Summary
Kompostmikrokosmos bringer det mikrobielle mangfoldet som finnes i naturen inn i laboratoriet for å lette mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Forutsatt her er protokoller for å sette opp mikrokosmoseksperimenter, med forsøkene som demonstrerer evnen til å modulere miljømikrobielt mangfold for å utforske forholdet mellom miljømikrobielt mangfold og ormens tarmmikrobiomsammensetning.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig modell for å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for interaksjoner mellom verter og deres tarmmikrobiomer. Mens eksperimenter med godt karakteriserte bakterier eller definerte bakteriesamfunn kan lette analysen av molekylære mekanismer, er det viktig å studere nematoder i deres naturlige mikrobielle sammenheng for å utforske mangfoldet av slike mekanismer. Samtidig er isolering av ormer fra naturen ikke alltid mulig, og selv når det er mulig, begrenser prøvetaking fra naturen bruken av det genetiske verktøysettet som ellers er tilgjengelig for C. elegans forskning. Følgende protokoll beskriver en metode for mikrobiomstudier som benytter kompostmikrokosmos for vekst i laboratoriet i mikrobielt forskjellige og naturlige miljøer.
Lokalt hentet jord kan berikes med råvarer for å diversifisere de mikrobielle samfunnene der ormer heves og hvorfra de høstes, vaskes og overflatesteriliseres for etterfølgende analyser. Representative eksperimenter demonstrerer evnen til å modulere det mikrobielle samfunnet i en felles jord ved å berike det med forskjellige produkter og videre demonstrere at ormer oppvokst i disse forskjellige miljøene samler lignende tarmmikrobiomer som er forskjellige fra deres respektive miljøer, og støtter forestillingen om et artsspesifikt kjernemikrobiom. Samlet sett gir kompostmikrokosmos naturlige laboratoriemiljøer for mikrobiomforskning som et alternativ til syntetiske mikrobielle samfunn eller til isolering av ville nematoder.
Introduction
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig modell for å studere interaksjoner mellom verter og deres tarmmikrobiomer 1,2. Som modell gir det flere fordeler. For det første er bakteriefrie eller gnotobiotiske dyr enkle å skaffe og vedlikeholde; Blekemiddel kan brukes til å drepe gravid ormer og tilhørende mikrober, slik at deres blekemiddelresistente egg uskadd vokser som alderssynkroniserte populasjoner som kan koloniseres av bakterier av interesse 3,4. I tillegg, når de vokser i nærvær av bakterier, inntar C. elegans, en bakterivor, de oppståtte bakteriene, med følsomme arter fordøyd eller utskilt, mens resistente og vedvarende arter stabilt koloniserer ormens tarm. Videre er C. elegans for det meste hermafrodittiske, og produserer populasjoner av genetisk identisk avkom, noe som reduserer forvirrende genetisk variasjon. Sammen med tilgjengeligheten av mutante og transgene ormstammer, tilbyr arbeid med C. elegans forskere en gnotobiotisk og genetisk trekkbar modell for å undersøke molekylære grunnlaget for vert-mikrobe-interaksjoner 5,6,7,8.
Mens eksperimenter med godt karakteriserte bakterier kan lette analysen av molekylære mekanismer, er det viktig å identifisere og studere bakteriene som ormer samhandler med i naturen, for å utforske mangfoldet av slike mekanismer, unraveling den naturlige konteksten for deres funksjon og forstå de selektive kreftene som har formet deres evolusjon. Utenfor laboratoriet finnes C. elegans globalt i fuktige tempererte klimaer, hvor populasjoner antas å gjennomgå en "boom-and-bust" livssyklus, preget av rask befolkningsvekst når ressursene er rikelig, etterfulgt av et utviklingsskifte til banebrytende, stresstolerante dauers når ressursene er utarmet9. Selv om det betraktes som en jordnematode, er viltvoksende C. elegans-populasjoner oftest funnet fôring på nedbrytende organisk materiale som råtnende blomster eller frukt, hvor bakteriepopulasjoner er rikelig og mangfoldig.
Studier av tarmmikrobiomet i nematoder isolert fra naturen har identifisert forskjellige, men karakteristiske, bakterielle samfunn 10,11, hvis sammensetning ble ytterligere støttet av studier utført med ormer oppvokst i naturlige mikrokosmosmiljøer 12,13. Sammen muliggjorde slike studier avgrensningen av et kjerneorm-tarmmikrobiom2. Mens prøvetaking av C. elegans populasjoner i naturen representerer den mest direkte undersøkelsen av naturlige orm-mikrobe-interaksjoner, er det ikke mulig overalt og når som helst, da det er begrenset til regioner og årstider med rikelig nedbør10,11. Alternativt, i stedet for å isolere ormer fra deres naturlige habitat, bringer eksperimenter ved hjelp av mikrokosmos det naturlige habitatet inn i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmosmiljøer fremstilles fra jord kompostert med ulike frukter eller grønnsaker, noe som muliggjør ytterligere diversifisering av startjordsamfunnet. De tilbyr trekkbare eksperimentelle metoder som kombinerer det mikrobielle mangfoldet og det tredimensjonale ville jordmiljøet med de eksperimentelle fordelene ved et kontrollert laboratorieanlegg og genetisk definerte ormstammer. Protokollen nedenfor beskriver trinnene som er involvert i å jobbe med kompostmikrokosmos, og demonstrerer deres bruk for å forstå samlingen av et karakteristisk ormtarmmikrobiom fra forskjellige miljøer.
Protocol
1. Tilberedning av kompost
- Skaff kompost eller hagejord fra en hvilken som helst praktisk kilde og oppbevar inne i laboratoriet i en standard kjøkkenplastbeholder med hull kuttet i lokket for å slippe inn luft. Plugg hullene med bomullsull for å holde bananfluer og andre virvelløse dyr ute (figur 1A).
MERK: Fem hundre gram jord (montering i en 1,5 gallon beholder, dimensjoner: 30 cm x 20 cm x 10 cm) vil gi nok materiale til 12 mikrokosmos. - Berik komposten eller jorda med hakkede produkter eller en blanding av forskjellige produkter i et 1: 2 masseforhold mellom råvarer og jord.
- Inkuber i 7-14 dager ved 20-25 °C, bland en gang daglig og tilsett M9-medium etter behov for å opprettholde fuktighet uten å gjøre det gjørmete.
MERK: Jord som ikke er beriket med råvarer, støtter vanligvis ikke C. elegans vekst, men hvilke spesifikke produkter som skal brukes, er opp til forskeren, med mange typer og blandinger som er i stand til å støtte ormvekst. Anrikning med forskjellige produkter vil fremme bakteriell samfunnsdiversifisering på forskjellige måter, noe som gjør det mulig å studere tarmmikrobiommontering fra forskjellige utgangspunkt (se diskusjonsdelen).
2. Fremstilling av kompostmikrokosmos
- For hvert mikrokosmos tilsettes 10 g beriket kompost til et 30 ml glassbeger dekket med tinnfolie og autoklav (figur 1B).
- For å forberede mikrobielt ekstrakt for å fylle opp den autoklaverte komposten, start med å tilsette 30 g av samme kompost som ble brukt i trinn 2.1 til hver av tre 50 ml rør og fyll med M9. Virvel i 1 min (figur 1C).
MERK: Dette bør gi nok bakterier til ni mikrokosmos, som hver støtter utviklingen av hundrevis av nematoder. - Sentrifuger rørene ved 560 × g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vær oppmerksom på ikke å forstyrre pelleten, fjern supernatantene med en serologisk pipette og kombiner i et nytt 50 ml rør.
- Konsentrer bakterieekstraktet ved sentrifugering med maksimal hastighet (2000 × g) i 15 minutter ved RT. Resuspend pellets i nok M9 til å ha 200 μL for hvert mikrokosmos og 200 μL mer for å legge til en plate som vil tjene som en synlig proxy for ormutvikling inne i mikrokosmos.
MERK: For eksempel, for ni mikrokosmos, resuspendere den mikrobielle pelleten i 2 ml M9. - Tilsett 200 μL av det konsentrerte mikrobielle ekstraktet til hvert beger av autoklaverekompost, samt til en NGM-plate som vil tjene som den synlige proxyplaten.
- Inkuber mikrokosmos og proxyplate i 24 timer ved 20-25 °C før tilsetning av ormer.
3. Heve ormer i kompostmikrokosmos
- Tilsett 500-1000 egg eller L1 larver3 til hvert mikrokosmos og til proxyplaten (trinn 2.7) for å starte eksperimentet (figur 1D).
MERK: Forsøkene som er beskrevet her, bruker N2 villtype ormer. Imidlertid kan andre C. elegans stammer (og potensielt andre nematoder) brukes. - Løft ormene til voksen alder ved 20 °C (vanligvis 3 dager).
Figur 1: Forbereder kompostmikrokosmos, oppdretter ormer og høster . (A) Berik lokal jord eller kompost med råvarer og inkuber i 2 uker. Kombiner (B) autoklavert beriket jord med (C) mikrobielt ekstrakt og (D) inkuber i minst 24 timer før du legger synkroniserte L1s ormer til mikrokosmos for å starte forsøket. (E, F) Når du er klar til å høste, tilsett kompost fra mikrokosmos i en Baermann-traktstøttesylinder og dekk med M9. (G) Slipp filtratet i et 50 ml rør etter 15 minutter. Forkortelse: sup. = supernatant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Forbereder en Baermann-trakt for høsting av ormer
- Monter en Baermann-trakt ved å feste 5-8 cm stive gummislanger til enden av en plasttrakt.
- Skyv en klemme på slangen og klem den lukket.
- Plasser i trakten et 7 cm langt, 5 cm diameter, sylindrisk PVC-rør med et 1 mm nylonnett limt i bunnen (figur 1E). Kle sylinderen med to ark silkepapir.
- Plasser Baermann-trakten i en kolbe (figur 1F).
5. Høsting av ormer fra mikrokosmos og innsamling av de respektive jordprøvene
- Tilsett 20 ml M9 til mikrokosmos der ormene ble hevet, agiter blandingen, og hell deretter blandingen fra begeret inn i den silkepapirforede sylinderen i Baermann-traktoppsettet. Legg til mer M9 for å senke komposten helt ned i trakten.
MERK: C. elegans (N2) populasjoner når voksen alder i kompostmikrokosmos med samme hastighet som på standard agarplater sådd med Escherichia coli. For ytterligere nøyaktighet ved høsting av ormer på et bestemt utviklingsstadium, se proxy-platen fra trinn 3.3. - Etter 30 minutter løsner du klemmen for å frigjøre filtratet som inneholder de høstede ormene i et 50 ml rør (figur 1G).
- Legg til mer M9 i sylinderen og gjenta for en andre runde for å høste flere ormer, og en gang til hvis det kreves flere ormer.
MERK: Når du gjentar høstingsrunder, må du være forsiktig så du ikke kompromitterer vevpapirets integritet, noe som kan tillate jordpartikler å passere gjennom. Maksimalt fire innhøstingsrunder skal isolere minst 50 % av ormene som opprinnelig ble tilsatt mikrokosmos uten at det går ut over vevspapirets integritet. - Konsentrer ormene ved sentrifugering ved 560 × g i 2 minutter (RT). Fjern 35 ml supernatant med en serologisk pipette.
- Overfør de resterende 15 ml til et 15 ml rør og sentrifuger igjen ved 560 × g i 1 minutt for å konsentrere ormene ytterligere. Fjern 14 ml av supernatanten med en serologisk pipette.
- Parallelt samler du 1 g av den gjenværende mikrokosmosjorda i et 1,5 ml rør. Behandle jordprøvene som inneholder miljøbakteriesamfunnet umiddelbart eller lagre dem ved -20 ° C for senere ekstraksjon av nukleinsyrer, som beskrevet nedenfor for ormprøver.
6. Vasking og overflatesterilisering av høstede ormer
- Overfør 1 ml av de konsentrerte, høstede ormene fra trinn 5,5 til et 1,5 ml rør ved hjelp av en glasspipette. Inkuber i 2 minutter for å la ormene slå seg ned i bunnen av røret. Fjern supernatanten, og la de nederste 100 μL være uforstyrret.
- Vask 6x med 1,5 ml M9 + T (0,025% Triton-X i M9), slik at ormene kan slå seg ned i bunnen hver gang.
- Overfør de vaskede ormene i et volum på 100 μL til et nytt 1,5 ml rør ved hjelp av en glasspipette.
MERK: På dette punktet i protokollen skal det ha gått omtrent 30 minutter siden første vask (trinn 6.2). Det anbefales å la ormene forbli uten mat i minst 1 time før tilsetning av levamisol anbefales å tillate utskillelse av forbigående bakterier og full fordøyelse av matbakterier. - Tilsett 100 μL 25 mM levamisolhydroklorid for å lamme ormene. Inkuber i 5 min på RT.
- Tilsett 200 μL 4% blekemiddelløsning. Inkuber i 2 min.
- Fjern supernatanten, la den nederste 150 μL være uforstyrret, og vask 3x med M9 + T, som ovenfor.
MERK: For å minimere kontaminering av prøvene, anbefales det å bruke filtrert M9 + T (gjennom et 0,2 μm filter) og å bruke hansker fra dette tidspunktet og fremover. - Etter vaskene, ta 50 μL av de resterende 150 μL fra siste vask og plate på en LB-plate, inkuber ved 25 ° C i 48 timer for å bekrefte effektiv fjerning av eksterne bakterier.
MERK: Observasjon av opptil 30 kolonier i siste vask (som representerer 60 eksterne bakterieceller totalt igjen i prøven) er tillatt og forventes å ha bare et marginalt bidrag til den analyserte mikrobiomsammensetningen, gitt de tusenvis av bakterier som vanligvis koloniserer hver voksen orm15. Når flere blir observert, kan prøveintegriteten bli kompromittert. - Bruk de overflatesteriliserte ormene umiddelbart (f.eks. for å trekke ut levende bakterier for dyrking [CFU-teller]) eller oppbevar ved -20 ° C for den påfølgende ekstraksjonen av nukleinsyrer.
7. DNA-ekstraksjon
MERK: Følgende trinn beskriver DNA-ekstraksjon av de høstede ormene ved hjelp av et kommersielt sett designet for ekstraksjon av mikrobielt DNA fra jord (se materialtabell), med modifikasjoner beskrevet nedenfor for å lette ekstraksjonen av mikrobielt DNA fra ormer.
- Overfør prøven som inneholder overflatesteriliserte ormer (tine ved RT om nødvendig) til rørene som leveres av settet, og erstatt de medfølgende glassperlene med zirkoniumperler med omtrent 30-50 1 mm diameter zirkoniumperler (se materialtabell).
MERK: De observerte DNA-utbyttene er høyere med zirkoniumperler enn med glassperlene som leveres av settet. Selv om årsaken bak denne observasjonen forblir ubestemt, kan zirkoniumperler bryte opp nematodekutikula mer effektivt og frigjøre flere bakterier. - For kompostprøver, tilsett omtrent 250 mg av den oppsamlede jorda til settets rør uten å erstatte glassperlene.
- Etter tilsetning av bufferløsningen som leveres av settet til alle prøvene, homogeniser med en effekthomogenisator ved RT (se materialtabell) i to runder med 2,000 o / min i 30 s hver, pause i 30 s i mellom.
- Fullfør de resterende DNA-rensetrinnene i henhold til kit-protokollen. Eluter ormeprøvene i ikke mer enn 50 μL elueringsbuffer for å sikre DNA-konsentrasjoner som er høye nok til sekvensering.
Representative Results
For å utforske evnen til å diversifisere samfunnet av jordmikrokosmos, sammenlignet vi de mikrobielle samfunnene i kompostmikrokosmos tilberedt ved å berike den samme innledende jorda, en industriell kompost tilgjengelig fra Berkeley, California, med forskjellige råvarer: epler, paprika, appelsiner eller poteter (hvert sett i tre eksemplarer). Vi sammenlignet videre de mikrobielle samfunnene i hvert kompostmiljø med tarmmikrobiomet av villtype C. elegans oppvokst i det respektive mikrokosmos. Analysen ble utført med DNA-prøver ekstrahert fra omtrent 500 overflatesteriliserte voksne per mikrokosmos og fra 250 mg kompostprøver av de respektive mikrokosmos.
Karakterisering av miljøjord- og ormtarmmikrobiomene var avhengig av neste generasjons sekvensering av V4-regionen av det bakterielle 16S rRNA-genet. Sekvensering av bibliotekforberedelse ble oppnådd ved bruk av standardsettene og utført i henhold til produsentens instruksjoner, med sekvensering utført på en kommersiell sequencer (se Materialtabell). Demultipleksede sekvenser ble behandlet ved hjelp av DADA2, tildelt taksonomi basert på referansedatabasen SILVA v132 og analysert med phyloseq16,17,18 (se tilleggsfil 1, tilleggsfigur S1, tilleggsfigur S2, tilleggsfigur S3, tilleggstabell S1 og tilleggstabell S2 for en detaljert beskrivelse av sekvensering og analyse; hele datasamlebåndet er tilgjengelig i GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Rådata er tilgjengelig på NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).
I gjennomsnitt ble 73 220 sekvenser oppnådd per prøve. Disse sekvensene representerer 15 027 amplikonsekvensvarianter (ASV-er), som spenner over 27 phyla og 216 familier, inkludert familier som anses som en del av kjernen C. elegans tarmmikrobiom13, som Rhizobiaceae, Burkholderiaceae og Bacillaceae. Enterobacteriaceae, og Pseudomonadaceae, som tidligere ble funnet å være dominerende medlemmer, var en minoritet denne gangen, men ble fortsatt beriket (2-10 ganger) sammenlignet med deres respektive jordmiljøer. Sammenligninger basert på både uvektede og vektede UniFrac 19,20-avstander viste god reproduserbarhet blant mikrokosmos-triplikater beriket med samme produkt, som indikert ved tett klynge. I motsetning til dette er miljøjordmikrobiomer beriket med forskjellige produkter gruppert bort fra hverandre, og demonstrerer evnen til å diversifisere et innledende mikrobielt samfunn gjennom tilsetning av forskjellige produkter (figur 2).
I sammenligninger av ormens tarmmikrobiomer og miljøsamfunn viste hovedkoordinatanalyse (PCoA) med enten uvektede eller vektede UniFrac-avstander tydelig klynger av ormens tarmmikrobiomer vekk fra deres respektive miljøer for hver mikrokosmostype (figur 2). Mens PCoA basert på uvektede UniFrac-avstander ikke skilte mellom jord- og ormemikrobiomer (figur 2A), viste clustering basert på vektede avstander et klart skille mellom ormens tarm og kompostmikrobiomer (figur 2B). Disse resultatene støtter en prosess der vertsfiltrering opererer på miljøtilgjengelighet for å forme et tarmmikrobiom som ikke er helt forskjellig fra miljøkilden med hensyn til tilstedeværelsen av taxa, men modulerer deres overflod ved å berike for en delmengde av den tilgjengelige taxaen, noe som til slutt resulterer i en kjerneorm tarmmikrobiom delt mellom ormer oppvokst i forskjellige miljøer.
Figur 2: Ormens tarmmikrobiomer klynger seg bort fra deres respektive produserende diversifiserte mikrobielle miljøer. Mikrobiomsammensetningen ble bestemt med 16S-sekvensering, og samfunn fra mikrokosmos beriket med de utpekte produktene eller fra ormer oppvokst i dem ble gruppert ved hjelp av PCoA basert på (A) uvektede eller (B) vektede UniFrac-avstander. Aksene som vises er de som forklarer den største variasjonen i samfunnssammensetning mellom prøver (N = 3 for hver mikrokosmostype). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Neste generasjons sekvensering og dataanalyse. Her presenteres trinnene for bibliotekforberedelse, sekvensering i laboratoriet og dataanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S1: Et eksempel på en kvalitetskontrollgraf for baksiden leser fra ett utvalg. X-aksen (syklusen) viser nukleotidposisjonen langs sekvensen som er lest. Den venstre Y-aksen viser kvalitetspoengene. Gråtonevarmekartet representerer frekvensen av kvalitetspoengene ved hver nukleotidposisjon; Den grønne linjen viser median kvalitetspoeng ved hver nukleotidposisjon; den øverste oransje linjen viser kvartilene til kvalitetspoengfordelingen; den nederste røde linjen viser prosentandelen av sekvensavlesninger som utvidet nukleotidposisjonen (høyre Y-akse, her 100%). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Feilrater for ulike utvalg. Feilfrekvensen i de forskjellige prøvene (svarte prikker) bør reduseres med økende kvalitetspoeng for hver mulige baseparsubstitusjon som er avbildet, noe som gjenspeiler den forventede trenden. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Et eksempel på PCoA basert på vektede UniFrac-avstander. Gruppenavnene som vises i forklaringen, representerer produktene som brukes til å berike komposten som brukes i de forskjellige mikrokosmosene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Sekvensiell sekvensfiltrering. en Antall sekvensavlesninger før filtrering. b-d Hver kolonne representerer antall sekvensavlesninger som gjenstår etter et filtreringstrinn: filtrering av lavkvalitetsavlesninger (trinn 2.5), denoisingalgoritme utført av dada() (trinn 2.8), sammenslåing fremover og bakover (trinn 2.9) og fjerning av kimærer (trinn 2.11). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Metadatatabell. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å studere tarmmikrobiomet av nematoder oppdratt i naturlige miljøer, og tilbyr en alternativ tilnærming til isolering av ormer fra naturen eller å heve dem på syntetiske samfunn.
De tusenvis av potensielle bakteriearter fanget i det representative mikrokosmoseksperimentet gjenspeiler det mikrobielle mangfoldet som ormene har utviklet seg med, og demonstrerer mikrokosmosrørledningens evne til å kombinere fordelene ved å jobbe med en modellvertsorganisme og de som arbeider med naturlige, mangfoldige mikrobielle samfunn.
De representative resultatene viser at berikelse av en felles jord med forskjellige produksjonstyper modulerer miljømikrobielt mangfold, og fremhever rekkevidden av mikrobielt mangfold som er tilgjengelig for leting ved hjelp av denne rørledningen. Produser valg er ikke spesielt viktig. Tidligere arbeid har brukt bananer, epler, appelsiner, jordbær, grønne teblader og poteter for å berike jord, noe som resulterer i lignende orm som øker effektiviteten. Blandede produkter har også blitt brukt effektivt. Nøkkelfunksjonen er at forskjellige produkter vil diversifisere en gitt jord på forskjellige måter.
Til tross for den store variasjonen i miljømikrobielt mangfold, varierer ormens tarmmikrobiomer betydelig mindre, og rekapitulerer betydningen av ormens tarmnisje og vertsfiltrering for montering av et kjernetarmmikrobiom som er forskjellig fra jordmiljøet13. Dette mønsteret observeres best med vektet UniFrac PCoA-analyse, som viser at forskjellene mellom miljøjord og ormtarmmikrobiomer hovedsakelig stammer fra forskjeller i den relative overfloden av nøkkeltaksa.
Selv om protokollen beskrevet her fokuserer på høsting av ormer for 16S-sekvensering, kan mikrokosmos brukes til å utforske flere spørsmål av interesse. For eksempel kan ormer høstet fra mikrokosmos senere undersøkes for effekten av et mangfoldig tarmmikrobiom på vertsresistens mot ulike ugunstige forhold, inkludert patogener eller toksiner. Alternativt kan nye bakteriearter og stammer isoleres og dyrkes fra jordhøstede ormer, og utvide det taksonomiske og funksjonelle mangfoldet av bakterier som er tilgjengelige for å utføre eksperimenter med.
Mens forskningsmetoder i laboratorieinnstillinger søker konsistens og reproduserbarhet, utnytter arbeid med mikrokosmos den naturlige variasjonen for å utforske vert-mikrobe-interaksjoner i en naturlig lignende sammenheng. Likevel byr denne variasjonen også på noen utfordringer. Noen jordarter som inneholder høye nivåer av endogene hvirvelløse dyr, kan kreve ytterligere sentrifugering, filtrering og undersøkelsestrinn for effektivt å eliminere uønskede organismer fra mikrokosmospreparatet. I tillegg kan lav mikrobiell overflod i jord indusere uønsket dauerdannelse i ormpopulasjoner, noe som krever en økning i mikrobiell ekstrakt eller berikende jord med større mengde råvarer. Med hvert mikrokosmoseksperiment som utføres, fortsetter forskere å utforske det fulle taksonomiske og funksjonelle mangfoldet som tilbys av naturen, noe som muliggjør oppdagelsen av nye mikrobielle taxa og funksjonelle evner som spenner fra infeksjonsresistens til beskyttelse mot miljømessige xenobiotika.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi som er relevante for innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av NIH-tilskuddene R01OD024780 og R01AG061302. K.T. ble videre støttet av et Summer Undergraduate Research Fellowship fra University of California, Berkeley, finansiert av Rose Hills Foundation. Tegneseriedesign i figur 1 ble hentet fra BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
| Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
| DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
| dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
| Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
| Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
| Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
| M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
| MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
| MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
| Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
| PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
| Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |
References
- Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285 (2017).
- Stiernagle, T.
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604 (2019).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
- Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
- Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343 (2022).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
