Kompostmikrokosmos bringer det mikrobielle mangfoldet som finnes i naturen inn i laboratoriet for å lette mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Forutsatt her er protokoller for å sette opp mikrokosmoseksperimenter, med forsøkene som demonstrerer evnen til å modulere miljømikrobielt mangfold for å utforske forholdet mellom miljømikrobielt mangfold og ormens tarmmikrobiomsammensetning.
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig modell for å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for interaksjoner mellom verter og deres tarmmikrobiomer. Mens eksperimenter med godt karakteriserte bakterier eller definerte bakteriesamfunn kan lette analysen av molekylære mekanismer, er det viktig å studere nematoder i deres naturlige mikrobielle sammenheng for å utforske mangfoldet av slike mekanismer. Samtidig er isolering av ormer fra naturen ikke alltid mulig, og selv når det er mulig, begrenser prøvetaking fra naturen bruken av det genetiske verktøysettet som ellers er tilgjengelig for C. elegans forskning. Følgende protokoll beskriver en metode for mikrobiomstudier som benytter kompostmikrokosmos for vekst i laboratoriet i mikrobielt forskjellige og naturlige miljøer.
Lokalt hentet jord kan berikes med råvarer for å diversifisere de mikrobielle samfunnene der ormer heves og hvorfra de høstes, vaskes og overflatesteriliseres for etterfølgende analyser. Representative eksperimenter demonstrerer evnen til å modulere det mikrobielle samfunnet i en felles jord ved å berike det med forskjellige produkter og videre demonstrere at ormer oppvokst i disse forskjellige miljøene samler lignende tarmmikrobiomer som er forskjellige fra deres respektive miljøer, og støtter forestillingen om et artsspesifikt kjernemikrobiom. Samlet sett gir kompostmikrokosmos naturlige laboratoriemiljøer for mikrobiomforskning som et alternativ til syntetiske mikrobielle samfunn eller til isolering av ville nematoder.
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig modell for å studere interaksjoner mellom verter og deres tarmmikrobiomer 1,2. Som modell gir det flere fordeler. For det første er bakteriefrie eller gnotobiotiske dyr enkle å skaffe og vedlikeholde; Blekemiddel kan brukes til å drepe gravid ormer og tilhørende mikrober, slik at deres blekemiddelresistente egg uskadd vokser som alderssynkroniserte populasjoner som kan koloniseres av bakterier av interesse 3,4. I tillegg, når de vokser i nærvær av bakterier, inntar C. elegans, en bakterivor, de oppståtte bakteriene, med følsomme arter fordøyd eller utskilt, mens resistente og vedvarende arter stabilt koloniserer ormens tarm. Videre er C. elegans for det meste hermafrodittiske, og produserer populasjoner av genetisk identisk avkom, noe som reduserer forvirrende genetisk variasjon. Sammen med tilgjengeligheten av mutante og transgene ormstammer, tilbyr arbeid med C. elegans forskere en gnotobiotisk og genetisk trekkbar modell for å undersøke molekylære grunnlaget for vert-mikrobe-interaksjoner 5,6,7,8.
Mens eksperimenter med godt karakteriserte bakterier kan lette analysen av molekylære mekanismer, er det viktig å identifisere og studere bakteriene som ormer samhandler med i naturen, for å utforske mangfoldet av slike mekanismer, unraveling den naturlige konteksten for deres funksjon og forstå de selektive kreftene som har formet deres evolusjon. Utenfor laboratoriet finnes C. elegans globalt i fuktige tempererte klimaer, hvor populasjoner antas å gjennomgå en “boom-and-bust” livssyklus, preget av rask befolkningsvekst når ressursene er rikelig, etterfulgt av et utviklingsskifte til banebrytende, stresstolerante dauers når ressursene er utarmet9. Selv om det betraktes som en jordnematode, er viltvoksende C. elegans-populasjoner oftest funnet fôring på nedbrytende organisk materiale som råtnende blomster eller frukt, hvor bakteriepopulasjoner er rikelig og mangfoldig.
Studier av tarmmikrobiomet i nematoder isolert fra naturen har identifisert forskjellige, men karakteristiske, bakterielle samfunn 10,11, hvis sammensetning ble ytterligere støttet av studier utført med ormer oppvokst i naturlige mikrokosmosmiljøer 12,13. Sammen muliggjorde slike studier avgrensningen av et kjerneorm-tarmmikrobiom2. Mens prøvetaking av C. elegans populasjoner i naturen representerer den mest direkte undersøkelsen av naturlige orm-mikrobe-interaksjoner, er det ikke mulig overalt og når som helst, da det er begrenset til regioner og årstider med rikelig nedbør10,11. Alternativt, i stedet for å isolere ormer fra deres naturlige habitat, bringer eksperimenter ved hjelp av mikrokosmos det naturlige habitatet inn i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmosmiljøer fremstilles fra jord kompostert med ulike frukter eller grønnsaker, noe som muliggjør ytterligere diversifisering av startjordsamfunnet. De tilbyr trekkbare eksperimentelle metoder som kombinerer det mikrobielle mangfoldet og det tredimensjonale ville jordmiljøet med de eksperimentelle fordelene ved et kontrollert laboratorieanlegg og genetisk definerte ormstammer. Protokollen nedenfor beskriver trinnene som er involvert i å jobbe med kompostmikrokosmos, og demonstrerer deres bruk for å forstå samlingen av et karakteristisk ormtarmmikrobiom fra forskjellige miljøer.
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å studere tarmmikrobiomet av nematoder oppdratt i naturlige miljøer, og tilbyr en alternativ tilnærming til isolering av ormer fra naturen eller å heve dem på syntetiske samfunn.
De tusenvis av potensielle bakteriearter fanget i det representative mikrokosmoseksperimentet gjenspeiler det mikrobielle mangfoldet som ormene har utviklet seg med, og demonstrerer mikrokosmosrørledningens evne til å kombinere fordelene ved å jobbe med en modellvertsorganisme og de som arbeider med naturlige, mangfoldige mikrobielle samfunn.
De representative resultatene viser at berikelse av en felles jord med forskjellige produksjonstyper modulerer miljømikrobielt mangfold, og fremhever rekkevidden av mikrobielt mangfold som er tilgjengelig for leting ved hjelp av denne rørledningen. Produser valg er ikke spesielt viktig. Tidligere arbeid har brukt bananer, epler, appelsiner, jordbær, grønne teblader og poteter for å berike jord, noe som resulterer i lignende orm som øker effektiviteten. Blandede produkter har også blitt brukt effektivt. Nøkkelfunksjonen er at forskjellige produkter vil diversifisere en gitt jord på forskjellige måter.
Til tross for den store variasjonen i miljømikrobielt mangfold, varierer ormens tarmmikrobiomer betydelig mindre, og rekapitulerer betydningen av ormens tarmnisje og vertsfiltrering for montering av et kjernetarmmikrobiom som er forskjellig fra jordmiljøet13. Dette mønsteret observeres best med vektet UniFrac PCoA-analyse, som viser at forskjellene mellom miljøjord og ormtarmmikrobiomer hovedsakelig stammer fra forskjeller i den relative overfloden av nøkkeltaksa.
Selv om protokollen beskrevet her fokuserer på høsting av ormer for 16S-sekvensering, kan mikrokosmos brukes til å utforske flere spørsmål av interesse. For eksempel kan ormer høstet fra mikrokosmos senere undersøkes for effekten av et mangfoldig tarmmikrobiom på vertsresistens mot ulike ugunstige forhold, inkludert patogener eller toksiner. Alternativt kan nye bakteriearter og stammer isoleres og dyrkes fra jordhøstede ormer, og utvide det taksonomiske og funksjonelle mangfoldet av bakterier som er tilgjengelige for å utføre eksperimenter med.
Mens forskningsmetoder i laboratorieinnstillinger søker konsistens og reproduserbarhet, utnytter arbeid med mikrokosmos den naturlige variasjonen for å utforske vert-mikrobe-interaksjoner i en naturlig lignende sammenheng. Likevel byr denne variasjonen også på noen utfordringer. Noen jordarter som inneholder høye nivåer av endogene hvirvelløse dyr, kan kreve ytterligere sentrifugering, filtrering og undersøkelsestrinn for effektivt å eliminere uønskede organismer fra mikrokosmospreparatet. I tillegg kan lav mikrobiell overflod i jord indusere uønsket dauerdannelse i ormpopulasjoner, noe som krever en økning i mikrobiell ekstrakt eller berikende jord med større mengde råvarer. Med hvert mikrokosmoseksperiment som utføres, fortsetter forskere å utforske det fulle taksonomiske og funksjonelle mangfoldet som tilbys av naturen, noe som muliggjør oppdagelsen av nye mikrobielle taxa og funksjonelle evner som spenner fra infeksjonsresistens til beskyttelse mot miljømessige xenobiotika.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av NIH-tilskuddene R01OD024780 og R01AG061302. K.T. ble videre støttet av et Summer Undergraduate Research Fellowship fra University of California, Berkeley, finansiert av Rose Hills Foundation. Tegneseriedesign i figur 1 ble hentet fra BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |