोन से बायोरिएक्टर फ्रेम को मशीन करें। फ्रेम समर्थन करता है (हरा तारांकन) रैक कास्ट (चित्रा 1 बी, हरे तारांकन) में देखे गए फ्रेम समर्थन के अनुरूप है।
    4. एक सीएनसी मिल का उपयोग करना, चित्रा 1 डी में योजनाबद्ध के अनुसार एल्यूमीनियम से बाहर एल्यूमीनियम कास्ट धारक मशीन। प्रत्येक स्लॉट पीडीएमएस रैक कास्ट (चित्रा 1 बी, मैजेंटा एरोहेड्स) में छेद के माध्यम से प्रवाह करने के लिए पीडीएमएस के लिए एक मृत स्थान प्रदान करने के लिए 0.25 मिमी लंबा है कि एक त्रिकोणीय शेल्फ (नारंगी त्रिकोण) होता है.
  2. एल्यूमीनियम नकारात्मक स्वामी से पीडीएमएस रैक की कास्टिंग
    1. थर्माप्लास्टिक फ्यूज्ड डिपोजिशन मॉडलिंग 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके, दो पीडीएमएस रैक कास्टिंग उपकरण ब्रैकेट (पूरक फ़ाइल 1) प्रिंट करें। निम्नलिखित प्रिंट सेटिंग्स का उपयोग करें: 0.1 मिमी की एक परत ऊंचाई, 1 मिमी की एक दीवार/नीचे/शीर्ष मोटाई, त्रिकोण के साथ 90% का एक इन्फिल घनत्व, 230 डिग्री सेल्सियस का मुद्रण तापमान, 70 डिग्री सेल्सियस का एक बिल्ड प्लेट तापमान, और आसंजन के लिए एक किनारा ।
    2. कास्ट होल्डर (चित्र 2AI) में चार एल्यूमीनियम नकारात्मक मास्टर कास्ट रखें जैसे कि पोस्ट छेद त्रिकोण अलमारियों के विपरीत मृत स्थान के साथ संरेखित हों ( चित्र 1D देखें)। तरल पीडीएमएस के रिसाव को रोकने के लिए गैसकेट के रूप में 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन शीटिंग (चित्रा 2 बी, सफेद तीर) के आयताकार टुकड़े में उपकरण लपेटें और इसे दो समानांतर 3 डी मुद्रित ब्रैकेट के बीच क्लैंप करें एक पेंच क्लैंप.
    3. एक उथले कंटेनर में पीडीएमएस इलास्टोमेर बेस (1:10 अनुपात, निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के 5 एमएल में पीडीएमएस इलाज एजेंट के 0.5 एमएल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए सख्ती से मिलाएं। एक वैक्यूम कक्ष में PDMS मिश्रण degas है, और कमरे के तापमान पर या बुलबुले गायब होने तक 20-60 मिनट के लिए एक मजबूत वैक्यूम (0.1-1 kPa) लागू होते हैं.
    4. कास्टिंग उपकरण पर पीडीएमएस मिश्रण डालो, प्रत्येक स्लॉट (चित्रा 2एआईआई) का पूरा कवरेज सुनिश्चित करने के लिए ओवरफिलिंग। यदि वांछित है, तो प्रत्येक पीडीएमएस रैक की अनूठी पहचान के लिए, पदों (चित्रा 2 बी) के साथ पक्ष के विपरीत, पीडीएमएस रैक (चित्रा 2एआईआई) के शरीर में छोटे, रंगीन ग्लास मोती जोड़ें। कास्टिंग उपकरण को वैक्यूम कक्ष में लौटाएं (यह सुनिश्चित करना कि यह क्षैतिज स्तर है), और कम से कम 12 घंटे के लिए एक मजबूत वैक्यूम लागू करें। पीडीएमएस को नाजुक पदों के पूर्ण इलाज और अधिकतम ताकत को सक्षम करने के लिए धूल से लगभग 48 घंटे दूर कमरे के तापमान पर इलाज करने की अनुमति दें। ओवन का उपयोग करने से बचें क्योंकि यह 3 डी-मुद्रित घटकों को विकृत करता है।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  3. एल्यूमीनियम नकारात्मक मास्टर कास्ट से पीडीएमएस रैक हटाने
    1. क्लू निकालेंampकास्टिंग उपकरण से कोष्ठक, कोष्ठक और सिलिकॉन शीटिंग। स्टेनलेस स्टील रेजर ब्लेड का उपयोग करके, कास्टिंग उपकरण और फ्रेम समर्थन के शीर्ष पर पीडीएमएस फिल्म को ट्रिम करें, और कास्ट धारक के किनारों से पीडीएमएस रैक को अलग करने के लिए धीरे से उंगलियों का उपयोग करें। कास्ट और कास्ट होल्डर के बीच मृत स्थान में एक कुंद स्टेनलेस-स्टील रेजरब्लेड डालें, और उन्हें अलग करें (चित्र 2CI, II), यह सुनिश्चित करते हुए कि मृत स्थान भरने वाला PDMS कास्ट होल्डर के साथ रहता है (जैसा कि यह पदों से जुड़ा हुआ है)। एक तेज स्टेनलेस स्टील ब्लेड का उपयोग करके, शेष पीडीएमएस फिल्मों को काट दें, और पदों की युक्तियों से मृत-स्थान पीडीएमएस को काट दें (चित्र 2सी III-V)।
    2. महत्वपूर्ण कदम: कलाकारों (चित्रा 2 डी) से पीडीएमएस रैक मुक्त करें। पदों के विपरीत पक्ष से शुरुआत करते हुए, पीडीएमएस रैक को धीरे-धीरे कलाकारों से अलग करने के लिए उंगलियों का उपयोग करें, वैकल्पिक पक्षों पर काम करें जब तक कि पोस्ट मास्टर कास्ट से मुक्त न हों।
    3. पिछले चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी पीडीएमएस रैक और सभी पोस्ट मुक्त न हो जाएं। रैक से किसी भी शेष अतिरिक्त पीडीएमएस को ट्रिम करने के लिए एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करें। परिणाम पहचान के लिए छह बरकरार पदों (नारंगी arrowheads) और रंगीन मोती (नीले तीर) के साथ एक PDMS रैक (चित्रा 2E) है.
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  4. स्थिर पोस्ट ट्रैकर (SPoT) निर्माण
    1. थर्माप्लास्टिक फ्यूज्ड डिपोजिशन मॉडलिंग 3D प्रिंटर का उपयोग करके, SPoT कास्टिंग उपकरण के घटकों को प्रिंट करें (पूरक फ़ाइल 2 और चित्र 3AI, II)। निम्नलिखित प्रिंट सेटिंग्स का उपयोग करें: 0.1 मिमी की एक परत ऊंचाई, 1 मिमी की एक दीवार/नीचे/शीर्ष मोटाई, त्रिकोण के साथ 80% का एक इन्फिल घनत्व, 230 डिग्री सेल्सियस का मुद्रण तापमान, 70 डिग्री सेल्सियस का एक बिल्ड प्लेट तापमान, और आसंजन के लिए एक किनारा ।
    2. 3 डी मुद्रित टुकड़े, साथ ही पीडीएमएस रैक और तीन आयामी जिग के बीच एक सुरक्षित प्रेस फिट सुनिश्चित करें, और पुष्टि करें कि पीडीएमएस रैक सिर्फ कुओं के नीचे तक पहुंचने वाले पदों के साथ अच्छी तरह से फिट होते हैं। यदि आवश्यक हो तो प्लास्टिक को ट्रिम/फाइल करें।
    3. एक छोटे वजन वाली नाव (या एक समान छोटे, उथले कंटेनर) में भाग बी (1: 1 अनुपात) के 0.5 एमएल से काले पीडीएमएस भाग ए के 0.5 एमएल जोड़ें (निर्माता के निर्देशों के अनुसार), और रंग में समान होने तक अच्छी तरह मिलाएं। 20 मिनट के लिए एक मजबूत वैक्यूम के तहत एक वैक्यूम कक्ष में मिश्रित काले PDMS degas. छेद को भरने के लिए 3 डी-प्रिंटेड बेस पर डिगैस्ड ब्लैक पीडीएमएस डालें, और यह सुनिश्चित करने के लिए टैप करें कि कोई बुलबुले न रहें। जितना संभव हो उतना अतिरिक्त पीडीएमएस को आधार से दूर करें।
    4. आधार पर तीन-आयामी टुकड़े को स्नैप करें, और पीडीएमएस रैक को तीन-आयामी जिग (चित्रा 3एआईआई, फ़िरोज़ा आयत) पर खांचे में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पदों के छोर गोलाकार कुओं में काले पीडीएमएस में डुबकी लगाते हैं (चित्र 3बी, सी)। कमरे के तापमान पर काले पीडीएमएस का इलाज करें और 48 घंटे के लिए धूल से सुरक्षित रहें।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
    5. पदों पर तनाव को कम करते हुए, तीन-आयामी टुकड़े को स्लाइड करें। प्रत्येक एसपीओटी को घेरने वाले काले पीडीएमएस की पतली फिल्म को दूर करने के लिए छोटे संदंश का उपयोग करें; फिर, एसपीओटी में ठीक-इत्तला दे दी तुला संदंश डालें अच्छी तरह से यह 3 डी मुद्रित आधार (चित्रा 3 डी) से मुक्त करने के लिए.
    6. एसपीओटी (चित्रा 3ई) का निरीक्षण करें, और ठीक वन्नास कैंची का उपयोग करके चरण 1.4.5 में नहीं हटाए गए कास्टिंग प्रक्रिया से किसी भी शेष काले पीडीएमएस फिल्म को ट्रिम करें। सुनिश्चित करें कि तैयार पोस्ट पॉलीसल्फोन फ्रेम पर पीडीएमएस रैक को फिट करके सही लंबाई के हैं और फिर इसे काले बेसप्लेट(चित्रा 4ए)पर स्लाइड कर रहे हैं।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
    7. पीडीएमएस रैक को जोड़ो, और फ्रेम टैब (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके उन्हें फ्रेम में जोड़ें। कम से कम 30 मिनट चक्र (<122 डिग्री सेल्सियस) के लिए PTFE बेसप्लेट के साथ एक बैग में आटोक्लेव warping को कम करने के लिए।

Figure 1
चित्रा 1: एचसीटी बायोरिएक्टर घटक। (ए) शीर्ष दृश्य (बाएं) और साइड व्यू (दाएं) पीटीएफई बेसप्लेट के छह समान रूप से दूरी वाले कुओं के साथ एचईसीटी (सफेद तीर) बनाने के लिए। (बी) साइड व्यू (बाएं) और शीर्ष दृश्य (दाएं) पीडीएमएस रैक के लिए एल्यूमीनियम नकारात्मक मास्टर कास्ट के छह समान रूप से दूरी वाले पदों (मैजेंटा एरोहेड्स) और बायोरिएक्टर फ्रेम (हरे तारांकन) से जुड़ने के लिए तीन अंतराल के साथ। (सी) पीडीएमएस रैक कास्ट (पैनल बी) में फ्रेम सपोर्ट के अनुरूप तीन समान रूप से दूरी वाले फ्रेम सपोर्ट (ग्रीन तारांकन) के साथ पीडीएमएस रैक के लिए पॉलीसल्फोन फ्रेम के साइड व्यू (बाएं) और निचला दृश्य (दाएं)। (डी) शीर्ष दृश्य (ऊपर) और साइड व्यू (नीचे) पीडीएमएस रैक कास्ट के लिए चार स्लॉट के साथ एल्यूमीनियम कास्ट होल्डर, प्रत्येक में 0.25 मिमी उच्च त्रिकोणीय शेल्फ (नारंगी में हाइलाइट किए गए बाएं-सबसे शेल्फ) के साथ। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक; Ø = व्यास; PTFE = पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; R = त्रिज्या। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पीडीएमएस रैक का निर्माण। (ए) सीएडी रेंडरिंग कास्टिंग उपकरण का एक तिरछा दृश्य दिखाती है। (I) एक नकारात्मक पीडीएमएस रैक मास्टर कास्ट को त्रिकोणीय शेल्फ (चित्रा 1डी, नारंगी त्रिकोण) के विपरीत मृत स्थान पर रखे पीडीएमएस पोस्ट (मैजेंटा एरोहेड्स) बनाने वाले छेद के साथ कास्ट होल्डर के चार स्लॉट्स में से प्रत्येक में डाला जाता है। (II) पीडीएमएस को नकारात्मक मास्टर कास्ट के प्रत्येक गुहा में डाला जाता है। (III) रंगीन मोतियों को रंग-कोडित पहचान प्रणाली के रूप में असुरक्षित पीडीएमएस में जोड़ा जाता है। (बी) इकट्ठे पीडीएमएस रैक कास्टिंग उपकरण दिखा फोटो, जो दो 3 डी मुद्रित कोष्ठक के साथ दोनों तरफ क्लैंप किया जाता है एक पेंच क्लैंप द्वारा जगह में आयोजित और 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन शीटिंग (सफेद तीर) के साथ लिपटे cled पक्षों सील करने के लिए। रंगीन मोतियों को रखा जाता है ताकि वे 0.5 मिमी व्यास के छेद को कवर न करें जो पदों (मैजेंटा एरोहेड्स) बनाते हैं। (सी) पीडीएमएस ठीक हो जाने के बाद, कास्ट होल्डर से कास्ट हटा दिया जाता है। (I) कास्ट होल्डर (II) से कास्ट को निकालने के लिए कास्ट और कास्ट होल्डर के बीच एक ब्लंटेड स्टेनलेस-स्टील रेजर ब्लेड या इसी तरह का पतला धातु का उपकरण डाला जाता है। (III) पदों के छेद के माध्यम से बहने वाले पीडीएमएस द्वारा बनाई गई फिल्म (फ़िरोज़ा ब्रैकेट) पदों की युक्तियों से जुड़ी होती है और इसे एक तेज ब्लेड (IV, V) का उपयोग करके काट दिया जाना चाहिए। (डी) पीडीएमएस रैक को कास्ट से अलग किया जाता है। (ई) पहचान (नीला तीर) के लिए शरीर में एम्बेडेड ग्लास मनका के साथ पीडीएमएस रैक के तिरछे (ऊपर), पक्ष (मध्य), और नीचे (नीचे) दृश्य दिखा रही तस्वीरें। पदों की युक्तियों (नारंगी तीर) को काली स्याही से चिह्नित किया गया है। स्केल बार = 1 सेमी। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: सीएडी = कंप्यूटर एडेड डिजाइन; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एसपीओटी निर्माण। (ए) सीएडी रेंडरिंग (I) बेस के प्रमुख आयामों और (II) SPoT कास्टिंग जिग के तीन-आयामी टुकड़े को दर्शाता है। गोलाकार SPoT रूपों (AI, काले तीर) के आयाम 0.2 मिमी गहरे x 1.2 मिमी व्यास के रूप में सेट किए गए हैं, और प्रत्येक एक व्यक्तिगत SPoT के लिए काला PDMS रखता है। शीर्ष दृश्य (AII, शीर्ष, फ़िरोज़ा आयत) में देखा गया 11.1 मिमी x 27 मिमी शेल्फ इलाज के दौरान PDMS रैक को पकड़ने के लिए 0.4 मिमी (जैसा कि नीचे साइड व्यू में देखा गया है) से उदास है। (बी) सीएडी प्रतिपादन एसपीओटी कास्टिंग उपकरण की असेंबली दिखा रहा है। (सी) इकट्ठे एसपीओटी कास्टिंग उपकरण की एक तस्वीर। (डी) पीडीएमएस के ठीक होने के बाद, पीडीएमएस रैक के नीचे से तीन-आयामी जिग को बाहर खिसकाया जाता है, और एसपीओटी को ठीक संदंश का उपयोग करके उनके कुओं से मुक्त किया जाता है। (ई) पीडीएमएस रैक की तस्वीरें बिना (ऊपर) और (नीचे) एसपीओटी के साथ। इनसेट पोस्ट के आवर्धित दृश्य दिखाते हैं। स्केल बार = 1 सेमी (ई), 2.5 सेमी ( ई की ज़ूम-इन छवियां)। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: सीएडी = कंप्यूटर एडेड डिजाइन; Ø = व्यास; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; आर = त्रिज्या; SPoT = स्थिर पोस्ट ट्रैकर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. सेल संस्कृति

  1. IPSC संवर्धन
    नोट: विभिन्न सेल लाइनों को मार्ग कमजोर पड़ने और आवृत्ति और / या मध्यम योजक के अनुमापन के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
    1. योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक सेल-संस्कृति-उपचारित 6-अच्छी प्लेट को कोट करें (निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1: 1 Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम में पतला: Ham's F12 पोषक तत्व समाधान [DMEM/F12] में), और प्लेट को इनक्यूबेट करें कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आईपीएससी संस्कृति माध्यम के 500 एमएल तैयार करें, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 आईयू / एमएल से 10,000 माइक्रोग्राम / एमएल) स्टॉक समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
    2. IPSC पारित करने के लिए, कुओं से माध्यम महाप्राण और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ एक बार प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें. अच्छी तरह से प्रति IPSC पृथक्करण समाधान के 1 एमएल जोड़ें, और 1 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में सेते हैं.
    3. IPSC पृथक्करण समाधान महाप्राण, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (किसी भी माध्यम के बिना) पर कोशिकाओं को सेते हैं. IPSC पृथक्करण समाधान को बेअसर करने के लिए IPSC माध्यम में 2 माइक्रोन थियाज़ोविविन के 1 एमएल जोड़ें।
    4. लगभग 10 कोशिकाओं के गुच्छों में कालोनियों को अलग करने के लिए एक 2 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग करें, और आईपीएससी माध्यम में 2 माइक्रोन थियाज़ोविविन के अतिरिक्त 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (चरण 2.1.1) के साथ लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें।
    5. 24 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दें, और ताजा आईपीएससी माध्यम जोड़ें (थियाज़ोविविन के बिना)। IPSC फ़ीड हर 48 घंटे के साथ 2 आईपीएससी मध्यम के एमएल या हर 72 घंटे के साथ 4 एमएल माध्यम. कोशिकाओं को 1:6 कमजोर पड़ने पर हर 3 दिनों में गुजरने के लिए या जब वे 80% संगम तक पहुंचते हैं।
      नोट: विभिन्न सेल लाइनों को कमजोर पड़ने और पारित होने की आवृत्ति के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  2. कार्डियोमायोसाइट भेदभाव
    1. भेदभाव शुरू जब IPSC monolayers कर रहे हैं 80% -90% मिलाऊ.
    2. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट 1640 मध्यम (आरपीएमआई) के 500 एमएल के लिए इंसुलिन के बिना बी 27 पूरक के 10 एमएल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन स्टॉक समाधान के 5 एमएल जोड़कर भेदभाव माध्यम तैयार करें। बी 27 पूरक के 10 एमएल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन स्टॉक समाधान के 5 एमएल को आरपीएमआई 1640 के 500 एमएल में जोड़कर कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम तैयार करें।
      नोट: भेदभाव माध्यम और कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. डे 0: कोशिकाओं को DMEM/F12 के 1 एमएल से धोएं, और भेदभाव माध्यम में 10 माइक्रोन CHIR99021 और पतला बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 2 एमएल जोड़ें।
    4. दिन 1: 24 घंटे के बाद, या जब सेल संगम 70% से कम हो गया है, तो कोशिकाओं को डीएमईएम/एफ 12 के 1 एमएल से धोएं, भेदभाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, और 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. दिन 3-4: कोशिकाओं को DMEM/F12 के 1 एमएल से धोएं, और भेदभाव माध्यम में 5 माइक्रोन IWR-1 के 2 एमएल जोड़ें। 4 दिन पर दोहराएं।
    6. दिन 5-6: कोशिकाओं को DMEM/F12 के 1 एमएल से धोएं, और भेदभाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। 6 दिन पर दोहराएं।
    7. दिन 7-10: कोशिकाओं को DMEM/F12 के 1 एमएल से धोएं, और कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। हर 24 घंटे दोहराएं।
    8. दिन 11+: हर 48-72 घंटे में ताजा कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के 4 एमएल के साथ माध्यम बदलें। एस्पिरेट और पिपेट धीरे-धीरे सख्ती से पिटाई monolayers को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए.

3. एचईसीटी संस्कृति

  1. कार्डियोमायोसाइट्स की कटाई
    1. hECT निर्माण में उपयोग के लिए कार्डियोमायोसाइट मोनोलेयर्स को 8-60 दिनों के बाद भेदभाव प्रेरण के बाद हार्वेस्ट करें। प्रति अच्छी तरह से 2-5 मिलियन कोशिकाओं की अपेक्षा करें।
      नोट: यदि कोशिकाओं ने 10 दिन तक धड़कना शुरू नहीं किया है, तो भेदभाव सफल होने की संभावना नहीं है। सख्ती से पिटाई monolayers अक्सर भेदभाव में 11-15 दिनों के बाद अलग और घने ऊतकों में कॉम्पैक्ट. इस समय ऐसी कोशिकाओं का उपयोग करने या उन्हें रिप्लेट करने की अनुशंसा की जाती है।
    2. पीबीएस के 2 एमएल के साथ कार्डियोमायोसाइट्स 2x के प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला। कमरे के तापमान 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं गोल दिखाई देते हैं और थाली के प्रकाश दोहन के साथ अलग हो जाएगा.
    3. पृथक्करण को बेअसर करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम में 10% एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें। धीरे एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक टिप का उपयोग monolayers विंदुक, और 10-20 कोशिकाओं के गुच्छों में गोली तोड़ने के लिए एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए हस्तांतरण.
    4. कोशिकाओं के 10 माइक्रोन को ट्राइपैन नीले रंग के 10 माइक्रोन में स्थानांतरित करने से पहले शंक्वाकार ट्यूब को उलटकर सेल निलंबन मिलाएं। एक स्वचालित सेल काउंटर या ग्लास हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सेल निलंबन को उचित रूप से अलग करें यदि सभी कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया जाएगा या यदि कुछ कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अलग रखा गया है।
      नोट: पूरक कोशिकाओं (जैसे फाइब्रोब्लास्ट्स) को इस बिंदु पर जोड़ा जा सकता है।
    5. 5 मिनट के लिए 250 × ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. तुरंत सेल गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, और बर्फ पर रखने. कोशिकाओं को गोली में खर्च समय को कम करने के लिए जल्दी से काम करते हैं.
  2. एचईसीटी निर्माण
    1. तालिका 2 में वॉल्यूम का उपयोग करें, और गोली में कोशिकाओं की संख्या के अनुसार समायोजित करें ताकि प्रत्येक एचसीटी में 1 मिलियन कोशिकाएं हों। प्रत्येक चरण के बाद, बुलबुले से बचने के लिए धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं।
      नोट: चरण 3.2.2-3.2.3 प्रत्यक्ष प्रकाश से परिरक्षित करें क्योंकि कुछ घटक प्रकाश-संवेदनशील होते हैं।
    2. आसुत जल के 13.442 माइक्रोन, 10x पीबीएस के 4.4 माइक्रोन, और 1 एम एनएओएच के 0.638 माइक्रोन जोड़कर 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में 2.9 ग्राम / एमएल टाइप -1 कोलेजन समाधान तैयार करें। एमएल कोलेजन स्टॉक समाधान के 25.52 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं।
    3. बाह्य मैट्रिक्स मिश्रण (तालिका 2 से ईसीएम मिश्रण) तैयार करें: 10x एमईएम के 5.5 माइक्रोन के बाद 0.2 एन पीएच 9 एचईपीईएस समाधान के 5.5 माइक्रोन जोड़ें। एक समान हल्के-पीले से हल्के-गुलाबी रंग तक अच्छी तरह मिलाएं। सेल गोली के लिए ईसीएम मिश्रण समाधान के 35.2 माइक्रोन स्थानांतरण, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 4.4 माइक्रोन जोड़ें।
    4. बायोरिएक्टर भागों के आटोक्लेव बैग खोलें (चरण 1.4.7, चित्र 4A)। जबकि दस्ताने 70% इथेनॉल के साथ निष्फल पहने हुए, आटोक्लेव बैग से काले बेसप्लेट को हटा दें, और कुओं का सामना करना पड़ के साथ एक 60 मिमी पकवान में जगह. बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए धीरे-धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से सेल मिश्रण के पिपेट 44 माइक्रोन। यदि आवश्यक हो, तो पिपेट का उपयोग किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए करें जो कि पाइपिंग द्वारा पेश किए गए थे या PTFE की हाइड्रोफोबिसिटी के कारण बने हैं। एचसीटी की मात्रा को पुनर्स्थापित करें जैसे कि तरल की सतह कुएं के होंठ के साथ फ्लश हो (चित्रा 4बीआई)।
    5. निष्फल दस्ताने की एक ताजा जोड़ी डॉन करें, और आटोक्लेव बैग से पीडीएमएस रैक के साथ पॉलीसल्फोन फ्रेम को हटा दें। बेसप्लेट पर फ्रेम को इस तरह कम करें कि फ्रेम के सिरे बेसप्लेट के सिरों पर खांचे में फिट हों (चित्र 4BII, III)। यह सुनिश्चित करने के लिए बायोरिएक्टर का निरीक्षण करें कि पोस्ट सभी सीधे हैं और 60 मिमी डिश में रखने से पहले फ्रेम झुका हुआ नहीं है।
    6. कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम में 10% एफबीएस के 1 एमएल को 60 मिमी डिश में जोड़ें (ध्यान रखें कि एचईसीटी को परेशान न करें) ताकि डिश में आर्द्रता बढ़ सके क्योंकि एचसीटी जम जाते हैं। एक उच्च प्रोफ़ाइल (20 मिमी लंबा) 100 मिमी पकवान में ढक्कन के बिना 60 मिमी पकवान रखें, एक 100 मिमी डिश ढक्कन के साथ कवर, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के लिए बायोरिएक्टर लौटने के लिए कोलेजन निलंबन में कोशिकाओं के साथ एक जेल फार्म करने के लिए.
    7. 2 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से पकवान को हटा दें। कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम में 10% एफबीएस के 13 एमएल जोड़ें, पीटीएफई बेसप्लेट और पीडीएमएस रैक के बीच प्रवाह के लिए माध्यम को प्रोत्साहित करने के लिए पकवान को झुकाएं।
    8. यह सुनिश्चित करने के लिए पक्ष से बायोरिएक्टर का निरीक्षण करें कि पीटीएफई बेसप्लेट और पीडीएमएस रैक की हाइड्रोफोबिक सतहों के बीच कोई हवाई बुलबुले फंस गए हैं, और डिश को इनक्यूबेटर में वापस कर दें। यदि फंसी हुई हवा है, तो बुलबुला टूटने देने के लिए बायोरिएक्टर को माध्यम से बाहर झुकाएं, और धीरे-धीरे इसे फिर से कम करें, या हवा को बाहर निकालने के लिए जेल लोडिंग टिप के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, ध्यान रखें कि पोस्ट परेशान न हों।
  3. बेसप्लेट हटाना
    1. फ्रेम में अंतराल के माध्यम से hECT संघनन का निरीक्षण करें। 24-96 घंटे के दौरान, एचसीटी कॉम्पैक्ट होते हैं और अधिक अपारदर्शी हो जाते हैं (चित्र 4CI-III)। एक बार जब एचसीटी और बेसप्लेट (चित्रा 4सीआईआई) की दीवार के बीच एक दृश्य अंतर होता है, तो एफबीएस के बिना मध्यम से कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम में बदलने के लिए दो अर्ध-मात्रा मध्यम परिवर्तन करें। बेसप्लेट निकालें जब एचईसीटी मूल व्यास (चित्रा 4CIII) की तुलना में कम से कम 30% से संकुचित होते हैं। बायोरिएक्टर युक्त 60 मिमी डिश को कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम से भरें जब तक कि तरल डिश के होंठ के साथ फ्लश न हो जाए, और एक नए 60 मिमी डिश में 14 एमएल जोड़ें।
    2. महत्वपूर्ण कदम: बाँझ दस्ताने पहनते समय, बायोरिएक्टर को उसके डिश में पलटें ताकि बेसप्लेट शीर्ष पर हो (चित्र 4BIV)। चरण 3.2.8 के रूप में फंस हवा बुलबुले के लिए निरीक्षण. धीरे-धीरे बेसप्लेट उठाएं, इसे स्तर (चित्रा 4 बीवी) रखते हुए।
    3. यदि बेसप्लेट हटाने के दौरान एक hECT गिर जाता है, लेकिन बेसप्लेट में रहता है, तो बेसप्लेट से hECT को 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग करें। अपने पोस्ट करने के लिए hECT के अंत गाइड करने के लिए संदंश का प्रयोग करें. पोस्ट स्थिर धारण करने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग करें, और यह एचसीटी में छेद के माध्यम से धागा. यदि आवश्यक हो तो दूसरी पोस्ट के लिए दोहराएं।
    4. पदों से जुड़े सभी एचसीटी के साथ, एचईसीटी के साथ फ्रेम को नए 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें, और फ्रेम को नीचे की ओर इशारा करते हुए पदों के साथ रखें (चित्र 4बीवीआई)। यह सुनिश्चित करने के लिए बायोरिएक्टर का निरीक्षण करें कि एचसीटी एसपीओटी के समीपस्थ अपने पदों पर बने रहें।
    5. यदि एक hECT को सतह तनाव द्वारा अपने पदों के आधार पर धकेल दिया गया है, तो बाँझ घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ फ्रेम को स्थिर करें। फ्रेम में स्लॉट के माध्यम से संदंश की अन्य जोड़ी डालें, यह बंद रखने. एक बार संदंश की नोक PDMS रैक पिछले उतारा गया है, यह पोस्ट तक पहुँच जाता है ताकि यह मोड़, और धीरे पोस्ट के अंत की ओर hECT धक्का करने के लिए बंद सुझावों का उपयोग जब तक यह एसपीओटी (चित्रा 4BVI, इनसेट) पर टिकी हुई है.
  4. एचईसीटी रखरखाव
    1. कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के साथ हर 24-48 घंटे में आधा मात्रा मध्यम परिवर्तन करें (संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, आवृत्ति प्रति सप्ताह दो बार कम हो सकती है।
    2. जब hECTs सहज पिटाई के समूहों को प्रदर्शित करते हैं, आमतौर पर दिन 3 तक, और दिन 5 तक दृश्यमान पोस्ट विक्षेपण के साथ समन्वित धड़कन, कार्यात्मक माप शुरू करें, और जितनी बार चाहें दोहराएं।
      नोट: hECTs कि दिन 7 तक समन्वित पिटाई शुरू नहीं कर दिया है सब पर ऐसा करने की संभावना नहीं है.
घटक वॉल्यूम (μL)
आसुत एच2ओ 13.442 2.9 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन समाधान "ईसीएम मिक्स" अंतिम एचसीटी सेल मिश्रण
NaOH 1N 0.638
पीबीएस 10x 4.4
5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन स्टॉक 25.52
0.2 एन पीएच 9 एचईपीईएस 5.5
10x एमईएम 5.5
सेल गोली में स्थानांतरित करने के लिए ईसीएम मिश्रण की मात्रा 35.2
Matrigel की मात्रा 4.4

तालिका 2: एचसीटी अभिकर्मकों। घटकों को सूचीबद्ध क्रम में जोड़ा जाना चाहिए और बर्फ पर रखा जाना चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: बायोरिएक्टर असेंबली और एचईसीटी निर्माण। (ए) (I) पॉलीसल्फोन फ्रेम (दाएं, तन) पर लगे दो पीडीएमएस रैक (बाएं, हल्का नीला)। (II) PTFE बेसप्लेट (काला, बाएं) तब फ्रेम (दाएं) पर फिट बैठता है जैसे कि पदों की प्रत्येक जोड़ी बेसप्लेट के एक कुएं में फिट बैठती है। (बी) (I) कोलेजन-आधारित बाह्य मैट्रिक्स में कार्डियोमायोसाइट निलंबन के चौवालीस माइक्रोलीटर छह बेसप्लेट कुओं में से प्रत्येक में जोड़े जाते हैं। (द्वितीय, तृतीय) पीडीएमएस रैक वाला फ्रेम बेसप्लेट पर प्रेस-फिट है। 1-4 दिनों के बाद, एचसीटी को बेसप्लेट से हटाया जा सकता है। (IV) सबसे पहले, बायोरिएक्टर को फ्रेम से ऊपर उठाने से पहले (V) उलटा किया जाता है। (VI) छह एचईसीटी वाले बायोरिएक्टर का साइड-व्यू। इनसेट: एसपीओटी (इनसेट) के सापेक्ष पदों पर एचईसीटी स्थिति दिखाते हुए आवर्धित दृश्य। (सी) सीएडी प्रतिपादन एचसीटी संघनन के तीन स्तर दिखा रहा है ([I] कम, [II] मध्यम, और [III] उच्च) जैसा कि पॉलीसल्फोन फ्रेम में अंतर के माध्यम से देखा गया है। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: सीएडी = कंप्यूटर एडेड डिजाइन; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; PTFE = पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन; SPoT = स्थिर पोस्ट ट्रैकर; hECT = मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. एचईसीटी पेसिंग उपकरण

  1. गर्म चरण के लिए जैकेट
    1. ऐक्रेलिक इन्सुलेट जैकेट के घटकों को 0.635 सेमी मोटी स्पष्ट ऐक्रेलिक शीट (पूरक फ़ाइल 3), चित्रा 5 ए-डी में से एक, और चित्रा 5 ई, एफ के दो प्रत्येक से बाहर काटने के लिए लेजर काटने की मशीन का उपयोग करें।
    2. चित्रा 5 से भागों (बी), (सी), (डी), और (ई) में से एक को इकट्ठा करें, और चित्रा 5GI में दिखाए गए ऐक्रेलिक गोंद का उपयोग करके एक साथ बंधें। शीर्ष पैनल संलग्न करें (चित्र 5GII), गोंद को सेट करने के लिए कई घंटों की अनुमति दें, और फिर गर्म अवस्था को जैकेट के किनारे में स्लाइड करें (चित्र 5GIII)।
    3. एक बार जैकेट जगह में है, गर्म चरण के पैरों के बीच में आवेषण सुरक्षित करने के लिए टेप का उपयोग करें, और विधानसभा (चित्रा 5GV) खत्म करने के लिए सामने पैनल (चित्रा 5GIV) जोड़ें.
  2. ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड निर्माण
    1. 35 मिमी लंबे ब्लॉक में देखे गए बैंड का उपयोग करके 6.25 मिमी मोटी, 25 मिमी चौड़ी ग्रेफाइट बार काटें; फिर, प्रत्येक ब्लॉक लंबाई में एक घुमावदार लाइन में इतना है कि प्रत्येक इलेक्ट्रोड एक छोर पर 13-16 मिमी लंबा है और दूसरे छोर पर 8-10 मिमी लंबा है. ऊपरी कोने में दो 0.7 मिमी व्यास छेद ड्रिल करें (चित्र 6AI)। कागज तौलिए के साथ टुकड़ों को पॉलिश करें, और ग्रेफाइट धूल को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए पानी में सोनिकेट करें। इलेक्ट्रोड(चित्रा 6AII) के बीच एक सुसंगत दूरी सुनिश्चित करने के लिए डिश की दीवारों और 25 मिमी चौड़ा बायोरिएक्टर के बीच इलेक्ट्रोड कील सुनिश्चित करें कि सुनिश्चित करें.
    2. इलेक्ट्रोड के छेद के माध्यम से एक 150 मिमी लंबा x 0.25 मिमी व्यास स्टील के तार को थ्रेड करें, और इसे 60 मिमी डिश के होंठ पर और 100 मिमी डिश की दीवारों के चारों ओर फिट करने के लिए मोड़ें ताकि ढक्कन बंद किया जा सके (चित्र 6AII)।
    3. किसी भी अवशोषित माध्यम को हटाने के लिए प्रत्येक उपयोग के बाद 1-2 घंटे के लिए आसुत जल में भिगोने से इलेक्ट्रोड को साफ करें, रात भर सूखने की अनुमति दें, और फिर 30 मिनट के लिए 132 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें। माप शुरू करने से पहले, बायोरिएक्टर (चित्रा 6AII) के दोनों ओर एक इलेक्ट्रोड रखें। तारों की स्थिति बनाएं ताकि 100 मिमी डिश ढक्कन को बंद किया जा सके, और बायोरिएक्टर को इनक्यूबेटर में संतुलित करने के लिए वापस कर दें।

Figure 5
चित्रा 5: गर्म ग्लास चरण को इन्सुलेट करने के लिए ऐक्रेलिक जैकेट। ग्लास टेबल के लिए डिज़ाइन किए गए ऐक्रेलिक जैकेट के टुकड़ों के प्रमुख आयामों को दिखाते हुए सीएडी छवियां। (ए) शीर्ष पैनल में बायोरिएक्टर डिश को हीटिंग तत्व पर बैठने की अनुमति देने के लिए 27 सेमी x 18.5 सेमी छेद कट-आउट है। कोनों में नारंगी आयताकार जैकेट के शीर्ष और हीटिंग तत्व के बीच जगह प्रदान करने के लिए छोटे स्पेसर टुकड़ों के सुझाए गए प्लेसमेंट को इंगित करते हैं। (बी) जैकेट के निचले टुकड़े में दो कट-आउट होते हैं ताकि गर्म चरण के पैरों को (हरे तारांकन) में स्लाइड करने की अनुमति मिल सके। (सी एंड डी) दो साइड पैनल शीर्ष टुकड़े के नीचे फिट होते हैं। (डी) बाईं ओर के पैनल में स्टेज पावर कॉर्ड के लिए 3 सेमी x 0.3 सेमी कट-आउट (इनसेट) शामिल है। (ई) लंबे पैनल आगे और पीछे फिट होते हैं। (एफ) तालिका के अंदर होने के बाद अंतराल को भरने के लिए आवेषण जोड़े जाते हैं। (G) (I) साइड और बैक पैनल नीचे के टुकड़े से जुड़े होते हैं, और फिर (II) शीर्ष पैनल जोड़ा जाता है। (III) कांच की मेज जैकेट (मैजेंटा तीर) में फिसल जाती है। (IV) आवेषण मेज के पैरों के बीच जुड़े होते हैं, और बॉक्स को बंद करने के लिए पीठ उद्घाटन पर फिट होती है। (V) पूर्ण जैकेट विधानसभा। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: सीएडी = कंप्यूटर एडेड डिजाइन; आर = त्रिज्या; Ø = व्यास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एचसीटी संकुचन का डेटा अधिग्रहण। (ए) (I) ग्रेफाइट सलाखों से काटे गए इलेक्ट्रोड की तस्वीरें। मैजेंटा तीर स्टेनलेस स्टील के तारों को जोड़ने के लिए छेद का संकेत देते हैं। स्केल बार = 1 सेमी। (II) तिरछा दृश्य (बाएं) और शीर्ष दृश्य (दाएं) बायोरिएक्टर में ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड की नियुक्ति दिखा रहा है। इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड के बीच एक सुसंगत दूरी सुनिश्चित करने के लिए 25 मिमी चौड़े बायोरिएक्टर और डिश की दीवार के बीच की जगह लेते हैं। डिश ढक्कन को बंद करने की अनुमति देने के लिए तारों को मोड़ा जाता है। (बी) लामिना का प्रवाह स्वच्छ बेंच-सभी उपकरणों को स्वच्छ बेंच से कंपन शोर को कम करने के लिए कंपन अलगाव तालिका पर रखा गया है। बायोरिएक्टर (मैजेंटा एरोहेड) जैकेट वाले गर्म मंच पर बैठता है, जो ऊपर से एक एलईडी प्रकाश स्रोत द्वारा प्रकाशित होता है। विदारक माइक्रोस्कोप नीचे से बायोरिएक्टर को देखने के लिए एक समकोण दर्पण (नारंगी तारांकन) पर क्षैतिज रूप से इंगित किया जाता है और एक सीसीडी कैमरा (बाएं) के साथ लगाया जाता है। फ़िरोज़ा ब्रैकेट बंद-लूप गर्म चरण नियंत्रक को प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए निरंतर तापमान निगरानी के लिए पानी के स्नान को इंगित करता है। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक; LED = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. hECT कार्यात्मक माप

  1. पेसिंग कार्यक्षेत्र की स्थापना
    1. गर्म चरण को 39.5 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें, और चित्रा 6 बी के अनुसार एक लामिना का प्रवाह साफ बेंच के अंदर एक कंपन अलगाव तालिका पर पेसिंग उपकरण स्थापित करें। एक बूम स्टैंड पर विदारक खुर्दबीन माउंट, और नीचे से बायोरिएक्टर देखने के लिए कांच की मेज के नीचे एक प्रयोगशाला जैक पर स्थित एक समकोण दर्पण (चित्रा 6 बी, नारंगी तारांकन) पर यह बिंदु. माइक्रोस्कोप के लिए एक उच्च गति सीसीडी कैमरा प्रत्यय, और कंप्यूटर से कनेक्ट. कार्यक्षेत्र निष्फल करने के लिए 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ सेटअप विकिरणित करें।
    2. बायोरिएक्टर (चित्रा 6 बी, मैजेंटा एरोहेड) को जैकेट वाले गर्म मंच पर रखें, ऊपर से एक दोहरे सिर वाले गोसनेक एलईडी प्रकाश स्रोत द्वारा प्रकाशित (एलईडी लैंप की गर्दन फाइबर-ऑप्टिक लैंप की तुलना में मुख्य इकाई में अधिक सुरक्षित रूप से बांधा जा सकता है)। कंपन तालिका (और तालिका ही) पर पेसिंग उपकरण सुनिश्चित करके अतिरिक्त शोर को कम करें लामिना का प्रवाह साफ बेंच के किसी भी हिस्से को नहीं छू रहा है।
    3. गर्म टेबल (चित्रा 6 बी, फ़िरोज़ा ब्रैकेट) पर 100 मिमी डिश के अंदर पहले से गरम पानी से भरा दूसरा 60 मिमी पकवान जोड़ें, और निरंतर तापमान निगरानी के लिए तापमान जांच के साथ संगठन। संदर्भ डिश के तापमान को 36-37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए आवश्यकतानुसार गर्म चरण की तापमान सेटिंग को समायोजित करें।
    4. माइक्रोस्कोप आवर्धन को 1.5x (या एक अन्य वांछित आवर्धन जिसके साथ एक एचसीटी को पर्याप्त संकल्प के साथ इसकी संपूर्णता में कल्पना की जा सकती है) पर सेट करें।
  2. कैमरा सेटिंग्स समायोजित करना
    1. कैमरा सॉफ़्टवेयर खोलें। पूरे एचसीटी की कल्पना करते हुए जितना संभव हो सके देखने के क्षेत्र को क्रॉप करने के लिए वीडियो फ़ीड का आकार बदलें। यह कैमरे की गति को अधिकतम करता है।
    2. कैप्चर दर को 90 फ्रेम प्रति सेकंड पर सेट करें। पूरे क्षेत्र में प्रकाश की स्थिति की एकरूपता को अनुकूलित करने के लिए एक्सपोज़र समय और प्रकाश स्रोत की स्थिति को समायोजित करें view और SPoT के कंट्रास्ट को अधिकतम करें।
  3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सेटअप
    1. स्क्वायर पल्स उत्तेजक चालू करें, और इसे कंप्यूटर से कनेक्ट करें। 12 वी के आयाम और 5 एमएस की अवधि के साथ द्विध्रुवीय दालों को वितरित करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें।
    2. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद "AutomatedPostTracking3.vi" फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 4) खोलें। एक बार यह लोड हो जाता है, उपकरण पट्टी के बाईं ओर सफेद तीर पर क्लिक करने के लिए कार्यक्रम (चित्रा 7A) आरंभ करें.
    3. गर्म चरण पर एक ग्लास हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट करें। टूलबार (चित्रा 7बी) में, हेमोसाइटोमीटर चिह्नों के 1 मिमी में एक रेखा खींचने के लिए लाइन टूल पर क्लिक करें (दिखाया नहीं गया है)। दूरी अंशांकन (पिक्सेल/मिमी) बॉक्स (चित्रा 7C) में, 1 के लिए संदर्भ लंबाई (मिमी) सेट, और उसके बाद गणना बटन पर क्लिक करें.
    4. ऊतक की चौड़ाई में एक रेखा खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करके hECT क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र को मापें। क्षेत्र की गणना करने के लिए क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (मिमी ^ 2) बॉक्स (चित्रा 7 डी) में 1 पर क्लिक करें (रैखिक ऊतक स्ट्रिप्स की एक बेलनाकार ज्यामिति मानते हुए, जैसा कि साहित्य 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 में स्थापित है, 12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38)। एचसीटी के विभिन्न हिस्सों के साथ दोहराएं, और बॉक्स में अन्य दो बटन के नीचे मान रिकॉर्ड करें। आउटपुट डेटा तालिका फ़ाइल ऊतक के व्यास की गणना करने के लिए इन तीन मानों के औसत की रिपोर्ट करती है।
  4. hECT कार्यात्मक लक्षण वर्णन
    1. सुनिश्चित करें कि पोस्ट टिप्स फोकस में हैं। थ्रेसहोल्डिंग स्विच (चित्रा 7E) चालू करें, और स्लाइडर (चित्रा 7F) को तब तक समायोजित करें जब तक कि एसपीओटी (चित्र 7G) अच्छी तरह से सीमांकित न हो जाएं और hECT अनुबंध के रूप में आकार न बदलें।
    2. SpoTs (चित्र 7, हरा आयत) में से किसी एक के चारों ओर एक आयत बनाने के लिए आयत उपकरण का उपयोग करें, और SPoT के चारों ओर आयत स्थिति सेट करने के लिए पोस्ट सीमाओं के बॉक्स (चित्र 7H) के अंदर सेट 1 बटन पर क्लिक करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि SPoT हर समय आयत की सीमा के भीतर रहता है। अन्य पोस्ट के लिए दोहराएं, और इसे सेट 2 के तहत रिकॉर्ड करें।
    3. प्रोग्राम को छोटी वस्तुओं को ट्रैक करने से रोकने के लिए ऑब्जेक्ट आकार सेटिंग्स (चित्र 7I) समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आयत में ट्रैक की गई वस्तुओं की संख्या स्थिर रहती है। इंटरफ़ेस (चित्रा 7J) वास्तविक समय में ट्रैक की गई वस्तुओं के बीच मापा दूरी दिखाता है। शोर की निगरानी के लिए इस ग्राफ का उपयोग करें।
    4. फ़ाइलों को सहेजने के लिए एक निर्देशिका का चयन करें (चित्र 7K)। अलग-अलग दिनों के डेटा को अलग-अलग फ़ोल्डर में स्टोर करें। वर्तमान ऊतक संख्या का चयन करें, और टिप्पणियाँ बॉक्स में कोई भी वांछित टिप्पणी लिखें।
    5. पेसिंग फ्रीक्वेंसी (हर्ट्ज) हेडर (चित्रा 7L) के तहत, वांछित आवृत्तियों की सीमा (न्यूनतम और अधिकतम) को इंगित करें, और न्यूनतम से अधिकतम तक कदम रखने के लिए वांछित अंतराल। यदि उनकी संपूर्ण कैप्चरिंग रेंज में एचईसीटी को पेस करते हैं, तो सबसे कम आवृत्ति खोजने के लिए अलग-अलग पेसिंग आवृत्तियों का परीक्षण करें, जिस पर 1: 1 उत्तेजना: पीक अनुपात हासिल किया जाता है, और उस अनुपात को खो जाने तक आवृत्ति में वृद्धि जारी रखें। एक मनमाना आवृत्ति रेंज (जैसे, 0.01 हर्ट्ज से 0.01 हर्ट्ज) चुनकर और स्क्वायर पल्स उत्तेजक आउटपुट को बंद रखकर सहज फ़ंक्शन को मापें।
    6. दाईं ओर के बक्से में, वांछित सेटिंग समय (ओं) का चयन करें (आवृत्ति सेट होने के बाद समय का अंतराल लेकिन डेटा रिकॉर्ड नहीं किया गया है) ताकि hECT को नई पेसिंग आवृत्ति में समायोजित करने की अनुमति मिल सके। रिकॉर्डिंग समय (ओं) और पेसिंग वोल्टेज (वी) निर्दिष्ट करें। स्टार्ट प्रोग्राम बटन (चित्रा 7M) पर क्लिक करके प्रोग्राम शुरू करें।
      नोट:: परिणाम स्वचालित रूप से चयनित निर्देशिका में सहेजे जाते हैं। प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बाद, स्क्रिप्ट डेटा (चित्रा 7N) के फूरियर परिवर्तन को प्रदर्शित करता है, जहां चोटियों का पता चला पिटाई आवृत्ति के अनुरूप है कि निरीक्षण करें.
    7. यदि वांछित है, तो देखने में एचईसीटी को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम वोल्टेज खोजने के लिए "उत्तेजना थ्रेशोल्ड फाइंडिंग" कार्यक्रम चलाएं (चित्र 7ओ)। यदि वांछित है, पदों (चित्रा 7P) के अधिकतम और न्यूनतम विक्षेपण की गणना.

Figure 7
चित्रा 7: पोस्ट विक्षेपण डेटा अधिग्रहण इंटरफ़ेस। (ए) सॉफ्टवेयर चलाने के लिए बटन। (बी) टूलबार जिसमें क्रमशः लंबाई माप और वस्तु चयन के लिए लाइन और आयत उपकरण होते हैं। (सी) दूरी अंशांकन नियंत्रण। (डी) तीन अलग-अलग बिंदुओं पर एचईसीटी क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र को मापने के लिए उपकरण। (ई) थ्रेसहोल्डिंग स्विच और (एफ) स्लाइडर वास्तविक समय में वीडियो फ़ीड को उच्च-विपरीत छवियों में परिवर्तित करने के लिए। (G) पूर्वावलोकन विंडो में दिखाई देने वाला एक SPoT. (ज) एसपीओटी का चयन करने के लिए उपकरण। (I) वस्तुओं को आकार से फ़िल्टर करने के लिए स्लाइडर। (जे) ग्राफ वास्तविक समय में ट्रैक की गई वस्तुओं के बीच मापा दूरी दिखा रहा है। (K) आउटपुट फ़ाइलों को सहेजने के लिए निर्देशिका का चयन करने के विकल्प। (एल) आवृत्ति रेंज, आवृत्ति अंतराल, रिकॉर्डिंग समय सेट करने और पोस्ट ट्रैकिंग प्रोग्राम (एम) के लिए रिकॉर्डिंग के बीच समय निर्धारित करने के विकल्प। (एन)अंतिम सहेजी गई रिकॉर्डिंग के विक्षेपण वक्र के फूरियर परिवर्तन का ग्राफ आउटपुट। (ओ) एचसीटी को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम वोल्टेज खोजने के लिए कार्यक्रम। (पी) पदों के अधिकतम और न्यूनतम विक्षेपण की गणना करने के लिए कार्यक्रम। संक्षिप्ताक्षर: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक; SPoT = स्थिर पोस्ट ट्रैकर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. पीडीएमएस रैक माप

  1. अनलोड की गई दूरियां
    1. एचईसीटी निर्माण से पहले, पीडीएमएस रैक की वांछित जोड़ी को एक फ्रेम पर माउंट करें। कार्यात्मक माप के लिए चरण 5.1 में वर्णित पेसिंग सेटअप और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। पदों के अंत में स्थिर एसपीओटी का चयन करें।
    2. शोर को <2 माइक्रोन तक कम करने के लिए यदि आवश्यक हो तो प्रकाश स्रोत और/या थ्रेसहोल्डिंग को समायोजित करें। स्प्रेडशीट में ग्राफ में इंगित औसत लाइव वाई-मान रिकॉर्ड करें।
  2. पोस्ट की ऊंचाई और hECT ऊंचाई
    1. चरण 5.2 में वर्णित पेसिंग सेटअप से, एंगल्ड मिरर और हीटेड स्टेज को हटा दें। बायोरिएक्टर के साइड व्यू के लिए बायोरिएक्टर को सीधे लैब जैक पर रखें।
    2. कैमरा सॉफ़्टवेयर खोलें। देखने के क्षेत्र में प्रकाश की स्थिति की एकरूपता को अनुकूलित करने और पदों की दृश्यता को अधिकतम करने के लिए एक्सपोज़र समय और प्रकाश स्रोत की स्थिति को समायोजित करें।
    3. डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद "PostMeasurement_PB3.vi" फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 5) खोलें। एक बार जब यह लोड हो जाता है, तो प्रोग्राम को इनिशियलाइज़ करने के लिए टूलबार के बाईं ओर सफेद तीर पर क्लिक करें।
    4. एक ग्लास हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट करें। देखने की खिड़की के बाईं ओर ऊर्ध्वाधर टूलबार में लाइन टूल पर क्लिक करें, और हेमोसाइटोमीटर चिह्नों के 1 मिमी में एक रेखा खींचें। स्क्रीन के निचले बाएँ में दूरी अंशांकन (पिक्सेल / मिमी) बॉक्स में, संदर्भ लंबाई (मिमी) को 1 पर सेट करें, और फिर गणना बटन पर क्लिक करें।
    5. अंशांकन क्षेत्रों के नीचे, ऊतक संख्या क्षेत्र में वांछित ऊतक संख्या (पहचान के लिए) सेट करें। कैमरे को hECT की बाईं पोस्ट पर फ़ोकस करें और पोस्ट साइड बॉक्स में लेफ्ट चुनें।
    6. पोस्ट (शीर्ष) के आधार से एसपीओटी (नीचे) की नोक तक एक रेखा खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें, और माप पोस्ट एचटी पर क्लिक करके रिकॉर्ड करें।
    7. पोस्ट के आधार से एचसीटी के दूर किनारे तक एक रेखा खींचें, और माप ऊतक शीर्ष एचटी पर क्लिक करके रिकॉर्ड करें। पोस्ट के आधार से hECT के निकट किनारे तक एक रेखा खींचें, और माप ऊतक बेस HT पर क्लिक करके रिकॉर्ड करें।
    8. इस बिंदु पर, सही पोस्ट ऊंचाई को मापने के लिए बायोरिएक्टर को चारों ओर घुमाएं। समान माप रिकॉर्ड करने के लिए सही पोस्ट विकल्प का चयन करें। स्प्रेडशीट को मापा मूल्यों के साथ पॉप्युलेट करने के लिए जोड़ें बटन पर क्लिक करें और स्वचालित रूप से एचसीईटी की औसत ऊंचाई की गणना करें, जिसका उपयोग चरण 7 में किया जाएगा।
    9. एक बार ऊतक ऊंचाइयों रिकॉर्डिंग समाप्त, पर क्लिक करें सहेजें एक पाठ फ़ाइल के मूल्यों को बचाने के लिए बटन.

7. कस्टम विश्लेषण स्क्रिप्ट का उपयोग कर कार्यात्मक डेटा प्रोसेसिंग

  1. स्प्रेडशीट संपादक में, टेम्पलेट (पूरक फ़ाइल 6) का उपयोग करके सारांश फ़ाइल भरें। पोस्ट लंबाई और औसत ऊतक ऊंचाई मूल्यों 6.2 कदम में अधिग्रहित का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि फ़ोल्डर में डेटा वाले सभी hECTs सारांश फ़ाइल में दर्शाए गए हैं। फ़ाइल को "सारांश #.csv" नाम दें, जहां # प्रयोग में दिनों की संख्या को संदर्भित करता है।
    नोट: hECT कार्यात्मक डेटा प्रयोग दिवस के अनुसार अलग-अलग फ़ोल्डरों में होना चाहिए।
  2. AnalyzeLogsGUI स्क्रिप्ट वाले फ़ोल्डर (पूरक फ़ाइल 7) और hECT रिकॉर्डिंग वाले फ़ोल्डर दोनों पथ में जोड़े जाते हैं सुनिश्चित करें।
  3. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। निर्देशिका पट्टी के बाईं ओर, पर क्लिक करें फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें उस मूल फ़ोल्डर में नेविगेट करने के लिए बटन जिसमें AnalyzeLogsGUI फ़ोल्डर और hECT कार्यात्मक डेटा दोनों शामिल हैं। वर्तमान विंडो साइडबार में, पथ में जोड़ें के लिए इन फ़ोल्डरों पर राइट-क्लिक करें | चयनित फ़ोल्डर और सबफ़ोल्डर जोड़ें.
  4. "AnalyzeLogsGui_SC.m" फ़ाइल खोलें। संपादक टैब में, रन बटन दबाएं, और एक नई विंडो में ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें।
    1. लॉग चयन बॉक्स (चित्र 8AI) में, निर्देशिका का चयन करें बटन पर क्लिक करें, और उस फ़ोल्डर में नेविगेट करें जिसमें hECT कार्यात्मक डेटा शामिल है। ऊतक ड्रॉपडाउन मेनू से संसाधित होने वाले वांछित hECT का चयन करें।
    2. डेटा इनपुट बॉक्स (चित्रा 8AII) में, डायस्टोलिक दूरी क्षेत्र में चरण 6.1 से दर्ज किए गए पदों के बीच अनलोड दूरी इनपुट करें। पोस्ट रेडियस (मिमी) फ़ील्ड में 0.25 इनपुट करें।
    3. विश्लेषण बाधाओं बॉक्स (चित्रा 8AIII) में, विश्लेषण से छोड़ने के लिए आवृत्तियों का चयन करें, या (अल्पविराम द्वारा अलग) शामिल करने के लिए विशिष्ट आवृत्तियों का चयन करें. रिकॉर्डिंग की पूरी लंबाई को संसाधित करने के लिए डिफ़ॉल्ट रूप से प्रारंभ समय और समाप्ति समय क्रमशः 0 और -1 पर सेट किया जाता है। यदि आवश्यक हो तो रिकॉर्डिंग को ट्रिम करने के लिए इन मानों को बदलें।
    4. फ़िल्टरिंग प्रक्रिया के दौरान चौरसाई के स्तर को बदलने के लिए बहुपद क्रम और फ़्रेम आकार के फ़िल्टर पैरामीटर (चित्र 8AIV) को बदलें और स्क्रिप्ट द्वारा पहचाने जाने वाले न्यूनतम शिखर आकार को सेट करने के लिए पीक डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्लाइडर को बदलें।
      नोट: स्क्रिप्ट में स्पाइक रिमूवल विकल्प होता है, जो कलाकृतियों के कारण लंबी चोटियों को क्लिप करता है; हालाँकि, इसकी अनुशंसा नहीं की जाती है क्योंकि यह चिकोटी के आकार को बदल देता है। इसके बजाय रिकॉर्डिंग trimming के माध्यम से कलाकृतियों निकालें (चित्रा 8AIII).
    5. अतिरिक्त डेटा विश्लेषण आउटपुट के लिए अतिरिक्त विकल्प (चित्रा 8 एवी) का उपयोग करें: एक अतिरिक्त पीक डिटेक्शन एल्गोरिथ्म चलाने के लिए पोस्ट विक्षेपण विश्लेषण , ज़ूम प्लॉट्स पर ऑटोस्केल वाई-अक्ष स्वचालित रूप से चिकोटी बल वक्र (चित्रा 8बी) पर अक्षों को समायोजित करने के लिए, प्रत्येक चिकोटी बल आकृति को बचाने के लिए बल-ट्रेस घटता सहेजें एक .fig फ़ाइल में, और बल-समय डेटा सहेजें चिकोटी बल वक्र आकृति में प्लॉट किए गए फ़िल्टर किए गए डेटा के एक्स- और वाई-निर्देशांक को बचाने के लिए।
    6. एक .txt फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए रन विश्लेषण पर क्लिक करें जिसमें पूरी रिकॉर्डिंग में ट्विच फोर्स कर्व (पूरक फ़ाइल 8) की विशेषताएं शामिल हैं।

Figure 8
चित्रा 8: चिकोटी बल वक्र गणना। (ए) डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में "AnalyzeLogsGUI.m" फ़ाइल चलाना GUI विंडो खोलता है। (I) लॉग चयन बॉक्स उपयोगकर्ता को hECT कार्यात्मक डेटा वाले फ़ोल्डर के लिए निर्देशिका का चयन करने की अनुमति देता है। दिन Num फ़ील्ड स्वचालित रूप से प्रोटोकॉल चरण 7.1 में बनाई गई सारांश फ़ाइल के शीर्षक से पॉपुलेटेड है। संसाधित किए जाने वाले hECT को ऊतक ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके चुना जाता है। (II) डेटा इनपुट बॉक्स में पीडीएमएस पदों की जोड़ी के बारे में जानकारी होती है जो एचसीईटी का समर्थन करती है, जैसे कि अनलोड दूरी (प्रोटोकॉल चरण 6.1 में प्राप्त) और पोस्ट त्रिज्या (0.25 मिमी)। (III) विश्लेषण बाधाएं बॉक्स उपयोगकर्ता को रिकॉर्डिंग को छोड़ने या शामिल करने और ट्रिम करने के लिए आवृत्तियों को चुनने की अनुमति देता है। (IV) फ़िल्टर पैरामीटर बॉक्स में यह चुनने के विकल्प होते हैं कि कच्चे चिकोटी बल वक्र को कैसे फ़िल्टर किया जाता है। बहुपद क्रम और फ़्रेम आकार फ़िल्टरिंग प्रक्रिया के दौरान चौरसाई के स्तर को बदलते हैं। पीक डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्लाइडर न्यूनतम शिखर आकार तय करता है जिसे स्क्रिप्ट द्वारा पहचाना जाएगा। स्पाइक रिमूवल विकल्प कलाकृतियों के कारण होने वाली लंबी चोटियों को क्लिप करता है। (वी) अतिरिक्त विकल्पों में पोस्ट विक्षेपण विश्लेषण शामिल है, जो एक अतिरिक्त पीक डिटेक्शन एल्गोरिथ्म चलाता है, ज़ूम प्लॉट्स पर ऑटोस्केल वाई-अक्ष, जो ट्विच बल वक्र पर कार्य करता है, बल-ट्रेस घटता बचाता है, जो चिकोटी बल के आंकड़े बचाता है, और बल-समय डेटा सहेजें, जो प्लॉट किए गए चिकोटी बल डेटा को बचाता है। (बी) पैनल ए से जीयूआई स्क्रीनशॉट द्वारा उत्पादित 1 हर्ट्ज पर गति वाले एक एचईसीटी की 30 एस रिकॉर्डिंग के चिकोटी बल वक्र का उदाहरण। लाल चिकोटी बल वक्र एआईवी में मापदंडों द्वारा उत्पादित फ़िल्टर किए गए बल को दिखाता है, कच्चे चिकोटी बल वक्र पर आरोपित होता है (गहरा नीला वक्र, तब प्रकट होता है जब एवी में अनफ़िल्टर्ड डेटा विकल्प का चयन किया जाता है)। संक्षिप्ताक्षर: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक; GUI = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स हमारे समूह 9,15 द्वारा पहले इस्तेमाल की जाने वाली एक स्वस्थ आईपीएससी लाइन से उत्पन्न हुए थे और संस्कृति में 8-61 दिनों के बाद एचसीटी में गढ़े गए थे। चित्रा 9 ए नीचे से देखे गए एचसीटी की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है, जो (ऊपर) और (नीचे) एसपीओटी के साथ बनाए गए थे। कार्यात्मक माप कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) और शारीरिक तापमान (36 डिग्री सेल्सियस) पर 37 दिनों और एचईसीटी निर्माण के बाद 52 दिनों के बीच लिया गया था। पीडीएमएस रैक के निर्माण में, हमने दस्तावेज किया है कि एक अनुभवी उपयोगकर्ता पीडीएमएस रैक में 80% उपज की उम्मीद कर सकता है, जिसमें सभी छह पोस्ट बरकरार हैं और कम से कम पांच पदों (हमारी प्रयोगशाला में तीन उपयोगकर्ताओं के आधार पर) की कुल 95% उपज है, पोस्ट ऊंचाई में <3% परिवर्तनशीलता के साथ।

एसपीओटी ने मार्कर स्याही के खंडित आकार की तुलना में डेटा अधिग्रहण (चित्रा 9 बी और पूरक वीडियो एस 1) के दौरान ट्रैक करने के लिए एक एकल परिभाषित आकार प्रदान किया, जो पीडीएमएस पदों (पूरक वीडियो एस 2)27की युक्तियों के लिए अच्छी तरह से बंधन नहीं करता है। कुछ चरम उदाहरणों में, ट्रैकिंग ऑब्जेक्ट भी अस्पष्ट हो सकता है (चित्रा 9 सी, शीर्ष पंक्ति)। ये अनियमितताएं बहुत अधिक शोर पेश करती हैं जो चिकोटी बल वक्र को अस्पष्ट करती हैं, इस प्रकार 10 μN के तहत विकसित बलों के सटीक माप को रोकती हैं। इसके लिए सही करने और इन आकृतियों की लगातार ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए, प्रकाश कोण और स्थिति के कई समायोजन आमतौर पर कंट्रास्ट और स्पष्टता को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक होते हैं। एसपीओटी आकृतियों का अंधेरा और नियमितता इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करती है, इस प्रकार अधिग्रहण के समय को लगभग 50% (~ 12-30 मिनट से 5-10 मिनट प्रति हेक्टेयर 1 हर्ट्ज की विशिष्ट कैप्चर रेंज के लिए 1 हर्ट्ज से 4 हर्ट्ज) तक कम कर देती है। इसके अतिरिक्त, इस काम में, एसपीओटी ने ऑप्टिकल ट्रैकिंग के लिए एक अधिक विश्वसनीय आकार प्रदान किया, और शोर में कमी ने 1 माइक्रोन के रूप में कम विकसित बल के साथ कमजोर ऊतकों के माप को सक्षम किया, जो 5 माइक्रोन (चित्रा 9 डी) से कम के पोस्ट विक्षेपण का प्रतिनिधित्व करता है, साथ ही एक ही एचईसीटी27 के माप के बीच परिवर्तनशीलता को कम करता है।

हमारे अनुभव में, अनुदैर्ध्य प्रयोगों में नमूना हानि आमतौर पर उल्टे पीडीएमएस पदों के सिरों से एचईसीटीएस के फिसलने के कारण होती है। यह एचईसीटी का फिसलना आमतौर पर बेसप्लेट से एचईसीटी को हटाने पर होता है (चित्र 4बीवी, 1-4 दिन बाद एचईसीटी निर्माण) या बाद में प्रयोग में (1-3 सप्ताह बाद एचईसीटी निर्माण) एचसीटी कॉम्पैक्ट और परिपक्व के रूप में। एचईसीटी की यह परिपक्वता कभी-कभी लचीली पदों पर पर्याप्त निष्क्रिय और सक्रिय तनाव डालती है ताकि एचसीटी खुद को एक पोस्ट के अंत से खींच सकें, जिसके परिणामस्वरूप विपरीत पोस्ट (चित्रा 9ई) के आसपास ऊतक का एक बेकार झुरमुट जमा हो जाता है। एसपीओटी एक कैप ज्यामिति प्रदान करते हैं जो एचईसीटी हानि (चित्रा 9 एफ) को रोकता है, जैसा कि चित्र 9 जी में मात्रा निर्धारित है। 2 वर्षों के दौरान बनाए गए 103 बायोरिएक्टरों के लिए (प्रत्येक शुरुआत में तीन से छह एचईसीटी के साथ), एसपीओटी के बिना पीडीएमएस रैक ने 66 बायोरिएक्टरों में औसतन 95% एचसीटी बनाए रखा। हालांकि, जबकि अधिकांश बायोरिएक्टरों में कोई ऊतक हानि नहीं थी, कुछ बायोरिएक्टर 30% -100% एचसीटी खो देते हैं (अक्सर जब एक एकल बायोरिएक्टर एक संपूर्ण प्रयोगात्मक समूह का प्रतिनिधित्व करता है), जिसके परिणामस्वरूप पर्याप्त अक्षमता होती है। इस काम में, एसपीओटी ने एचईसीटी हानि को प्रभावी ढंग से समाप्त कर दिया, इस प्रकार 37 बायोरिएक्टर (पी = 0.038)27में 100% तक अवधारण दर में काफी सुधार हुआ।

Figure 9
चित्रा 9: पोस्ट विक्षेपण डेटा गुणवत्ता में सुधार और पीडीएमएस पदों में एसपीओटी को जोड़ने के साथ एचईसीटी प्रतिधारण में वृद्धि। (ए) (शीर्ष) या (नीचे) एसपीओटी के बिना एचईसीटी का निचला दृश्य। (बी, सी) बायोरिएक्टर के नीचे से देखी गई पोस्ट पर एक एचईसीटी के एक छोर की क्लोज-अप छवियां, सही कॉलम थ्रेशोल्ड सेटिंग्स के साथ डेटा अधिग्रहण के दौरान समान हैं। लाल बक्से पोस्ट ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर द्वारा ट्रैक करने योग्य वस्तुओं को इंगित करते हैं। (बी) मार्कर स्याही बनाम एसपीओटी के साथ एक पोस्ट पर ट्रैक करने योग्य फिड्यूशियल मार्करों की तुलना। (सी) मार्कर स्याही (शीर्ष दो पंक्तियों) या एसपीओटी (नीचे दो पंक्तियों) के साथ पदों पर आराम से और अनुबंधित एचईसीटी। (डी) 1 माइक्रोन के विकसित बल के साथ 1 हर्ट्ज पर विद्युत रूप से धड़कन वाले एक एचईसीटी के उदाहरण चिकोटी बल अनुरेखण, 5 माइक्रोन से कम (चैती: अनफ़िल्टर्ड ट्रेस; मैजेंटा: फ़िल्टर्ड ट्रेस) के विक्षेपण के अनुरूप। (ई) एसपीओटी के बिना एक बायोरिएक्टर का तिरछा दृश्य जहां एचईसीटी अपने पदों में से एक से फिसल गया, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक का एक झुरमुट हुआ जो विपरीत पोस्ट (फ़िरोज़ा एरोहेड्स) के आसपास बनता है। (एफ) एसपीओटी के साथ एक बायोरिएक्टर की तस्वीर 100% एचईसीटी प्रतिधारण दिखा रही है। (जी) डॉट प्लॉट एसपीओटी (एन = 322 एचसीटी, 66 बायोरिएक्टर) के बिना पीडीएमएस रैक (प्रत्येक तीन से छह एचसीटी के साथ) और एसपीओटी (एन = 134 एचसीटी, 37 बायोरिएक्टर) के साथ पीडीएमएस रैक के लिए प्रति बायोरिएक्टर ऊतक प्रतिधारण दिखा रहा है, जिसमें बेसप्लेट हटाने (दिन 1-4) और बाद में संस्कृति प्रक्रिया (दिन 4-15) के दौरान ऊतक विफलताओं के साथ बायोरिएक्टर से डेटा शामिल है। *पी = 0.038; हीरा माध्य को इंगित करता है। स्केल बार = 1 मिमी (ए, सी), 1 सेमी (ई)। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक; SPoT = स्थिर पोस्ट ट्रैकर; GUI = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उपरोक्त विधियों के एक उदाहरण अनुप्रयोग के रूप में, हम कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) के बजाय शारीरिक तापमान (36 डिग्री सेल्सियस) पर एचसीटी फ़ंक्शन को मापने के महत्व को भी प्रदर्शित करते हैं। एचईसीटी फ़ंक्शन गर्म चरण (चित्रा 10 ए)27के साथ वर्तमान पेसिंग सेटअप में विस्तारित संस्कृति समय पर स्थिर पाया गया था। शारीरिक तापमान पर माप की तुलना में, एचईसीटी ने कमरे के तापमान पर संकुचन गतिशीलता को बदल दिया, संकुचन और विश्राम की धीमी दर ( चित्रा 10 बी में चोटियों की ढलानों द्वारा इंगित) के साथ।

इस काम में, 10 में से 1 एचसीटी ने हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी का प्रदर्शन किया (जहां विकसित बल 36 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 23 डिग्री सेल्सियस पर अधिक था), लेकिन केवल कम आवृत्तियों पर। जब एचसीटी को 1.5 हर्ट्ज पर गति दी गई थी, तो इसमें 36 डिग्री सेल्सियस (कोई हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी) पर एक मजबूत विकसित बल था और चिकोटी (चिकोटी बल वक्र के फ्लैट इंटरपीक क्षेत्रों, दाएं पैनल) के बीच पूर्ण विश्राम लेकिन 23 डिग्री सेल्सियस पर संकुचन के बीच अपूर्ण छूट (चोटियों, बाएं पैनल के बीच निष्क्रिय बल में वृद्धि) (चित्रा 10 बीआई)। जब एचईसीटी 0.75 हर्ट्ज पर गति की गई थी, हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी मौजूद थी (चित्र 10बीआईआई), और एचईसीटी को 23 डिग्री सेल्सियस (बाएं पैनल) पर भी संकुचन के बीच पूरी तरह से आराम करने के लिए मनाया गया था। हालांकि, एचईसीटी फ़ंक्शन की निश्चित आवृत्ति-मिलान तुलना चुनौतीपूर्ण थी क्योंकि अधिकांश एचसीटी की कैप्चर रेंज ने तापमान(चित्रा 10सी)में न्यूनतम ओवरलैप दिखाया। यह काफी हद तक 23 डिग्री सेल्सियस (ज्यादातर ≤1.5 हर्ट्ज) पर कम अधिकतम कैप्चर आवृत्ति और 36 डिग्री सेल्सियस (ज्यादातर ≥ 1.5 हर्ट्ज) (चित्रा 10 डी) पर एचसीटी की उच्च न्यूनतम कैप्चर आवृत्ति के कारण था; इन सीमाओं को देशी मायोकार्डियम (28 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण) में नहीं देखा जाता है क्योंकि देशी वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम अनायास46 को हरा नहीं करता है। आवृत्ति ओवरलैप वाले एचसीटी में से केवल एक ने आवृत्ति-मिलान हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी(चित्रा 10डी)दिखाया। जैसा कि चित्र 10B में चिकोटी बल घटता द्वारा इंगित किया गया है, 36 डिग्री सेल्सियस पर गति वाले hECTs ने 23 डिग्री सेल्सियस (धराशायी लाइनों) की तुलना में + डीएफ/डीटी और -डीएफ/डीटी (चित्रा 10E, ठोस रेखाएं) के उच्च परिमाण दिखाए। हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी (लाल रेखा) प्रदर्शित करने वाले एचसीटी में, कम बल के बावजूद संकुचन और विश्राम 36 डिग्री सेल्सियस पर बहुत तेज था। जब 36 डिग्री सेल्सियस पर गति की जाती है, तो एचईसीटी में एक उच्च सहज बीट दर (चित्रा 10एफ) (एन = 10, पी = 0.000016 एक युग्मित टी-परीक्षण के लिए) और आवृत्तियों को कैप्चर करने की एक अधिक विस्तृत रेंज होती है (चित्र 10जी) (एन = 9, पी = 0.0000061 एक युग्मित टी-परीक्षण के लिए), इस प्रकार 4.5 हर्ट्ज से 6.75 हर्ट्ज(चित्रा 10सी)के सुपरफिजियोलॉजिकल आवृत्तियों48 पर 1:1 कैप्चर प्राप्त करना।

Figure 10
चित्रा 10: तापमान निर्भरता का प्रदर्शन करने वाले एचसीईटी सिकुड़ा हुआ गतिशीलता। (ए) समय के साथ फ़ंक्शन में स्थिरता दिखाने के लिए 30 मिनट (शीर्ष) के लिए 1 हर्ट्ज पर गति वाले एचईसीटी के चिकोटी बल अनुरेखण, इनसेट (नीचे) के साथ 5 मिनट के अंतराल पर शीर्ष का एक बढ़ाया दृश्य दिखा रहा है। (बी) क्रमशः (I) 1.5 हर्ट्ज और (II) 0.75 हर्ट्ज के बिना और हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी के साथ एक hECT के चिकोटी बल अनुरेखण। बाएं पैनल ट्रेसिंग 23 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त किए गए थे, और दाएं पैनल ट्रेसिंग 36 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त किए गए थे। (सी) एचईसीटी का बल-आवृत्ति संबंध (एन = 6 एचईसीटी दिन 37 पोस्ट फैब्रिकेशन पर दो बायोरिएक्टरों में, एन = 4 दिन 52 पोस्ट फैब्रिकेशन दो बायोरिएक्टरों में) 23 डिग्री सेल्सियस (धराशायी लाइनों) और 36 डिग्री सेल्सियस (ठोस लाइनों) पर। प्रत्येक रंग एक एचसीईटी का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) पैनल सी से तीन एचसीटी के बल-आवृत्ति संबंध जो दोनों तापमानों पर आवृत्ति ओवरलैप प्रदर्शित करते हैं, जिनमें से एक आवृत्ति-मिलान हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी (काला तीर) प्रदर्शित करता है। (E) + dF/dt और -dF/dt पैनल D में एक ही hECT के 23 °C (धराशायी रेखाओं) और 36 °C (ठोस रेखाओं) पर आवृत्तियों में प्लॉट किए गए। (एफ) दो तापमान स्थितियों (एन = 10, पी = 0.000016) पर एचसीटी की सहज बीट दर। (जी) 1: 1 उत्तेजना के साथ आवृत्तियों की सीमा: पीक कैप्चर (इस ग्राफ में आवृत्तियों की सीमा को अधिकतम कैप्चरिंग आवृत्ति के रूप में परिभाषित किया गया है - न्यूनतम कैप्चरिंग आवृत्ति) प्रत्येक तापमान पर (एन = 9, पी = 0.000006.1)। युग्मित छात्र के t-परीक्षण से p-मान। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं। यह आंकड़ा वैन नेस्टे27 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्त: hECT = मानव इंजीनियर हृदय ऊतक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: मशीनी बायोरिएक्टर भागों के लिए सीएडी फाइलें। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: 3D-मुद्रित SPoT कास्टिंग उपकरण के लिए CAD फ़ाइलें। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: गर्म चरण के लिए इन्सुलेट ऐक्रेलिक जैकेट के लिए सीएडी फाइलें। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 4: AutomatedPostTracking3.vi फ़ाइल hECT विक्षेपण (प्रोटोकॉल चरण 5.3) पर नज़र रखने के लिए। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 5: पोस्ट लंबाई और ऊतक ऊंचाइयों को मापने के लिए PostMeasurement_PB3.vi फ़ाइल (प्रोटोकॉल चरण 6.2)। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 6: "सारांश #.csv" (प्रोटोकॉल चरण 7.1) के लिए टेम्पलेट, जिसका उपयोग पोस्ट विक्षेपण डेटा को संसाधित करने के लिए किया जाता है। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 7: पोस्ट विक्षेपण डेटा (प्रोटोकॉल चरण 7) को संसाधित करने के लिए MatLab स्क्रिप्ट युक्त AnalyzeLogsGUI फ़ोल्डर। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 8: MatLab स्क्रिप्ट आउटपुट "_datatable.txt" फ़ाइल में चर का विवरण। लाइनें 10-24 रिकॉर्डिंग की अवधि में सभी चोटियों में औसत चिकोटी बल वक्र के पैरामीटराइजेशन हैं (लाइन 25 में दर्शाया गया है)। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S1: एसपीओटी के साथ पोस्ट पर अनायास एचईसीटी की पिटाई का वीडियो। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S2: एसपीओटी के बिना पदों पर अनायास एचईसीटी की पिटाई का वीडियो। यह फ़ाइल वैन नेस्ट27 से अनुकूलित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

साहित्य में प्रकाशित कई रैखिक इंजीनियर कार्डियक ऊतक मॉडल हैं, जिनमें से कुछ तालिका 1में वर्णित हैं। कुछ मॉडल ऊतक बल के प्रत्यक्ष माप शामिल, लेकिन इन आम तौर पर एक अलग मांसपेशी स्नान38 के लिए निर्माण हस्तांतरण की आवश्यकता होती है. अधिकांश मॉडल दोनों सिरों पर स्थायी रूप से लंगर डाले हुए ऊतकों के साथ डिज़ाइन किए गए हैं, आमतौर पर पीडीएमएस पोस्ट 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17,18,19,20,21,
22,25,26 (या तार39), जो ऊतक हेरफेर की आवश्यकता को हटा देता है, और ऊतकों द्वारा उत्पन्न बल को अंत एंकर सुविधाओं के ऑप्टिकल ट्रैकिंग के माध्यम से सटीक रूप से गणना की जा सकती है। हमारे समूह 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 द्वारा विकसित पीडीएमएस पदों को मध्यम आकार के ऊतकों का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और ये पोस्ट थ्रूपुट, सटीक कार्यात्मक माप और देशी कार्डियक आला के प्रमुख पहलुओं को बनाए रखने के लिए संतुलित करते हैं। पोस्ट एक विभाजित कास्टिंग विधि 10,13,14,18,19,20,21,24 के लिए अनुमति देने के लिए बहुत छोटे थे, और एकीकृत कैप महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरण 1.3.2 के दौरान पदों को स्नैप करने का कारण बनेंगे। कैप के बिना, एचसीटी पदों से फिसल सकता है। ऐसे मामलों में जब ऊतक प्रतिधारण 100% नहीं था, उन बायोरिएक्टरों ने अक्सर एचसीटी का एक बड़ा हिस्सा खो दिया, जिससे सभी या कोई भी समस्या27 नहीं हुई। यह महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरण 3.3.2 के दौरान सबसे अधिक बार हुआ, जब एचईसीटी को उनके बेसप्लेट से अच्छी तरह से हटा दिया गया था। एचईसीटी को कभी-कभी शारीरिक रूप से पोस्ट के प्रत्येक छोर के साथ पोस्ट पर वापस हेरफेर किया जा सकता है, ध्यान से एचसीईटी में छेद के माध्यम से पिरोया जाता है; यह न केवल तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण था, बल्कि क्षति का एक महत्वपूर्ण स्रोत भी था जो बाद के सिकुड़ा समारोह को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता था।

पीडीएमएस पोस्ट डिज़ाइन में जोड़े गए एसपीओटी तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एचईसीटी संस्कृति की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, कम संघनन / निष्क्रिय तनाव (जैसे, कम गैर-मायोसाइट सामग्री या पतला कार्डियोमायोपैथी4 के मॉडल) के फेनोटाइप के साथ एचईसीटी, जो अन्यथा पदों से फिसल जाएंगे, एसपीओटी के साथ सुसंस्कृत और मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके विपरीत, टोपी ज्यामिति सुनिश्चित करता है कि उच्च निष्क्रिय तनाव (जैसे, उच्च गैर myocyte सामग्री या बिगड़ा डायस्टोलिक छूट49 के साथ रोग मॉडल) है कि चिकनी PDMS पदों को खींचने के लिए करते हैं के साथ hECTs27 जगह में आयोजित कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, एसपीओटी अपेक्षाकृत अद्वितीय हैं कि उन्हें पीडीएमएस पदों में एक दूसरे निर्माण चरण में जोड़ा जाता है, जिसे केवल एक अन्य मॉडल में काफी छोटे ऊतकों17 के साथ देखा गया है। जबकि एसपीओटी को इस अलग निर्माण चरण की आवश्यकता होती है, वे टोपी में विभिन्न सामग्रियों को शामिल करने के अवसर के साथ एक टोपी ज्यामिति के एक साथ जोड़ने की अनुमति देते हैं, जैसे कि एक अपारदर्शी काला रंग, मैग्नेट, या फ्लोरोसेंट मोती; ये कुछ अन्य समूहों द्वारा पता लगाया गया है, लेकिन यह भी अतिरिक्त निर्माण कदम23,25,26 की आवश्यकता है.

इस पत्र का एक और फोकस एचईसीटी फ़ंक्शन पर तापमान के प्रभावों का पता लगाना था। जबकि कार्डियक इंजीनियर ऊतकों का उपयोग विवो कार्डियक फ़ंक्शन (जैसे, रोग मॉडलिंग 4,8,50,51 और दवा प्रतिक्रियाओं 15,21,52) के कई पहलुओं को मॉडल करने के लिए किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, तापमान-निर्भर प्रभावों को व्यवस्थित रूप से इन मॉडलों में नहीं खोजा गया है। आवृत्ति-मिलान हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी दोनों का उच्चारण किया जाता है-कभी-कभी विकसित बल में पांच गुना वृद्धि के साथ-और सर्वव्यापी45, क्योंकि वे कई स्तनधारी प्रजातियों (चूहों 46,53,54, फेरेट्स 54, खरगोशों55, और बिल्लियों54) में देखे जाते हैं, साथ ही साथ विभिन्न उम्र के स्वस्थ और असफल मानव मायोकार्डियम44. हमने पाया कि एचसीटी सहज हरा दर और कब्जा आवृत्तियों की सीमा कम तापमान पर बहुत कम आवृत्तियों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया, लेकिन आवृत्ति मिलान हाइपोथर्मिक inotropy हमेशा27 मौजूद नहीं था. परिपक्वता13,18 और बायोकॉम्पलेक्सिटी56 में प्रगति के माध्यम से इंजीनियर हृदय के ऊतकों को बेहतर बनाने की खोज में, हाइपोथर्मिक इनोट्रॉपी देशी हृदय की मांसपेशियों का एक और कार्यात्मक फेनोटाइप प्रदान करता है जिसे कार्डियक बायोफिडेलिटी के बेंचमार्क के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

देशी मायोकार्डियम के तापमान-निर्भरता के प्रकाश में और देशी कार्डियक आला वातावरण को पुन: व्यवस्थित करने के प्रयास में, इंजीनियर ऊतक समारोह को अक्सर शारीरिक तापमान पर विशेषता होती है। हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं होता है क्योंकि बाँझपन बनाए रखते हुए ऊतक कार्यात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए कुछ सिस्टम हीटिंग के लिए अनुकूल नहीं होते हैं। इस प्रकार, विभिन्न तापमानों पर मापा ऊतकों (या ऊतक मॉडल) के बीच समारोह की तुलना उचित नहीं हो सकता है. दरअसल, इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग परख में के लिए परीक्षण की स्थिति के मानकीकरण दोनों पुनर्योजी चिकित्सा में आवश्यक समझा जाता है57 और इस तरह के खाद्य एवं औषधि प्रशासन के रूप में नियामक एजेंसियों द्वारा58,59. इस पत्र में वर्णित तरीके एचईसीटी फ़ंक्शन27 पर तापमान के प्रभावों पर आगे के अध्ययन को सक्षम करने के अलावा इस तरह के मानकीकरण को प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं।

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Disclosures

केडीसी नोवोहार्ट के सह-संस्थापक और मुख्य वैज्ञानिक अधिकारी हैं और होल्डिंग कंपनी, मेडेरा बायोफार्मास्युटिकल में इक्विटी स्वामित्व रखते हैं। नोवोहार्ट ने इस अध्ययन के वित्त पोषण, योजना या निष्पादन में योगदान नहीं दिया; हालांकि, अध्ययन के परिणाम संभावित रूप से नोवोहार्ट और मेडेरा पर वित्तीय प्रभाव डाल सकते हैं। अन्य लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस पद्धति पर पिछले काम के लिए डॉ टिमोथी कैशमैन को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) (R01-HL132226 और K01 HL133424) और लेडुक फाउंडेशन इंटरनेशनल नेटवर्क ऑफ एक्सीलेंस प्रोग्राम (CURE-PLaN) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire McMaster Carr 6517K61 
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.7 mL Microtubes Axygen MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall) Corning 353003
10 mL Serological Pipette Drummond 6-000-010
10 N NaOH Fisher Scientific SS225-1 dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium Sigma Aldrich M0275
20 - 200 μL Micropipette Eppendorf 3123000055
200 μL MicroPipette Tips VWR 76322-150
5 mL Serological Pipette Drummond 6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 352070
6 cm Petri Dish Corning 353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator AmScope  LED-6W 
6-Well Plates Corning 353046
90 degree angle mirror Edmund Optics 45-594
Acrylic bonding glue SCIGRIP #4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack Fisher Scientific 14-673-50
Aluminum 6061 McMaster Carr 9008K82
A-Plan 10X Objective Lens ZEISS 1020-863
Autoclave Bags Propper 21002
B-27 supplement ThermoFisher 17504044
B-27 supplement (without insulin) ThermoFisher A1895601
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810 R
Black ABS Ultimaker 2.85 mm wide
Bovine Collagen I Gibco A1064401
CHIR99021 Tocris 4423
Class II Biosafety Cabinet Labconco 3430009
Clear Acrylic Sheeting estreetplastics 1002502436 6.25 mm thick
CNC Vertical Mill Haas VF-1
Conductive Graphite Bars McMaster Carr 1763T33
Dissection microscope Olympus SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix ThermoFisher 11330032
Ethanol Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter NanoEntek E1000
EVE Cell Counting Slide NanoEntek EVS-050
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10438026
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Electron Corporation 3110 AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software Autodesk AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer Reichert 1475 0.1 mm deep
HEPES Sigma Aldrich H3784
hESC qualified matrigel Corning 354277 AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera PixelLINK P7410
Inverted Microscope Carl Zeiss Werk Axiovert 40 CFL 10X phase contrast objective
IWR-1 Selleck Chem S7086
LabView Software National Instruments 2016
Laminar flow clean bench NuAire NU-201-330 necessary for hECT functional analysis
Laptop AsusTek Strix Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine Epilog Helix 24
Magnification headset ExcelBlades 70020 Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab Mathworks Version 2019b or later AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade WPI Instruments 501839
Microscope Boom Stand Olympus SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution ThermoFisher 15140122 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations Sigma Aldrich P3813 Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller Drummond 4-000-100
PixelLINK Capture OEM PixelLINK 10.2.1.6 AKA "Camera Software"
Polysulfone McMaster Carr 86735K73 translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE) McMaster Carr 8545K176  Black, molded
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media ThermoFisher 11875135
Silicone Sheeting SMI manufacturing glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads Michael's color should withstand autoclaving
Spatula Fisher Scientific 14-373 used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator  Astro-Med / Grass Technologies S88X
Stainless Steel Razoblades GEM 62-0179-CTN preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex ThermoFisher A3349401 AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water ThermoFisher 5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit Dow DOWSIL 170 2LB KIT AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit Dow DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage Okolab H401-HG-SMU Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer Ultimaker Ultimaker 3
Thiazovivin Selleck Chem S1459
Trypan Blue NanoEntek EBT-001
Vacuum Chamber Bel-Art Parts F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw Micro-Mark 82203
Variable Speed Miniature Drill Press Micro-Mark 82959
Vibration Isolation Table Labconco 3618000
Weighing Boats VWR 10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp VWR 97035-528 AKA screw clamp

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References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
  3. Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447 (2016).
  4. Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
  5. Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
  6. Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
  7. Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
  8. Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
  9. Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373 (2019).
  10. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
  14. Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
  15. Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
  16. Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
  17. Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214 (2022).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  19. Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  20. Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
  21. Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
  22. Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919 (2020).
  23. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  24. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  25. Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
  26. Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
  27. van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
  28. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  29. Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
  30. Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931 (2019).
  31. Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
  32. Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
  33. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  34. Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14 (2020).
  35. Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
  36. Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
  37. Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
  38. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
  39. Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
  40. Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
  41. Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
  42. Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
  43. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  44. Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
  45. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
  46. Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
  47. Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
  48. Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
  49. Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
  50. Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
  51. Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
  52. de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
  53. Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
  54. Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
  55. Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
  56. Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
  57. Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
  58. Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
  59. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 01/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

इंजीनियर कार्डियक ऊतकों के डेटा अधिग्रहण और मॉडल थ्रूपुट में सुधार के लिए एक बायोरिएक्टर डिजाइन करना
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van Neste, C. C., Wiley, K. A.,… More

van Neste, C. C., Wiley, K. A., Chang, S. W., Borrello, J., Turnbull, I. C., Costa, K. D. Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues. J. Vis. Exp. (196), e64368, doi:10.3791/64368 (2023).

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