Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Designe en bioreaktor for å forbedre datainnsamling og modellere gjennomstrømning av konstruert hjertevev

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64368
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

Tredimensjonalt hjertevev bioengineered ved hjelp av stamcelleavledede kardiomyocytter har dukket opp som lovende modeller for å studere sunt og sykt humant myokard in vitro , samtidig som de rekapitulerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for fremstilling og analyse av høyt innhold konstruert hjertevev generert fra humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter.

Abstract

Hjertesvikt er fortsatt den ledende dødsårsaken over hele verden, noe som skaper et presserende behov for bedre prekliniske modeller av det menneskelige hjerte. Vevsteknikk er avgjørende for grunnvitenskapelig hjerteforskning; in vitro human cellekultur eliminerer forskjellene mellom artene i dyremodeller, mens et mer vevslignende 3D-miljø (f.eks. med ekstracellulær matrise og heterocellulær kobling) simulerer in vivo-forhold i større grad enn tradisjonell todimensjonal kultur på petriskåler av plast. Imidlertid krever hvert modellsystem spesialisert utstyr, for eksempel spesialdesignede bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter. I tillegg er disse protokollene ofte kompliserte, arbeidskrevende og plaget av svikt i de små, delikate vevene.

Denne artikkelen beskriver en prosess for å generere et robust humant konstruert hjertevev (hECT) modellsystem ved bruk av induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter for langsgående måling av vevsfunksjon. Seks hekter med lineær stripegeometri dyrkes parallelt, med hver hECT suspendert fra et par kraftfølende polydimetylsiloksan (PDMS) innlegg festet til PDMS-stativer. Hvert innlegg er avkortet med en svart PDMS stabil postsporing (SPoT), en ny funksjon som forbedrer brukervennligheten, gjennomstrømningen, vevsretensjonen og datakvaliteten. Formen muliggjør pålitelig optisk sporing av postavbøyninger, noe som gir forbedrede rykningskraftsporinger med absolutt aktiv og passiv spenning. Hettegeometrien eliminerer vevssvikt på grunn av at hekter glir av stolpene, og da de involverer et andre trinn etter PDMS-rackfabrikasjon, kan SPoTs legges til eksisterende PDMS-postbaserte design uten store endringer i bioreaktorfabrikasjonsprosessen.

Systemet brukes til å demonstrere viktigheten av å måle hECT-funksjonen ved fysiologiske temperaturer og viser stabil vevsfunksjon under datainnsamling. Oppsummert beskriver vi et toppmoderne modellsystem som reproduserer viktige fysiologiske forhold for å fremme biofidelitet, effektivitet og strenghet av konstruerte hjertevev for in vitro-applikasjoner .

Introduction

Konstruerte hjertevevsmodeller kommer i et mangfoldig utvalg av geometrier og konfigurasjoner for å rekapitulere ulike aspekter av den opprinnelige hjertenisjen som er vanskelig å oppnå med tradisjonell todimensjonal cellekultur. En av de vanligste konfigurasjonene er den lineære vevsstrimmelen, med fleksible ankre i hver ende for å indusere vevets selvmontering og gi vevet en definert forspenning og en avlesning av de resulterende rykningskreftene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. Kraften som genereres kan bestemmes robust gjennom optisk sporing av vevsforkortelsen og ved hjelp av elastisk stråleteori for å beregne kraften fra de målte avbøyningene og fjærkonstanten til ankrene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.

Imidlertid er hjertevevsteknikk fortsatt et utviklende felt, og noen utfordringer gjenstår. Spesialutstyr, for eksempel skreddersydde bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter, kreves for hvert modellsystem 10,29,30,31. Størrelsen og kompleksiteten til mikromiljøet til disse konstruksjonene er ofte begrenset av lav gjennomstrømning på grunn av arbeidsintensive protokoller, høyt antall celler og vevssårbarhet. For å løse dette har noen grupper vendt seg til fabrikasjon av mikrovev som bare inneholder hundrevis eller tusenvis av celler for å lette analyser med høy gjennomstrømning som er nyttige for narkotikaforskning. Denne reduserte skalaen kompliserer imidlertid den nøyaktige vurderingen av funksjon12, eliminerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen (som næringsstoffer / oksygendiffusjonsgradienter og kompleks arkitektur36), og begrenser mengden materiale som er tilgjengelig for påfølgende molekylær og strukturell analyse (som ofte krever sammenslåing av vevene). Tabell 1 oppsummerer noen av konfigurasjonene av lineære vevsstrimmelmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe Celler per vev Vev per plate Plate format Forankringsfunksjon Metode for funksjonell datainnsamling Delt mediebad? Funksjonelt mål-
ment in situ?
Yoshida (ECT) 38 4 millioner 6 modifisert 6-brønns plate* Kraft-svinger Direkte kraftmåling Nei Nei
Chan (hESC-CM-ECTs)26 310 k 6 Tilpasset 6-brønns tallerken PDMS innlegg Direkte kraftmåling Ja Nei
Feinberg (dyn-EHT)16 1,5 millioner 6 Tilpasset 6-brønns tallerken PDMS ledning vev form Nei Ja
RADISIC (BioWire)39, 40 110 k 8 polymer wire Tråd form Ja Ja
Costa (enkelt hekt)1, 2 1-2 millioner 4** 10 cm petriskål** PDMS innlegg optisk avbøyning (kant-/objektsporing) Ja Ja
Costa (flere hekt) 3–9 500 K-1 millioner 6 6 cm petriskål PDMS innlegg optisk avbøyning (kant-/objektsporing) Ja Ja
Costa (multi-hECT m / SPoT) 1 millioner 6 6 cm petriskål PDMS-innlegg med svarte caps optisk avbøyning (objektsporing) Ja Ja
Passier (EHT)17 245 k 36 12-brønns plate PDMS-innlegg med svarte caps optisk avbøyning (objektsporing) Ja Ja
Vunjak-Novakovic13, 18 1 millioner 12 6 cm petriskål PDMS-innlegg med caps optisk avbøyning (kantdeteksjon) Ja Ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 550 k 6 Tilpasset 6-brønns tallerken PDMS-innlegg med caps optisk avbøyning (objektsporing); kalsium avbildning Nei Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 1 millioner 12 12-brønns plate PDMS-innlegg med caps optisk avbøyning (kantdeteksjon av post avbøyning); kalsium avbildning Nei Ja
Zandstra (CaMiRi)22 25-150 k 96 96-brønns plate PDMS-innlegg med kroker optisk avbøyning (kantdeteksjon) Nei Ja
Murry23, 24 900 k 24 24-brønns plate PDMS-stolper med caps, integrert magnet magnetisk sensor Nei Ja
Riket (μTUG)11, 12, 25 Udefinert 156 156-brønns tallerken PDMS-stolper med caps, integrert magnet optisk sporing (fluorescerende perle) Ja Ja

Tabell 1: Karakteristika for noen lineærkonstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen. Lineærkonstruerte hjertevevsmodeller varierer i størrelse, gjennomstrømning, forankringsfunksjonsdesign og tilrettelegging av delte mellomstore bad, samt kravene til et eget muskelbadsystem for funksjonell karakterisering. * Forskerne brukte et kommersielt tilgjengelig konstruert vevssystem basert på dimensjonene til en standard 6-brønnsplate. ** Et modulært system der enkeltvevsbioreaktorer er forankret til en hvilken som helst plastkulturskål i ønsket antall og plassering.

Dette papiret beskriver den nyeste protokollen for å fremstille vår etablerte modell av lineært humant konstruert hjertevev (hECT) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 og metoder for vurdering av hECT-kontraktil funksjon. Hver bioreaktor med flere vev har plass til opptil seks hektar i et delt mediumbad og består av to "rack" -stykker laget av silikonelastomerpolydimetylsiloksan (PDMS) montert på en stiv polysulfonramme. Hvert PDMS-stativ inneholder seks fleksible integrerte kraftsensorstolper som er 0,5 mm i diameter og 3,25 mm lange, og sammen gir to stativer seks par stolper, som hver har en hECT. Inversjon av bioreaktoren bidrar til å overvinne enhver hindring for visualisering av hektene nedenfra på grunn av vannkondens fra kulturmediet eller forvrengninger fra menisken i luft-væske-grensesnittet. Hver sammentrekning av en hECT forårsaker avbøyning av de integrerte endestolpene, og den optiske målingen av avbøyningssignalet behandles til en kraft-mot-tidssporing som representerer den kontraktile funksjonen til hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Sammenlignet med enkeltvevsbioreaktorene som vanligvis brukes til vev av denne størrelsen, forbedrer multivevsdesignet den eksperimentelle gjennomstrømningen og muliggjør studier av parakrin signalering mellom tilstøtende vev med potensielt forskjellig cellulær sammensetning. Dette systemet har blitt validert i publiserte studier som beskriver anvendelser i sykdomsmodellering 4,8, parakrin signalering 6,7, heterocellulær kultur 5,9 og terapeutisk screening 7,9.

I dette systemet er hECT-ene designet for å være omtrent 6 mm lange og 0,5 mm i diameter for å muliggjøre robust optisk sporing av kraftmålinger med lite støy. Videre er aspekter av vevskompleksitet som diffusjonsgradienter og cellulær organisasjon balansert med et håndterbart krav på 1 million celler per vev. Med standard CCD-kamerateknologi genererer krefter så svake som 1 μN (som representerer mindre enn 5 μm etter nedbøyning) et klart signal, noe som sikrer at selv ekstremt svak kontraktil funksjon, som observert med noen hECT-sykdomsmodeller, kan måles nøyaktig. Dette forenkler også den detaljerte analysen av rykningskraftkurven, og muliggjør dermed analyse av høyt innhold av opptil 16 kontraktilitetsmålinger41, inkludert utviklet kraft, sammentrekningshastigheter (+dF/dt) og avslapning (-dF/dt) og variasjon i slaghastighet.

Denne protokollen begynner med instruksjoner for fremstilling av bioreaktorkomponentene. Spesiell oppmerksomhet rettes mot trinnene for å maksimere hECT-utbyttet, redusere teknisk variasjon i vevsfunksjonen og optimalisere kvaliteten og dybden av vevsvurderingen. De fleste hjertevevstekniske studier rapporterer ikke frekvenser av vevstap under fabrikasjon og langsiktig testing, selv om det er en kjent utfordring i feltet og reduserer gjennomstrømningen og effektiviteten til studiene27. De vevstekniske metodene beskrevet her har blitt raffinert gjennom årene for å sikre oppbevaring av alle hECTs i de fleste bioreaktorer (uavhengig av hvordan PDMS-stativene er produsert). Selv 5% -20% tap av vev kan imidlertid påvirke den statistiske styrken betydelig, spesielt i mindre eksperimenter begrenset av antall tilgjengelige kardiomyocytter (f.eks. på grunn av differensieringsutfordringer med noen syke cellelinjer4 eller på grunn av høye kostnader for kommersielt kjøpte kardiomyocytter), eller ved behandlingstilstanden (f.eks. begrenset tilgjengelighet eller høye kostnader for forskjellige behandlingsforbindelser).

Denne protokollen beskriver fabrikasjon av stabile postsporere (SPoTs), en ny funksjon i PDMS-rackene, som fungerer som caps i enden av kraftfølerstolpene som holder hECTs27. Det er demonstrert hvordan hettegeometrien signifikant reduserer hECT-tapet fra å falle eller trekke av stolpene, og dermed åpne nye muligheter for dyrking av hECTs med større variasjon av stivheter og spenninger, som er utfordrende for kultur på uavkortede innlegg. I tillegg gir SPoTs et objekt med høy kontrast for å forbedre den optiske sporingen av hECT-sammentrekningen gjennom en konsekvent og veldefinert form27. Dette etterfølges av en beskrivelse av dyrking av humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) og kardiomyocyttdifferensiering basert på tidligere publiserte protokoller 3,42,43 og en forklaring av hECT-fabrikasjon, kultur og funksjonelle målinger.

Denne artikkelen tar også for seg behovet for å måle vevsfunksjonen ved fysiologisk temperatur. Humant myokard (føtalt så vel som voksent sunt og sykt vev), samt hjertevev fra et bredt spekter av dyrearter (inkludert rotter, katter, mus, ildere og kaniner)44,45, viser en markert økning i frekvensmatchet rykningskraft ved temperaturer på 28 ° C-32 ° C sammenlignet med fysiologisk temperatur - et fenomen kjent som hypoterm inotropi45, 46. Imidlertid forblir effekten av temperatur på konstruert myokardvevsfunksjon understudert. Mange nyere konstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen er designet for å bli funksjonelt vurdert ved 37 °C for å tilnærme fysiologiske forhold 13,14,37. Men så vidt vi vet, har de temperaturavhengige effektene på kraften generert av konstruerte hjertevev ikke blitt systematisk undersøkt. Denne protokollen beskriver en pacingelektrodedesign som minimerer varmetap under testing, samt tillater inkorporering av et isolert varmeelement i oppsettet for funksjonelle målinger, som kan opprettholde hektene ved fysiologisk temperatur uten at det går ut over steriliteten27. Vi rapporterer deretter noen av de observerte effektene av temperatur på hECT-funksjonen, inkludert på den utviklede kraften, spontan slagfrekvens, +dF / dt og -dF / dt. Til sammen gir dette papiret detaljene som kreves for å produsere dette multi-tissue force-sensing bioreaktorsystemet for å fremstille humant konstruert hjertevev og å vurdere deres kontraktile funksjon, og et sett med data presenteres som gir et sammenligningsgrunnlag for målinger ved romtemperatur og ved 37 ° C27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen brukte en avidentifisert iPSC-linje, SkiPS 31.3 (opprinnelig omprogrammert ved hjelp av dermale fibroblaster fra en sunn 45 år gammel mann)47, og var dermed unntatt fra spesifikk godkjenning fra Institutional Review Board, i samsvar med institusjonens retningslinjer for human forskningsetikk. Utfør all celle- og hECT-manipulering under aseptiske forhold i et HEPA-filtrert biologisk sikkerhetskabinett i klasse II eller laminær strømningsarbeidsbenk. Steriliser alle ikke-sterile løsninger ved filtrering gjennom et 0,22 μm filter, og vedlikehold alle celler og hekter i en inkubator ved 37 ° C, 95% relativ fuktighet og 5% CO2.

1. Fabrikasjon av bioreaktorer

  1. Bioreaktorkomponenter og aluminium master støpt fabrikasjon
    MERK: Dataassistert konstruksjon (CAD)-filer finnes i tilleggsfil 1. Protokollen kan settes på pause hvor som helst mellom disse trinnene. Det anbefales å engasjere en profesjonell maskinist til å produsere hovedformene beskrevet i denne delen, da høye toleranser (≤5 μm) og en jevn finish kreves for nøyaktig postgeometri og for riktig trykkmontering av polysulfonrammene til polytetrafluoretylen (PTFE) baseplater (sikte på en tettsittende friksjonspassform, men ikke for stram).
    1. Ved hjelp av en datamaskin numerisk kontroll (CNC) fres, maskin grunnplaten ut av PTFE i henhold til skjemaene i figur 1A. Hectene vil bli dannet i de seks jevnt fordelte brønnene (hvite piler).
    2. Ved hjelp av en CNC-fres, maskin polydimetylsiloksan (PDMS) rack negativ master støpt ut av aluminium i henhold til skjemaene i figur 1B, med tre rammestøtter (grønne stjerner). Bor seks jevnt fordelte hull (magenta pilspisser) på 0,5 mm i diameter for å lage PDMS-stolpene.
    3. Bruk en CNC-fres, maskin bioreaktorrammen ut av polysulfon i henhold til skjemaene i figur 1C. Rammestøttene (grønne stjerner) tilsvarer rammestøttene som ses i stativstøpningen (figur 1B, grønne stjerner).
    4. Ved hjelp av en CNC-fres, maskin aluminiumstøpeholderen ut av aluminium i henhold til skjemaene i figur 1D. Hvert spor inneholder en trekantet hylle (oransje trekant) som er 0,25 mm høy for å gi et dødt rom for PDMS å strømme gjennom hullene i PDMS-stativavstøpningene (figur 1B, magenta pilspisser).
  2. Støping av PDMS-stativet fra aluminiumsnegative mestere
    1. Bruk en termoplastisk 3D-skriver for deponeringsmodellering til å skrive ut to PDMS-rackstøpeapparatbraketter (tilleggsfil 1). Bruk følgende utskriftsinnstillinger: en laghøyde på 0,1 mm, en vegg-/bunn-/topptykkelse på 1 mm, en innfyllstetthet på 90 % med trekanter, en utskriftstemperatur på 230 °C, en byggeplatetemperatur på 70 °C og en brem for vedheft.
    2. Plasser fire aluminiumsnegative masteravstøpninger i støpeholderen (figur 2AI) slik at stolpehullene stemmer overens med dødrommet på motsatt side av trekanthyllene (se figur 1D). Pakk apparatet inn i et rektangulært stykke 0,5 mm tykt silikonbelegg (figur 2B, hvite piler) som en pakning for å forhindre lekkasje av flytende PDMS og klem den mellom to parallelle 3D-printede braketter ved hjelp av en skrueklemme.
    3. Tilsett 0,5 ml PDMS-herdemiddel til 5 ml PDMS-elastomerbase (1:10-forhold, i henhold til produsentens instruksjoner) i en grunne beholder, og bland kraftig i 5 minutter. Degas PDMS-blandingen i et vakuumkammer, og påfør et sterkt vakuum (0,1-1 kPa) i 20-60 minutter ved romtemperatur eller til bobler forsvinner.
    4. Hell PDMS-blandingen på støpeapparatet, overfylling for å sikre fullstendig dekning av hvert spor (figur 2AII). Hvis ønskelig, legg til små, fargede glassperler til kroppen på PDMS-stativene (figur 2AII), motsatt siden med stolpene (figur 2B), for den unike identifikasjonen av hvert PDMS-rack. Sett støpeapparatet tilbake i vakuumkammeret (sørg for at det er horisontalt nivå), og påfør et sterkt vakuum i minst 12 timer. La PDMS herde ved romtemperatur i ca. 48 timer borte fra støv for å muliggjøre fullstendig herding og maksimal styrke på de delikate stolpene. Unngå å bruke en ovn, da dette forvrenger de 3D-printede komponentene.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  3. PDMS-rackfjerning fra aluminiumsnegative masterstøp
    1. Fjern klemmen, brakettene og silikonplaten fra støpeapparatet. Bruk et barberblad i rustfritt stål, trim bort PDMS-filmen på toppen av støpeapparatet og rammestøttene, og bruk fingrene forsiktig til å skille PDMS-stativene fra sidene av støpeholderen. Sett et sløvt barberblad i rustfritt stål inn i dødrommet mellom støpen og støpeholderen, og lirk dem fra hverandre (figur 2CI, II), slik at PDMS som fyller dødrommet, forblir med støpeholderen (da dette er festet til stolpene). Bruk et skarpt blad i rustfritt stål, klipp bort de resterende PDMS-filmene, og kutt PDMS med dødt mellomrom fra spissene på stolpene (figur 2C III-V).
    2. KRITISK TRINN: Frigjør PDMS-stativet fra gipsen (figur 2D). Begynn med siden motsatt stolpene, bruk fingrene til å sakte skille PDMS-stativet fra kastet, og arbeid på alternative sider til stolpene er fri for masterkastene.
    3. Gjenta forrige trinn til alle PDMS-stativene og alle innleggene er frigjort. Bruk et skarpt barberblad for å trimme bort overflødig PDMS fra stativene. Resultatet er et PDMS-stativ (figur 2E) med seks intakte stolper (oransje pilspisser) og fargede perler (blå pil) for identifikasjon.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  4. Fabrikasjon av stabil postsporing (SPoT)
    1. Bruk en termoplastisk smeltet avsetningsmodellerende 3D-skriver, og skriv ut komponentene til SPoT-støpeapparatet (tilleggsfil 2 og figur 3AI, II). Bruk følgende utskriftsinnstillinger: en laghøyde på 0,1 mm, en vegg-/bunn-/topptykkelse på 1 mm, en fylltetthet på 80 % med trekanter, en utskriftstemperatur på 230 °C, en byggeplatetemperatur på 70 °C og en brem for vedheft.
    2. Sørg for en sikker trykkpasning mellom de 3D-printede stykkene, samt mellom PDMS-stativene og den trekantede jiggen, og bekreft at PDMS-stativene passer godt til stolpene som akkurat når bunnen av brønnene uten å bli bøyd. Trim / fil plasten om nødvendig.
    3. Tilsett 0,5 ml svart PDMS del A til 0,5 ml del B (1:1-forhold, i henhold til produsentens instruksjoner) til en liten veiebåt (eller en lignende liten, grunn beholder), og bland grundig til den er ensartet i fargen. Degas den blandede svarte PDMS i et vakuumkammer under et sterkt vakuum i 20 minutter. Hell de avgassede svarte PDM-ene på den 3D-printede basen for å fylle hullene, og trykk for å sikre at ingen bobler blir igjen. Skrap bort så mye overflødig PDMS fra basen som mulig.
    4. Fest det trekantede stykket på basen, og plasser PDMS-stativene i sporene på den trekantede jiggen (figur 3AII, turkis rektangel), og sørg for at endene av stolpene dypper inn i de svarte PDM-ene i de sirkulære brønnene (figur 3B, C). Herd den svarte PDMS ved romtemperatur og beskyttet mot støv i 48 timer.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
    5. Skyv ut det trekantede stykket, og minimer spenningen på innleggene. Bruk små tang for å skrape bort den tynne filmen av svart PDMS som omgir hver SPoT; Sett deretter inn fintippede bøyde tanger i SPoT-brønnen for å frigjøre den fra den 3D-printede basen (figur 3D).
    6. Inspiser SPoTs (figur 3E), og trim bort gjenværende svart PDMS-film fra støpeprosessen som ikke ble fjernet i trinn 1.4.5 ved hjelp av fin Vannas-saks. Forsikre deg om at de ferdige stolpene har riktig lengde ved å montere PDMS-stativene på polysulfonrammen og deretter skyve dette på den svarte bunnplaten (figur 4A).
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
    7. Par PDMS-stativene, og legg dem til i rammen ved hjelp av rammetappene (figur 4A). Autoklav i pose med PTFE-grunnplate i minst 30 minutters syklus (<122 °C for å redusere vridning).

Figure 1
Figur 1: hECT bioreaktorkomponenter. (A) Toppvisning (venstre) og sidevisning (høyre) av PTFE-bunnplaten med seks jevnt fordelte brønner for dannelse av hekter (hvite piler). (B) Sidevisning (venstre) og toppvisning (høyre) av de negative aluminiumsmasteravstøpningene for PDMS-stativene med seks jevnt fordelte stolper (magenta pilspisser) og tre hull for å feste til bioreaktorrammen (grønne stjerner). (C) Sidevisning (venstre) og bunnvisning (høyre) av polysulfonrammene for PDMS-stativene med tre jevnt fordelte rammestøtter (grønne stjerner) som tilsvarer rammestøttene i PDMS-stativstøpen (panel B). (D) Sett ovenfra (øverst) og sett fra siden (nederst) av støpeholderen i aluminium med fire spor for PDMS-stativstøpene, hver med en 0,25 mm høy trekantet hylle (hyllen lengst til venstre uthevet i oransje). Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: hECT = humant konstruert hjertevev; Ø = diameter; PTFE = polytetrafluoretylen; PDMS = polydimetylsiloksan; R = radius. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fabrikasjon av PDMS-stativene. (A) CAD-gjengivelser viser et skrått bilde av støpeapparatet. (I) En negativ PDMS-rackmasterstøp settes inn i hvert av de fire sporene i støpeholderen med hullene som danner PDMS-stolpene (magenta pilspisser) plassert over dødrommet motsatt den trekantede hyllen (figur 1D, oransje trekant). (II) PDMS helles i hvert hulrom i den negative masterkasten. (III) Fargede perler legges til uherdet PDMS som et fargekodet identifikasjonssystem. (B) Foto som viser det monterte PDMS-stativstøpeapparatet, som er klemmet på hver side med to 3D-printede braketter holdt på plass av en skrueklemme og innpakket med 0,5 mm tykk silikonplate (hvite piler) for å forsegle de klemte sidene. De fargede perlene er plassert slik at de ikke dekker hullene med en diameter på 0,5 mm som danner stolpene (magenta pilspisser). (C) Når PDMS er herdet, fjernes avstøpningen fra støpeholderen. (I) Et buttet barberblad i rustfritt stål eller lignende tynt metallverktøy settes inn mellom støpen og støpeholderen for å lirke avstøpningen fra støpeholderen (II). (III) Filmen (turkise parenteser) dannet av PDMS som strømmer gjennom hullene på stolpene, er festet til spissene på stolpene og må kuttes bort med et skarpt blad (IV, V). (D) PDMS-stativet er atskilt fra gipsen. (E) Bilder som viser skrå (øverst), side (midten) og bunn (nederst) utsikt over PDMS-stativet med en glassperle innebygd i kroppen for identifikasjon (blå pil). Spissene på stolpene (oransje pilspisser) er merket med svart blekk. Skala bar = 1 cm. Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: CAD = dataassistert design; PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: SPoT-fabrikasjon. (A) CAD-gjengivelser som indikerer nøkkeldimensjoner på (I)-basen og (II) trekantet del av SPoT-støpejiggen. Dimensjonene til de sirkulære SPoT-skjemaene (AI, svarte piler) er satt til 0,2 mm dyp x 1,2 mm i diameter, og hver inneholder de svarte PDM-ene for en individuell SPoT. Den 11,1 mm x 27 mm hyllen sett i toppvisningen (AII, øverst, turkis rektangel) trykkes ned med 0,4 mm (som vist i sidevisningen nedenfor) for å holde PDMS-stativet på plass under herding. (B) CAD-gjengivelse som viser monteringen av SPoT-støpeapparatet. (C) Et bilde av det monterte SPoT-støpeapparatet. (D) Etter at PDMS har herdet, skyves den trekantede jiggen ut fra undersiden av PDMS-stativene, og SPoT-ene frigjøres fra brønnene sine ved hjelp av fine tang. (E) Bilder av PDMS-racket uten (øverst) og med (nederst) SPoT. Innfellinger viser forstørrede visninger av innleggene. Skalastolper = 1 cm (E), 2,5 cm (innzoomede bilder i av E). Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: CAD = dataassistert design; Ø = diameter; PDMS = polydimetylsiloksan; R = radius; SPoT = stabil post tracker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Cellekultur

  1. Dyrking av iPSCs
    MERK: Ulike cellelinjer kan kreve justeringer av passasjefortynning og frekvens og/eller titrering av mediumtilsetningene.
    1. Belegg en cellekulturbehandlet 6-brønnsplate med kvalifisert kjellermembranmatrise (fortynnet i 1: 1 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM / F12] i henhold til produsentens instruksjoner), og inkuber platen ved 37 ° C i minst 30 minutter. Forbered 500 ml iPSC kulturmedium i henhold til produsentens instruksjoner, og tilsett 5 ml penicillin-streptomycin (10.000 IE / ml til 10.000 μg / ml) stamløsning.
    2. For å passere iPSCene, aspirer mediet fra brønnene og vask hver brønn en gang med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett 1 ml iPSC dissosiasjonsløsning per brønn, og inkuber i en laminær strømningshette i 1 min.
    3. Aspirer iPSC-dissosiasjonsløsningen og inkuber cellene ved 37 °C (uten medium) i 5 minutter. Tilsett 1 ml 2 μM tiazovivin i iPSC-medium for å nøytralisere iPSC-dissosiasjonsløsningen.
    4. Bruk en 2 ml serologisk pipette til å dissosiere koloniene i klumper på omtrent 10 celler, og vask hver brønn med ytterligere 1 ml 2 μM tiazovivin i iPSC-medium. Tilsett 2 ml cellesuspensjon til hver brønn på platen nylig belagt med kjellermembranmatrise (trinn 2.1.1).
    5. Etter 24 timer, fjern mediet, og tilsett friskt iPSC medium (uten tiazovivin). Fôr iPSCene hver 48. time med 2 ml iPSC-medium eller hver 72. time med 4 ml medium. Replate cellene ved en 1:6 fortynning for passering hver 3. dag eller når de når 80% samløp.
      MERK: Ulike cellelinjer kan kreve justering av fortynnings- og passasjefrekvensen.
  2. Kardiomyocytt differensiering
    1. Begynn differensieringen når iPSC-monolagene er 80% -90% sammenflytende.
    2. Forbered differensieringsmediet ved å tilsette 10 ml B27-tilskudd uten insulin og 5 ml penicillin-streptomycin-stamløsning til 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI). Forbered kardiomyocytt vedlikeholdsmediet ved å tilsette 10 ml B27-tilskudd og 5 ml penicillin-streptomycin-stamløsning til 500 ml RPMI 1640.
      MERK: Differensieringsmidlet og kardiomyocytt vedlikeholdsmedium kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
    3. Dag 0: Vask cellene med 1 ml DMEM/F12, og tilsett 2 ml 10 μM CHIR99021 og fortynnet kjellermembranmatrise i differensieringsmedium.
    4. Dag 1: Etter 24 timer, eller når cellekonfluensen er redusert til under 70 %, vask cellene med 1 ml DMEM/F12, tilsett 2 ml differensieringsmedium og inkuber i 48 timer.
    5. Dag 3-4: Vask cellene med 1 ml DMEM/F12, og tilsett 2 ml 5 μM IWR-1 i differensieringsmedium. Gjenta på dag 4.
    6. Dag 5-6: Vask cellene med 1 ml DMEM/F12, og tilsett 2 ml differensieringsmedium. Gjenta på dag 6.
    7. Dag 7-10: Vask cellene med 1 ml DMEM/F12, og tilsett 2 ml kardiomyositt vedlikeholdsmedium. Gjenta hver 24.
    8. Dag 11+: Erstatt mediet med 4 ml ferskt kardiomyocytt vedlikeholdsmedium hver 48-72 timer. Aspirer og pipett sakte for å unngå å skade de kraftig slående monolagene.

3. hECT-kultur

  1. Høsting av kardiomyocyttene
    1. Høst kardiomyocyttmonolagene for bruk i hECT-fabrikasjonen 8-60 dager etter differensieringsinduksjon. Forvent 2-5 millioner celler per brønn.
      MERK: Hvis cellene ikke har begynt å slå innen dag 10, er differensieringen usannsynlig å lykkes. Kraftig slående monolayers løsner ofte etter 11-15 dager i differensieringen og komprimeres i tette vev. Det anbefales å bruke eller replate slike celler på dette tidspunktet.
    2. Skyll hver brønn med kardiomyocytter 2x med 2 ml PBS. Tilsett 1 ml romtemperatur 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 °C i 5-10 minutter til cellene virker avrundede og vil løsne med lett tapping av platen.
    3. Tilsett 1 ml 10% FBS i kardiomyocytt vedlikeholdsmedium til hver brønn for å nøytralisere dissosiasjonen. Pipetter monolagene forsiktig med en 5 ml serologisk pipettespiss, og overfør til et 50 ml konisk rør for å bryte opp pelleten i klumper på 10-20 celler.
    4. Bland cellesuspensjonen ved å invertere det koniske røret før du overfører 10 μL celler til 10 μL trypanblått. Telle cellene ved hjelp av en automatisert celleteller eller glass hemocytometer. Separer cellesuspensjonen på riktig måte hvis ikke alle cellene skal brukes, eller hvis noen celler er satt til side for flowcytometri.
      MERK: Supplerende celler (som fibroblaster) kan legges til på dette tidspunktet.
    5. Sentrifuge cellene ved 250 × g i 5 minutter. Aspirer umiddelbart så mye supernatant som mulig uten å forstyrre cellepelleten, og hold på is. Arbeid raskt for å minimere tiden som cellene bruker i pelleten.
  2. hECT fabrikasjon
    1. Bruk volumene i tabell 2, og juster i henhold til antall celler i pelleten slik at hver hECT inneholder 1 million celler. Etter hvert trinn, bland ved å pipettere sakte for å unngå bobler.
      MERK: Utfør trinn 3.2.2-3.2.3 skjermet mot direkte lys, da noen komponenter er lysfølsomme.
    2. Forbered en 2,9 g / ml type-1 kollagenoppløsning i et 1,7 ml mikrorør ved å tilsette 13,442 μL destillert vann, 4,4 μL 10x PBS og 0,638 μL 1M NaOH. Tilsett 25,52 μl 5 mg/ml kollagenoppløsning, og bland langsomt.
    3. Forbered ekstracellulær matriksblanding (ECM-blanding fra tabell 2): Tilsett 5,5 μL 0,2 N pH 9 HEPES-oppløsning etterfulgt av 5,5 μL 10x MEM. Bland grundig til en jevn lysegul til lysrosa farge blir observert. Overfør 35,2 μL av ECM-blandingsløsningen til cellepelleten, og tilsett 4,4 μL kjellermembranmatrise.
    4. Åpne den autoklaverte posen med bioreaktordeler (trinn 1.4.7, figur 4A). Mens du bruker hansker sterilisert med 70% etanol, fjern den svarte bunnplaten fra autoklavposen, og legg i en 60 mm tallerken med brønnene vendt opp. Pipett 44 μL av celleblandingen inn i hver brønn sakte for å unngå å introdusere bobler. Bruk om nødvendig pipetten til å fjerne bobler som ble introdusert ved pipettering eller har dannet seg på grunn av hydrofobisiteten til PTFE. Gjenopprett volumet av hECT slik at overflaten av væsken er flush med leppen av brønnen (figur 4BI).
    5. Ta på deg et nytt par steriliserte hansker, og fjern polysulfonrammen med PDMS-stativer fra autoklavposen. Senk rammen ned på bunnplaten slik at endene av rammen passer inn i sporene i enden av bunnplaten (figur 4BII, III). Inspiser bioreaktoren for å sikre at stolpene er rette og at rammen ikke er vippet før den plasseres i en 60 mm tallerken.
    6. Tilsett 1 ml 10% FBS i kardiomyocyttvedlikeholdsmedium til 60 mm-fatet (pass på at du ikke forstyrrer hektene) for å øke fuktigheten i parabolen når hektene stivner. Plasser 60 mm-fatet uten lokk i en 100 mm tallerken med høy profil (20 mm høy), dekk til med et 100 mm oppvasklokk, og sett bioreaktoren tilbake til 37 °C, 5 % CO2 -inkubatoren slik at kollagenet danner en gel med cellene i suspensjon.
    7. Etter 2 timer, fjern parabolen fra inkubatoren. Tilsett 13 ml 10% FBS i kardiomyocytt vedlikeholdsmedium, vipp parabolen for å oppmuntre mediet til å strømme mellom PTFE-grunnplaten og PDMS-stativene.
    8. Inspiser bioreaktoren fra siden for å sikre at ingen luftbobler fanges mellom de hydrofobe overflatene på PTFE-grunnplaten og PDMS-stativene, og returner parabolen til inkubatoren. Hvis det er fanget luft, vipp bioreaktoren ut av mediet for å la boblen bryte, og senk den sakte igjen, eller bruk en mikropipette med en gelbelastningsspiss for å sippe ut luften, pass på at du ikke forstyrrer stolpene.
  3. Fjerning av bunnplater
    1. Inspiser hECT-komprimeringen gjennom åpningen i rammen. I løpet av 24-96 timer komprimeres hektene og blir mer ugjennomsiktige (figur 4CI-III). Når det er et synlig gap mellom hektene og veggen av baseplaten (figur 4CII), utfør to halvvolummediumendringer for å endre mediet til kardiomyocytt vedlikeholdsmedium uten FBS. Fjern bunnplaten når hektene er komprimert med minst 30% sammenlignet med den opprinnelige diameteren (figur 4CIII). Fyll 60 mm-fatet som inneholder bioreaktoren med kardiomyocytt vedlikeholdsmedium til væsken skylles med leppen på fatet, og tilsett 14 ml til en ny 60 mm tallerken.
    2. KRITISK TRINN: Mens du bruker sterile hansker, snu bioreaktoren i parabolen slik at bunnplaten er på toppen (figur 4BIV). Inspiser for fangede luftbobler som i trinn 3.2.8. Løft bunnplaten sakte og hold den i vater (figur 4BV).
    3. Hvis en hECT faller av under fjerning av baseplaten, men forblir i baseplaten, bruk steril buet fin tang for å overføre hECT fra baseplaten til 60 mm parabolen. Bruk tangen til å lede enden av hECT til stolpen. Bruk en tang nummer to til å holde stolpen stødig, og tre den gjennom hullet i hECT. Gjenta for det andre innlegget om nødvendig.
    4. Med alle hektene festet til stolpene, overfør rammen med hECTene til den nye 60 mm parabolen, og plasser rammen med stolpene pekende ned (figur 4BVI). Inspiser bioreaktoren for å sikre at hektene forblir på sine poster bare proksimalt for SPoTs.
    5. Hvis en hECT har blitt presset av overflatespenning til bunnen av stolpene, stabiliserer du rammen med et par sterile buede tang. Sett den andre tangen gjennom sporet i rammen, og hold den lukket. Når spissen av tangen er senket forbi PDMS-stativene, vrir du den slik at den når stolpen, og bruker de lukkede spissene til å skyve hECT forsiktig mot slutten av stolpen til den hviler på SPoT (figur 4BVI, innfelt).
  4. hECT vedlikehold
    1. Utfør halvvolummediumendringer med kardiomyocytt vedlikeholdsmedium hver 24-48 h (etter 2 ukers kultur kan frekvensen reduseres til to ganger per uke.)
    2. Når hECT-ene viser klynger av spontan juling, vanligvis etter dag 3, og koordinert juling med synlig etterbøyning innen dag 5, begynner de funksjonelle målingene og gjentar så ofte som ønsket.
      MERK: hECTs som ikke har begynt koordinert juling innen dag 7 er usannsynlig å gjøre det i det hele tatt.
Komponent Volum (μL)
destillert H2O 13.442 2,9 mg/ml kollagenoppløsning "ECM-blanding" endelig hECT-celleblanding
NaOH 1N 0.638
PBS 10x 4.4
5 mg/ml kollagenlager 25.52
0,2 N pH 9 HEPES 5.5
10x MEM 5.5
Volum av ECM-blanding som skal overføres til cellepellet 35.2
Volum av Matrigel 4.4

Tabell 2: hECT-reagenser. Komponentene skal legges i den rekkefølgen som er oppført og holdes på is.

Figure 4
Figur 4: Bioreaktormontering og hECT-fabrikasjon. (A) (I) To PDMS-stativer (venstre, lyseblå) montert på polysulfonrammen (høyre, brunfarge). (II) PTFE-grunnplaten (svart, venstre) passer deretter på rammen (høyre) slik at hvert par stolper passer inn i en brønn på bunnplaten. (B) (I) Førtifire mikroliter kardiomyocyttsuspensjon i kollagenbasert ekstracellulær matriks tilsettes til hver av de seks baseplatebrønnene. (II, III) Rammen med PDMS-stativer er trykkpasning på bunnplaten. Etter 1-4 dager kan hektene fjernes fra grunnplaten. (IV) Først blir bioreaktoren invertert før (V) bunnplaten løftes av rammen. (VI) Sidevisning av bioreaktoren med seks hektar. Rammemarg: forstørret visning som viser hECT-posisjonen på innleggene i forhold til SPoTs (innfelling). (C) CAD-gjengivelse som viser tre nivåer av hECT-komprimering ([I] lav, [II] medium og [III] høy) sett gjennom gapet i polysulfonrammen. Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: CAD = dataassistert design; PDMS = polydimetylsiloksan; PTFE = polytetrafluoretylen; SPoT = stabil post tracker; hECT = humant konstruert hjertevev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. utstyr for hECT-pacing

  1. Jakke til oppvarmet scene
    1. Bruk en laserskjæringsmaskin til å kutte komponentene i akrylisolerende jakke ut av et 0,635 cm tykt klart akrylark (tilleggsfil 3), en hver av figur 5A-D, og to hver av figur 5E, F.
    2. Sett sammen deler (B), (C), (D) og en av (E) fra figur 5, og bind sammen med akryllim som vist i figur 5GI. Fest topppanelet (figur 5GII), la limet få flere timer å stivne, og skyv deretter det oppvarmede trinnet inn i siden av jakken (figur 5GIII).
    3. Når jakken er på plass, bruk tape for å feste innsatsene mellom bena på den oppvarmede scenen, og legg til frontpanelet (figur 5GIV) for å fullføre monteringen (figur 5GV).
  2. Grafittelektrodefabrikasjon
    1. Klipp 6,25 mm tykke, 25 mm brede grafittstenger ved hjelp av en båndsag i blokker 35 mm lange; Klipp deretter hver blokk på langs i en buet linje slik at hver elektrode er 13-16 mm høy i den ene enden og 8-10 mm høy i den andre enden. Bor to hull med diameter på 0,7 mm i øvre hjørne (figur 6AI). Poler bitene med papirhåndklær, og sonicate i vann i 20 min for å fjerne grafittstøv. Sørg for at elektrodene kiler seg mellom veggene i parabolen og den 25 mm brede bioreaktoren for å sikre en jevn avstand mellom elektrodene (figur 6AII).
    2. Tre en 150 mm lang x 0,25 mm diameter ståltråd gjennom hullene på elektrodene, og bøy den slik at den passer over leppen på 60 mm-fatet og rundt veggene på 100 mm-fatet slik at lokket kan lukkes (figur 6AII).
    3. Rengjør elektrodene ved å bløtlegge i destillert vann i 1-2 timer etter hver bruk for å fjerne absorbert medium, la det tørke over natten og deretter autoklav ved 132 °C i 30 minutter. Før målingene påbegynnes, plasser en elektrode på hver side av bioreaktoren (figur 6AII). Plasser ledningene slik at 100 mm tallerkenlokket kan lukkes, og returner bioreaktoren til inkubatoren for å likevekte.

Figure 5
Figur 5: Akryljakke for isolering av det oppvarmede glasstrinnet. CAD-bilder som viser nøkkeldimensjonene til delene av akryljakken designet for glassbordet. (A) Topppanelet har en 27 cm x 18,5 cm hullutskjæring for å tillate bioreaktorfatet å sitte på varmeelementet. De oransje rektanglene i hjørnene indikerer den foreslåtte plasseringen av små avstandsstykker for å gi plass mellom toppen av jakken og varmeelementet. (B) Det nederste stykket av jakken har to utskjæringer for å la bena på den oppvarmede scenen gli inn (grønne stjerner). (C&D) To sidepaneler passer under toppstykket. (D) Det venstre sidepanelet har en utskjæring på 3 cm x 0,3 cm for strømledningen på scenen. (E) Lange paneler passer på forsiden og baksiden. (F) Innsatser legges til for å fylle hullene når bordet er inne. (G) (I) Side- og bakpanelene festes til bunnstykket, og deretter (II) legges topppanelet til. (III) Glassbordet skyves inn i jakken (magenta piler). (IV) Innsatsene er festet mellom bena på bordet, og ryggen passer på åpningen for å lukke boksen. (V) Den ferdige jakkemonteringen. Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: CAD = dataassistert design; R = radius; Ø = diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Datainnsamling av hECT-kontraksjon. (A) (I) Bilder av elektrodene kuttet fra grafittstenger. De magenta pilene indikerer hull for å feste de rustfrie ståltrådene. Skalastang = 1 cm. (II) Skrå visning (venstre) og toppvisning (høyre) som viser plasseringen av grafittelektrodene i bioreaktoren. Elektrodene tar opp mellomrommet mellom den 25 mm brede bioreaktoren og veggen på parabolen for å sikre en jevn avstand mellom elektrodene. Ledningene er bøyd for å tillate lukking av oppvasklokket. (B) Bilde av hECT-pacingoppsettet inne i det laminære flytrensebenkutstyret er plassert på vibrasjonsisolasjonsbordet for å redusere vibrasjonsstøy fra den rene benken. Bioreaktoren (magenta pilspiss) sitter på den jakkede oppvarmede scenen, opplyst av en LED-lyskilde ovenfra. Dissekeringsmikroskopet peker horisontalt mot et rettvinklet speil (oransje stjerne) for å se bioreaktoren nedenfra og er utstyrt med et CCD-kamera (venstre). Den turkise braketten indikerer et vannbad for kontinuerlig temperaturovervåking for å gi tilbakemelding til den lukkede oppvarmede sceneregulatoren. Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: hECT = humant konstruert hjertevev; LED = lysemitterende diode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. hECT funksjonelle målinger

  1. Definere arbeidsområdet tempo
    1. Slå på den oppvarmede scenen til 39,5 °C, og sett opp tempoutstyret på et vibrasjonsisolasjonsbord inne i en laminær strømningsren benk i henhold til figur 6B. Monter dissekeringsmikroskopet på et bomstativ, og pek det mot et rettvinklet speil (figur 6B, oransje stjerne) plassert på en laboratoriekontakt under glassbordet for å se bioreaktoren nedenfra. Fest et høyhastighets CCD-kamera til mikroskopet, og koble til datamaskinen. Bestråle oppsettet med UV-lys i 15 minutter for å sterilisere arbeidsområdet.
    2. Plasser bioreaktoren (figur 6B, magenta pilspiss) på den jakkede oppvarmede scenen, opplyst av en dual-head gooseneck LED-lyskilde ovenfra (halsene på LED-lamper kan festes sikrere til hovedenheten sammenlignet med fiberoptiske lamper). Minimer ekstra støy ved å sikre at pacingutstyret på vibrasjonsbordet (og selve bordet) ikke berører noen del av den laminære strømningsrenne benken.
    3. Legg til en annen 60 mm tallerken fylt med forvarmet vann inne i en 100 mm tallerken på det oppvarmede bordet (figur 6B, turkis brakett), og antrekk med en temperatursonde for kontinuerlig temperaturovervåking. Juster temperaturinnstillingen for det oppvarmede trinnet etter behov for å holde temperaturen på referanseskålen ved 36-37 °C.
    4. Sett mikroskopforstørrelsen til 1,5x (eller en annen ønsket forstørrelse som en hECT kan visualiseres i sin helhet med tilstrekkelig oppløsning).
  2. Justere kamerainnstillingene
    1. Åpne kameraprogramvaren. Endre størrelsen på videofeeden for å beskjære synsfeltet så mye som mulig mens du fortsatt visualiserer en hel hECT. Dette maksimerer kamerahastigheten.
    2. Sett fangsthastigheten til 90 bilder per sekund. Juster eksponeringstiden og lyskildeposisjonen for å optimalisere ensartede lysforhold over synsfeltet og maksimere kontrasten til SPoT-ene.
  3. Oppsett av anskaffelse av programvare
    1. Slå på den firkantede pulsstimulatoren, og koble den til datamaskinen. Juster innstillingene for å levere bifasiske pulser med en amplitude på 12 V og en varighet på 5 ms.
    2. Åpne datainnsamlingsprogramvaren, og åpne deretter filen "AutomatedPostTracking3.vi" (tilleggsfil 4). Når den er lastet, klikker du på den hvite pilen på venstre side av verktøylinjen for å initialisere programmet (figur 7A).
    3. Kalibrer programvaren ved hjelp av et glasshemocytometer på det oppvarmede scenen. Klikk linjeverktøyet på verktøylinjen (figur 7B) for å tegne en linje over 1 mm av hemocytometermarkeringene (ikke vist). I boksen Avstandskalibrering (piksler/mm) (figur 7C) setter du referanselengden (mm) til 1, og deretter klikker du på Beregn-knappen.
    4. Mål hECT-tverrsnittsarealet ved hjelp av linjeverktøyet til å tegne en linje over bredden på vevet. Klikk på 1 i boksen Tverrsnittsareal (mm ^ 2) (figur 7D) for å beregne arealet (forutsatt en sylindrisk geometri av de lineære vevsstrimlene, som etablert i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Gjenta langs forskjellige deler av hECT, og registrer verdiene under de to andre knappene i boksen. Utdatatabellfilen rapporterer gjennomsnittet av disse tre verdiene for å beregne diameteren på vevet.
  4. hECT funksjonell karakterisering
    1. Sørg for at innleggstipsene er i fokus. Slå på terskelbryteren (figur 7E), og juster glidebryteren (figur 7F) til SPoT-ene (figur 7G) er pent avgrenset og ikke endrer form når hECT-kontraktene trekker seg sammen.
    2. Bruk rektangelverktøyet til å tegne et rektangel rundt en av SpoT-ene (figur 7, grønt rektangel), og klikk på Sett 1-knappen i boksen Postgrenser (figur 7H) for å angi rektangelposisjonen rundt SPoT, slik at SPoT forblir innenfor rektangelets grense til enhver tid. Gjenta for det andre innlegget, og ta det opp under Sett 2.
    3. Juster innstillingene for objektstørrelse (figur 7I) for å hindre at programmet sporer mindre objekter. Sørg for at antall objekter som spores i hvert rektangel, forblir konstant. Grensesnittet (figur 7J) viser den målte avstanden mellom de sporede objektene i sanntid. Bruk denne grafen til å overvåke støyen.
    4. Velg en katalog for å lagre filene (figur 7K). Lagre data fra forskjellige dager i separate mapper. Velg gjeldende vevsnummer, og skriv eventuelle ønskede kommentarer i kommentarfeltet .
    5. Under overskriften Pacing Frequency (Hz) (figur 7L) angir du ønsket frekvensområde (Min og Max), og ønsket intervall for å gå fra Min til Maks. Hvis pacing hECTs over hele fangstområdet, teste forskjellige pacing frekvenser for å finne den laveste frekvensen der en 1: 1 stimulus: peak ratio oppnås, og fortsette å øke frekvensen til at forholdet er tapt. Mål den spontane funksjonen ved å velge et vilkårlig frekvensområde (f.eks. 0,01 Hz til 0,01 Hz) og holde den kvadratiske pulsstimulatorutgangen av.
    6. I boksene til høyre velger du ønsket innstillingstid(er) (et tidsintervall etter at frekvensen er angitt, men data ikke registreres) for å la hECT tilpasse seg den nye tempofrekvensen. Angi opptakstid (er) og pacing voltage (V). Start programmet ved å klikke på Start program-knappen (figur 7M).
      MERK: Resultatene lagres automatisk i den valgte katalogen. Etter hvert opptak, observer at skriptet viser Fourier-transformasjonen av dataene (figur 7N), der toppene tilsvarer den oppdagede slagfrekvensen.
    7. Hvis ønskelig, kjør programmet "Excitation Threshold Finding" for å finne minimumsspenningen som kreves for å stimulere hECT i sikte (figur 7O). Hvis ønskelig, beregne maksimum og minimum avbøyninger av innleggene (figur 7P).

Figure 7
Figur 7: Grensesnitt for datainnsamling etter avbøyning. (A) Knapp for kjøring av programvaren. (B) Verktøylinje som inneholder linje- og rektangelverktøyene for henholdsvis lengdemål og objektvalg. (C) Avstandskalibreringskontroller. (D) Verktøy for måling av hECT-tverrsnittsareal på tre forskjellige punkter. (E) Terskelbryter og (F) glidebryter for konvertering av videofeed til bilder med høy kontrast i sanntid. (G) En SPoT synlig i forhåndsvisningsvinduet. (H) Verktøy for valg av SPoTs. (I) Glidebryter for filtrering av objektene etter størrelse. (J) Graf som viser den målte avstanden mellom de sporede objektene i sanntid. (K) Alternativer for å velge katalogen for å lagre utdatafilene. (L) Alternativer for innstilling av frekvensområde, frekvensintervall, opptakstid og innstilling av tid mellom opptak for postsporingsprogrammet (M). (N) Grafutgang fra Fourier-transformasjonen av avbøyningskurven til det sist lagrede opptaket. (O) Program for å finne minimumsspenningen som kreves for å stimulere hECTs. (P) Program for å beregne maksimum og minimum avbøyninger av innleggene. Forkortelser: hECT = humant konstruert hjertevev; SPoT = stabil post tracker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Måling av PDMS-rack

  1. Lossede avstander
    1. Før hECT-fabrikasjon, monter ønsket par PDMS-stativer på en ramme. Bruk tempooppsettet og programvaren beskrevet i trinn 5.1 for funksjonsmålingene. Velg de stasjonære SPoT-ene på slutten av innleggene.
    2. Juster lyskilden og/eller terskelverdien om nødvendig for å redusere støyen til <2 μm. Registrer den gjennomsnittlige live y-verdien som er angitt i grafen i et regneark.
  2. Stolpehøyder og hECT-høyder
    1. Fra tempooppsettet som er beskrevet i trinn 5.2, fjerner du det vinklede speilet og det oppvarmede trinnet. Plasser bioreaktoren direkte på laboratoriekontakten for en sidevisning av bioreaktoren.
    2. Åpne kameraprogramvaren. Juster eksponeringstiden og lyskildeposisjonen for å optimalisere ensartede lysforhold over synsfeltet og maksimere synligheten til stolpene.
    3. Åpne programvaren for datainnsamling, og åpne deretter filen "PostMeasurement_PB3.vi" (tilleggsfil 5). Når den er lastet, klikker du på den hvite pilen på venstre side av verktøylinjen for å initialisere programmet.
    4. Kalibrer programvaren ved hjelp av et glasshemocytometer. Klikk på linjeverktøyet i den vertikale verktøylinjen til venstre for visningsvinduet, og tegn en linje over 1 mm av hemocytometermarkeringene. I boksen Avstandskalibrering (piksler/mm) nederst til venstre på skjermen, sett referanselengden (mm) til 1, og klikk deretter på Beregn-knappen .
    5. Under kalibreringsfeltene angir du ønsket vevsnummer (for identifikasjon) i feltet Tissue Number . Fokuser kameraet på venstre stolpe i hECT, og velg Venstre i Post Side-boksen .
    6. Bruk linjeverktøyet til å tegne en linje fra bunnen av innlegget (øverst) til spissen av SPoTs (nederst), og registrer ved å klikke på Mål innlegg Ht.
    7. Tegn en linje fra bunnen av stolpen til ytterkanten av hECT, og registrer ved å klikke på Mål vev Top Ht. Tegn en linje fra bunnen av stolpen til den nære kanten av hECT, og registrer ved å klikke Mål vevsbase Ht.
    8. På dette punktet, snu bioreaktoren rundt for å måle riktig stolpehøyde. Velg riktig innleggsalternativ for å registrere de samme målingene. Klikk på Legg til-knappen for å fylle regnearket med de målte verdiene og automatisk beregne gjennomsnittshøyden til hECT, som vil bli brukt i trinn 7.
    9. Når du er ferdig med å registrere vevshøyder, klikker du på Lagre-knappen for å lagre verdiene i en tekstfil.

7. Funksjonell databehandling ved hjelp av tilpassede analyseskript

  1. I et regnearkredigeringsprogram fyller du ut sammendragsfilen ved hjelp av malen (tilleggsfil 6). Bruk verdiene for innleggslengde og gjennomsnittlig vevshøyde som er oppnådd i trinn 6.2. Forsikre deg om at alle hECTene som har data i mappen, er representert i sammendragsfilen. Gi filen navnet "sammendrag #.csv", der # refererer til antall dager inn i eksperimentet.
    MERK: Funksjonsdataene for hECT må være i separate mapper i henhold til eksperimentdagen.
  2. Kontroller at mappen som inneholder AnalyzeLogsGUI-skriptene (tilleggsfil 7) og mappen med hECT-opptakene, begge legges til banen.
  3. Åpne dataanalyseprogramvaren. Til venstre for kataloglinjen klikker du på Søk etter mappe-knappen for å navigere til den overordnede mappen som inneholder både AnalyzeLogsGUI-mappen og hECT-funksjonsdataene. I sidefeltet for gjeldende vindu høyreklikker du på disse mappene for å legge til i bane | Legg til valgte mapper og undermapper.
  4. Åpne filen "AnalyzeLogsGui_SC.m". Trykk på Kjør-knappen i Editor-fanen, og vent til det grafiske brukergrensesnittet (GUI) vises i et nytt vindu.
    1. I Loggvalg-boksen (figur 8AI) klikker du på Velg katalog-knappen og navigerer til mappen som inneholder hECT-funksjonsdataene. Velg ønsket hECT som skal behandles, fra rullegardinmenyen Vev .
    2. I boksen Datainndata (figur 8AII) skriver du inn den ubelastede avstanden mellom stolpene som er registrert fra trinn 6.1 i feltet Diastolisk avstand. Input 0,25 i feltet Post Radius (mm).
    3. I boksen Analysebegrensninger (figur 8AIII) velger du frekvensene som skal utelates fra analysen, eller velger bestemte frekvenser som skal inkluderes (atskilt med komma). Starttid og sluttidspunkt er satt til henholdsvis 0 og −1, som standard for å behandle hele lengden på opptakene. Endre disse verdiene for å trimme opptakene om nødvendig.
    4. Endre filterparametrene (figur 8AIV) for polynomrekkefølge og rammestørrelse for å endre utjevningsnivået under filtreringsprosessen, og glidebryteren for toppdeteksjonsterskel for å angi minste toppstørrelse som gjenkjennes av skriptene.
      MERK: Skriptet inneholder alternativet Spike Removal (Fjerning av pigg ), som klipper høye topper forårsaket av artefakter. Dette anbefales imidlertid ikke, da det endrer formen på rykningene. Fjern artefakter ved å trimme opptaket i stedet (figur 8AIII).
    5. Bruk flere alternativer (figur 8AV) for ytterligere dataanalyseutdata: Analyse etter nedbøyning for å kjøre en ekstra toppdeteksjonsalgoritme, Autoskalering y-akse på zoomplott for automatisk å justere aksene på rykningskraftkurven (figur 8B), Lagre kraftsporingskurver for å lagre hver trekkkraftfigur til en .fig-fil og Lagre krafttidsdata for å lagre x- og y-koordinatene til de filtrerte dataene som er plottet i figuren Twitch Force Curve.
    6. Klikk på Kjøranalyse for å generere en .txt fil som inneholder attributtene til twitch-kraftkurven (tilleggsfil 8) i gjennomsnitt over et helt opptak.

Figure 8
Figur 8: Beregninger av rykningskraftkurver. (A) Når du kjører filen "AnalyzeLogsGUI.m" i databehandlingsprogramvaren, åpnes GUI-vinduet. (I) Loggvalg-boksen lar brukeren velge katalogen for mappen som inneholder hECT-funksjonsdataene. Dag num-feltet fylles automatisk ut fra tittelen på sammendragsfilen som ble opprettet i protokolltrinn 7.1. hECT som skal behandles, velges ved hjelp av rullegardinmenyen Vev . (II) Datainngangsboksen inneholder informasjon om paret PDMS-innlegg som støtter hECT, for eksempel den ubelastede avstanden (oppnådd i protokolltrinn 6.1) og postradiusen (0,25 mm). (III) Ved hjelp av boksen Analysebegrensninger kan brukeren velge frekvensene som skal utelates, eller inkluderes, og trimme opptakene. (IV) Filterparameterboksen inneholder alternativene for å velge hvordan den rå rykningskraftkurven skal filtreres. Polynomrekkefølge og Delbildestørrelse endrer utjevningsnivået under filtreringsprosessen. Glidebryteren Peak Detection Threshold bestemmer minste toppstørrelse som gjenkjennes av skriptene. Alternativet Fjerning av pigg klipper høye topper forårsaket av artefakter. (V) Ytterligere alternativer inkluderer etteravbøyningsanalyse, som kjører en ekstra toppdeteksjonsalgoritme, autoskalering y-akse på zoomplott, som virker på rykningskraftkurven, Lagre kraftsporingskurver, som lagrer rykningskrafttallene, og Lagre krafttidsdata, som lagrer de plottede rykningskraftdataene. (B) Eksempel på rykningskraftkurven til et 30 s-opptak av et hECT tempo ved 1 Hz produsert av GUI-skjermbildet fra panel A. Den røde rykningskraftkurven viser den filtrerte kraften produsert av parametrene i AIV, lagt oppå den rå rykningskraftkurven (mørk blå kurve, vises når alternativet Vis ufiltrerte data i AV er valgt). Forkortelser: hECT = humant konstruert hjertevev; GUI = grafisk brukergrensesnitt; PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen ovenfor ble kardiomyocytter generert fra en sunn iPSC-linje som tidligere ble brukt av vår gruppe 9,15 og fremstilt i hektar etter 8-61 dager i kultur. Figur 9A viser representative bilder av hECTs sett fra bunnen, som ble opprettet uten (øverst) og med (nederst) SPoTs. Funksjonsmålinger ble gjort ved romtemperatur (23 °C) og ved fysiologisk temperatur (36 °C) mellom 37 dager og 52 dager etter hECT-fabrikasjon. I fabrikasjonen av PDMS-stativene har vi dokumentert at en erfaren bruker kan forvente å ha en 80% avkastning i PDMS-stativer med alle seks stolpene intakte og et samlet utbytte på 95% på minst fem innlegg (basert på tre brukere i laboratoriet vårt), med <3% variasjon i stolpehøyde.

SPoT-ene ga en enkelt definert figur å spore under datainnsamlingen (figur 9B og tilleggsvideo S1) sammenlignet med de fragmenterte figurene på markørtrykkfargen, som ikke bindes godt til tuppene i PDMS-innleggene (tilleggsvideo S2)27. I noen ekstreme tilfeller kan sporingsobjektet til og med være skjult (figur 9C, øverste rad). Disse uregelmessighetene introduserer mye støy som skjuler tråkkkraftkurven, og forhindrer dermed nøyaktig måling av de utviklede kreftene under 10 μN. For å korrigere for dette og sikre konsekvent sporing av disse formene, er det vanligvis nødvendig med mange justeringer av lysvinkelen og posisjonen for å optimalisere kontrasten og klarheten. Mørket og regelmessigheten til SPoT-formene strømlinjeformer denne prosessen, og reduserer dermed innsamlingstiden med omtrent 50 % (fra ~12-30 min til 5-10 min per hECT for et typisk opptaksområde på 1 Hz til 4 Hz). I tillegg ga SPoTs i dette arbeidet en mer pålitelig form for optisk sporing, og reduksjonen i støy muliggjorde måling av svake vev med en utviklet kraft så lav som 1 μN, som representerer en etteravbøyning på mindre enn 5 μm (figur 9D), samt å redusere variabiliteten mellom målingene av samme hECT27.

Etter vår erfaring oppstår prøvetap i langsgående eksperimenter vanligvis på grunn av glidning av hECTS av endene av de inverterte PDMS-innleggene. Denne glidningen av hECTene skjer vanligvis ved fjerning av hektene fra baseplaten (figur 4BV, 1-4 dager etter hECT-fabrikasjon) eller enda senere i forsøket (1-3 uker etter hECT-fabrikasjon) når hECTene er kompakte og modne. Denne modningen av hECTs utøver noen ganger nok passiv og aktiv spenning på de fleksible stolpene for å få hECTs til å trekke seg av enden av et innlegg, noe som resulterer i en ubrukelig klump av vev komprimert rundt motsatt stolpe (figur 9E). SPoT-ene gir en hettegeometri som forhindrer hECT-tap (figur 9F), som kvantifisert i figur 9G. For de 103 bioreaktorene som ble opprettet i løpet av 2 år (hver med tre til seks hektar i starten), beholdt PDMS-rackene uten SPoTs 95% av hektene i gjennomsnitt på tvers av 66 bioreaktorer. Imidlertid, mens de fleste bioreaktorer ikke hadde noe vevstap, mistet noen bioreaktorer 30% -100% av hektene (ofte når en enkelt bioreaktor representerer en hel eksperimentell gruppe), noe som resulterte i betydelig ineffektivitet. I dette arbeidet eliminerte SPoTs effektivt hECT-tap, og forbedret dermed retensjonsraten betydelig til 100% på tvers av 37 bioreaktorer (p = 0,038) 27.

Figure 9
Figur 9: Forbedring av datakvaliteten etter avbøyning og økning i hECT-retensjon med tillegg av SPoTs til PDMS-innleggene. (A) Nederste visning av hECTs uten (øverst) eller med (nederst) SPoTs. (B,C) Nærbilder av den ene enden av en hECT på en stolpe sett fra under bioreaktoren, med terskelinnstillingene i høyre kolonne de samme som ved datainnsamling. De røde boksene indikerer objekter som kan spores av postsporingsprogramvaren. (B) Sammenligning av sporbare fiducial markører på et innlegg med markør blekk versus SPoT. (C) Avslappede og sammentrukne hect-er på innlegg med markørblekk (de to øverste radene) eller med SPoT (de to nederste radene). (D) Eksempel på rykningskraftsporing av en hECT elektrisk tempo ved 1 Hz som slår med en utviklet kraft på 1 μN, tilsvarende en avbøyning på mindre enn 5 μm (blågrønn: ufiltrert spor; magenta: filtrert spor). (E) Skrå visning av en bioreaktor uten SPoTs hvor hECTs gled av en av sine stolper, noe som resulterte i en klump av vev som dannet seg rundt motsatt stolpe (turkise pilspisser). (F) Foto av en bioreaktor med SPoTs som viser 100% hECT retensjon. (G) Punktplott som viser vevsretensjon per bioreaktor for PDMS-rack (hver med tre til seks hektoT) uten SPoTs (n = 322 hECTs, 66 bioreaktorer) og PDMS-rack med SPoT (n = 134 hECTs, 37 bioreaktorer), inkludert data fra bioreaktorer med vevssvikt under fjerning av baseplate (dag 1-4) og senere i dyrkningsprosessen (dag 4-15). *p = 0,038; Diamant indikerer gjennomsnittet. Skalastenger = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelser: hECT = humant konstruert hjertevev; SPoT = stabil post tracker; GUI = grafisk brukergrensesnitt; PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som et eksempel på anvendelse av metodene ovenfor viser vi også viktigheten av å måle hECT-funksjonen ved fysiologisk temperatur (36 °C) i stedet for ved romtemperatur (23 °C). hECT-funksjonen ble funnet å være stabil over lengre dyrkningstid i gjeldende tempooppsett med det oppvarmede trinnet (figur 10A)27. Sammenlignet med målinger ved fysiologisk temperatur viste hekter endret kontraksjonsdynamikk ved romtemperatur, med langsommere sammentreknings- og relaksasjonshastigheter (indikert av toppenes helninger i figur 10B).

I dette arbeidet viste 1 hECT av 10 hypoterm inotropi (hvor den utviklede kraften var høyere ved 23 °C enn ved 36 °C), men bare ved lave frekvenser. Når hECT ble tempoet på 1,5 Hz, hadde det en sterkere utviklet kraft ved 36 °C (ingen hypoterm inotropi) og fullstendig relaksasjon mellom rykninger (flate interpeak-regioner i rykningskraftkurven, høyre panel), men ufullstendig relaksasjon mellom sammentrekninger ved 23 °C (økt passiv kraft mellom topper, venstre panel) (figur 10BI). Når hECT ble tempoet på 0,75 Hz, var hypoterm inotropi til stede (figur 10BII), og hECT ble observert å slappe helt av mellom riene, selv ved 23 °C (venstre panel). Imidlertid var definitive frekvensmatchede sammenligninger av hECT-funksjonen utfordrende fordi fangstområdet for de fleste hECTs viste minimal overlapping over temperaturer (figur 10C). Dette skyldtes i stor grad den lave maksimale fangstfrekvensen ved 23 °C (for det meste ≤1,5 Hz) og den høye minimumsfangstfrekvensen på hECT ved 36 °C (for det meste ≥ 1,5 Hz) (figur 10D); Disse begrensningene ses ikke i native myokard (testet ved 28 °C og 37 °C) da native ventrikkelmyokard ikke slår spontant46. Kun én av hECT-ene med frekvensoverlapp viste frekvensmatchet hypoterm inotropi (figur 10D). Som indikert av rykningskraftkurvene i figur 10B, viste hECTs paced ved 36 ° C høyere størrelser på + dF / dt og -dF / dt (figur 10E, heltrukne linjer) enn når tempoet ved 23 ° C (stiplede linjer). Ved hECT som viste hypoterm inotropi (rød linje), var sammentrekningen og relaksasjonen mye raskere ved 36 °C til tross for lavere kraft. Når tempoet var ved 36 °C, hadde hektene også en høyere spontan slagfrekvens (figur 10F) (n = 10, p = 0,000016 for en paret t-test) og et mer ekspansivt område for fangstfrekvenser (figur 10G) (n = 9, p = 0,0000061 for en paret t-test), og oppnådde dermed 1:1-opptak ved suprafysiologiske frekvenser48 på 4,5 Hz til 6,75 Hz (figur 10C).

Figure 10
Figur 10: hECT-kontraktil dynamikk som viser temperaturavhengighet. (A) Twitch force tracing av en hECT tempoet på 1 Hz i 30 min (øverst) for å vise stabilitet i funksjonen over tid, med innsatser (nederst) som viser en forstørret visning av toppen ved 5 minutters intervaller. (B) Twitch force tracings av en hECT paced på (I) 1,5 Hz og (II) 0,75 Hz uten og med hypoterm inotropi, henholdsvis. Venstre panelsporing ble oppnådd ved 23 °C, og høyre panelsporing ble oppnådd ved 36 °C. (C) Kraft-frekvensforhold mellom hECTs (n = 6 hektar ved dag 37 post fabrikasjon over to bioreaktorer, n = 4 ved dag 52 etter fabrikasjon over to bioreaktorer) ved 23 °C (stiplede linjer) og ved 36 °C (heltrukne linjer). Hver farge representerer en hECT. (D) Kraftfrekvensforhold mellom tre hektar fra panel C som viser frekvensoverlapping ved begge temperaturer, hvorav den ene demonstrerer frekvensmatchet hypoterm inotropi (svart pilspiss). (E) +dF/dt og −dF/dt av de samme hECTene i panel D plottet over frekvenser ved 23 °C (stiplede linjer) og 36 °C (heltrukne linjer). (F) Spontan slagfrekvens av hekt ved de to temperaturforholdene (n = 10, p = 0,000016). (G) Frekvensområde med 1:1-stimulering: toppfangst (frekvensområde i denne grafen definert som maksimal fangstfrekvens - minimum fangstfrekvens) ved hver temperatur (n = 9, p = 0,000006.1). p-verdier fra paret Student t-test. Feilfelt angir standardavviket. Denne figuren ble modifisert fra van Neste27. Forkortelse: hECT = humant konstruert hjertevev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: CAD-filer for de maskinerte bioreaktordelene. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: CAD-filer for det 3D-printede SPoT-støpeapparatet. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: CAD-filer for den isolerende akrylkappen for det oppvarmede trinnet. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: AutomatedPostTracking3.vi fil for sporing av hECT-avbøyninger (protokolltrinn 5.3). Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: PostMeasurement_PB3.vi-fil for måling av stolpelengder og vevshøyder (protokolltrinn 6.2). Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: Mal for "sammendrag #.csv" (protokolltrinn 7.1), som brukes til å behandle dataene etter avbøyning. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: AnalyzeLogsGUI-mappe som inneholder MatLab-skript for behandling av data etter avbøyning (protokolltrinn 7). Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 8: Beskrivelser av variablene i MatLab-skriptutdatafilen "_datatable.txt". Linjene 10-24 er parametriseringer av rykningskraftkurven i gjennomsnitt over alle toppene i løpet av opptakets varighet (angitt i linje 25). Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S1: Video av spontant å slå hekter på innlegg med SPoT. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo F2: Video av spontant å slå hECT-er på innlegg uten SPoTs. Denne filen ble tilpasset fra van Neste27. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finnes mange lineærkonstruerte hjertevevsmodeller publisert i litteraturen, hvorav noen er beskrevet i tabell 1. Noen modeller involverer direkte måling av vevskraften, men disse krever vanligvis overføring av konstruksjonen til et eget muskelbad38. De fleste modeller er designet med vevene permanent forankret i begge ender, oftest til PDMS-innlegg 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17,18,19,20,21,
22,25,26 (eller ledninger 39), som fjerner behovet for vevsmanipulasjon, og kraften som genereres av vevet kan beregnes nøyaktig gjennom optisk sporing av endeankerfunksjonene. PDMS-innleggene utviklet av vår gruppe 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 ble designet for å støtte mellomstore vev, og disse innleggene balanserer gjennomstrømning, presise funksjonelle målinger og opprettholder viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen. Stolpene var for små til å tillate en delt støpemetode 10,13,14,18,19,20,21,24, og integrerte caps ville føre til at innleggene knakk under det kritiske protokolltrinnet 1.3.2. Uten caps kunne hECTs slippe av innleggene. I tilfeller der vevretensjonen ikke var 100%, mistet disse bioreaktorene ofte en stor andel av hektene, noe som skapte et alt-eller-ingen-problem27. Dette skjedde oftest under det kritiske protokolltrinnet 3.3.2, da hECTene ble fjernet fra bunnplatebrønnen. Hect-ene kunne noen ganger fysisk manipuleres tilbake på stolpene med hver ende av stolpen forsiktig tredd gjennom hullet i hECT; Dette var ikke bare teknisk utfordrende, men også en betydelig skadekilde som kunne påvirke den påfølgende kontraktile funksjonen negativt.

SPoTs lagt til PDMS-postdesignet tillater hECT-kultur med et bredere spenningsspekter. Dermed kan hekter med en fenotype av lav komprimering / passiv spenning (f.eks. lavt ikke-myocyttinnhold eller modeller av dilatert kardiomyopati4), som ellers ville gli av innleggene, dyrkes og evalueres med SPoTs. Omvendt sikrer hettegeometrien at hekter med høy passiv spenning (f.eks. høyt ikke-myocyttinnhold eller sykdomsmodeller med nedsatt diastolisk relaksasjon49) som har en tendens til å trekke av glatte PDMS-innlegg, holdes på plass27. I tillegg er SPoT-ene relativt unike ved at de legges til PDMS-innleggene i et andre fabrikasjonstrinn, som bare har blitt sett i en annen modell med betydelig mindre vev17. Mens SPoTs krever dette separate fabrikasjonstrinnet, tillater de samtidig tillegg av en hettegeometri med mulighet til å innlemme forskjellige materialer i hetten, for eksempel en ugjennomsiktig svart farge, magneter eller fluorescerende perler; Disse har blitt utforsket av noen andre grupper, men krever også ytterligere fabrikasjonstrinn 23,25,26.

Et annet fokus i denne artikkelen var å undersøke effekten av temperatur på hECT-funksjonen. Mens hjertekonstruerte vev har blitt brukt til å modellere mange aspekter av in vivo hjertefunksjon (f.eks. sykdomsmodellering 4,8,50,51 og legemiddelresponser 15,21,52), har temperaturavhengige effekter ikke blitt systematisk utforsket i disse modellene, så vidt vi vet. Frekvensmatchet hypoterm inotropi er både uttalt - noen ganger med en fem ganger økning i utviklet kraft - og allestedsnærværende45, som de ses hos mange pattedyrarter (rotter 46,53,54, ildere54, kaniner 55 og katter54), samt sunt og sviktende humant myokard i forskjellige aldre44. Vi fant at hECTs spontane takthastighet og rekkevidde av fangstfrekvenser ble forskjøvet til mye lavere frekvenser ved lavere temperaturer, men frekvensmatchet hypoterm inotropi var ikke alltid til stede27. I søken etter å forbedre konstruerte hjertevev gjennom fremskritt i modning13,18 og biokompleksitet56, tilbyr hypoterm inotropi en annen funksjonell fenotype av innfødt hjertemuskel som kan brukes som referanse for hjertebiofidelitet.

I lys av temperaturavhengigheten av naturlig myokard og i et forsøk på å rekapitulere det opprinnelige hjertenisjemiljøet, karakteriseres ofte konstruert vevsfunksjon ved fysiologisk temperatur. Dette er imidlertid ikke alltid mulig fordi noen systemer for å anskaffe vevsfunksjonelle data samtidig som steriliteten opprettholdes, ikke bidrar til oppvarming. Dermed kan sammenligninger av funksjon mellom vev (eller vevsmodeller) målt ved forskjellige temperaturer ikke være hensiktsmessige. Faktisk anses standardisering av testbetingelser for in vitro vevstekniske analyser som nødvendig både i regenerativ medisin57 og av reguleringsorganer som Food and Drug Administration58,59. Metodene beskrevet i denne artikkelen kan bidra til å oppnå en slik standardisering i tillegg til å muliggjøre videre studier av effekten av temperatur på hECT-funksjon27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

K.D.C. er medstifter og Chief Scientific Officer i Novoheart og har eierandel i holdingselskapet Medera Biopharmaceutical. Novoheart bidro ikke til finansiering, planlegging eller gjennomføring av denne studien; studieresultatene kan imidlertid potensielt ha en økonomisk innvirkning på Novoheart og Medera. De andre forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Dr. Timothy Cashman for tidligere arbeid med denne metoden. Denne studien ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 og K01 HL133424) og Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire McMaster Carr 6517K61 
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.7 mL Microtubes Axygen MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall) Corning 353003
10 mL Serological Pipette Drummond 6-000-010
10 N NaOH Fisher Scientific SS225-1 dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium Sigma Aldrich M0275
20 - 200 μL Micropipette Eppendorf 3123000055
200 μL MicroPipette Tips VWR 76322-150
5 mL Serological Pipette Drummond 6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 352070
6 cm Petri Dish Corning 353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator AmScope  LED-6W 
6-Well Plates Corning 353046
90 degree angle mirror Edmund Optics 45-594
Acrylic bonding glue SCIGRIP #4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack Fisher Scientific 14-673-50
Aluminum 6061 McMaster Carr 9008K82
A-Plan 10X Objective Lens ZEISS 1020-863
Autoclave Bags Propper 21002
B-27 supplement ThermoFisher 17504044
B-27 supplement (without insulin) ThermoFisher A1895601
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810 R
Black ABS Ultimaker 2.85 mm wide
Bovine Collagen I Gibco A1064401
CHIR99021 Tocris 4423
Class II Biosafety Cabinet Labconco 3430009
Clear Acrylic Sheeting estreetplastics 1002502436 6.25 mm thick
CNC Vertical Mill Haas VF-1
Conductive Graphite Bars McMaster Carr 1763T33
Dissection microscope Olympus SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix ThermoFisher 11330032
Ethanol Fisher Scientific A4094 Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter NanoEntek E1000
EVE Cell Counting Slide NanoEntek EVS-050
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10438026
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Electron Corporation 3110 AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software Autodesk AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer Reichert 1475 0.1 mm deep
HEPES Sigma Aldrich H3784
hESC qualified matrigel Corning 354277 AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera PixelLINK P7410
Inverted Microscope Carl Zeiss Werk Axiovert 40 CFL 10X phase contrast objective
IWR-1 Selleck Chem S7086
LabView Software National Instruments 2016
Laminar flow clean bench NuAire NU-201-330 necessary for hECT functional analysis
Laptop AsusTek Strix Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine Epilog Helix 24
Magnification headset ExcelBlades 70020 Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab Mathworks Version 2019b or later AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade WPI Instruments 501839
Microscope Boom Stand Olympus SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution ThermoFisher 15140122 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations Sigma Aldrich P3813 Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller Drummond 4-000-100
PixelLINK Capture OEM PixelLINK 10.2.1.6 AKA "Camera Software"
Polysulfone McMaster Carr 86735K73 translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE) McMaster Carr 8545K176  Black, molded
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media ThermoFisher 11875135
Silicone Sheeting SMI manufacturing glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads Michael's color should withstand autoclaving
Spatula Fisher Scientific 14-373 used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator  Astro-Med / Grass Technologies S88X
Stainless Steel Razoblades GEM 62-0179-CTN preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex ThermoFisher A3349401 AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water ThermoFisher 5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit Dow DOWSIL 170 2LB KIT AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit Dow DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage Okolab H401-HG-SMU Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer Ultimaker Ultimaker 3
Thiazovivin Selleck Chem S1459
Trypan Blue NanoEntek EBT-001
Vacuum Chamber Bel-Art Parts F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw Micro-Mark 82203
Variable Speed Miniature Drill Press Micro-Mark 82959
Vibration Isolation Table Labconco 3618000
Weighing Boats VWR 10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp VWR 97035-528 AKA screw clamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
  3. Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447 (2016).
  4. Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
  5. Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
  6. Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
  7. Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
  8. Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
  9. Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373 (2019).
  10. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
  14. Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
  15. Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
  16. Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
  17. Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214 (2022).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  19. Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  20. Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
  21. Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
  22. Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919 (2020).
  23. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  24. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  25. Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
  26. Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
  27. van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
  28. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  29. Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
  30. Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931 (2019).
  31. Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
  32. Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
  33. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  34. Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14 (2020).
  35. Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
  36. Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
  37. Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
  38. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
  39. Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
  40. Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
  41. Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
  42. Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
  43. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  44. Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
  45. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
  46. Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
  47. Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
  48. Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
  49. Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
  50. Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
  51. Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
  52. de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
  53. Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
  54. Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
  55. Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
  56. Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
  57. Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
  58. Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
  59. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).

Tags

Bioreaktor datainnsamling konstruert hjertevev menneskelig hjerte vevsteknikk 3D-miljø ekstracellulær matrise heterocellulær kobling spesialdesignede bioreaktorer funksjonelle vurderingsenheter robust humant konstruert hjertevev (hECT) modellsystem induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter langsgående måling av vevsfunksjon kraftfølende polydimetylsiloksan (PDMS) innlegg stabil postsporing (SPoT) optisk sporing

Erratum

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 01/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Designe en bioreaktor for å forbedre datainnsamling og modellere gjennomstrømning av konstruert hjertevev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Neste, C. C., Wiley, K. A.,… More

van Neste, C. C., Wiley, K. A., Chang, S. W., Borrello, J., Turnbull, I. C., Costa, K. D. Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues. J. Vis. Exp. (196), e64368, doi:10.3791/64368 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter