堆肥微观世界将自然界中发现的微生物多样性带入实验室,以促进 秀丽隐杆线虫的微生物组研究。这里提供了用于建立微观实验的协议,实验展示了调节环境微生物多样性的能力,以探索环境微生物多样性与蠕虫肠道微生物组组成之间的关系。
线虫秀 丽隐杆线虫 正在成为研究宿主与其肠道微生物组之间相互作用的分子机制的有用模型。虽然使用表征良好的细菌或确定的细菌群落进行实验可以促进分子机制的分析,但在自然微生物环境中研究线虫对于探索这些机制的多样性至关重要。同时,从野外分离蠕虫并不总是可行的,即使可能,从野外取样也限制了遗传工具包的使用,否则可用于 秀丽隐杆线虫 研究。以下协议描述了一种利用堆肥微观世界在微生物多样化和类似自然的环境中进行实验室内生长的微生物组研究方法。
当地采购的土壤可以用农产品来丰富,以使饲养蠕虫的微生物群落多样化,并从中收获、清洗和表面消毒以进行后续分析。代表性实验证明了通过用不同的农产品丰富来调节普通土壤中的微生物群落的能力,并进一步证明在这些不同环境中饲养的蠕虫组装了与各自环境不同的相似肠道微生物组,支持物种特异性核心肠道微生物组的概念。总体而言,堆肥微观世界为微生物组研究提供了类似自然的实验室环境,作为合成微生物群落或野生线虫分离的替代方案。
线虫秀丽隐杆线虫正在成为研究宿主与其肠道微生物组之间相互作用的有用模型1,2。作为一种模型,它提供了几个优点。首先,无菌或侏儒动物易于获得和饲养;漂白剂可用于杀死妊娠蠕虫和相关微生物,使其抗漂白剂卵不受伤害地生长为年龄同步的种群,可以被感兴趣的细菌定植3,4。此外,当在细菌存在下生长时,秀丽隐杆线虫(一种细菌食者)摄取遇到的细菌,易感物种被消化或排泄,而耐药性和持久性物种则稳定地定植在蠕虫肠道中。此外,秀丽隐杆线虫大多是雌雄同体的,产生基因相同的后代种群,这减少了混杂的遗传变异。再加上突变和转基因蠕虫菌株的可用性,与秀丽隐杆线虫合作为研究人员提供了一个GNTOBIO和遗传可处理的模型,以研究宿主 – 微生物相互作用的分子基础5,6,7,8。
虽然对表征良好的细菌的实验可以促进分子机制的分析,但识别和研究蠕虫在自然界中与之相互作用的细菌对于探索这些机制的多样性、揭示其功能的自然背景以及了解塑造其进化的选择性力量至关重要。在实验室之外, 秀丽隐杆线虫 在全球范围内被发现在潮湿的温带气候中,那里的种群被认为经历了“繁荣与萧条”的生命周期,其特征是资源丰富时人口快速增长,然后在资源枯竭时向开拓性、抗压的 dauers 发展转变9.虽然被认为是土壤线虫,但野生增殖的 秀丽隐杆线虫 种群最常见于腐烂的有机物质,如腐烂的花朵或水果,其中细菌种群丰富多样。
对从野外分离的线虫中的肠道微生物组的研究已经确定了多种但具有特征的细菌群落10,11,其组成得到了在自然微观环境中饲养的蠕虫进行的研究的进一步支持12,13。总之,这些研究能够描绘出核心蠕虫肠道微生物组2。虽然对野生秀丽隐杆线虫种群的采样代表了对天然蠕虫-微生物相互作用的最直接检查,但它并非随时随地可行,因为它仅限于降水充足的地区和季节10,11。或者,不是将蠕虫与它们的自然栖息地隔离开来,而是使用微观世界的实验将自然栖息地带入实验室6,8,12,13,14,15。微观环境由含有各种水果或蔬菜的土壤堆肥制备而成,这使得起始土壤群落进一步多样化。它们提供了易于处理的实验方法,将微生物多样性和三维野生土壤环境与受控实验室设施和遗传定义的蠕虫菌株的实验优势相结合。下面的协议详细介绍了使用堆肥微观世界所涉及的步骤,展示了它们在理解来自不同环境的特征蠕虫肠道微生物组组装中的用途。
这里介绍的协议描述了一种研究在自然环境中饲养的线虫肠道微生物组的方法,提供了一种将蠕虫与自然界隔离或在合成群落上饲养蠕虫的替代方法。
在代表性的微观实验中捕获的数千种潜在细菌物种反映了蠕虫进化的微生物多样性,并证明了微观管道将使用模型宿主生物的优势与与自然,多样化的微生物群落合作的优势相结合的能力。
代表性结果表明,用不同的农产品类型丰富公共土壤可以调节环境微生物多样性,突出了使用该管道可用于勘探的微生物多样性范围。产品选择并不是特别重要。以前的工作使用香蕉,苹果,橙子,草莓,绿茶叶和土豆来丰富土壤,从而产生类似的蠕虫饲养效率。混合产品也得到了有效利用。关键特征是不同的产品将以不同的方式使给定的土壤多样化。
尽管环境微生物多样性差异很大,但蠕虫肠道微生物组的变化要小得多,这概括了蠕虫肠道生态位和宿主过滤对于组装与其土壤环境不同的核心肠道微生物组的重要性13。这种模式在加权UniFrac PCoA分析中观察到最好,表明环境土壤和蠕虫肠道微生物组之间的差异主要源于关键分类群相对丰度的差异。
尽管此处描述的协议侧重于收集蠕虫以进行16S测序,但微观世界可用于探索其他感兴趣的问题。例如,随后可以检查从微观世界中收获的蠕虫,以确定多种肠道微生物组对宿主对各种不利条件(包括病原体或毒素)的抵抗力的影响。或者,可以从地面收获的蠕虫中分离和培养新的细菌种类和菌株,从而扩大可用于进行实验的细菌的分类和功能多样性。
虽然实验室环境中的研究方法寻求一致性和可重复性,但微观世界的工作利用自然变异在类似自然的背景下探索宿主 – 微生物相互作用。然而,这种变化也带来了一些挑战。一些含有高水平内源性无脊椎动物的土壤可能需要额外的离心、过滤和检查步骤,以有效地从微观制备中消除不需要的生物。此外,土壤中微生物丰度低可能会在蠕虫种群中诱导不希望的dauer形成,需要增加微生物提取物或用更多的农产品丰富土壤。随着每个微观实验的进行,研究人员继续探索自然界提供的全部分类学和功能多样性,从而能够发现新的微生物分类群和功能能力,从抗感染到对环境异生的保护。
The authors have nothing to disclose.
本手稿中描述的工作得到了NIH拨款R01OD024780和R01AG061302的支持。K.T.得到了加州大学伯克利分校的暑期本科生研究奖学金的进一步支持,该奖学金由玫瑰山基金会资助。 图1 中的卡通设计是从 BioRender.com 获得的。
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |