Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Summary

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten.

Abstract

Hartfalen blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, waardoor er een dringende behoefte is aan betere preklinische modellen van het menselijk hart. Tissue engineering is cruciaal voor fundamenteel wetenschappelijk hartonderzoek; in vitro menselijke celkweek elimineert de verschillen tussen soorten van diermodellen, terwijl een meer weefselachtige 3D-omgeving (bijv. met extracellulaire matrix en heterocellulaire koppeling) in vivo omstandigheden in grotere mate simuleert dan traditionele tweedimensionale cultuur op plastic petrischalen. Elk modelsysteem vereist echter gespecialiseerde apparatuur, bijvoorbeeld op maat ontworpen bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur. Bovendien zijn deze protocollen vaak ingewikkeld, arbeidsintensief en worden ze geplaagd door het falen van de kleine, delicate weefsels.

Dit artikel beschrijft een proces voor het genereren van een robuust humaan gemanipuleerd hartweefsel (hECT) modelsysteem met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten voor de longitudinale meting van de weefselfunctie. Zes hECT's met lineaire stripgeometrie worden parallel gekweekt, waarbij elke hECT wordt opgehangen aan een paar krachtgevoelige polydimethylsiloxaan (PDMS)-palen die aan PDMS-rekken zijn bevestigd. Elke post is afgedekt met een zwarte PDMS stable post tracker (SPoT), een nieuwe functie die het gebruiksgemak, de doorvoer, het vasthouden van weefsel en de gegevenskwaliteit verbetert. De vorm maakt het mogelijk om post-afbuigingen betrouwbaar optisch te volgen, wat resulteert in verbeterde twitch force tracings met absolute actieve en passieve spanning. De dopgeometrie elimineert weefselfalen als gevolg van hECT's die van de palen glijden, en aangezien ze een tweede stap na de fabricage van PDMS-rekken inhouden, kunnen de SPoT's worden toegevoegd aan bestaande PDMS-postgebaseerde ontwerpen zonder grote wijzigingen in het fabricageproces van de bioreactor.

Het systeem wordt gebruikt om het belang aan te tonen van het meten van de hECT-functie bij fysiologische temperaturen en toont een stabiele weefselfunctie tijdens data-acquisitie. Samenvattend beschrijven we een state-of-the-art modelsysteem dat belangrijke fysiologische omstandigheden reproduceert om de biotrouw, efficiëntie en nauwkeurigheid van gemanipuleerde hartweefsels voor in-vitrotoepassingen te bevorderen.

Introduction

Gemanipuleerde hartweefselmodellen zijn er in een breed scala aan geometrieën en configuraties voor het recapituleren van verschillende aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche die moeilijk te bereiken zijn met traditionele tweedimensionale celkweek. Een van de meest voorkomende configuraties is de lineaire weefselstrip^, met flexibele ankers aan elk uiteinde om zelfassemblage van weefsel te induceren en het weefsel te voorzien van een gedefinieerde voorspanning en een uitlezing van de resulterende spiertrekkingen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. De opgewekte kracht kan robuust worden bepaald door het optisch volgen van de weefselverkorting en het gebruik van de elastische bundeltheorie om de kracht te berekenen uit de gemeten doorbuigingen en de veerconstante van de ankers 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Hartweefselengineering is echter nog steeds een evoluerend vakgebied en er blijven enkele uitdagingen bestaan. Gespecialiseerde apparatuur, zoals op maat gemaakte bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur, is vereist voor elk modelsysteem 10,29,30,31. De omvang en complexiteit van de micro-omgeving van deze constructen worden vaak beperkt door een lage doorvoer als gevolg van arbeidsintensieve protocollen, grote aantallen cellen en weefselkwetsbaarheid. Om dit aan te pakken, hebben sommige groepen zich gewend tot de fabricage van microweefsels die slechts honderden of duizenden cellen bevatten om high-throughput-assays mogelijk te maken die nuttig zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Deze kleinere schaal bemoeilijkt echter de nauwkeurige beoordeling van functie¹², elimineert belangrijke aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche (zoals nutriënten/zuurstofdiffusiegradiënten en complexe architectuur³⁶) en beperkt de hoeveelheid materiaal die beschikbaar is voor latere moleculaire en structurele analyse (waarbij vaak pooling van de weefsels nodig is). Tabel 1 geeft een overzicht van enkele configuraties van lineaire weefselstripmodellen in de literatuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Groep		Cellen per weefsel	Weefsels per plaat	Formaat van de plaat		Verankeringsfunctie		Methode voor het verzamelen van functionele gegevens		Gedeelde media bad?	Functionele maat- ter plaatse?
Yoshida (ECT)38		4 miljoen	6	Gemodificeerde plaat met 6 putjes*		kracht omvormer		Directe krachtmeting		Nee	Nee
Chan (hESC-CM-ECT's)26		310 km-loop	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-berichten		Directe krachtmeting		ja	Nee
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 miljoen	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-draad		Vorm van het weefsel		Nee	ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 km-loop	8			polymeer draad		Vorm van de draad		ja	ja
Costa (enkele hECT)1, 2		1-2 miljoen	4**	Petrischaaltje van 10 cm**		PDMS-berichten		Optische afbuiging (rand-/objecttracking)		ja	ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 k-1 miljoen	6	6 cm Petrischaal		PDMS-berichten		Optische afbuiging (rand-/objecttracking)		ja	ja
Costa (multi-hECT met SPoT)		1 miljoen	6	6 cm Petrischaal		PDMS-palen met zwarte doppen		Optische afbuiging (object volgen)		ja	ja
Passier (EHT)17		245 km-loop	36	Plaat met 12 putjes		PDMS-palen met zwarte doppen		Optische afbuiging (object volgen)		ja	ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 miljoen	12	6 cm Petrischaal		PDMS-palen met doppen		Optische doorbuiging (randdetectie)		ja	ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 km-loop	6	Aangepaste schotel met 6 putjes		PDMS-palen met doppen		optische afbuiging (volgen van objecten); Calcium beeldvorming		Nee	ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 miljoen	12	Plaat met 12 putjes		PDMS-palen met doppen		optische afbuiging (randdetectie van na-afbuiging); Calcium beeldvorming		Nee	ja
Zandstra (CaMiRi)22		25 tot 150 km-loop	96	Plaat met 96 putjes		PDMS-palen met haken		Optische doorbuiging (randdetectie)		Nee	ja
Murry23, 24		900 km	24	Plaat met 24 putjes		PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet		Magnetische sensor		Nee	ja
Reich (μTUG)11, 12, 25		Ongedefinieerde	156	Schotel met 156 putjes		PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet		optische tracking (fluorescerende kraal)		ja	ja

Tabel 1: Kenmerken van enkele lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur. Lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen variëren in grootte, doorvoer, ontwerpen van verankeringskenmerken en het faciliteren van gedeelde mediumbaden, evenals de vereisten voor een afzonderlijk spierbadsysteem voor functionele karakterisering. * De onderzoekers gebruikten een in de handel verkrijgbaar gemanipuleerd weefselsysteem op basis van de afmetingen van een standaard plaat met 6 putjes. ** Een modulair systeem waarbij bioreactoren met één weefsel worden verankerd aan elk plastic kweekschaaltje in het gewenste aantal en op de gewenste locatie.

Dit artikel beschrijft het nieuwste protocol voor het vervaardigen van ons gevestigde model van lineair menselijk gemanipuleerd hartweefsel (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 en methoden voor het beoordelen van de contractiele functie van hECT. Elke multi-weefsel bioreactor biedt plaats aan maximaal zes hECT's in een gedeeld mediumbad en bestaat uit twee "rek"-stukken gemaakt van het siliconenelastomeer polydimethylsiloxaan (PDMS) gemonteerd op een stijf polysulfonframe. Elk PDMS-rek bevat zes flexibele geïntegreerde krachtdetectiepalen met een diameter van 0,5 mm en een lengte van 3,25 mm, en samen bieden twee rekken zes paar palen, die elk één hECT bevatten. Inversie van de bioreactor helpt bij het overwinnen van elke belemmering voor de visualisatie van de hECT's van onderaf als gevolg van watercondensatie van het kweekmedium of vervormingen van de meniscus van de lucht-vloeistofinterface. Elke samentrekking van een hECT veroorzaakt afbuiging van de geïntegreerde eindposten, en de optische meting van het afbuigsignaal wordt verwerkt tot een kracht-versus-tijdtracering die de contractiele functie van de hECT weergeeft 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Vergeleken met de bioreactoren met één weefsel die doorgaans worden gebruikt voor weefsels van deze grootte, verbetert het ontwerp met meerdere weefsels de experimentele doorvoer en maakt het de studie mogelijk van paracriene signalering tussen aangrenzende weefsels met een potentieel verschillende cellulaire samenstelling. Dit systeem is gevalideerd in gepubliceerde studies die toepassingen beschrijven in ziektemodellering ^4,8, paracriene signalering ^6,7, heterocellulaire cultuur ^5,9 en therapeutische screening ^7,9.

In dit systeem zijn de hECT's ontworpen om ongeveer 6 mm lang en 0,5 mm in diameter te zijn om een robuuste optische tracking van krachtmetingen met weinig ruis mogelijk te maken. Bovendien worden aspecten van weefselcomplexiteit, zoals diffusiegradiënten en cellulaire organisatie, in evenwicht gehouden met een beheersbare behoefte van 1 miljoen cellen per weefsel. Met standaard CCD-cameratechnologie genereren krachten zo zwak als 1 μN (minder dan 5 μm na afbuiging) een duidelijk signaal, zodat zelfs extreem zwakke contractiele functie, zoals waargenomen bij sommige hECT-ziektemodellen, nauwkeurig kan worden gemeten. Dit vergemakkelijkt ook de gedetailleerde analyse van de twitch-krachtcurve, waardoor de analyse met een hoog gehalte van maximaal 16 contractiliteitsmetrieken⁴¹ mogelijk wordt, waaronder ontwikkelde kracht, contractiesnelheden (+dF/dt) en ontspanning (−dF/dt), en variabiliteit van de beatsnelheid.

Dit protocol begint met instructies voor het vervaardigen van de bioreactorcomponenten. Speciale aandacht wordt besteed aan de stappen om de hECT-opbrengst te maximaliseren, de technische variabiliteit in de weefselfunctie te verminderen en de kwaliteit en diepte van de weefselbeoordeling te optimaliseren. De meeste onderzoeken naar cardiale weefselmanipulatie rapporteren geen percentages van weefselverlies tijdens fabricage en langetermijntesten, hoewel het een bekende uitdaging is in het veld en de doorvoer en efficiëntie van de onderzoeken vermindert²⁷. De hier beschreven methoden voor weefselmanipulatie zijn in de loop der jaren verfijnd om ervoor te zorgen dat alle hECT's in de meeste bioreactoren behouden blijven (ongeacht hoe de PDMS-rekken zijn vervaardigd). Maar zelfs een verlies van weefsels van 5%-20% kan de statistische power aanzienlijk beïnvloeden, vooral in kleinere experimenten die worden beperkt door het aantal beschikbare cardiomyocyten (bijv. als gevolg van differentiatie-uitdagingen met sommige zieke cellijnen⁴ of vanwege de hoge kosten van commercieel gekochte cardiomyocyten), of door de behandelingstoestand (bijv. beperkte beschikbaarheid of hoge kosten van verschillende behandelingsverbindingen).

Dit protocol beschrijft de fabricage van stabiele posttrackers (SPoT's), een nieuwe functie van de PDMS-rekken, die fungeren als doppen aan de uiteinden van de krachtgevoelige palen die de hECTs²⁷ bevatten. Er wordt gedemonstreerd hoe de dopgeometrie het hECT-verlies door vallen of aftrekken van de palen aanzienlijk vermindert, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan voor het kweken van hECT's met een grotere verscheidenheid aan stijfheden en spanningen, die moeilijk te kweken zijn op niet-afgedekte palen. Bovendien bieden de SPoT's een object met een hoog contrast om de optische tracking van de hECT-contractie te verbeteren door middel van een consistente en goed gedefinieerde vorm²⁷. Dit wordt gevolgd door een beschrijving van het kweken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en differentiatie van cardiomyocyten op basis van eerder gepubliceerde protocollen ^3,42,43 en een uitleg van hECT-fabricage, kweek en functionele metingen.

Dit artikel gaat ook in op de noodzaak om de weefselfunctie bij fysiologische temperatuur te meten. Menselijk myocardium (zowel foetaal als volwassen gezond en ziek weefsel), evenals hartweefsel van een breed scala aan diersoorten (waaronder ratten, katten, muizen, fretten en konijnen)^44,45, vertoont een duidelijke toename van de frequentie-afgestemde spiertrekkingskracht bij temperaturen van 28 °C-32 °C in vergelijking met fysiologische temperatuur - een fenomeen dat bekend staat als hypothermische inotropie^{45, 46}. okt. De effecten van temperatuur op de functie van gemanipuleerd myocardweefsel blijven echter onderbelicht. Veel recent gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur zijn ontworpen om functioneel te worden beoordeeld bij 37 °C om fysiologische omstandigheden te benaderen 13,14,37. Voor zover wij weten, zijn de temperatuurafhankelijke effecten op de kracht die wordt gegenereerd door gemanipuleerde hartweefsels echter niet systematisch onderzocht. Dit protocol beschrijft een pacing-elektrodeontwerp dat warmteverlies tijdens het testen minimaliseert, en dat de integratie van een geïsoleerd verwarmingselement in de opstelling mogelijk maakt voor functionele metingen, waardoor de hECT's op fysiologische temperatuur kunnen worden gehouden zonder de steriliteit in gevaar te brengen²⁷. Vervolgens rapporteren we enkele van de waargenomen effecten van temperatuur op de hECT-functie, inclusief op de ontwikkelde kracht, spontane klopfrequentie, +dF/dt en −dF/dt. Al met al biedt dit artikel de details die nodig zijn om dit multi-weefsel krachtgevoelige bioreactorsysteem te vervaardigen om door mensen gemanipuleerde hartweefsels te fabriceren en hun contractiele functie te beoordelen, en er wordt een reeks gegevens gepresenteerd die een vergelijkingsbasis bieden voor metingen bij kamertemperatuur en bij 37 °C²⁷.

Protocol

Dit protocol maakte gebruik van een geanonimiseerde iPSC-lijn, SkiPS 31.3 (oorspronkelijk geherprogrammeerd met behulp van dermale fibroblasten van een gezonde 45-jarige man)⁴⁷, en was dus vrijgesteld van specifieke goedkeuring door de Institutional Review Board, in overeenstemming met de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de instelling. Voer alle cel- en hECT-manipulatie uit in aseptische omstandigheden in een HEPA-gefilterde klasse II biologische veiligheidskast of laminaire flowwerkbank. Steriliseer alle niet-steriele oplossingen door filtratie door een filter van 0,22 μm en houd alle cellen en hECT's in een incubator op 37 °C, 95% relatieve vochtigheid en 5% CO₂.

1. Fabricage van bioreactoren

1. Bioreactorcomponenten en fabricage van aluminium mastercast
   OPMERKING: CAD-bestanden (Computer-aided design) zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Het protocol kan ergens tussen deze stappen worden gepauzeerd. Het wordt aanbevolen om een professionele machinist in te schakelen om de in deze sectie beschreven hoofdmatrijzen te vervaardigen, aangezien hoge toleranties (≤5 μm) en een gladde afwerking vereist zijn voor een nauwkeurige nageometrie en voor een goede perspassing van de polysulfonframes op de polytetrafluorethyleen (PTFE) grondplaten (gericht op een goede wrijvingspasvorm, maar niet te strak).
   1. Gebruik een CNC-frees (Computer Numerical Control) om de grondplaat uit PTFE te bewerken volgens de schema's in figuur 1A. De hECT's worden gevormd in de zes gelijkmatig verdeelde putjes (witte pijlen).
   2. Bewerk met behulp van een CNC-frees het polydimethylsiloxaan (PDMS) reknegatief mastergegoten uit aluminium volgens de schema's in figuur 1B, met drie framesteunen (groene sterretjes). Boor zes gelijkmatig verdeelde gaten (magenta pijlpunten) met een diameter van 0,5 mm voor het maken van de PDMS-palen.
   3. Bewerk met behulp van een CNC-frees het frame van de bioreactor uit polysulfon volgens de schema's in figuur 1C. De framesteunen (groene sterretjes) komen overeen met de framesteunen die te zien zijn in de rek (Figuur 1B, groene sterretjes).
   4. Gebruik een CNC-frees om de aluminium gegoten houder uit aluminium te bewerken volgens de schema's in afbeelding 1D. Elke sleuf bevat een driehoekige plank (oranje driehoek) die 0,25 mm hoog is om een dode ruimte te bieden voor het PDMS om door de gaten in de PDMS-rekafgietsels te stromen (Figuur 1B, magenta pijlpunten).
2. Gieten van het PDMS-rek van de aluminium negatieve masters
   1. Print met behulp van een thermoplastische 3D-printer voor gefuseerde depositiemodellering twee PDMS-beugels voor rekgietapparatuur (aanvullend bestand 1). Gebruik de volgende printinstellingen: een laaghoogte van 0,1 mm, een wand-/onder-/bovendikte van 1 mm, een vuldichtheid van 90% bij driehoeken, een printtemperatuur van 230 °C, een bouwplaattemperatuur van 70 °C en een rand voor hechting.
   2. Plaats vier aluminium negatieve mastercasts in de casthouder (Figuur 2AI) zodat de paalgaten op één lijn liggen met de dode ruimte tegenover de driehoekige planken (zie Afbeelding 1D). Wikkel het apparaat in een rechthoekig stuk siliconenfolie van 0.5 mm dik (figuur 2B, witte pijlen) als pakking om lekkage van de vloeibare PDMS te voorkomen en klem het tussen twee parallelle 3D-geprinte beugels met behulp van een schroefklem.
   3. Voeg 0,5 ml PDMS-uithardingsmiddel toe aan 5 ml PDMS-elastomeerbasis (verhouding 1:10, volgens de instructies van de fabrikant) in een ondiepe container en meng krachtig gedurende 5 minuten. Ontgas het PDMS-mengsel in een vacuümkamer en pas een sterk vacuüm (0,1-1 kPa) toe gedurende 20-60 minuten bij kamertemperatuur of totdat de belletjes verdwijnen.
   4. Giet het PDMS-mengsel op het gietapparaat en vul het te vol om ervoor te zorgen dat elke sleuf volledig wordt bedekt (Figuur 2AII). Voeg desgewenst kleine, gekleurde glaskralen toe aan het lichaam van de PDMS-rekken (Figuur 2AII), tegenover de kant met de palen (Figuur 2B), voor de unieke identificatie van elk PDMS-rek. Plaats het gietapparaat terug in de vacuümkamer (zorg ervoor dat het horizontaal waterpas staat) en pas een sterk vacuüm toe gedurende ten minste 12 uur. Laat het PDMS ongeveer 48 uur uitharden bij kamertemperatuur, uit de buurt van stof, om de volledige uitharding en maximale sterkte van de delicate stiften mogelijk te maken. Vermijd het gebruik van een oven, omdat dit de 3D-geprinte componenten vervormt.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
3. PDMS-rekverwijdering van de aluminium negatieve mastercasts
   1. Verwijder de klem, beugels en siliconenfolie van het gietapparaat. Snijd met een roestvrijstalen scheermesje de PDMS-film bovenop het gietapparaat en de framesteunen weg en gebruik voorzichtig de vingers om de PDMS-rekken van de zijkanten van de werphouder te scheiden. Steek een bot roestvrijstalen scheermesje in de dode ruimte tussen het gips en de gipshouder en wrik ze uit elkaar (Figuur 2CI, II), waarbij u ervoor zorgt dat het PDMS dat de dode ruimte vult, bij de gipshouder blijft (aangezien deze aan de palen is bevestigd). Snijd met een scherp roestvrijstalen mes de resterende PDMS-folies weg en snijd de dode ruimte PDMS uit de uiteinden van de palen (Figuur 2C III-V).
   2. KRITIEKE STAP: Maak het PDMS-rek los van het gips (Figuur 2D). Begin met de kant tegenover de palen en gebruik de vingers om het PDMS-rek langzaam van de cast te scheiden, waarbij u aan afwisselende kanten werkt totdat de palen vrij zijn van de hoofdcasts.
   3. Herhaal de vorige stap totdat alle PDMS-rekken en alle palen zijn vrijgemaakt. Gebruik een scherp scheermesje om eventueel achtergebleven overtollig PDMS uit de rekken weg te snijden. Het resultaat is een PDMS-rek (Figuur 2E) met zes intacte palen (oranje pijlpunten) en gekleurde kralen (blauwe pijl) voor identificatie.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
4. Stabiele posttracker (SPoT) fabricage
   1. Print met behulp van een thermoplastische 3D-printer voor gefuseerde depositiemodellering de componenten van het SPoT-gietapparaat (aanvullend bestand 2 en figuur 3AI, II). Gebruik de volgende printinstellingen: een laaghoogte van 0,1 mm, een wand-/onder-/bovendikte van 1 mm, een vuldichtheid van 80% met driehoeken, een printtemperatuur van 230 °C, een bouwplaattemperatuur van 70 °C en een rand voor hechting.
   2. Zorg voor een veilige perspassing tussen de 3D-geprinte stukken, evenals tussen de PDMS-rekken en de drietandige mal, en bevestig dat de PDMS-rekken goed passen met de palen die net de bodem van de putten bereiken zonder te worden gebogen. Snijd/vijl het plastic indien nodig.
   3. Voeg 0,5 ml zwart PDMS deel A toe aan 0,5 ml deel B (verhouding 1:1, volgens de instructies van de fabrikant) aan een kleine weegboot (of een vergelijkbare kleine, ondiepe container) en meng grondig tot een uniforme kleur. Ontgas de gemengde zwarte PDMS in een vacuümkamer onder sterk vacuüm gedurende 20 minuten. Giet de ontgaste zwarte PDMS op de 3D-geprinte basis om de gaten te vullen en tik om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven. Schraap zoveel mogelijk overtollig PDMS van de basis.
   4. Klik het drietandige stuk op de basis en plaats de PDMS-rekken in de groeven op de drietandige mal (Figuur 3AII, turquoise rechthoek), en zorg ervoor dat de uiteinden van de palen in het zwarte PDMS in de cirkelvormige putten duiken (Figuur 3B, C). Laat de zwarte PDMS 48 uur uitharden bij kamertemperatuur en beschermd tegen stof.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
   5. Schuif het drietandige stuk naar buiten, waardoor de spanning op de palen tot een minimum wordt beperkt. Gebruik een kleine pincet om de dunne film van zwarte PDMS die elke SPoT omringt weg te schrapen; steek vervolgens een gebogen pincet met fijne punt in de SPoT-put om deze los te maken van de 3D-geprinte basis (Figuur 3D).
   6. Inspecteer de SPoT's (Figuur 3E) en knip alle resterende zwarte PDMS-film van het gietproces die niet in stap 1.4.5 is verwijderd, weg met een fijne Vannas-schaar. Zorg ervoor dat de afgewerkte palen de juiste lengte hebben door de PDMS-rekken op het polysulfonframe te plaatsen en deze vervolgens op de zwarte grondplaat te schuiven (Figuur 4A).
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
   7. Koppel de PDMS-rekken en voeg ze toe aan het frame met behulp van de frametabs (Afbeelding 4A). Autoclaaf in een zak met een PTFE-huidplaat gedurende een cyclus van ten minste 30 minuten (<122 °C om kromtrekken te verminderen).

Figuur 1: hECT-bioreactorcomponenten. (A) Bovenaanzicht (links) en zijaanzicht (rechts) van de PTFE-grondplaat met zes gelijkmatig verdeelde putjes voor het vormen van hECT's (witte pijlen). (B) Zijaanzicht (links) en bovenaanzicht (rechts) van de aluminium negatieve mastercasts voor de PDMS-rekken met zes gelijkmatig verdeelde palen (magenta pijlpunten) en drie openingen voor bevestiging aan het frame van de bioreactor (groene sterretjes). (C) Zijaanzicht (links) en onderaanzicht (rechts) van de polysulfonframes voor de PDMS-rekken met drie gelijkmatig verdeelde framesteunen (groene sterretjes) die overeenkomen met de framesteunen in het PDMS-rek (paneel B). (D) Bovenaanzicht (boven) en zijaanzicht (onder) van de aluminium gegoten aluminium houder met vier sleuven voor de PDMS-tandheugelafgietsels, elk met een 0,25 mm hoge driehoekige plank (meest linkse plank oranje gemarkeerd). Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: hECT = human engineered heart tissue; Ø = diameter; PTFE = polytetrafluorethyleen; PDMS = polydimethylsiloxaan; R = straal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Fabricage van de PDMS-rekken. (A) CAD-renderings tonen een schuin beeld van het gietapparaat. (I) In elk van de vier sleuven van de strooiselhouder wordt een negatieve PDMS-rekmasterworp gestoken met de gaten die de PDMS-palen vormen (magenta pijlpunten) geplaatst over de dode ruimte tegenover de driehoekige plank (Figuur 1D, oranje driehoek). (II) PDMS wordt in elke holte van de negatieve mastercast gegoten. (III) Gekleurde kralen worden toegevoegd aan het niet-uitgeharde PDMS als een kleurgecodeerd identificatiesysteem. (B) Foto van het geassembleerde PDMS-rekgietapparaat, dat aan weerszijden is vastgeklemd met twee 3D-geprinte beugels die op hun plaats worden gehouden door een schroefklem en omwikkeld met 0,5 mm dikke siliconenfolie (witte pijlen) om de vastgeklemde zijkanten af te dichten. De gekleurde kralen zijn zo geplaatst dat ze de gaten met een diameter van 0,5 mm die de palen vormen (magenta pijlpunten) niet bedekken. (C) Zodra het PDMS is uitgehard, wordt het gips uit de gipshouder verwijderd. (I) Een stomp roestvrijstalen scheermesje of soortgelijk dun metalen gereedschap wordt tussen het gips en de gipshouder gestoken om het gips uit de gipshouder (II) te wrikken. (III) De folie (turquoise beugels) die wordt gevormd door het PDMS dat door de gaten van de palen stroomt, wordt aan de uiteinden van de palen bevestigd en moet met een scherp mes (IV,V) worden weggesneden. (D) Het PDMS-rek is gescheiden van het gips. (E) Foto's met schuine (boven), zijkant (midden) en onderkant (onder) aanzichten van het PDMS-rek met een glazen kraal ingebed in het lichaam voor identificatie (blauwe pijl). De uiteinden van de palen (oranje pijlpunten) zijn gemarkeerd met zwarte inkt. Schaalbalk = 1 cm. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: CAD = computer-aided design; PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: SPoT-fabricage. (A) CAD-renderings die de belangrijkste afmetingen van de (I) basis en (II) drietandig stuk van de SPoT-gietmal aangeven. De afmetingen van de cirkelvormige SPoT-vormen (AI, zwarte pijlen) zijn ingesteld op 0,2 mm diep x 1,2 mm in diameter, en elk bevat het zwarte PDMS voor een individuele SPoT. De plank van 11,1 mm x 27 mm die te zien is in het bovenaanzicht (AII, bovenaanzicht, turquoise rechthoek) wordt 0,4 mm ingedrukt (zoals te zien is in het zijaanzicht hieronder) om het PDMS-rek op zijn plaats te houden tijdens het uitharden. (B) CAD-weergave van de montage van het SPoT-gietapparaat. (C) Een foto van het geassembleerde SPoT-gietapparaat. (D) Nadat het PDMS is uitgehard, wordt de drietandige mal onder de PDMS-rekken vandaan geschoven en worden de SPoT's met een fijne pincet uit hun putten bevrijd. (E) Foto's van het PDMS-rek zonder (boven) en met (onder) SPoT's. Inzetstukken tonen vergrote weergaven van de berichten. Schaalbalken = 1 cm (E), 2,5 cm (ingezoomde afbeeldingen of E). Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: CAD = computer-aided design; Ø = diameter; PDMS = polydimethylsiloxaan; R = straal; SPoT = stabiele post tracker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Celkweek

1. Het kweken van de iPSC's
   OPMERKING: Verschillende cellijnen kunnen aanpassingen vereisen aan de doorgangsverdunning en -frequentie en/of de titratie van de mediumadditieven.
   1. Smeer een met celkweek behandelde plaat met 6 putjes in met een gekwalificeerde basaalmembraanmatrix (verdund in 1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12] volgens de instructies van de fabrikant) en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Bereid 500 ml iPSC-kweekmedium volgens de instructies van de fabrikant en voeg 5 ml penicilline-streptomycine (10.000 IE/ml tot 10.000 μg/ml) bouillonoplossing toe.
   2. Om de iPSC's te passeren, zuigt u het medium uit de putjes op en wast u elk putje één keer met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml iPSC-dissociatieoplossing per putje toe en incubeer gedurende 1 minuut in een laminaire stroomkap.
   3. Zuig de iPSC-dissociatieoplossing op en incubeer de cellen bij 37 °C (zonder medium) gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml 2 μM thiazovivine toe in iPSC-medium om de iPSC-dissociatieoplossing te neutraliseren.
   4. Gebruik een serologische pipet van 2 ml om de kolonies te dissociëren in klonten van ongeveer 10 cellen en was elk putje met een extra 1 ml 2 μM thiazovivine in iPSC-medium. Voeg 2 ml celsuspensie toe aan elk putje van de plaat dat nieuw is bedekt met basaalmembraanmatrix (stap 2.1.1).
   5. Verwijder na 24 uur het medium en voeg vers iPSC-medium toe (zonder thiazovivine). Voer de iPSC's elke 48 uur met 2 ml iPSC-medium of elke 72 uur met 4 ml medium. Vernieuw de cellen in een verdunning van 1:6 voor passaging om de 3 dagen of wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken.
      OPMERKING: Verschillende cellijnen kunnen een aanpassing van de verdunnings- en doorgangsfrequentie vereisen.
2. Differentiatie van cardiomyocyten
   1. Begin met differentiatie wanneer de iPSC-monolagen voor 80%-90% samenvloeien.
   2. Bereid het differentiatiemedium voor door 10 ml B27-supplement zonder insuline en 5 ml penicilline-streptomycine-stockoplossing toe te voegen aan 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640-medium (RPMI). Bereid het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten voor door 10 ml B27-supplement en 5 ml penicilline-streptomycine-stockoplossing toe te voegen aan 500 ml RPMI 1640.
      OPMERKING: Het differentiatiemedium en het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
   3. Dag 0: Was de cellen met 1 ml DMEM/F12 en voeg 2 ml 10 μM CHIR99021 en verdunde basaalmembraanmatrix toe in differentiatiemedium.
   4. Dag 1: Na 24 uur, of wanneer de celsamenvloeiing is afgenomen tot minder dan 70 uur, wast u de cellen met 1 ml DMEM/F12, voegt u 2 ml differentiatiemedium toe en incubeert u gedurende 48 uur.
   5. Dag 3-4: Was de cellen met 1 ml DMEM/F12 en voeg 2 ml 5 μM IWR-1 toe aan differentiatiemedium. Herhaal dit op dag 4.
   6. Dag 5-6: Was de cellen met 1 ml DMEM/F12 en voeg 2 ml differentiatiemedium toe. Herhaal dit op dag 6.
   7. Dag 7-10: Was de cellen met 1 ml DMEM/F12 en voeg 2 ml cardiomyocytenonderhoudsmedium toe. Herhaal dit elke 24 uur.
   8. Dag 11+: Vervang het medium elke 48-72 uur door 4 ml vers onderhoudsmedium voor cardiomyocyten. Zuig langzaam op en pipetteer langzaam om beschadiging van de krachtig kloppende monolagen te voorkomen.

3. hECT-cultuur

1. Oogsten van de cardiomyocyten
   1. Oogst de cardiomyocytenmonolagen voor gebruik in de hECT-fabricage 8-60 dagen na differentiatie-inductie. Verwacht 2-5 miljoen cellen per putje.
      OPMERKING: Als de cellen op dag 10 nog niet zijn begonnen met kloppen, is het onwaarschijnlijk dat de differentiatie succesvol is. Krachtig kloppende monolagen komen vaak na 11-15 dagen los in de differentiatie en verdichten zich tot dichte weefsels. Het wordt aanbevolen om dergelijke cellen op dit moment te gebruiken of opnieuw te plaatsen.
   2. Spoel elk putje cardiomyocyten 2x met 2 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA op kamertemperatuur toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 minuten tot de cellen afgerond lijken en loskomen door licht op de plaat te tikken.
   3. Voeg 1 ml 10% FBS in het onderhoudsmedium van cardiomyocyten toe aan elk putje om de dissociatie te neutraliseren. Pipeteer de monolagen voorzichtig met een serologische pipetpunt van 5 ml en breng ze over naar een conische buis van 50 ml om de pellet in klonten van 10-20 cellen te breken.
   4. Meng de celsuspensie door de conische buis om te keren voordat u 10 μL cellen overbrengt naar 10 μL trypanblauw. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of glazen hemocytometer. Scheid de celsuspensie op de juiste manier als niet alle cellen worden gebruikt of als sommige cellen worden gereserveerd voor flowcytometrie.
      OPMERKING: Aanvullende cellen (zoals fibroblasten) kunnen op dit punt worden toegevoegd.
   5. Centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten. Zuig onmiddellijk zoveel mogelijk supernatans op zonder de celkorrel te verstoren en bewaar op ijs. Werk snel om de tijd die de cellen in de pellet doorbrengen tot een minimum te beperken.
2. hECT fabricage
   1. Gebruik de volumes in tabel 2 en pas deze aan op basis van het aantal cellen in de pellet, zodat elke hECT 1 miljoen cellen bevat. Meng na elke stap door langzaam te pipetteren om luchtbellen te voorkomen.
      NOTITIE: Voer de stappen 3.2.2-3.2.3 uit afgeschermd van direct licht, aangezien sommige componenten lichtgevoelig zijn.
   2. Bereid een collageenoplossing van 2,9 g/ml type-1 in een microbuisje van 1,7 ml door 13,442 μl gedestilleerd water, 4,4 μl 10x PBS en 0,638 μl 1M NaOH toe te voegen. Voeg 25,52 μL 5 mg/ml collageenbouillonoplossing toe en meng langzaam.
   3. Bereid extracellulaire matrixmix (ECM-mix uit tabel 2): Voeg 5,5 μl 0,2 N pH 9 HEPES-oplossing toe, gevolgd door 5,5 μl 10x MEM. Meng grondig tot een uniforme lichtgele tot lichtroze kleur wordt waargenomen. Breng 35,2 μL van de ECM-mixoplossing over naar de celpellet en voeg 4,4 μL basaalmembraanmatrix toe.
   4. Open de geautoclaveerde zak met onderdelen van de bioreactor (stap 1.4.7, figuur 4A). Terwijl u handschoenen draagt die zijn gesteriliseerd met 70% ethanol, verwijdert u de zwarte huidplaat uit de autoclaafzak en plaatst u deze in een schaal van 60 mm met de putjes naar boven gericht. Pipetteer langzaam 44 μl van het celmengsel in elk putje om te voorkomen dat er belletjes ontstaan. Gebruik indien nodig de pipet om eventuele luchtbellen te verwijderen die door het pipetteren zijn ontstaan of die zijn ontstaan door de hydrofobiciteit van het PTFE. Herstel het volume van de hECT zodanig dat het oppervlak van de vloeistof gelijk ligt met de rand van de put (Figuur 4BI).
   5. Trek een nieuw paar gesteriliseerde handschoenen aan en verwijder het polysulfonframe met PDMS-rekken uit de autoclaafzak. Laat het frame zo op de grondplaat zakken dat de uiteinden van het frame in de groeven aan de uiteinden van de grondplaat passen (Figuur 4BII, III). Inspecteer de bioreactor om er zeker van te zijn dat de palen allemaal recht zijn en dat het frame niet gekanteld is voordat u deze in een schaal van 60 mm plaatst.
   6. Voeg 1 ml 10% FBS in onderhoudsmedium voor cardiomyocyten toe aan de schaal van 60 mm (zorg ervoor dat u de hECT's niet verstoort) om de luchtvochtigheid in de schaal te verhogen naarmate de hECT's stollen. Plaats de schaal van 60 mm zonder deksel in een schaal van 100 mm met een hoog profiel (20 mm hoog), dek af met een deksel van 100 mm en plaats de bioreactor terug in de incubator van 37 °C, 5% CO₂ om het collageen een gel te laten vormen met de cellen in suspensie.
   7. Haal de schaal na 2 uur uit de couveuse. Voeg 13 ml 10% FBS toe aan het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten en kantel de schaal om het medium te laten stromen tussen de PTFE-huidplaat en de PDMS-rekken.
   8. Inspecteer de bioreactor vanaf de zijkant om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen vast komen te zitten tussen de hydrofobe oppervlakken van de PTFE-grondplaat en de PDMS-rekken, en plaats de schaal terug in de incubator. Als er ingesloten lucht is, kantel dan de bioreactor uit het medium om de bel te laten breken en laat hem langzaam weer zakken, of gebruik een micropipet met een gellaadtip om de lucht over te hevelen, waarbij u ervoor zorgt dat u de palen niet verstoort.
3. Grondplaat verwijderen
   1. Inspecteer de hECT-verdichting door de opening in het frame. In de loop van 24-96 uur worden de hECT's compacter en ondoorzichtiger (Figuur 4CI-III). Zodra er een zichtbare opening is tussen de hECT's en de wand van de huidplaat (Figuur 4CII), voert u twee mediumwisselingen van het halve volume uit om het medium te veranderen in een onderhoudsmedium voor cardiomyocyten zonder FBS. Verwijder de grondplaat wanneer de hECT's ten minste 30% zijn samengeperst ten opzichte van de oorspronkelijke diameter (Figuur 4CIII). Vul de schaal van 60 mm met de bioreactor met onderhoudsmedium voor cardiomyocyten totdat de vloeistof gelijk ligt met de rand van de schaal en voeg 14 ml toe aan een nieuwe schaal van 60 mm.
   2. KRITIEKE STAP: Draai de bioreactor met steriele handschoenen om in de schaal zodat de huidplaat erop ligt (Figuur 4BIV). Inspecteer op ingesloten luchtbellen zoals beschreven in stap 3.2.8. Til de grondplaat langzaam op en houd deze waterpas (Figuur 4BV).
   3. Als een hECT eraf valt tijdens het verwijderen van de huidplaat maar in de huidplaat blijft, gebruik dan een steriele gebogen fijne pincet om de hECT van de huidplaat over te brengen naar de schaal van 60 mm. Gebruik de pincet om het uiteinde van de hECT naar zijn paal te leiden. Gebruik een tweede pincet om de paal stabiel te houden en haal deze door het gat in de hECT. Herhaal dit indien nodig voor de tweede post.
   4. Met alle hECT's aan de palen bevestigd, brengt u het frame met de hECT's over naar de nieuwe 60 mm-schotel en plaatst u het frame met de palen naar beneden gericht (Figuur 4BVI). Inspecteer de bioreactor om er zeker van te zijn dat de hECT's op hun posten blijven, net vlak bij de SPoT's.
   5. Als een hECT door oppervlaktespanning naar de basis van de palen is geduwd, stabiliseer dan het frame met een steriele gebogen pincet. Steek de andere pincet door de gleuf in het frame en houd deze gesloten. Zodra de punt van de pincet voorbij de PDMS-rekken is neergelaten, draait u deze zodat deze de paal bereikt en gebruikt u de gesloten uiteinden om de hECT voorzichtig naar het einde van de paal te duwen totdat deze op de SPoT rust (Figuur 4BVI, inzet).
4. hECT onderhoud
   1. Voer elke 24-48 uur mediumveranderingen van de helft van het volume uit met een onderhoudsmedium voor cardiomyocyten (na 2 weken kweek kan de frequentie worden teruggebracht tot twee keer per week).
   2. Wanneer de hECT's clusters van spontaan kloppen vertonen, meestal op dag 3, en gecoördineerd kloppen met zichtbare post-afbuiging op dag 5, begin dan met de functionele metingen en herhaal dit zo vaak als gewenst.
      OPMERKING: hECT's die op dag 7 nog niet zijn begonnen met gecoördineerd slaan, zullen dit waarschijnlijk helemaal niet doen.

Bestanddeel			Volume (μL)
gedistilleerd H2O			13.442			2,9 mg/ml collageenoplossing	"ECM-mix"	het uiteindelijke hECT-celmengsel
NaOH 1N			0.638
PBS 10x			4.4
5 mg/ml collageenbouillon			25.52
0,2 N pH 9 HEPES			5.5
10x MEM			5.5
Volume van het ECM-mengsel om over te brengen naar de celpellet			35.2
Volume van Matrigel			4.4

Tabel 2: hECT-reagentia. De componenten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd en op ijs worden bewaard.

Figuur 4: Assemblage van de bioreactor en fabricage van hECT. (A) (I) Twee PDMS-racks (links, lichtblauw) gemonteerd op het polysulfonframe (rechts, bruin). (II) De PTFE grondplaat (zwart, links) past dan op het frame (rechts) zodat elk paar palen in een kuil van de grondplaat past. (B) (I) Vierenveertig microliter cardiomyocytensuspensie in een extracellulaire matrix op basis van collageen wordt toegevoegd aan elk van de zes putjes van de grondplaat. (II,III) Het frame met PDMS-rekken wordt op de grondplaat geperst. Na 1-4 dagen kunnen de hECT's van de huidplaat worden verwijderd. (IV) Eerst wordt de bioreactor omgekeerd voordat (V) de grondplaat van het frame wordt getild. (VI) Zijaanzicht van de bioreactor met zes hECT's. Inzet: vergrote weergave van de hECT-positie op de palen ten opzichte van de SPoT's (inzet). (C) CAD-weergave met drie niveaus van hECT-verdichting ([I] laag, [II] gemiddeld en [III] hoog) gezien door de opening in het polysulfonframe. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: CAD = computer-aided design; PDMS = polydimethylsiloxaan; PTFE = polytetrafluorethyleen; SPoT = stabiele post tracker; hECT = menselijk gemanipuleerd hartweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. hECT-pacing-apparatuur

1. Jas voor het verwarmde podium
   1. Gebruik een lasersnijmachine om de onderdelen van de acrylisolatiemantel uit een 0.635 cm dikke doorzichtige acrylplaat te snijden (aanvullend bestand 3), één van figuur 5A-D en twee van figuur 5E, F.
   2. Monteer de onderdelen (B), (C), (D) en een van (E) uit afbeelding 5 en lijm ze aan elkaar met acryllijm zoals weergegeven in afbeelding 5GI. Bevestig het bovenpaneel (Figuur 5GII), laat de lijm enkele uren uitharden en schuif vervolgens de verwarmde tafel in de zijkant van de mantel (Figuur 5GIII).
   3. Zodra de mantel op zijn plaats zit, gebruikt u tape om de inzetstukken tussen de poten van de verwarmde tafel te bevestigen en voegt u het voorpaneel toe (Figuur 5GIV) om de montage te voltooien (Figuur 5GV).
2. Fabricage van grafietelektroden
   1. Zaag grafietstaven van 6,25 mm dik en 25 mm breed met een lintzaag in blokken van 35 mm lang; Snijd vervolgens elk blok in de lengte in een gebogen lijn, zodat elke elektrode aan het ene uiteinde 13-16 mm hoog is en aan het andere uiteinde 8-10 mm hoog. Boor twee gaten met een diameter van 0.7 mm in de bovenhoek (Figuur 6AI). Poets de stukken met keukenpapier en sonificeer 20 minuten in water om grafietstof te verwijderen. Zorg ervoor dat de elektroden tussen de wanden van de schaal en de 25 mm brede bioreactor klemmen om een constante afstand tussen de elektroden te garanderen (Figuur 6AII).
   2. Rijg een staaldraad van 150 mm lang x 0,25 mm diameter door de gaten van de elektroden en buig deze zodat deze over de lip van de schaal van 60 mm en rond de wanden van de schaal van 100 mm past, zodat het deksel kan worden gesloten (Figuur 6AII).
   3. Reinig de elektroden door ze na elk gebruik 1-2 uur in gedestilleerd water te laten weken om eventueel geabsorbeerd medium te verwijderen, een nacht te laten drogen en vervolgens gedurende 30 minuten in de autoclaaf bij 132 °C te laten autoclaveren. Voordat u met de metingen begint, plaatst u één elektrode aan weerszijden van de bioreactor (Figuur 6AII). Plaats de draden zo dat het 100 mm schaaldeksel kan worden gesloten en plaats de bioreactor terug in de incubator om in evenwicht te komen.

Figuur 5: Acrylmantel voor het isoleren van de verwarmde glazen tafel. CAD-afbeeldingen met de belangrijkste afmetingen van de stukken van de acrylmantel die zijn ontworpen voor de glazen tafel. (A) Het bovenpaneel heeft een uitsparing van 27 cm x 18,5 cm zodat de bioreactorschotel op het verwarmingselement kan zitten. De oranje rechthoeken in de hoeken geven de voorgestelde plaatsing van kleine afstandsstukken aan om ruimte te creëren tussen de bovenkant van de jas en het verwarmingselement. (B) Het onderste stuk van de jas heeft twee uitsparingen om de poten van het verwarmde podium naar binnen te laten schuiven (groene sterretjes). (C&D) Onder het bovenstuk passen twee zijpanelen. (D) Het linker zijpaneel bevat een uitsparing van 3 cm x 0,3 cm (inzet) voor het netsnoer van het podium. (E) Lange panelen passen aan de voor- en achterkant. (F) Inserts worden toegevoegd om de gaten op te vullen zodra de tafel erin zit. (G) (I) De zij- en achterpanelen worden aan het onderste stuk bevestigd en vervolgens (II) wordt het bovenste paneel toegevoegd. (III) De glazen tafel wordt in de mantel geschoven (magenta pijlen). (IV) De inzetstukken worden tussen de poten van de tafel bevestigd en de achterkant past op de opening om de doos te sluiten. (V) De voltooide mantelassemblage. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: CAD = computer-aided design; R = straal; Ø = diameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Data-acquisitie van hECT-contractie. (A) (I) Foto's van de elektroden die uit grafietstaven zijn gesneden. De magenta pijlen geven gaten aan voor het bevestigen van de roestvrijstalen draden. Schaalbalk = 1 cm. (II) Schuine aanzicht (links) en bovenaanzicht (rechts) met de plaatsing van de grafietelektroden in de bioreactor. De elektroden nemen de ruimte tussen de 25 mm brede bioreactor en de wand van de schotel in beslag om een constante afstand tussen de elektroden te garanderen. De draden zijn gebogen om het deksel van de schotel te kunnen sluiten. (B) Foto van de hECT-stimulatie-opstelling in de laminaire stroomschone bank - alle apparatuur wordt op de trillingsisolatietafel geplaatst om het trillingsgeluid van de schone bank te verminderen. De bioreactor (magenta pijlpunt) staat op het ommantelde verwarmde podium, van bovenaf verlicht door een LED-lichtbron. De ontleedmicroscoop is horizontaal gericht op een rechthoekige spiegel (oranje sterretje) om de bioreactor van onderaf te bekijken en is uitgerust met een CCD-camera (links). De turquoise beugel geeft een waterbad aan voor continue temperatuurbewaking om feedback te geven aan de verwarmde faseregelaar met gesloten lus. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: hECT = human engineered heart tissue; LED = lichtgevende diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. hECT functionele metingen

1. De pacing-werkruimte instellen
   1. Zet de verwarmde trap aan tot 39.5 °C en plaats de stimulatieapparatuur op een trillingsisolatietafel in een laminaire stroomreinigingsbank volgens afbeelding 6B. Monteer de ontleedmicroscoop op een giekstandaard en richt deze op een rechthoekige spiegel (Figuur 6B, oranje sterretje) op een laboratoriumaansluiting onder de glazen tafel om de bioreactor van onderaf te bekijken. Bevestig een high-speed CCD-camera op de microscoop en sluit deze aan op de computer. Bestraal de opstelling gedurende 15 minuten met UV-licht om de werkruimte te steriliseren.
   2. Plaats de bioreactor (Figuur 6B, magenta pijlpunt) op het ommantelde verwarmde podium, verlicht door een tweekoppige zwanenhals LED-lichtbron van bovenaf (de halzen van LED-lampen kunnen steviger aan de hoofdeenheid worden bevestigd in vergelijking met de glasvezellampen). Minimaliseer extra geluid door ervoor te zorgen dat de stimulatieapparatuur op de triltafel (en de tafel zelf) geen enkel deel van de laminaire stroomschone bank raakt.
   3. Plaats een tweede schaal van 60 mm gevuld met voorverwarmd water in een schaal van 100 mm op de verwarmde tafel (figuur 6B, turquoise beugel) en rust deze uit met een temperatuursonde voor continue temperatuurbewaking. Pas de temperatuurinstelling van de verwarmde stand naar behoefte aan om de temperatuur van de referentieschaal op 36-37 °C te houden.
   4. Stel de microscoopvergroting in op 1,5x (of een andere gewenste vergroting waarmee een hECT in zijn geheel kan worden gevisualiseerd met voldoende resolutie).
2. De camera-instellingen aanpassen
   1. Open de camerasoftware. Wijzig het formaat van de videofeed om het gezichtsveld zoveel mogelijk bij te snijden en toch een hele hECT te visualiseren. Dit maximaliseert de camerasnelheid.
   2. Stel de opnamesnelheid in op 90 frames per seconde. Pas de belichtingstijd en de positie van de lichtbron aan om de uniformiteit van de lichtomstandigheden over het hele gezichtsveld te optimaliseren en het contrast van de SPoT's te maximaliseren.
3. Installatie van acquisitiesoftware
   1. Schakel de vierkante pulsstimulator in en sluit deze aan op de computer. Pas de instellingen aan om bifasische pulsen te leveren met een amplitude van 12 V en een duur van 5 ms.
   2. Open de data-acquisitiesoftware en open vervolgens het bestand "AutomatedPostTracking3.vi" (aanvullend bestand 4). Zodra het is geladen, klikt u op de witte pijl aan de linkerkant van de werkbalk om het programma te initialiseren (Figuur 7A).
   3. Kalibreer de software met behulp van een glazen hemocytometer op het verwarmde podium. Klik in de werkbalk (Figuur 7B) op het lijngereedschap om een lijn te trekken over 1 mm van de hemocytometermarkeringen (niet afgebeeld). Stel in het vak Afstandskalibratie (pixels/mm) (Figuur 7C) de referentielengte (mm) in op 1 en klik vervolgens op de knop Berekenen .
   4. Meet de hECT-dwarsdoorsnede door het lijngereedschap te gebruiken om een lijn over de breedte van het weefsel te trekken. Klik op de 1 in het vak Dwarsdoorsnede (mm^2) (Figuur 7D) om de oppervlakte te berekenen (uitgaande van een cilindrische geometrie van de lineaire weefselstroken, zoals vastgesteld in de literatuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,15,16,18,19,20^,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Herhaal dit langs verschillende delen van de hECT en noteer de waarden onder de andere twee knoppen in de doos. Het uitvoergegevenstabelbestand rapporteert het gemiddelde van deze drie waarden om de diameter van het weefsel te berekenen.
4. hECT functionele karakterisering
   1. Zorg ervoor dat de posttips scherp zijn. Zet de drempelschakelaar aan (Figuur 7E) en pas de schuifregelaar aan (Figuur 7F) totdat de SPoT's (Figuur 7G) mooi zijn afgebakend en niet van vorm veranderen als de hECT samentrekt.
   2. Gebruik het rechthoekgereedschap om een rechthoek rond een van de SpoT's te tekenen (Figuur 7, groene rechthoek) en klik op de knop Instellen 1 in het vak Berichtgrenzen (Figuur 7H) om de rechthoekpositie rond de SPoT in te stellen, waarbij u ervoor zorgt dat de SPoT te allen tijde binnen de grens van de rechthoek blijft. Herhaal dit voor het andere bericht en neem het op onder Set 2.
   3. Pas de instellingen voor de objectgrootte aan (Figuur 7I) om te voorkomen dat het programma kleinere objecten volgt. Zorg ervoor dat het aantal objecten dat in elke rechthoek wordt gevolgd , constant blijft. De interface (Figuur 7J) toont de gemeten afstand tussen de gevolgde objecten in realtime. Gebruik deze grafiek om de ruis te monitoren.
   4. Selecteer een map om de bestanden op te slaan (Figuur 7K). Sla gegevens van verschillende dagen op in aparte mappen. Selecteer het huidige weefselnummer en schrijf de gewenste opmerkingen in het vak Opmerkingen .
   5. Geef onder de kop Pacing Frequency (Hz) (Figuur 7L) het gewenste frequentiebereik aan (Min en Max) en het gewenste interval voor het stappen van Min naar Max. Als u de hECT's over hun hele opnamebereik pact, test dan verschillende pacingfrequenties om de laagste frequentie te vinden waarbij een stimulus:piekverhouding van 1:1 wordt bereikt, en blijf de frequentie verhogen totdat die verhouding verloren gaat. Meet de spontane functie door een willekeurig frequentiebereik te kiezen (bijv. 0,01 Hz tot 0,01 Hz) en de uitgang van de vierkante pulsstimulator uit te houden.
   6. Kies in de vakken aan de rechterkant de gewenste insteltijd(en) (een tijdsinterval nadat de frequentie is ingesteld maar er geen gegevens zijn geregistreerd) om de hECT in staat te stellen zich aan te passen aan de nieuwe stimulatiefrequentie. Geef de opnametijd (s) en stimulatiespanning (V) op. Start het programma door op de knop Programma starten te klikken (Figuur 7M).
      OPMERKING: De resultaten worden automatisch opgeslagen in de geselecteerde map. Merk na elke opname op dat het script de Fouriertransformatie van de gegevens weergeeft (Figuur 7N), waarbij de pieken overeenkomen met de gedetecteerde slagfrequentie.
   7. Voer desgewenst het programma "Excitation Threshold Finding" uit om de minimale spanning te vinden die nodig is om de hECT in beeld te stimuleren (Figuur 7O). Bereken desgewenst de maximale en minimale doorbuigingen van de palen (figuur 7P).

Figuur 7: Interface voor het verzamelen van gegevens na afbuiging. (A) Knop voor het uitvoeren van de software. (B) Werkbalk met de lijn- en rechthoekgereedschappen voor respectievelijk de lengtemetingen en de objectselectie. (C) Kalibratiecontroles op afstand. (D) Instrumenten voor het meten van de hECT-dwarsdoorsnede op drie verschillende punten. (E) Drempelschakelaar en (F) schuifregelaar voor het omzetten van de videofeed in contrastrijke beelden in realtime. (G) Een SPoT zichtbaar in het voorbeeldvenster. (H) Hulpmiddelen voor het selecteren van de SPoT's. (I) Schuifregelaar voor het filteren van de objecten op grootte. (J) Grafiek die de gemeten afstand tussen de gevolgde objecten in real time weergeeft. (K) Opties voor het selecteren van de map om de uitvoerbestanden op te slaan. (L) Opties voor het instellen van het frequentiebereik, het frequentie-interval, de opnametijd en de insteltijd tussen opnames voor het post-trackingprogramma (M). (N) Grafiekuitvoer van de Fouriertransformatie van de doorbuigingscurve van de laatst opgeslagen opname. (O) Programmeer om de minimale spanning te vinden die nodig is om de hECT's te stimuleren. (P) Programma voor de berekening van de maximale en minimale doorbuiging van de palen. Afkortingen: hECT = human engineered heart tissue; SPoT = stabiele post tracker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. PDMS rack metingen

1. Onbelaste afstanden
   1. Monteer vóór de hECT-fabricage het gewenste paar PDMS-racks op een frame. Gebruik de pacing-instellingen en software beschreven in stap 5.1 voor de functionele metingen. Selecteer de stationaire SPoT's aan de uiteinden van de palen.
   2. Pas indien nodig de lichtbron en/of drempelwaarde aan om de ruis te verminderen tot <2 μm. Noteer de gemiddelde live y-waarde die in de grafiek wordt aangegeven in een spreadsheet.
2. Paalhoogtes en hECT-hoogten
   1. Verwijder de schuine spiegel en de verwarmde tafel uit de in stap 5.2 beschreven pacing-instellingen. Plaats de bioreactor direct op de laboratoriumaansluiting voor een zijaanzicht van de bioreactor.
   2. Open de camerasoftware. Pas de belichtingstijd en de positie van de lichtbron aan om de uniformiteit van de lichtomstandigheden over het gezichtsveld te optimaliseren en de zichtbaarheid van de palen te maximaliseren.
   3. Open de software voor gegevensverzameling en open vervolgens het bestand "PostMeasurement_PB3.vi" (aanvullend bestand 5). Zodra het is geladen, klikt u op de witte pijl aan de linkerkant van de werkbalk om het programma te initialiseren.
   4. Kalibreer de software met behulp van een glazen hemocytometer. Klik op het lijngereedschap in de verticale werkbalk links van het weergavevenster en trek een lijn over 1 mm van de hemocytometermarkeringen. Stel in het vak Afstandskalibratie (pixels/mm) linksonder in het scherm de referentielengte (mm) in op 1 en klik vervolgens op de knop Berekenen .
   5. Stel onder de kalibratievelden het gewenste weefselnummer (voor identificatie) in het veld Weefselnummer in. Richt de camera op de linkerpaal van de hECT en selecteer Links in het vak Paalzijde .
   6. Gebruik het lijngereedschap om een lijn te trekken van de basis van de paal (boven) naar de punt van de SPoT's (onder) en noteer door op Post Ht meten te klikken.
   7. Trek een lijn van de basis van de paal naar de uiterste rand van de hECT en noteer door te klikken op Measure Tissue Top Ht. Trek een lijn van de basis van de paal naar de dichtstbijzijnde rand van de hECT en noteer door te klikken op Tissue Base Ht meten.
   8. Draai nu de bioreactor om om de juiste paalhoogte te meten. Selecteer de juiste paaloptie om dezelfde metingen vast te leggen. Klik op de knop Toevoegen om de spreadsheet te vullen met de gemeten waarden en bereken automatisch de gemiddelde hoogte van de hECT, die in stap 7 wordt gebruikt.
   9. Als u klaar bent met het opnemen van de weefselhoogtes, klikt u op de knop Opslaan om de waarden op te slaan in een tekstbestand.

7. Functionele gegevensverwerking met behulp van aangepaste analysescripts

1. Vul in een spreadsheet-editor het overzichtsbestand in met behulp van het sjabloon (aanvullend bestand 6). Gebruik de waarden voor de lengte van de paal en de gemiddelde weefselhoogte die in stap 6.2 zijn verkregen. Zorg ervoor dat alle hECT's met gegevens in de map worden weergegeven in het overzichtsbestand. Noem het bestand "samenvatting #.csv", waarbij # verwijst naar het aantal dagen in het experiment.
   OPMERKING: De hECT-functionele gegevens moeten zich in aparte mappen bevinden, afhankelijk van de experimentdag.
2. Zorg ervoor dat de map met de AnalyzeLogsGUI-scripts (aanvullend bestand 7) en de map met de hECT-opnamen beide aan het pad zijn toegevoegd.
3. Open de data-analysesoftware. Klik links van de mapbalk op de knop Bladeren naar map om naar de bovenliggende map te navigeren die zowel de map AnalyzeLogsGUI als de functionele hECT-gegevens bevat. Klik in de zijbalk van het huidige venster met de rechtermuisknop op deze mappen om toe te voegen aan pad | Voeg geselecteerde mappen en submappen toe.
4. Open het bestand "AnalyzeLogsGui_SC.m". Druk op het tabblad Editor op de knop Uitvoeren en wacht tot de grafische gebruikersinterface (GUI) in een nieuw venster verschijnt.
   1. Klik in het vak Logboekselectie (Figuur 8AI) op de knop Directory selecteren en navigeer naar de map met de hECT-functiegegevens. Selecteer de gewenste hECT die moet worden verwerkt in het vervolgkeuzemenu Weefsel .
   2. Voer in het vak Gegevensinvoer (Figuur 8AII) de onbelaste afstand tussen de palen in die zijn geregistreerd in stap 6.1 in het veld Diastolische afstand . Voer 0.25 in het veld Straal van de paal (mm) in.
   3. Kies in het vak Analysis Constraints (Figuur 8AIII) de frequenties die u uit de analyse wilt weglaten of selecteer specifieke frequenties die u wilt opnemen (gescheiden door komma's). De begintijd en eindtijd zijn standaard ingesteld op respectievelijk 0 en −1 om de gehele lengte van de opnames te verwerken. Wijzig deze waarden om de opnamen indien nodig in te korten.
   4. Wijzig de filterparameters (Figuur 8AIV) van Polynomial Order en Frame Size om het niveau van afvlakking tijdens het filterproces te wijzigen en de schuifregelaar Peak Detection Threshold om de minimale piekgrootte in te stellen die door de scripts wordt herkend.
      OPMERKING: Het script bevat de optie Spike verwijderen, die hoge pieken clipt die worden veroorzaakt door artefacten; Dit wordt echter niet aanbevolen, omdat het de vorm van de spiertrekkingen verandert. Verwijder artefacten door in plaats daarvan de opname bij te snijden (Afbeelding 8AIII).
   5. Gebruik extra opties (Afbeelding 8AV) voor aanvullende uitvoer van gegevensanalyse: Post-deflectieanalyse om een extra algoritme voor piekdetectie uit te voeren, Y-as automatisch schalen op zoomplots om de assen op de twitch-krachtcurve automatisch aan te passen (Afbeelding 8B), Force-trace-curven opslaan om elke twitch-krachtfiguur op te slaan in een . fig-bestand en Force-time-gegevens opslaan om de X- en Y-coördinaten op te slaan van de gefilterde gegevens die zijn uitgezet in de figuur van de Twitch-krachtcurve.
   6. Klik op Analyse uitvoeren om een .txt bestand te genereren dat de attributen bevat van de twitch-krachtcurve (aanvullend bestand 8) gemiddeld over een hele opname.

Figuur 8: Berekeningen van de Twitch-krachtcurve. (A) Als u het bestand "AnalyzeLogsGUI.m" uitvoert in de gegevensverwerkingssoftware, wordt het GUI-venster geopend. (I) Met het vak Log Selection kan de gebruiker de map selecteren voor de map met de hECT functionele gegevens. Het veld Dagnummer wordt automatisch ingevuld op basis van de titel van het overzichtsbestand dat is gemaakt in protocolstap 7.1. De te verwerken hECT wordt geselecteerd met behulp van het vervolgkeuzemenu Weefsel . (II) Het vak Gegevensinvoer bevat informatie over het paar PDMS-palen dat de hECT ondersteunt, zoals de onbelaste afstand (verkregen in protocolstap 6.1) en de straal van de paal (0,25 mm). (III) In het vak Analysis Constraints kan de gebruiker kiezen welke frequenties hij wil weglaten of opnemen en de opnamen inkorten. (IV) Het vak met filterparameters bevat de opties om te kiezen hoe de ruwe trilkrachtcurve wordt gefilterd. Polynomiale volgorde en framegrootte wijzigen het niveau van afvlakking tijdens het filterproces. De schuifregelaar Drempelwaarde voor piekdetectie bepaalt de minimale piekgrootte die door de scripts wordt herkend. Met de optie Spike verwijderen worden hoge pieken geknipt die worden veroorzaakt door artefacten. (V) Extra opties zijn onder meer Post-deflectieanalyse, waarmee een extra algoritme voor piekdetectie wordt uitgevoerd, Y-as automatisch schalen op zoomplots, die inwerkt op de twitch-krachtcurve, Force-trace-curven opslaan, waarmee de twitch-krachtcijfers worden opgeslagen, en Force-time-gegevens opslaan, waarmee de geplotte twitch-force-krachtgegevens worden opgeslagen. (B) Voorbeeld van de trilkrachtcurve van een opname van 30 seconden van een hECT-tempo op 1 Hz, geproduceerd door de GUI-schermafbeelding van paneel A. De rode trilkrachtcurve toont de gefilterde kracht die wordt geproduceerd door de parameters in AIV, gesuperponeerd op de ruwe trilkrachtcurve (donkerblauwe curve, verschijnt wanneer de optie Ongefilterde gegevens weergeven in AV is geselecteerd). Afkortingen: hECT = human engineered heart tissue; GUI = grafische gebruikersinterface; PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Volgens het bovenstaande protocol werden cardiomyocyten gegenereerd uit een gezonde iPSC-lijn die eerder door onze groep ^9,15 werd gebruikt en na 8-61 dagen in kweek tot hECT's gefabriceerd. Figuur 9A toont representatieve beelden van hECT's van onderaf, die zijn gemaakt zonder (boven) en met (onder) SPoT's. Functionele metingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 °C) en bij fysiologische temperatuur (36 °C) tussen 37 dagen en 52 dagen na hECT-fabricage. Bij de fabricage van de PDMS-rekken hebben we gedocumenteerd dat een ervaren gebruiker een rendement van 80% kan verwachten in PDMS-rekken met alle zes palen intact en een totale opbrengst van 95% van ten minste vijf palen (gebaseerd op drie gebruikers in ons laboratorium), met <3% variabiliteit in paalhoogte.

De SPoT's leverden een enkele gedefinieerde vorm op om te volgen tijdens de gegevensverzameling (Figuur 9B en aanvullende video S1) in vergelijking met de gefragmenteerde vormen van de markeerinkt, die niet goed hecht aan de uiteinden van de PDMS-palen (aanvullende video S2)²⁷. In sommige extreme gevallen kan het volgobject zelfs worden verduisterd (Figuur 9C, bovenste rij). Deze onregelmatigheden introduceren veel ruis die de trilkrachtcurve verdoezelt, waardoor de nauwkeurige meting van de ontwikkelde krachten onder 10 μN wordt verhinderd. Om dit te corrigeren en ervoor te zorgen dat deze vormen consistent worden gevolgd, zijn doorgaans veel aanpassingen van de belichtingshoek en -positie nodig om het contrast en de helderheid te optimaliseren. De duisternis en regelmaat van de SPoT-vormen stroomlijnen dit proces, waardoor de acquisitietijd met ongeveer 50% wordt verkort (van ~12-30 min tot 5-10 min per hECT voor een typisch opnamebereik van 1 Hz tot 4 Hz). Bovendien zorgden de SPoT's in dit werk voor een betrouwbaardere vorm voor optische tracking, en de vermindering van ruis maakte het mogelijk om zwakke weefsels te meten met een ontwikkelde kracht van slechts 1 μN, wat neerkomt op een postafbuiging van minder dan 5 μm (Figuur 9D), evenals het verminderen van de variabiliteit tussen de metingen van dezelfde hECT²⁷.

Onze ervaring is dat monsterverlies in longitudinale experimenten meestal optreedt als gevolg van het wegglijden van de hECTS van de uiteinden van de omgekeerde PDMS-palen. Dit afglijden van de hECT's treedt meestal op bij het verwijderen van de hECT's van de huidplaat (Figuur 4BV, 1-4 dagen na hECT-fabricage) of zelfs later in het experiment (1-3 weken na hECT-fabricage) naarmate de hECT's compacter en volwassen worden. Deze rijping van de hECT's oefent soms voldoende passieve en actieve spanning uit op de flexibele palen om de hECT's zichzelf van het uiteinde van een paal te laten trekken, wat resulteert in een nutteloze klomp weefsel die rond de tegenoverliggende paal is samengeperst (Figuur 9E). De SPoT's bieden een dopgeometrie die hECT-verlies voorkomt (Figuur 9F), zoals gekwantificeerd in Figuur 9G. Voor de 103 bioreactoren die in de loop van 2 jaar werden gemaakt (elk met drie tot zes hECT's aan het begin), behielden de PDMS-rekken zonder SPoT's gemiddeld 95% van de hECT's in 66 bioreactoren. Hoewel de meeste bioreactoren geen weefselverlies hadden, verloren sommige bioreactoren 30%-100% van de hECT's (vaak wanneer een enkele bioreactor een hele experimentele groep vertegenwoordigt), wat resulteerde in aanzienlijke inefficiëntie. In dit werk hebben de SPoT's het hECT-verlies effectief geëlimineerd, waardoor het retentiepercentage aanzienlijk werd verbeterd tot 100% in 37 bioreactoren (p = 0,038)²⁷.

Figuur 9: Verbetering van de kwaliteit van de gegevens na afbuiging en verhoging van de hECT-retentie door toevoeging van SPoT's aan de PDMS-berichten. (A) Onderaanzicht van hECT's zonder (boven) of met (onder) SPoT's. (B,C) Close-upbeelden van het ene uiteinde van een hECT op een paal, gezien van onder de bioreactor, met de drempelinstellingen in de rechterkolom hetzelfde als tijdens het verzamelen van gegevens. De rode vakjes geven objecten aan die kunnen worden gevolgd door de post-trackingsoftware. (B) Vergelijking van de traceerbare fiduciale markers op een paal met markerinkt versus SPoT. (C) Ontspannen en samengetrokken hECT's op palen met markeerinkt (bovenste twee rijen) of met SPoT's (onderste twee rijen). (D) Voorbeeld van een twitch force tracing van een hECT elektrisch gepacificeerd bij 1 Hz kloppend met een ontwikkelde kracht van 1 μN, overeenkomend met een afbuiging van minder dan 5 μm (groenblauw: ongefilterd spoor; magenta: gefilterd spoor). (E) Schuin zicht van een bioreactor zonder SPoT's waar hECT's van een van hun palen gleden, wat resulteerde in een klomp weefsel die zich rond de tegenoverliggende paal vormde (turquoise pijlpunten). (F) Foto van een bioreactor met SPoT's die 100% hECT-retentie laten zien. (G) Dot plot met de weefselretentie per bioreactor voor PDMS-racks (elk met drie tot zes hECT's) zonder SPoT's (n = 322 hECT's, 66 bioreactoren) en PDMS-racks met SPoT's (n = 134 hECT's, 37 bioreactoren), inclusief gegevens van bioreactoren met weefselfalen tijdens het verwijderen van de huidplaat (dag 1-4) en later in het kweekproces (dag 4-15). *p = 0,038; Diamant geeft het gemiddelde aan. Schaalbalken = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkortingen: hECT = human engineered heart tissue; SPoT = stabiele post tracker; GUI = grafische gebruikersinterface; PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als voorbeeldtoepassing van bovenstaande methoden tonen we ook het belang aan van het meten van de hECT-functie bij fysiologische temperatuur (36 °C) in plaats van bij kamertemperatuur (23 °C). De hECT-functie bleek stabiel te zijn gedurende een langere kweektijd in de huidige stimulatie-opstelling met de verwarmde fase (Figuur 10A)²⁷. Vergeleken met metingen bij fysiologische temperatuur vertoonden hECT's een veranderde contractiedynamiek bij kamertemperatuur, met langzamere contractie- en ontspanningssnelheden (aangegeven door de hellingen van de pieken in figuur 10B).

In dit werk vertoonde 1 op de 10 hECT hypothermische inotropie (waarbij de ontwikkelde kracht hoger was bij 23 °C dan bij 36 °C), maar alleen bij lage frequenties. Wanneer de hECT op 1,5 Hz werd afgewerkt, had deze een sterker ontwikkelde kracht bij 36 °C (geen onderkoelde inotropie) en volledige ontspanning tussen spiertrekkingen (vlakke interpiekgebieden van de spiertrekkingskrachtcurve, rechterpaneel) maar onvolledige ontspanning tussen contracties bij 23 °C (verhoogde passieve kracht tussen pieken, linkerpaneel) (Figuur 10BI). Wanneer de hECT op 0,75 Hz werd uitgevoerd, was er sprake van hypothermische inotropie (Figuur 10BII) en werd waargenomen dat de hECT zich volledig ontspande tussen de weeën, zelfs bij 23 °C (linkerpaneel). Definitieve frequentie-afgestemde vergelijkingen van de hECT-functie waren echter een uitdaging omdat het opnamebereik van de meeste hECT's minimale overlap tussen temperaturen vertoonde (Figuur 10C). Dit was grotendeels te wijten aan de lage maximale opnamefrequentie bij 23 °C (meestal ≤1,5 Hz) en de hoge minimale opnamefrequentie van hECT's bij 36 °C (meestal ≥ 1,5 Hz) (figuur 10D); deze beperkingen worden niet gezien bij het native myocardium (getest bij 28 °C en 37 °C), aangezien het native ventriculaire myocardium niet spontaan klopt⁴⁶. Slechts één van de hECT's met frequentieoverlap vertoonde frequentie-afgestemde hypothermische inotropie (Figuur 10D). Zoals aangegeven door de trilkrachtcurven in figuur 10B, vertoonden hECT's met een tempo van 36 °C hogere magnitudes van +dF/dt en −dF/dt (Figuur 10E, ononderbroken lijnen) dan wanneer ze werden gepaced op 23 °C (stippellijnen). In de hECT die onderkoelde inotropie vertoonde (rode lijn), waren de samentrekking en ontspanning veel sneller bij 36 °C, ondanks de lagere kracht. Bij een tempo van 36 °C hadden hECT's ook een hogere spontane beatfrequentie (Figuur 10F) (n = 10, p = 0,000016 voor een gepaarde t-toets) en een uitgebreider bereik van opnamefrequenties (Figuur 10G) (n = 9, p = 0,0000061 voor een gepaarde t-toets), waardoor 1:1 opname werd bereikt bij suprafysiologische frequenties⁴⁸ van 4,5 Hz tot 6,75 Hz (Figuur 10C).

Figuur 10: hECT-contractiele dynamiek die temperatuurafhankelijkheid aantoont. (A) Twitch-krachttracering van een hECT met een tempo van 1 Hz gedurende 30 minuten (boven) om stabiliteit in de functie in de loop van de tijd weer te geven, met inzetstukken (onder) die een vergroot beeld van de bovenkant tonen met tussenpozen van 5 minuten. (B) Twitch-krachttraceringen van een hECT met respectievelijk (I) 1,5 Hz en (II) 0,75 Hz zonder en met onderkoelde inotropie. De traceringen van de linkerpanelen werden verkregen bij 23 °C en de traceringen van de rechterpanelen werden verkregen bij 36 °C. (C) Kracht-frequentierelatie van hECT's (n = 6 hECT's op dag 37 na fabricage in twee bioreactoren, n = 4 op dag 52 na fabricage in twee bioreactoren) bij 23 °C (stippellijnen) en bij 36 °C (ononderbroken lijnen). Elke kleur vertegenwoordigt één hECT. (D) Kracht-frequentierelaties van drie hECT's van paneel C die frequentieoverlap bij beide temperaturen aantonen, waarvan er één frequentie-afgestemde hypothermische inotropie aantoont (zwarte pijlpunt). (E) +dF/dt en −dF/dt van dezelfde hECT's in paneel D , uitgezet over frequenties bij 23 °C (stippellijnen) en 36 °C (ononderbroken lijnen). (F) Spontane slagsnelheid van hECT's bij de twee temperatuuromstandigheden (n = 10, p = 0,000016). (G) Frequentiebereik met 1:1 stimulatie:piekopname (frequentiebereik in deze grafiek gedefinieerd als maximale opnamefrequentie - minimale opnamefrequentie) bij elke temperatuur (n = 9, p = 0,000006,1). p-waarden van de gepaarde t-toets van de student. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van van Van Neste²⁷. Afkorting: hECT = human engineered heart tissue. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: CAD-bestanden voor de machinaal bewerkte bioreactoronderdelen. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: CAD-bestanden voor het 3D-geprinte SPoT-gietapparaat. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: CAD-bestanden voor de isolerende acrylmantel voor het verwarmde podium. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: AutomatedPostTracking3.vi bestand voor het opsporen van hECT-doorbuigingen (protocolstap 5.3). Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: PostMeasurement_PB3.vi-bestand voor het meten van de lengte van de paal en de hoogte van de weefsels (protocolstap 6.2). Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Sjabloon voor "samenvatting #.csv" (protocolstap 7.1), dat wordt gebruikt voor de verwerking van de gegevens na afbuiging. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: AnalyzeLogsGUI-map met MatLab-scripts voor het verwerken van de post-deflectiegegevens (protocolstap 7). Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 8: Beschrijvingen van de variabelen in het MatLab script output "_datatable.txt" bestand. Lijnen 10-24 zijn parametrisaties van de trilkrachtcurve gemiddeld over alle pieken gedurende de duur van de opname (aangegeven in regel 25). Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S1: Video van het spontaan verslaan van hECT's op palen met SPoT's. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S2: Video van het spontaan verslaan van hECT's op berichten zonder SPoTs. Dit bestand is een bewerking van van Neste²⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Er zijn tal van lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen gepubliceerd in de literatuur, waarvan sommige worden beschreven in tabel 1. Sommige modellen omvatten de directe meting van de weefselkracht, maar deze vereisen meestal het overbrengen van het construct naar een apart spierbad³⁸. De meeste modellen zijn ontworpen met de weefsels permanent verankerd aan beide uiteinden, meestal aan PDMS-palen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^,17,18,19,20,21,
22,25,26 (of draden³⁹), waardoor weefselmanipulatie niet meer nodig is, en de kracht die door de weefsels wordt gegenereerd, nauwkeurig kan worden berekend door de optische tracking van de eindankerfuncties. De PDMS-palen die door onze groep 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 zijn ontwikkeld, zijn ontworpen om middelgrote weefsels te ondersteunen, en deze posten balanceren de doorvoer, nauwkeurige functionele metingen en het behoud van belangrijke aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche. De palen waren te klein om een gesplitste gietmethode 10,13,14,18,19,20,21,24 mogelijk te maken, en geïntegreerde doppen zouden ervoor zorgen dat de palen zouden breken tijdens de kritieke protocolstap 1.3.2. Zonder doppen zouden de hECT's van de palen kunnen glijden. In gevallen waarin de weefselretentie niet 100% was, verloren die bioreactoren vaak een groot deel van de hECT's, waardoor een alles-of-niets-probleem ontstond²⁷. Dit gebeurde het vaakst tijdens de kritieke protocolstap 3.3.2, toen de hECT's uit hun grondplaatput werden verwijderd. De hECT's konden soms fysiek terug op de palen worden gemanipuleerd, waarbij elk uiteinde van de paal zorgvuldig door het gat in de hECT werd geregen; Dit was niet alleen technisch uitdagend, maar ook een belangrijke bron van schade die een negatieve invloed zou kunnen hebben op de daaropvolgende contractiele functie.

SPoT's die aan het PDMS-postontwerp zijn toegevoegd, maken hECT-cultuur mogelijk met een breder spanningsbereik. Zo kunnen hECT's met een fenotype van lage verdichting/passieve spanning (bijv. laag gehalte aan niet-myocyten of modellen van gedilateerde cardiomyopathie⁴), die anders van de palen zouden glijden, worden gekweekt en geëvalueerd met de SPoT's. Omgekeerd zorgt de kapgeometrie ervoor dat hECT's met een hoge passieve spanning (bijv. een hoog gehalte aan niet-myocyten of ziektemodellen met verminderde diastolische ontspanning⁴⁹) die de neiging hebben om gladde PDMS-palen los te trekken, op hun plaats worden gehouden²⁷. Bovendien zijn de SPoT's relatief uniek omdat ze in een tweede fabricagestap aan de PDMS-posten worden toegevoegd, wat alleen is gezien in één ander model met aanzienlijk kleinere weefsels¹⁷. Hoewel de SPoT's deze afzonderlijke fabricagestap vereisen, maken ze het mogelijk om tegelijkertijd een dopgeometrie toe te voegen met de mogelijkheid om verschillende materialen in de dop op te nemen, zoals een ondoorzichtige zwarte kleur, magneten of fluorescerende kralen; Deze zijn door enkele andere groepen onderzocht, maar vereisen ook aanvullende fabricagestappen 23,25,26.

Een ander aandachtspunt van dit artikel was het onderzoeken van de effecten van temperatuur op de hECT-functie. Hoewel cardiale weefsels zijn gebruikt om veel aspecten van de in vivo hartfunctie te modelleren (bijv. ziektemodellering ^4,8,50,51 en geneesmiddelreacties 15,21,52), zijn temperatuurafhankelijke effecten voor zover wij weten niet systematisch onderzocht in deze modellen. Frequentie-afgestemde hypothermische inotropie is zowel uitgesproken - soms met een vijfvoudige toename van de ontwikkelde kracht - als alomtegenwoordig⁴⁵, zoals ze worden gezien bij tal van zoogdiersoorten (ratten 46,53,54, fretten ⁵⁴, konijnen⁵⁵ en katten⁵⁴), evenals gezond en falend menselijk myocardium van verschillende leeftijden⁴⁴. We ontdekten dat de spontane hartslag van hECT en het bereik van de opnamefrequenties werden verschoven naar veel lagere frequenties bij lagere temperaturen, maar frequentie-afgestemde hypothermische inotropie was niet altijd aanwezig²⁷. In de zoektocht om gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren door vooruitgang in rijping^13,18 en biocomplexiteit⁵⁶, biedt hypothermische inotropie een ander functioneel fenotype van de inheemse hartspier dat kan worden gebruikt als een benchmark voor cardiale biotrouw.

In het licht van de temperatuurafhankelijkheid van het oorspronkelijke myocardium en in een poging om de oorspronkelijke cardiale niche-omgeving te recapituleren, wordt de functie van gemanipuleerd weefsel vaak gekarakteriseerd bij fysiologische temperatuur. Dit is echter niet altijd mogelijk omdat sommige systemen voor het verkrijgen van functionele weefselgegevens met behoud van steriliteit niet bevorderlijk zijn voor verhitting. Vergelijkingen van de functie tussen weefsels (of weefselmodellen) gemeten bij verschillende temperaturen zijn dus mogelijk niet geschikt. Standaardisatie van testomstandigheden voor in vitro weefselmanipulatietests wordt inderdaad noodzakelijk geacht, zowel in de regeneratieve geneeskunde⁵⁷ als door regelgevende instanties zoals de Food and Drug Administration^58,59. De methoden die in dit artikel worden beschreven, kunnen bijdragen tot een dergelijke standaardisatie en kunnen bovendien verder onderzoek naar de effecten van temperatuur op de hECT-functie mogelijk^{maken 27}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp